Báo cáo th cđbtv nhóm 5 chiều t4

PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ TRÊN MẪU VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII...15 2.1 Phương pháp ly trích DNA và điện di tổng số trên mẫu vi khuẩn Pantoea stewartii...15 2.1.1.. Kết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT

TP Thủ Đức, 12/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO MÔN HỌC

THỰC HÀNH CHẨN ĐOÁN BỆNH THỰC VẬT

PGS TS NGUYỄN BẢO QUỐC Nguyễn Đạt Tiến Khoa_21126376

Nguyễn Văn Tân _21126493Cao Minh Trực_21126559

TP Thủ Đức, 12/2024

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH SÁCH CÁC BẢNG 6

DANH SÁCH CÁC HÌNH 7

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Bệnh xơ đen trên cây mít 8

1.1.1 Điều kiện thuận lợi giúp vi khuẩn xâm nhập và lây lan 8

1.1.2 Dấu hiệu nhận biết 8

1.1.3 Các biện pháp phòng ngừa và xử lý hiện tượng xơ đen ở mít 9

1.2 Giới thiệu về Pantoea stewartii 10

1.2.1 Phân loại 10

1.2.2.Đặc điểm hình thái 10

1.3 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 11

1.3.1 Định nghĩa 11

1.3.2 Nguyên lý hoạt động 12

1.4 Giới thiệu về điện di 12

1.4.1 Định nghĩa 12

1.4.2 Thành phần điện di 12

1.4.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose 12

1.4.3.1 Dung dịch đệm 12

1.4.3.2 Agarose 13

1.4.4 Phương pháp điện di 13

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ TRÊN MẪU VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII 15

2.1 Phương pháp ly trích DNA và điện di tổng số trên mẫu vi khuẩn Pantoea stewartii 15

2.1.1 Phương pháp ly trích DNA 15

2.1.2 Vật liệu và phương pháp điện di tổng số trên mẫu vi khuẩn Pantoea stewartii 15

2.1.2.1 Vật liệu điện di 15

2.1.2.2 Phương pháp điện di 15

Chương 3 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR 16S RNA 17

3.1 Vật liệu phản ứng PCR 16s RNA 17

3.2 Các bước thực hiện phản ứng PCR 16s RNA 17

3.3 Kết quả phản ứng PCR 16S RNA và thảo luận 18

Chương 4 SỬ DỤNG CẶP PRIMER TỪ PHÒNG CHẨN ĐOÁN BỆNH HỌC ĐỂ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PANTOEA STEWARTII 19

4.1 Nội dung thực hiện 19

4.2 Vật liệu và phương pháp thực hiện 19

4.2.1 Vật liệu 19

4.2.2 Phương pháp thực hiện 20

Chương 5 SỬ DỤNG CẶP PRIMER THAM KHẢO TỪ TÀI LIỆU KHOA HỌC ĐỂ XÁC

ĐỊNH PANTOEA STEWARTII 23

5.1 Nội dung thực hiện 23

5.2 Vật liệu và phương pháp thực hiện 23

5.2.1 Vật liệu 23

5.2.2 Phương pháp thực hiện 23

5.3 Kết quả và thảo luận 25

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Kết quả điện di tổng số trên mẫu vi khuẩn Pantoea stewartii 16

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh xơ đen trên cây mít

Hiện tượng xơ đen ở mít có hai nguyên nhân chính: thiếu dinh dưỡng và sự xâmnhập của vi khuẩn

Theo công bố mới nhất, vi khuẩn Pantoea stewartii sub sp được xác định là tác

nhân gây đốm vàng nâu bên trong trái mít Vi khuẩn này được phát hiện đầu tiên tạiMalaysia (Zulperio và cộng sự, 2017) và cũng được ghi nhận gây bệnh tương tự trên câymít ở Mexico (2017) Nghiên cứu của Nguyễn Thành Nhân (2018) chỉ ra rằng vi khuẩn

có thể tấn công trái mít trong quá trình thụ phấn qua hai con đường: (1) xâm nhập qua vòinhị cái và đi vào bên trong trái, (2) xâm nhập qua khe hở giữa các múi khi trái còn non.Ngoài ra, thiếu hụt canxi trong đất cũng là một nguyên nhân quan trọng gây ra hiệntượng này

1.1.1 Điều kiện thuận lợi giúp vi khuẩn xâm nhập và lây lan

Khi có mưa, vi khuẩn theo nước trên nhụy hoa xâm nhập vào vòi nhụy và đến bầunoãn Tại đây, vi khuẩn phát triển khiến múi không thụ tinh được và làm hạt lép lửng.Nếu vi khuẩn xâm nhập sau khi thụ tinh, hạt non sẽ bị hư và chuyển sang màu đen Ngoài

ra, vi khuẩn có thể xâm nhập qua các khe hở giữa các múi mít

Do hình dạng lồi lõm của trái mít, nước mưa thường đọng lại ở các vị trí lõm, tạomôi trường ẩm ướt thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và gây hại Bên cạnh đó, mưa nhiềulàm rửa trôi canxi trong đất và hạ thấp pH, gây ra tình trạng thiếu hụt canxi

1.1.2 Dấu hiệu nhận biết

Trái mít bị xơ đen thường có hình dạng méo mó, đầu trái nhỏ, vỏ ngoài khôngbóng, xù xì, sần sùi và có màu tối Khi bổ ra, phần xơ bên trong chuyển sang màu đen,các múi không phát triển đầy đủ, bị lép và hạt không hình thành hoặc phát triển kém.Hiện tượng này không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng và năng suất trái mà còn làm giảmgiá trị kinh tế của mít Nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn xâm nhập trong quá trình thụphấn hoặc thiếu hụt canxi trong đất, đặc biệt trong điều kiện mưa nhiều và độ ẩm cao

Hình 1.1 Hiện tượng xơ đen ở mít.

1.1.3 Các biện pháp phòng ngừa và xử lý hiện tượng xơ đen ở mít

c Biện pháp hóa học

Phòng trừ vi khuẩn bằng cách xử lý cuống và trái, phun thuốc kháng sinh (nhưSạch khuẩn, Polysuper ) ít nhất 2-3 lần trong các giai đoạn nhú cựa gà, trước và sau khiđậu trái Kết hợp với xử lý rầy rệp và côn trùng bằng các sản phẩm như Cheones,Daiphat

Bổ sung phân bón lá giàu canxi (Canxibo, Canxibo Sillic, Natucar ) định kỳ hàng thángtrong giai đoạn nuôi trái để tăng sức đề kháng và phát triển trái khỏe mạnh

1.2 Giới thiệu về Pantoea stewartii

Pantoea stewartii là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, gram âm, không di động, không tạo

bào tử, có kích thước 0,4 - 0,8 x 0,9 - 2,2 µm, với hai phân loài chính là P stewartii

subsp stewartii và P stewartii subsp indologenes P stewartii subsp stewartii phát

triển ở 4°C hoặc 37°C, không phát triển ở 41°C, tạo khuẩn lạc màu vàng lồi trên môitrường thạch chiết xuất nấm men - dextrose - canxi cacbonat, hoặc màu vàng cam trênthạch dinh dưỡng - glucose Loại này không sinh indole, không thủy phân esculin, khôngtăng trưởng trên citrate, mucate và không tạo axit từ các đường như cellobiose, maltose,lactose, salicin

Trong khi đó, P stewartii subsp indologenes có thể phát triển ở 41°C hoặc 44°C,

sinh indole, thủy phân esculin, tăng trưởng trên cis-aconitate, meso-tartate và tạo axit từ

cellobiose, maltose, lactose, salicin Các axit béo chính tương tự như phân loài stewartii

Cả hai phân loài này đều sản xuất polysaccharide ngoại bào liên quan đến độc lực, với

ghi nhận P stewartii subsp stewartii gây bệnh cháy lá và héo trên bắp, cũng như xơ đen

trên mít

Kỹ thuật PCR được nhà hóa sinh học người Hoa Kỳ Kary Mullis (1944-2019)phát triển vào năm 1985 dựa trên ý tưởng muốn xây dựng một quy trình giúp đoạn DNA

có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ phản ứng thông qua xúc tác

nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như vi khuẩn E.

coli hay nấm men để tách sợi đôi ADN thành hai mạch đơn, sau đó sử dụngcác cặp mồi

bổ sung để bắt cặp với mạch đơn, tái bản nhờ enzyme DNA polymerase

Với y học hiện đại ngày nay, xét nghiệm sinh học phân tử PCR đang được ứngdụng rộng rãi trong chẩn đoán và chữa bệnh Nổi bật là ứng dụng của PCR trong chẩnđoán các bệnh đặc hiệu liên quan tới virus mà các xét nghiệm truyền thống không thểchẩn đoán hoặc chẩn đoán cho kết quả không chính xác Tại Việt Nam, PCR và các kỹthuật dựa trên nền tảng PCR đang được ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực nghiêncứu khác nhau như y học (phát hiện bệnh di truyền, nông nghiệp (chọn dòng cá thể lainhờ chỉ thị phân tử, xác định bệnh và kiểm định giống)

1.3.2 Nguyên lý hoạt động

Nguyên lý hoạt động của máy PCR là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bảnsao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

1.4 Giới thiệu về điện di

1.4.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose

đổi thành phần hóa học của dung dịch và làm thay đổi pH của dung dịch pH của dungdịch là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong quá trình điện di nên phải giữ cho

pH của dung dịch điện di không thay đổi trong suốt quá trình điện di Do đó, dung dịchđiện di phải là dung dịch có khả năng đệm tốt, không quá loãng và không quá đặc, đảmbảo dung dịch đệm phải giữ cho protein ở trạng thái bền vững không bị biến tính và phântách tốt hỗn hợp protein thành các cấu tử

Dung dịch đệm TBE (Tris-borate-EDTA) là đệm được sử dụng phổ biến nhấttrong điện di các phân tử DNA và RNA Đệm TBE giúp giữ ổn định pH qua đó giữ ổnđịnh sự tích điện của phân tử axit nucleic Do đó, sự phân tách phân tử ADN trong điện

di bởi kích thước phân tử của nó Ngoài sử dụng để chạy điện di, TBE còn được sử dụng

để tạo gel Do đó việc lựa chọn dung dịch TBE là quan trọng để đảm kết quả của điện di.Đệm TBE thường được sử dụng với các đoạn DNA nhỏ, vì nó cung cấp khả năng phântách tốt hơn cho các kích thước <1 kb

Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate EDTA) có khả năng đệm tốt hơn vì trong TBE

có chứa borate, chất này ức chế các enzyme nên các sản phẩm sau điện di cần được phânlập cho các ứng dụng liên quan đến enzyme thì dung dịch đệm TAE là lựa chọn tốt hơn.Đệm TAE thường được sử dụng để điện di các đoạn acid nucleic >1 kb nhờ gốc acetate.Tương thích với các phản ứng enzyme và được khuyên dùng cho điện di gel

1.4.3.2 Agarose

Agarose là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích thước lỗ gellớn, thích hợp cho phân tách các phân tử DNA có kích thước lớn và điện di dựa trên độtích điện

Thông thường gel có nồng độ agarose cao thì kích thước lỗ càng nhỏ, do đó có thểphân tách phân tử có khối lượng nhỏ hơn trong khi gel có nồng độ agarose thấp sẽ phântách được phân tử có khối lượng lớn hơn Phạm vi phân tách hiệu quả của gel agarose vớinồng độ agarose khác nhau Ngoài ra đảm bảo sử dụng cùng bộ đệm với bộ đệm trong bểđiện di (không trộn lẫn các bộ đệm khác nhau và không sử dụng nước)

1.4.4 Phương pháp điện di

Nguyên tắc chung của điện di là dựa trên khả năng di chuyển của phần tử tích điệntrong điện trường Cả protein và acid nucleic đều có thể được phân tách bằng điện di

tồn tại dưới dạng tích điện dương, âm hoặc trung hòa về điện pH mà tại đó protein khôngtích điện gọi là pH đẳng điện hay pHi Nếu pH môi trường lớn hơn pHi, protein sẽ mangđiện âm và sẽ di chuyển về phía cực dương Nếu pH môi trường nhỏ hơn pHi, proteinmang điện dương và di chuyển về phía cực âm Khi pH môi trường bằng pH, trung hòa

về điện nên sẽ không di chuyển trong điện trường

Các phân tử tích điện khác như DNA, RNA cũng điện di theo nguyên tắc trên Ởmôi trường pH ≥ 8, DNA tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện nó sẽ di chuyển vềcực dương

Trong xét nghiệm sinh học phân tử nói chung và kĩ thuật điện di nói riêng, bắtbuộc phải sử dụng đối chứng dương và đối chứng âm

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH DNA VÀ ĐIỆN

DI TỔNG SỐ TRÊN MẪU VI KHUẨN PANTOEA

STEWARTII

2.1 Phương pháp ly trích DNA và điện di tổng số trên mẫu vi khuẩn Pantoea

stewartii 2.1.1 Phương pháp ly trích DNA

Bước 1: Thu cặn khuẩn (1 mL dịch tăng sinh vào tube 1,5 mL) Đem đi ly tâm10.000 vòng/3 phút Loại bỏ dịch nổi (lặp lại 2 lần)

Bước 2: Thêm 400µl STE vào, đem đi vortex Sau đó đem đi ly tâm 10.000vòng/3 phút và đổ bỏ dịch nổi Lặp lại 2 lần

Bước 3: Thêm 400µl Lysis buffer, đem đi vortex và ủ ở 65 độ C trong vòng 1 giờ.Bước 4: Thêm 300µl CI vào và đảo đều Cũng đi ly tâm ở 13.000 vòng/10 phút.Bước 5: Hút 300µl dịch nổi vào tube mới Thêm vào 100 µl Chloroform (1:3) Lytâm 13.000 vòng/18 phút

2.1.2 Vật liệu và phương pháp điện di tổng số trên mẫu vi khuẩn Pantoea

stewartii 2.1.2.1 Vật liệu điện di

Gel Agarose 1%: 25μL; đệm TBE (0,5X); Gel-red 0.6X; Loading dye

2.1.2.2 Phương pháp điện di

Chuẩn bị gel: Gel Agarose 1%: cân 0,35 g agarose trong 35 mL đệm TBE 0,5X

vênh của dụng cụ do nhiệt độ cao Đổ agarose từ từ vào khay gel được cài sẵn lược với độdày gel từ 0,5 đến 1cm Dùng mũi giáo đâm thủng bọt khí nếu có Để nguội 20 - 30 phútđến khi hoàn toàn đông đặc

Chuẩn bị mẫu điện di: Trộn 5 μL mẫu thu được từ phản ứng PCR và 1 μL Gelred0,6X Hút 6 μL hỗn hợp trên bơm vào giếng số 6 Gel agarose gồm ladder, mẫu, đốichứng âm Tiến hành điện di ở 100V trong 25 phút Chụp ảnh và thu kết quả

Chương 3 THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR 16S RNA

3.1 Vật liệu phản ứng PCR 16s RNA

63S: 5μL; DNA mục tiêu: 1μL

3.2 Các bước thực hiện phản ứng PCR 16s RNA

Chuẩn bị gel agarose: Gel Agarose 1%: cân 0,35 g agarose trong 35 mL đệm TBE

cong vênh của dụng cụ do nhiệt độ cao Đổ agarose từ từ vào khay gel được cài sẵn lượcvới độ dày gel từ 0,5 đến 1cm Dùng mũi giáo đâm thủng bọt khí nếu có Để nguội từ 20 -

30 phút đến khi hoàn toàn đông đặc

Chuẩn bị phản ứng PCR: Votex eppendorf chứa DNA có kí hiệu 5 Hút 59 μL H

μL DNA 5 vào eppendorf 3 Cho vào máy luân nhiệt PCR và tiến hành PCR với chươngtrình nhiệt

Bảng 3.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR buổi 3

Chuẩn bị mẫu điện di: Trộn 5 μL mẫu thu được từ phản ứng PCR và 1 μL Gelred0,6X Hút 6 μL hỗn hợp trên bơm vào giếng số 4 Gel agarose gồm ladder, mẫu, đốichứng âm Tiến hành điện di ở 100V trong 25 phút Chụp ảnh và thu kết quả

Hình 2.1 Kết quả điện di tổng số trên mẫu vi khuẩn Pantoea stewartii

3.3 Kết quả phản ứng PCR 16S RNA và thảo luận

Sau khi điện di mẫu cần kiểm tra (5) có band sáng tương đương 214 bp Band mụctiêu 16S khoảng 1500 bp Mẫu cần kiểm tra (5) có band sáng tương đương 1500 bp Đốichứng âm không bị lệch band hay trùng band với các mẫu, chứng tỏ hóa chất và thao táctốt

Hình 3.3 Kết quả chạy PCR 16S

Mẫu 5

Chương 4 SỬ DỤNG CẶP PRIMER TỪ PHÒNG CHẨN

ĐOÁN BỆNH HỌC ĐỂ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN

PANTOEA STEWARTII

4.1 Nội dung thực hiện

Quy trình phát hiện vi khuẩn Pantoea stewartii được thực hiện bằng cách sử dụng

cặp mồi chuyên biệt do phòng thí nghiệm thiết kế

4.2 Vật liệu và phương pháp thực hiện

4.2.1 Vật liệu

Mẫu DNA vi khuẩn Pantoea stewartii được cung cấp bởi phòng RIBE304, thuộc

phòng Chẩn đoán bệnh học – Khoa Khoa học Sinh học và Viện Nghiên cứu Công nghệSinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

● Taq DNA Polymerase: Enzyme chịu nhiệt, giúp tổng hợp sợi DNA mới

● Cặp primer: Bao gồm primer xuôi (Forward Est6) và primer ngược (Reverse ESIG2c)

Các chất hỗ trợ điện di:

● Gel agarose 1%

● DNA gel loading dye

Thiết bị và dụng cụ: Máy PCR, máy vortex, bồn điện di, lò vi sóng, micropipette,

4.2.2 Phương pháp thực hiện

Các bước tiến hành phản ứng PCR:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Lấy mẫu DNA từ vi khuẩn Pantoea stewartii đã được cung cấp Đảm bảo DNA

được bảo quản trong điều kiện lạnh để tránh hư hỏng

Bước 2: Chuẩn bị hỗn hợp Master Mix:

Bước 3: Đặt ống PCR vào máy PCR và thiết lập chu trình nhiệt

Bảng 4.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Bắt cặp 61 30 giây

Hình 4.1 Chuẩn bị phản ứng trên máy luân nhiệt PCR

Sau khi hoàn tất phản ứng PCR, tiến hành kiểm tra kết quả bằng phương phápđiện di trên gel agarose

Các bước tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose

Cân 0,5 g agarose tinh khiết vào một cốc chứa, sau đó thêm 50 mL dung dịchđệm TBE 0,5X và khuấy đều hỗn hợp Đặt cốc vào lò vi sóng, đun sôi và lắc nhẹ cho đến

Bước 2: Chuẩn bị bồn điện di

Khi gel agarose đã đông đặc hoàn toàn, nhẹ nhàng nhấc lược ra khỏi gel để tạogiếng mẫu Tiếp theo, đặt bản gel vào bồn điện di theo chiều đúng, từ cực âm sang cựcdương, để đảm bảo mẫu DNA di chuyển đúng hướng trong quá trình điện di Đổ dungdịch đệm TBE 0,5X vào bồn cho đến khi gel ngập hoàn toàn, tạo môi trường dẫn điện ổnđịnh cho quá trình điện di

Bước 3: Chuẩn bị mẫu

Trộn 0,5 µL loading dye với 1 µL GelRed để tạo hỗn hợp đánh dấu và nhuộmDNA Sau đó, thêm 3 µL sản phẩm PCR vào hỗn hợp và trộn đều Hút toàn bộ hỗn hợp

đã chuẩn bị và nạp vào các giếng trên gel agarose, cẩn thận thao tác để tránh làm trànhoặc làm bẩn các giếng khác

Bước 4: Tiến hành điện di

Đậy nắp bồn điện di cẩn thận và kết nối bồn với bộ nguồn Điều chỉnh hiệu điệnthế ở mức 100 V và tiến hành điện di trong khoảng 30 phút

4.3 Kết quả và thảo luận

Dc (-)

5Ladder