Báo cáo thực hành sắc kí nhóm 1 thứ 4,tiết 7

Thảo luận Hai dung môi hexane và ethanol có độ phân cực khác nhau dẫn đến độ hòa tan của các hợp chất trong mẫu khác nhau.. - Hexane là dung môi không phân cực, ưu tiên hòa tan các hợp c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KĨ THUẬT SẮC KÍ NÂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn: TS Trịnh Thị Phi Ly Sinh viên thực hiện: Nhóm 1-Thứ 4 tiết 7

Thành phố Thủ Đức, ngày 20 tháng 11 năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KĨ THUẬT SẮC KÍ NÂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Lưu Vĩnh Hảo 21126333

Thành phố Thủ Đức, ngày 20 tháng 11 năm 2024

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC HÌNH iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

THÍ NGHIỆM 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1.1 Mục đính thí nghiệm 1

1.2 Vật liệu và phương pháp 1

1.2.1 Vật liệu 1

1.2.2 Phương pháp 1

1.3 Kết quả và thảo luận 2

1.3.1 Kết quả 2

1.3.2 Thảo luận 3

THÍ NGHIỆM 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÝ CỘT 4

2.1 Mục đính thí nghiệm 4

2.2 Vật liệu và phương pháp thực hiện 4

2.2.1 Vật liệu 4

2.2.2 Phương pháp thực hiện 4

2.3 Kết quả và thảo luận 5

2.3.1 Kết quả 5

2.3.2 Thảo luận 6

THÍ NGHIỆM 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT TLC 8

3.1 Mục đích thí nghiệm 8

3.2 Vật liệu và phương pháp 8

3.2.1 Vật liệu 8

3.2.2 Phương pháp 8

3.3 Kết quả và kết luận 9

3.3.1 Kết quả 9

3.3.2 Thảo luận 10

BÀI TẬP 11

4.1 Dựng đồ thị tương quan 11

4.2 Xác định nồng độ hợp chất trong mẫu 1 12

4.2.1 Nồng độ Caffeic acid 12

4.2.2 Nồng độ Chlorogenic acid 12

4.2.3 Nồng độ Protocatechuic acid 12

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cân mẫu 1

Hình 1.2 Bã lọc sau khi sấy 2

Hình 2.1 Cân mẫu lá ngũ sắc xay nhiễm 4

Hình 2.2 Cân silica gel 5

Hình 2.3 Mẫu ở cột sắc ký đang tách và di chuyển xuống 6

Hình 2.4 Mẫu phân tách thành 2 phần riêng 6

Hình 3.1 Kết quả sau khi thực hiện sắc kí lớp mỏng ở lần lượt hai hệ dung môi 9

Hình 4.1 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích của chất chuẩn Caffeic acid 11

Hình 4.2 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích của chất chuẩn Chlorogenic acid. 11

Hình 4.3 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích của chất chuẩn Protocatechuic acid 12

DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả khoảng cách di chuyển của các chất trong hệ dung môi khác nhau.9 Bảng 3.2 Hệ số Rf của các chất ở hai hệ dung môi 9

THÍ NGHIỆM 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG NGUYÊN LIỆU BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

1.1 Mục đính thí nghiệm

Đánh giá ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng chất chiết thô

1.2 Vật liệu và phương pháp

1.2.1 Vật liệu

Mẫu bột cà phê

Dụng cụ và thiết bị: cân kỹ thuật, bình erlen, pipet pasteur, cốc thuỷ tinh, máy siêu

âm (50-60 Hz, 465W), giấy lọc, phễu thủy tinh, chén độ ẩm, bình hút ẩm, tủ sấy (105℃)

Dung môi: hexane, ethanol

1.2.2 Phương pháp

Hình 1.1 Cân mẫu.

Bước 1: Cân 1g nguyên liệu vào hai bình erlen sau đó cho 15 mL dung môi

(hexane, ethanol) vào mỗi bình Đánh siêu âm(tần số 50/60 Hz) ở nhiệt độ phòng trong 15 phút và lọc qua giấy lọc

Bước 2: Thêm tiếp 15 mL dung môi vào bã của mỗi bình và chiết tiếp lần 2

Bước 3: Lọc hết bã trong bình qua giấy lọc

Bước 4: Sấy khô cả bã và giấy lọc trong tủ sấy

Bước 5: Cân lượng bã còn lại

Xác định hàm lượng chất chiết thô bằng phương pháp độ ẩm:

H %=m 1 −m 2

m 1 ×W % ×100.

Trong đó: m1: khối lượng nguyên liệu khô ban đầu (g)

m2: khối lượng bả khô trên giấy lọc (g)

W%: độ ẩm của nguyên liệu

1.3 Kết quả và thảo luận

1.3.1 Kết quả

Thu được 2 mẫu dịch chiết có màu, độ trong khác nhau và bã lọc sau khi lọc Khối lượng bã cân được sau khi sấy khô ở hai loại dung môi ethanol và hexan lần lượt

1.5954g và 1.6864g

Khối lượng bột lá cà phê sau khi sấy là 21.3216g và 20.3410g

Hình 1.2 Bã lọc sau khi sấy.

Độ ẩm của bột lá cà phê:

Chén 1:

W %=w 1 −w 2

m ×100=21.4824−21.3216

2.0203 ×100=7.96 % Chén 2:

W %=w 1 −w 2

m ×100=20.5136−20.3410

Hàm lượng chất chiết khô:

- Dung môi Ethanol:

H %=m 1 −m 2

m 1 ×100

¿(100 %−7 ,96 %) x 1.006−(1,5654−0.784 )

-Dung môi hexan:

H %=m 1 −m 2

m 1 ×100

¿(100 %−8 ,62%) x 1.004−(1.6864−0.7759)

1.3.2 Thảo luận

Hai dung môi hexane và ethanol có độ phân cực khác nhau dẫn đến độ hòa tan của các hợp chất trong mẫu khác nhau

- Hexane là dung môi không phân cực, ưu tiên hòa tan các hợp chất không phân cực hoặc ít phân cực như lipid,, các hợp chất hữu cơ không có nhóm chức phân cực, dịch chiết thường chứa các hợp chất kỵ nước hơn (lipid, dầu thực vật, một số sắc

tố kỵ nước như beta-carotene)

- Ethanol là dung môi phân cực trung bình, có thể hòa tan cả hợp chất phân cực lẫn một phần hợp chất không phân cực, dịch chiết thường chứa nhiều hợp chất ưa nước hơn (polyphenol, flavonoid, tannin, một số alkaloid và đường)

THÍ NGHIỆM 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KĨ

THUẬT SẮC KÝ CỘT 2.1 Mục đính thí nghiệm

Đánh giá khả năng phân tách các sắc tố thực vật

2.2 Vật liệu và phương pháp thực hiện

2.2.1 Vật liệu

Nguyên liệu: lá ngũ sắc xay nhuyễn

Hóa chất và thiết bị: Hexan, acenton, máy lắc siêu âm (50-60 Hz, 465W), cân điện

tử, giấy lọc, pipet Pasteur, pipet, micropipet, cốc đựng, bình định mức, bình tam giác, ống nghiệm, bông nhồi cột sắc ký

2.2.2 Phương pháp thực hiện

Chuẩn bị dịch chiết sắc tố:

Cân 1g lá ngũ sắc xay nhuyễn cho vào bình chứa tam giác

Hình 2.1 Cân mẫu lá ngũ sắc xay nhiễm.

Pha 10ml dung môi hexane: aceton(tỉ lệ 8:2), cho dung dịch và bình chứa có 1g lá ngũ sắc

Đem dung dịch cho và máy chiết bằng siêu âm trong 5 phút

Lọc dung dịch qua giấy lọc để lấy dịch chiết cho vào ống nghiệm

Chuẩn bị cột:

Cân 0,5g silica gel (có kích thước hạt 70~230 Mesh) vào cốc thủy tinh khô, thêm vào 5ml hexan ngâm trong 5-10 phút

Hình 2.2 Cân silica gel

Sử dụng pipet Pasteur làm cột, nhét 1 lớp bông dưới đáy pipet cho 1 ít hexan vào để làm ướt bông

Dùng pipet hút hỗn hợp được cho vào pipet Pasteur, gõ nhẹ để không khí không bị giữ lại khi silica gel lắng xuống và toàn bộ silica gel dính trên thành cột sẽ rơi xuống

Đưa mẫu vào cột

Khi pha động cách bề mặt pha tĩnh 1mm, thêm khoảng 1mL hỗn hợp sắc tố vào cột dọc theo thành, tránh xao động bề mặt pha tĩnh

Tiếp tục cho pha động là n-hexane qua cột, tránh để cột khô

Rửa giải:

Pha dung môi phân cực hơn là 70%n-hexan + 30% aceton để rủa giải

Nhóm carotenoid màu vàng cam được rửa giải trước, thu vào ống nghiệm.

Sử dụng dung môi để rửa giải diệp lục tố

Tiến hành rửa 2 lần để các hợp chất ra khỏi cột

2.3 Kết quả và thảo luận

2.3.1 Kết quả

Hình 2.3 Mẫu ở cột sắc ký đang tách và di chuyển xuống.

Quan sát pipet Pasteur thấy hỗn hợp dung dịch sẽ phân thành hai lớp, lớp dưới có màu vàng cam là màu của sắc tố carotenoid, lớp trên có màu xanh lục là màu của diệp lục Sau khi rửa giải, sắc tố carotenoid sẽ ra khỏi cột trước tiên, sau đó là dung dịch màu xanh diệp lục chlorophill

Hình 2.4 Mẫu phân tách thành 2 phần riêng.

Những sắc tố này đã di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau, tạo thành các dải màu riêng biệt Các sắc tố carotenoid màu vàng cam di chuyển nhanh và tách ra trước Chlorophyll a và b (diệp lục a và b) di chuyển chậm hơn, xuất hiện với màu xanh lá cây đặc trưng và tách ra ở vị trí sau carotenoids

2.3.2 Thảo luận

Các hạt silica gel ( pha tĩnh) có tính phân cực mạnh dùng làm chất hấp thụ, vì thế mà các hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ bám vào silica gel và ngƣợc lại những hợp chất kém phân cực sẽ đi ngang qua cột nhanh hơn những hợp chất phân cực

Sắc tố không phân cực carotenoids là các sắc tố không phân cực và ít tương tác với pha tĩnh silica gel , vì vậy chúng di chuyển nhanh qua cột Sắc tố phân cực các sắc tố như diệp lục (chlorophylls a, b) có tính phân cực cao, do đó chúng sẽ tương tác mạnh mẽ với pha tĩnh Khi sử dụng dung môi phân cực chúng sẽ di chuyển chậm hơn và xuất hiện ở phần cuối cột Silica gel là chất mang phân cực, do đó các sắc tố phân cực sẽ tương tác mạnh mẽ với silica gel, làm chậm tốc độ di chuyển của chúng qua cột, dẫn đến việc tách các sắc tố phân cực chlorophylls a,b diễn ra chậm và tách ra sau khi sử dụng dung môi phân cực

Ngoài ra nguyên liệu còn có các chất:Anthocyanin là nhóm sắc tố màu đỏ, tím và xanh dương Betalains là nhóm sắc tố màu đỏ và vàng Flavonoid là một nhóm sắc tố thực vật phổ biến có màu vàng, đỏ và xanh

THÍ NGHIỆM 3 PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ

THUẬT TLC 3.1 Mục đích thí nghiệm

Đánh giá khả năng phân tách và khả năng phân cực của các sắc tố của cây Ngũ Sắc trong dung môi ly giải khác nhau bằng pp sắc kí bảng mỏng

3.2 Vật liệu và phương pháp

3.2.1 Vật liệu

Mẫu bột cây ngũ sắc (Ageratum conyzoides) được xử lý và đồng nhất tại phòng thí nghiệm

Dụng cụ và thiết bị

● Cốc thủy tinh

● Ống đong

● Đầu tip micropipette

● Bảng mỏng sắc kí tráng silica gel f254

Hóa chất: Hexan, acetone

3.2.2 Phương pháp

Dịch chiết ở thí nghiệm 3 được sử dụng cho thí nghiệm 4

Bước 1: Thực hiện chuẩn bị bảng mỏng, dùng bút chì kẻ vạch đánh dấu xuất phát cách đáy bảng 0,5 cm, đánh dấu điểm xuất phát cách đều nhau và cách đều hai bên bảng

Bước 2: Chuẩn bị dung môi ly giải, hai loại dung môi ly giải được sử dụng là Hexane, acetone theo tỉ lệ lần lượt là 7:3 và 6:4 cho vào các cốc thủy tinh khác nhau

Bước 3: Sử dụng đầu tip chấm dịch chiết cho lên điểm xuất phát để khô tự nhiên cho mỗi lần chấm, chấm ba đến bốn lần, để khô tự nhiên Đặt bảng mỏng đã chấm vào các bình ly giải đã chuẩn bị, lưu ý mực dung môi trong bình ly giải không vượt quá vạch chấm dịch chiết ban đầu cách khoảng 5mm Khi dung môi không chạy trên bảng mỏng

nữa lấy bảng mỏng ra khỏi bình ly giải gạch ngang vạch dung môi, đo chiều dài đường đi của từng chất, tính toán hệ số di chuyển

Công thức tính hệ số di chuyển Rf

R f= l

lo

Trong đó :

Rf: hệ số di chuyển

l: khoảng cách di chuyển của chất tan (mm)

l0: khoảng cách di chuyển của dung môi (mm)

3.3 Kết quả và kết luận

3.3.1 Kết quả

Kết quả sau khi tiến hành sắc kí bảng mỏng thể hiện ở hình 4.1

Hình 3.1 Kết quả sau khi thực hiện sắc kí lớp mỏng ở lần lượt hai hệ dung môi.

A) Kết quả sắc kí ở hệ dung môi tỉ lệ 7:3; B) Kết quả sắc kí ở hệ dung môi 6:4

Bảng 3.1 Kết quả khoảng cách di chuyển của các chất trong hệ dung môi khác nhau.

Hexane: Acetone

7:3

Hexane: Acetone

6:4

B A

Chlorophyll b 18 22.5

Trong đó Carotene có khoảng cách di chuyển xa nhất so với hai chất là

Chlorophyll a và Chlorophyll b Hệ dung môi tỉ lệ (6:4) phân tách các hợp chất tốt hơn so với hệ dung môi (7:3) rõ nhất là Chlorophyll a và Chlorophyll b ở hệ dung môi (7:3) tách nhau rõ ràng hơn Hệ số di chuyển của các chất Carotene, Chlorophyll a, Chlorophyll b được thể hiện ở bảng 4.2

Bảng 3.2 Hệ số Rf của các chất ở hai hệ dung môi

Hexane: Acetone

7:3

Hexane: Acetone

6:4

3.3.2 Thảo luận

Từ kết quả hệ số Rf cho thấy độ phân cực của các chất theo tính phân cực tĩnh là Chlorophyll b và Chlorophyll a, còn Carotene kém phân cực yếu với pha tĩnh Thứ tự độ phân cực có thể đƣợc xếp theo chiều tăng dần độ phân cực Carotene < Chlorophyll a < Chlorophyll b Cả hai hệ dung môi Chlorophyll b đều có hệ số nhỏ hơn so với các chất còn lại lần lượt là 0,4 ở hệ dung môi (7:3) và 0,72 ở hệ dung môi (6:4) có thể kết luận rằng Chlorophyll b phân cực nhất trong ba chất phân tách từ dịch chiết cây ngũ sắc

BÀI TẬP 4.1 Dựng đồ thị tương quan

Để xác định nồng các chất cần dựa vào diện tích của chất chuẩn ở nồng độ đã biết Dựa vào diện tích và nồng độ của chất chuẩn, dựng đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích chất chuẩn, từ đó suy ra phương trình

Hình 4.1 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích của chất chuẩn Caffeic acid.

0 200 400 600 800 1,000 1,200

f(x) = 20.0077171957672 x − 9.70922751322757

Nồng độ (mg/l)

Hình 4.2 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích của chất chuẩn Chlorogenic acid.

Từ đồ thị tương quan (Hình 4.2) rút ra phương trình: y = 20.008x - 9.7092 Trong

đó y: diện tích peak, x: nồng độ chất chuẩn

0 50 100 150 200 250 300 350

400

f(x) = 14.3718240362812 x − 2.29179637188207

Nồng độ (mg/l)

Hình 4.3 Đồ thị tương quan giữa nồng độ và diện tích của chất chuẩn Protocatechuic

acid

Từ đồ thị tương quan (Hình 4.3) rút ra phương trình: y = 14.372x - 2.2918 Trong

đó y: diện tích peak, x: nồng độ chất chuẩn

4.2 Xác định nồng độ hợp chất trong mẫu 1

4.2.1 Nồng độ Caffeic acid

Dựa vào phương trình y = 21.456x - 4.1538, với diện tích peak của chất caffeic acid trong mẫu 1 nồng độ Caffeic acid: 22.4415 = 21.456x - 4.1538 → x = 1.2395

Vậy nồng độ Caffeic acid ở mẫu 1 là: 1.2395 (mg/l)

4.2.2 Nồng độ Chlorogenic acid

Dựa vào phương trình y = 20.008x - 9.7092, với diện tích peak của chất

Chlorogenic acid trong mẫu 1, nồng độ Chlorogenic acid: 296.2346 = 20.008x - 9.7092→

x = 15.291

Vậy nồng độ Chlorogenic acid ở mẫu 1 là: 15.291 (mg/l)

4.2.3 Nồng độ Protocatechuic acid

Dựa vào phương trình y = 14.372x - 2.2918, với diện tích peak của chất

Protocatechuic acid trong mẫu 1, nồng độ Protocatechuic acid: 36.3344 = 14.372x - 2.2918→ x = 2.6876

Vậy nồng độ Protocatechuic acid ở mẫu 1 là: 2.6876 (mg/l)