Báo cáo thực hành kỹ thuật sắc ký nhóm 5 thứ 4 ca 3

LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG CỎ NGŨ SẮC BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU .... Hầu hết các thành phần này đều có tác dụng trong y dược, chính vì điều đó việc chiết suất cỏ ngũ sắc ngày càng đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

KỸ THUẬT SẮC KÝ

ĐÁNH GIÁ % THAM GIA

Bảng đánh giá % tham gia công việc của các thành viên trong nhóm

Họ và tên

Mã số

Mức độ hoàn thành (%)

Bài 2); Viết báo cáo Bài 2

100

Bài 2); Viết tổng quan giới thiệu Bài 1 và 2

100

Bài 2); Viết báo cáo Bài 2

100

Bài 2 ); Viết báo cáo Bài 1; Tổng hợp, chỉnh sửa báo cáo tổng kết của nhóm

100

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phân hóa học của lá, thân, rễ, hoa của cây Ageratum conyzoides 2

Bảng 3.1 Khối lượng trước và sau sấy của bột cỏ ngũ sắc 8

Bảng 3.2 Số liệu thu được sau khi cân 9

Bảng 3.3 Hiệu suất chiết cao của dung môi Ethanol và Ethyl Acetate 9

Bảng 3.4 Hệ số Rf của các sắc tố trong hai hệ dung môi aceton: hexan 18

Bảng 3.5 Nồng dộ một số hợp chất có trong chất chuẩn hỗn hợp đã phân tích bằng kĩ thuật sắc ký lỏng pha đảo – cột C18 20

Bảng 3.6 Nồng dộ 1 số hợp chất có trong chiết suất quả cafe đã phân tích bằng kĩ thuật sắc ký lỏng pha đảo – cột C18 22

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Ageratum conyzoides 1

Hình 1.2 Công thức hóa học của Ethanol 4

Hình 1.3 Công thức hóa học của Ethyl Acetate 5

Hình 1.4 Công thức hóa học của Hexan 11

Hình 1.5 Công thức hóa học của Acetone 12

Hình 2.1 Mô phỏng đánh dấu trên sắc ký bản mỏng 16

Hình 3.1 Kết quả phân tách sắc tố 17

Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng không chiếu đèn huỳnh quang và chiếu đèn 18

Hình 3.5 Đồ thị đường chuẩn của Protocatechuic acid 20

Hình 3.6 Đồ thị đường chuẩn của Chlorogenic acid 21

Hình 3.7 Đồ thị đường chuẩn của Caffeic acid 21

MỤC LỤC

ĐÁNH GIÁ % THAM GIA i

DANH SÁCH CÁC BẢNG ii

DANH SÁCH CÁC HÌNH iii

MỤC LỤC iv

BÀI 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG CỎ NGŨ SẮC BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU 1

1 Giới thiệu 1

1.1.1 Cây ngũ sắc 1

1.1.2 Đặc điểm cỏ ngũ sắc 1

1.1.3 Thành phần hóa học 1

1.1.4 Ứng dụng của Ageratum conyzoides 3

1.1.5 Ethanol (C 2 H 5 OH) 3

1.1.5.1 Lợi ích và hạn chế của Ethanol trong chiết xuất 4

1.1.5.2 Ứng dụng 5

1.1.6 Ethyl Acetate 5

1.1.6.1 Lợi ích và hạn chế của Ethyl Acetate trong chiết xuất 5

1.1.6.2 Ứng dụng 6

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 6

1.3 Nội dung thực hiện 6

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 6

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 6

2.2 Vật liệu nghiên cứu 6

2.3 Phương pháp nghiên cứu 7

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 7

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 7

3 Kết quả và thảo luận 8

3.1 Độ ẩm của nguyên liệu 8

3.2 Hàm lượng chất chiết thô 8

4 Kết luận và đề nghị 9

4.1 Kết luận 9

4.2 Đề nghị 10

BÀI 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT VÀ KỸ THUẬT TLC 11

1 Giới thiệu 11

1.1.1 Henxan 11

1.1.2 Lợi ích và hạn chế của Hexan trong chiết xuất 11

1.1.3 Ứng dụng của Hexan 12

1.1.4 Acetone 12

1.1.5 Lợi ích và hạn chế của Acetone trong chiết xuất 12

1.1.6 Ứng dụng của Acetone 13

1.1.7 Sử dụng kết hợp Hexan và Acetone 13

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 13

1.3 Nội dung thực hiện 13

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 14

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 14

2.2 Vật liệu nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật sắc ký cột 14

2.3.2 Phân tách sắc tố thực vật bằng kỹ thuật TLC (Thin Layer Chromatography) 15

3 Kết quả và thảo luận 17

3.1 Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật sắc ký cột 17

3.2 Phân tách sắc tố thực vật bằng kĩ thuật TLC 18

4 Kết luận và đề nghị 19

4.1 Kết luận 19

4.2 Đề nghị 19

BÀI TẬP 20

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

BÀI 1 LY TRÍCH CHẤT CHIẾT THÔ TRONG CỎ NGŨ SẮC

BẰNG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU

1 Giới thiệu

1.1.1 Cây ngũ sắc

Cây ngũ sắc hay được gọi là cây Cứt lợn (Ageratum conyzoides) là loại cây thân thảo có lịch sử lâu đời về mặt y học truyền thống ở nhiều quốc gia trên thế giới Loại cỏ này được viết đến từ thời xa vì đặc tính chữa bệnh và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau

(Credit: Forest and Kim Starr)

Ageratum conyzoides có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, loài này phân bố rộng rãi ở các vùng nóng và ẩm trên thế giới như Đông Nam Á, Tây Phi, châu Mỹ (Okunade, 2001)

Hoa: Cụm hoa bao gồm 30 – 50 hoa màu trắng đến tím

Quả: Quả bế màu đen, quả nhỏ có 1 hạt bên trong được phát tán nhờ gió

1.1.3 Thành phần hóa học

Các thành phần hóa học có trong cỏ ngũ sắc được trình bày cụ thể ở Bảng 1.1 Cỏ ngũ sắc chứa nhiều Alkaoids, Flavonoids và Tannins Hầu hết các thành phần này đều có tác dụng trong y dược, chính vì điều đó việc chiết suất cỏ ngũ sắc ngày càng được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn

Bảng 1.1 Thành phân hóa học của lá, thân, rễ, hoa của cây Ageratum conyzoides

++

- +

-

-

-

+ + +

và giãn mạch, bên cạnh đó còn có khả năng dọn sạch các gốc hydroxyl, anion siêu oxit và các gốc peroxy lipid (Alan và ctv, 1996; Okwu và ctv, 2004) Hoạt động kháng khuẩn của

lá Ageratum conyzoides có thể là do sự hiện diện dồi dào của ancaloit và flavonoid Các thành phần flavonoid khác như aurone, chalcone, flavonoid, flavone, flavonol và leucoanthocyanin được phát hiện trong các bộ phận được nghiên cứu của Ageratum conyzoides trong nghiên cứu hiện tại có thể đã hỗ trợ hoạt động kháng khuẩn của cây Tanin

có đặc tính làm se, đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương và niêm mạc bị viêm (Okwu

và ctv, 2004) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng saponin mặc dù không độc hại, nhưng có thể tạo ra phản ứng sinh lý bất lợi ở động vật tiêu thụ, saponin biểu hiện tác dụng gây độc tế

bào và ức chế sự phát triển của nhiều loại tế bào khiến chúng có đặc tính chống viêm và chống ung thư (Iwu và ctv, 1989) Sự hiện diện của tannin và saponin trong nghiên cứu hiện tại có thể là do sử dụng Ageratum conyzoides để điều trị vết thương, ngăn ngừa mất máu, v.v (Iwu và ctv, 1993; Onwuka và ctv, 2005) lưu ý rằng kiến thức về hàm lượng glycosides và HCN trong cây rất quan trọng do tác động bất lợi của chúng lên chuỗi hô hấp nhưng điều này không gây ra vấn đề gì vì cả hai hợp chất đều thấp trong các mẫu được nghiên cứu trong nghiên cứu này Các hợp chất steroid rất quan trọng trong dược phẩm do mối quan hệ của chúng với hormone sinh dục (Okwu và ctv, 2001) Sự hiện diện của phenol trong các mẫu được nghiên cứu cho thấy cây Ageratum conyzoides có thể được sử dụng như một tác nhân chống vi khuẩn Resins có hiệu quả chống lại sự mài mòn da, coumarin đóng vai trò quan trọng như chất chống đông máu, terpen chống lại bệnh sốt rét và ung thư (Obidoa và ctv, 2010; Evan và ctv, 1995) trong khi chromone và cardenolide cũng được tìm thấy trong các bộ phận được nghiên cứu của Ageratum conyzoides là các hóa chất thực vật quan trọng và có thể đã bổ sung vào giá trị dược liệu của cây (Ben và ctv, 2012) 1.1.4 Ứng dụng của Ageratum conyzoides

Hình 1.2 Công thức hóa học của Ethanol Ethanol là một dung môi lưỡng cực (chứa nhóm hydroxyl (-OH) và phần hydrocarbon (-CH3)), có thể hòa tan cả hợp chất phân cực (Alkaloid, Flavonoid, Phenol, )

và không phân cực (Tinh dầu, Lipid, ) Có thể điều chỉnh độ phân cực để chiết xuất hợp chất khác nhau bằng cách pha loãng Ethanol với nước

Ethanol có nhiệt độ sôi thấp (~78.37oC) nên rất dễ bay hơi giúp Ethanol dễ dàng được loại bỏ sau khi chiết xuất mà không để lại dư lượng lớn trong sản phẩm

Tính kháng khuẩn giúp hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình chiết xuất

1.1.5.1 Lợi ích và hạn chế của Ethanol trong chiết xuất

Dùng Ethanol làm dung môi trong chiết xuất có thể mang lại hiệu quả cao vì Ethanol

có thể chiết xuất nhiều loại hợp chất khác nhau trong cùng một quy trình Bên cạnh đó, Ethanol còn có giá thành hợp lý, dễ sản xuất và sử dụng ở quy mô lớn Điều đặc biệt hơn

là Ethanol phân hủy sinh học tốt hơn các loại dung môi hữu cơ khác, giảm tác động đến môi trường Từ đó mang lại một giá trị bền vững thân thiện với môi trường

Trong quá trình thí nghiệm cần lưu ý các hạn chế của loại dung môi này Ethanol rất dễ cháy vì vậy cần tuân thủ các biện pháp an toàn khi sử dụng Ethanol trong chiết xuất Hàm lượng nước trong Ethanol cũng đáng quan tâm vì nếu nước trong Ethanol quá cao có thể hòa tan cả tạp chất ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm Và một số Nếu nước trong Ethanol quá cao có thể hòa tan cả tạp chất ảnh hưởng đến độ tinh khiết của sản phẩm

vì các tương tác không mong muốn

Nhiệt độ sôi của Ethyl Acetate khá thấp (~77oC) giúp dễ dàng bay hơi và loại bỏ sau quá trình chiết xuất mà không làm hỏng các hợp chất nhạy cảm với nhiệt

Ethyl Acetate ổn định và không dễ bị phân hủy trong điều kiện chiết xuất thông thường đảm bảo hiệu suất thu hồi cao

1.1.6.1 Lợi ích và hạn chế của Ethyl Acetate trong chiết xuất

Khả năng hòa tan và chọn lọc của dung môi Ethyl Acetate rất tốt, giúp giảm tạp chất

và nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm Sau khi chiết xuất dung môi dễ dàng được loại bỏ bằng nhiệt độ sôi thấp giúp dễ cô đặc hoặc tách dung môi mà không ảnh hưởng đến sản

phẩm Tính kinh tế của loại dung môi này tương đối tốt vì chi phí thấp, dễ sản xuất và sử dụng trong quy mô công nghiệp Ngoài ra, Ethyl Acetate dễ phân hủy sinh học giảm nguy

cơ ô nhiễm môi trường

Điều cần lưu ý là Ethyl Acetate dễ cháy nên cần tuân thủ các biện pháp an toàn khi

sử dụng Khi sử dụng cần có bảo hộ đầy đủ và hạn chế tiếp xúc trực tiếp vì nó có độc tính nhẹ Nếu yêu cầu độ phân cực cao hơn thì cần chọn dung môi phù hợp do Ethyl Acetatehòa tan hạn chế với nước

1.1.6.2 Ứng dụng

Ngành dược liệu: Chiết xuất các hợp chất sinh học từ thực vật

Ngành thực phẩm: Chiết xuất các hương liệu tự nhiên

Ngành mỹ phẩm: Chiết xuất tinh dầu và các hoạt chất tính từ thảo dược dùng trong

mỹ phẩm

Ngành công nghiệp: Sử dụng trong chiết xuất các chất phụ gia, sản xuất sơn, mực

in, các sản phẩm công nghiệp khác

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết cao (hàm lượng chất chiết thô)

1.3 Nội dung thực hiện

Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm của nguyên liệu (cỏ ngũ sắc)

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của hai loại dung môi đến hàm lượng chất chiết thô

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu

Thời gian: Từ ngày 06/11/2024 đến ngày 07/11/2024

Địa điểm: RIBE 306 – Viện nghiên cứu công nghệ Sinh học và Môi trường

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu: Bột Cỏ ngũ sắc (lá ngũ sắc) với kích thước nhỏ hơn 1 mm

Hóa chất: Dung môi Ethanol và Ethyl acetate

Thiết bị và dụng cụ: Máy siêu âm, máy sấy, cân kỹ thuật, erlen, cốc, bình định mức, chén sấy, bình hút ẩm, giấy lọc được trang bị tại phòng thí nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi (Ethanol và Ethyl acetate) dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1

Để xác định được độ ẩm của nguyên liệu cần tiến hành theo quy trình như sau: Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu

Cân 2 gram bột cỏ ngũ sắc (có kích thước nhỏ hơn 1mm) cho vào chén sấy, đồng thời cân khối lượng chén sấy và ghi nhận lại số liệu

Bước 2: Sấy ở nhiệt độ 105o C cho đến khi cân 2 lần liên tiếp không có sự thay đổi của khối lượng thì dừng lại Sau đó, để nguội chén sấy có chứa bột cỏ ngũ sắc đã sấy khô trong bình hút ẩm

Bước 3: Cân khối lượng chất khô thu được và áp dụng công thức sau để tính phần trăm nước (xác định độ ầm) có trong nguyên liệu

Trong đó:

%W: % nước có trong nguyên liệu mo: khối lượng nguyên liệu (g) m1: khối lượng của chén sấy (g) m2: tổng khối lượng nguyên liệu sau khi sấy khô và chén sấy (g) Bước 4: Dựa vào %W thu được để tính khối lượng chất khô

Thí nghiệm được thực hiện với 2 lần lặp lại

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2

Để xác định được hiệu suất chiết của hai loại dung môi (Ethanol và Ethyl acetate)

ta thực hiện theo quy trình sau tương tự cho cả 2 loại dung môi

Bước 1: Cân 1 gram bột cỏ ngũ sắc vào erlen, thêm dung môi vào với tỷ lệ 1 : 15 (bột nguyên liệu : dung môi), đồng thời cân giấy lọc

Bước 2: Cho erlen (đã chứa hỗn hợp dung dịch) vào máy siêu âm với thông số 300W – 40 kHz trong 15 phút cho lần chiết đầu tiên

Bước 3: Lọc dịch lỏng qua giấy lọc, phần rắn còn lại tiếp tục cho vào 15 ml dung môi để chiết lần 2 (tương tự lần 1: 300W – 40 kHz trong 15 phút)

Bước 4: Lọc hết bã trong bình erlen qua giấy lọc Thu phần bã mang sấy trong tủ sấy với

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Độ ẩm của nguyên liệu

Sau khi sấy khô và tiến hành cân thu được kết quả trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Khối lượng trước và sau sấy của bột cỏ ngũ sắc

Khối lượng nguyên liệu khô (bột cỏ ngũ sắc khô) – dựa vào độ ẩm nguyên liệu (10,12 %) ta có:

Khối lượng nguyên liệu khô chiết xuất với dung môi Ethanol là:

m = 1,0019  mo = 1,0019 * 89,88 % = 0,9005 (g) Khối lượng nguyên liệu khô chiết xuất với dung môi Ethyl Acetate là:

m = 1,0001  mo = 1,0001 * 89,88 % = 0,8989 (g) Kết quả cân bã khô và giấy lọc đã sấy được trình bày ở Bảng 3.2

Bảng 3.2 Số liệu thu được sau khi cân

Ghi chú: mo: khối lượng nguyên liệu khô (bột cỏ ngũ sắc) ban đầu (g); m1: khối lượng bả khô còn lại trên giấy lọc (g)

Hàm lượng chất chiết thô của lần lượt 2 loại dung môi:

Áp dụng công thức tính hàm lượng chiết thô cho số liệu của 2 loại dung môi thu được kết quả như Bảng 3.3

Bảng 3.3 Hiệu suất chiết cao của dung môi Ethanol và Ethyl Acetate

(i) Theo nghiên cứu của Diwan (2018) , cỏ ngũ sắc chứa nhiều flavonoid có cấu trúc polyphenolic (có nhiều nhóm OH) và trong cỏ ngũ sắc có các loại sắc tố phân cực như chlorophyl a và b

(ii) Độ phân cực của ethanol (5,2) cao hơn so với ethyl acetate (4,4)

Từ hai yếu tố trên có thể thấy được rằng, dung môi Ethanol là một loại dung môi phân cực nên khi dùng để chiết suất cỏ ngũ sắc (có thành phần phân cực) thì hiệu suất sẽ cao hơn khi dùng dung môi Ethyl Acetate

Tuy nhiên, tùy theo mục đích chiết suất, các thành phần hóa học mong muốn hoặc phân đoạn có hoạt tính tốt nhất cần lựa chọn loại dung môi phù hợp, không nhất thiết phải chọn loại dung môi có hiệu suất chiết thô cao nhất

4 Kết luận và đề nghị

4.1 Kết luận

Độ ẩm và kích thước phù hợp thì quá trình chiết suất diễn ra thuận lợi hơn

Dung môi có độ phân cực khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết cao Hiệu suất chiết cao của dung môi Ethanol cao hơn Ethyl Acetate

4.2 Đề nghị

Nên thực hiện thí nghiệm với 3 lần lặp lại để kết quả mang tính chính xác hơn Dựa vào mục đích nghiên cứu để chọn loại dung môi phù hợp với vật liệu

BÀI 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ THỰC VẬT BẰNG KỸ THUẬT

SẮC KÝ CỘT VÀ KỸ THUẬT TLC

1 Giới thiệu

1.1.1 Henxan

Hexan (C6H14) là một hydrocacbon no trong dãy đồng đẳng của Alkane

Hình 1.4 Công thức hóa học của Hexan Hexan là dung môi không phân cực chỉ hòa tan được các hợp chất không phân cực (Tinh dầu, Lipid, ) Nhiệt độ sôi thấp (~68oC) giúp hexan dễ dàng được tách ra khỏi dầu sau khi chiết xuất thông qua sự bay hơi Hexan có khả năng thẩm thấu tốt vào các hạt hoặc nguyên liệu giúp hòa tan và chiết xuất tối đa dầu từ nguyên liệu

Các isomer của Hexan

Hexan có 5 đồng phân cấu trúc:

1.1.2 Lợi ích và hạn chế của Hexan trong chiết xuất

Chi phí thấp, dễ sản xuất ở quy mô công nghiệp Hexan có thể được tái chế và sử dụng lại trong chiết xuất nên giảm được chi phí vận hành Hexan có tính an toàn với thực phẩm vì được loại bỏ gần như hoàn toàn khỏi dầu bằng cách bay hơi Dư lượng của Hexan trong sản phẩm cuối cùng rất thấp và nằm trong giới hạn an toàn Bên cạnh đó, Hexan cũng phù hợp với các thiết bị chiết xuất công nghiệp giúp đảm bảo hiệu quả cao trong chiết xuất

Tuy nhiên, Hexan là chất hóa học dễ bay hơi và có độc tính tiềm tàng Khi tiếp xúc lâu dài với hơi Hexan có thể gây tổn thương thần kinh ở người Cần lưu ý các vấn đề cháy