Bài giảng thực hành nuôi cấy mô tbtv

CƠ SỞ CỦA VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân t

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

******

BÀI GIẢNG THỰC HÀNH NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

Tháng 04 năm 2021

LỜI MỞ ĐẦU

Từ rất lâu, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp Từ cách gieo hạt đến cách lấy trực tiếp nhánh cây để trồng được gọi là giâm cành, hoặc chiết cành trực tiếp từ cây mẹ Một phương pháp nhân giống khác đó là ghép cành với những gốc ghép và mắt ghép của cây khác cây mẹ, phương pháp này hiện đang được ứng dụng rộng rãi với những ưu điểm nhất định và qua đó có thể nhân giống cây lên hàng loạt mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn Bên cạnh đó để đáp ứng nhu cầu cây giống cũng như chất lượng con giống thì một giải pháp được đặt ra là ứng dụng công nghệ hiện đại vào nhân giống cây trồng đó là công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ này đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành sản xuất nông nghiệp Cùng một lúc phương pháp này tạo ra hàng vạn cây trồng mới, nhanh chóng mà không nhất thiết phải là từ các hạt của cây mà

có thể lấy từ bất kỳ mô bào nào, trừ những mô tế bào đã hóa gỗ Tuy nhiên, nền công nghệ này đòi hỏi khá tốn kém, sự kiên nhẫn và khéo léo

MỤC LỤC

Nội dung Trang

Lời mở đầu 2

Mục lục 3

Phần 1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 4

Chương I CƠ SỞ CỦA VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 4

1.1 Tính toàn năng của tế bào 4

1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào 4

1.3 Môi trường dinh dưỡng 4

Chương II NHÂN GIỐNG in vitro 5

2.1 Ý nghĩa của nhân giống in vitro 5

2.2 Các phương thức nhân giống in vitro 5

2.3 Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro 5

2.3.1 Giai đoạn 1 – Cấy khởi đầu 6

2.3.2 Giai đoạn 2 – Nhân nhanh 6

2.3.3 Giai đoạn 3 – Tạo rễ 7

2.3.4 Giai đoạn 4 – Đưa cây ra ngoài đất 7

2.4 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy 7

2.5 Đảm bảo điều kiện vô trùng 8

2.6 Chọn và xử lý mô cấy 9

Phần 2 THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 10

Bài 1 GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ VÀ CÁCH SỬ DỤNG 11

1.1 Phòng chuẩn bị môi trường nuôi cấy 12

1.2 Khu vực rửa dụng cụ 1

1.3 Phòng khử trùng 13

1.4 Phòng cấy 13

1.5 Phòng tăng trưởng 14

Bài 2 CHUẨN BỊ DUNG DỊCH GỐC (DUNG DỊCH STOCK) 15

2.1 Giới thiệu 15

2.2 Vật liệu – Trang thiết bị 15

2.3 Phương pháp tiến hành 15

2.3.1 Pha stock môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) 15

2.3.2 Pha stock các chất điều hòa sinh trưởng 15

Bài 3 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 16

3.1 Giới thiệu 16

3.2 Thiết bị - Hóa chất sử dụng trong pha môi trường nuôi cấy 16

3.3 Cánh tiến hành pha môi trường 16

3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 16

3.3.2 Cách đo pH 16

3.3.3 Cách sử dụng nồi hấp 16

Bài 4 KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN MẪU MÔ THỰC VẬT in vitro 17

4.1 Vật liệu nuôi cấy 17

4.2 Cách tiến hành 17

Bài 5 KỸ THUẬT VÔ TRÙNG MẪU CẤY 18

5.1 Vật liệu nuôi cấy 18

5.2 Cách tiến hành 18

5.2.1 Khử trùng tủ cấy 18

5.2.2 Khử trùng mẫu cấy 18

5.2.2.1 Thao tác bên ngoài tủ cấy 18

5.2.2.2 Thao tác bên trong tủ cấy 19

Bài 6 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO LỚP MỎNG 20

6.1 Vật liệu nuôi cấy 20

6.2 Cách tiến hành 20

6.2.1 Khử trùng tủ cấy 20

6.2.2 Kỹ thuật cắt lớp mỏng tế bào thực vật 20

Phần 1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

Chương I CƠ SỞ CỦA VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của

tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách có định hướng vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của

tế bào thực vật

1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Tế bào bất kỳ nào của cơ thể sinh vật đa bào cũng đều phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Đó là tính toàn năng của tế bào

(Theo Gottlied Haberlandt trong cuốn “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời”)

1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật

Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng chuyên biệt (chuyên hóa) Sau đó các tế bào phôi sinh này tiếp tục được biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô cơ quan khác nhau Đó là

sự phân hóa

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hóa tế bào

1.3 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy thực vật

Là nhân tố quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy Hầu hết các môi trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm các thành phần sau

Các nguyên tố khoáng:

Nguyên tố đa lượng

Nguyên tố vi lượng

Nguồn carbon

Vitamin

Bảng 1 Thành phần một số môi trường thông dụng trong nuôi cấy tế bào thực vật

(mg/l) Schenk and

Hildebrandt,

1972 (SH)

Murashige

và Skoog,

1962 (MS)

Gamborg (B5)

Woody Plant Medium (WPM)

Nitsch

và Nitsch (NN)

Vacin

và Went (VW) Khoáng đa lượng

Khoáng vi lượng

Chất hữu cơ

Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm: auxin, cytokinin, …

Chương II NHÂN GIỐNG in vitro

2.1 Ý nghĩa của nhân giống in vitro

- Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ

- Duy trì và nhân nhanh các nguồn gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống

- Nhân nhanh với hiệu quả kinh tế cao…

2.2 Các phương thức nhân giống in vitro

- Tái sinh cây mới từ cấu trúc sinh dưỡng

- Nhân giống thông qua mô sẹo (callus) - nuôi cấy mô không phát sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo

- Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính – Công nghệ hạt nhân tạo

- Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học

Sơ đồ các phương thức tạo cây hoàn chỉnh trong nhân giống in vitro

2.3 Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro

2.3.1 Giai đoạn 1 – Cấy khởi đầu

- Lựa chọn mẫu

Hầu hết là các cơ quan hay bộ phận của cây như: chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, đốt thân, rễ, hoa, …

Chồi Nuôi cấy cơ quan

Chồi, cụm chồi, phôi

củ nhỏ

Tế bào đơn Phôi

Chồi

Cây Cây Cây Cây

Callus

Callus

Chồi Nuôi cấy cơ quan

Tế bào đơn Phôi

Chồi

Cây Cây Cây

Callus

Callus

Chồi Nuôi cấy cơ quan

Cây

Cây

Nuôi cấy callus

Nuôi cấy phôi

Nuôi cấy tế bào Chồi, cụm

chồi, phôi

củ nhỏ

Cây

Tế bào đơn Phôi

Chồi

Cây Callus

Callus

Chồi Nuôi cấy cơ quan

Cây Cây

Mẫu phải ít mầm bệnh, cây mẹ khỏe mạnh, không có biểu hiện bị bệnh…

Tùy vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu

- Nuôi cấy khởi động

Đưa mẫu từ ngoài môi trường vào phải đảm bảo các yêu cầu sau:

+ Tỉ lệ nhiễm thấp

+ Tỉ lệ sống cao

+ Tốc độ sinh trưởng nhanh

2.3.2 Giai đoạn 2 – Nhân nhanh

Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô thực vật lên môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh Những khả năng có thể tạo cây đó là:

+ Phát triển chồi nách

+ Tạo cây vô tính

+ Tạo đỉnh sinh trưởng mới

Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng mới: tăng cytokinin và giảm auxin

+ Tỉ lệ auxin/cytokinin < 1 tăng cường quá trình tạo chồi

+ Tỉ lệ auxin/cytokinin =1 cân bằng hai quá trình tạo rễ và chồi

+ Tỉ lệ auxin/cytokinin >1 tăng cường quá trình tạo rễ

Bảo đảm ở chế độ nhiệt độ 20 - 270

C trong thời gian nuôi cấy Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyền hợp lý bởi vì nếu số lần cấy chuyền quá nhiều (> 7 lần/mẫu) thì sẽ dẫn tới hiện tượng cây bị thoái hóa và sinh trưởng kém, có thể mất đi những đặc tính ban đầu của cây bố mẹ

2.3.3 Giai đoạn 3 – Tạo rễ

Giai đoạn này bao gồm quá trình kéo dài chồi để tạo kích thước thích hợp và tạo rễ tức là quá trình tạo cây hoàn chỉnh Môi trường lúc này không cần bổ sung cytokinin mà chỉ cần bổ sung auxin Nồng độ auxin tối ưu được xác định dựa trên tỉ lệ tạo rễ, số lượng

rễ và chiều dài rễ

2.3.4 Giai đoạn 4 – Đưa cây ra ngoài đất

Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm công việc thuần hóa cây in vitro thích nghi

với điều kiện khí hậu thay đổi: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn Quá trình thích nghi ở đây phải được hiểu như là quá

trình thay đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu của bản thân cây đó Thời gian tối thiểu cho

sự thích nghi với môi trường ngoài tự nhiên khoảng từ 2 - 3 tuần Trong thời gian này cây phải được bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như:

+ Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô

+ Nhiễm vi khuẩn và nấm làm cho cây bị héo khô

+ Cháy lá do nắng

2.4 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy

- Đảm bảo điều kiện vô trùng

- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách

- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy

2.5 Đảm bảo điều kiện vô trùng

- Ý nghĩa: Môi trường nuôi cấy có chứa đường, khoáng … rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật nên nếu môi trường bị nhiễm chỉ sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt nuôi cấy sẽ phủ đầy vi khuẩn và nấm, mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần

- Vô trùng các nguồn tạp chất

 Dụng cụ thủy tinh rửa sạch, hấp khử trùng và sấy trước khi sử dụng

 Nút đậy (bằng cao su, bông không thấm nước hoặc Nylon chịu nhiệt): Nút phải tương đối chặt để bụi không đi qua được và nước không thoát ra được trong quá trình nuôi cấy

 Mô nuôi cấy: dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn mạnh…

 Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy

2.6 Chọn và xử lý mô cấy

Tùy từng loại cây mà có thể chọn mô thích hợp, thông thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy trừ những mô đã hóa gỗ Tuy vậy, để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một số cây nhất định thì trước tiên phải chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn

Phần 2 THỰC HÀNH NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

Bài 1

GIỚI THIỆU TRANG THIẾT BỊ VÀ CÁCH SỬ DỤNG

Để thực hiện quy trình nuôi cấy thực vật in vitro thì phòng thí nghiệm cần có một

số trang thiết bị và dụng cụ sau:

1.1 Phòng chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Máy cất nước, máy đo pH, máy khuấy từ, tủ lạnh đựng hóa chất

Các dụng cụ như: cốc đong, ống đong, pipett, chai thuỷ tinh,…

1.2 Khu vực rửa dụng cụ

Vòi nước, bồn nước, giá, kệ để chai, xà phòng, cọ rửa chai …

1.3 Phòng khử trùng

Nồi hấp (autoclave), tủ sấy, bàn để môi trường và dụng cụ đã khử trùng

1.4 Phòng cấy

- Phòng cấy: đảm bảo điều kiện vô trùng, hạn chế quá nhiều người ra vào Có quạt hút gió, có đèn huỳnh quang và đèn UV khử trùng

- Tủ cấy: có 2 loại

Loại tủ kín: kín hoàn toàn, chỉ chừa vừa đủ để hai tay thực hiện các thao tác, trong tủ có đèn huỳnh quang và đèn UV

Loại laminar flow: loại tủ có luồng gió vô trùng thổi liên tục từ trên xuống hoặc từ trong lùa ra ngoài

1.5 Phòng tăng trưởng

Phòng tăng trưởng là nơi nuôi dưỡng cây sau khi cấy, có máy điều hòa nhiệt độ,

kệ để chai, trên kệ có gắn đèn huỳnh quang hoặc đèn led, đảm bảo:

- Nhiệt độ: nhiệt độ ổn định, thường từ 22 – 25 0C, tuy nhiên tùy đối tượng nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp

- Ánh sáng: sử dụng đèn huỳnh quang hoặc đèn led có ánh sáng trắng, cường độ ánh sáng từ 100 lux đến 5000 lux (tương đương 5W/m2

đến 25W/m2) Quang kỳ thay đổi tùy theo loại cây nhưng phần lớn các phòng tăng trưởng có thời gian chiếu sáng từ 16 đến

18 giờ/ngày

- Độ ẩm: độ ẩm không khí tốt nhất là 70%

Bài 2

CHUẨN BỊ DUNG DỊCH GỐC (DUNG DỊCH STOCK)

2.1 Giới thiệu

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo từng loại cây và bộ phận nuôi cấy, thường bao gồm 5 thành phần chính:

Đường (nguồn carbon), các muối khoáng đa lượng, các muối khoáng vi lượng, các vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng Ngoài ra còn có thêm một số thành phần khác như acid amin, EDTA, nước dừa, dịch chiết nấm men, khoai tây, chuối,…Có rất nhiều công thức môi trường đã được công bố và sử dụng, trong đó môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng rộng rãi nhất

Nhằm tiết kiệm thời gian và công sức, thường pha dung dịch stock (hay còn gọi là dung dịch gốc), dung dịch này đậm đặc gấp 10 – 100 lần, được bảo quản lạnh và có thể

sử dụng lâu dài

2.2 Vật liệu – Trang thiết bị

Hóa chất cần thiết; cân điện tử, máy khuấy từ và gia nhiệt; cốc thuỷ tinh, đĩa petri, ống đong, pipette, nước cất, dung môi HCl hoặc KOH

2.3 Phương pháp tiến hành

2.3.1 Pha dung dịch stock cho môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

Stock đa lượng: các chất có calcium, phosphate và magnesium thường kết tủa do liều lượng quá đậm đặc khi pha stock do đó nên pha riêng chất CaCl2 2H2O và KH2PO4;Stock vi lượng; Stock Fe-EDTA và Stock vitamin

Các bước tiến hành

- Tính khối lượng hóa chất cần sử dụng; kiểm tra và sắp xếp hóa chất theo thứ tự

- Cân hóa chất bằng cân điện tử: khi sử dụng cân chú ý giới hạn sử dụng của cân

*Lưu ý: cân riêng lẻ từng hóa chất trên đĩa petri

- Hòa tan từng hóa chất với lượng nhỏ nhất nước cất (đủ để làm tan chất tan)

- Cho các dung dịch thành phần vào bình định mức

- Thêm nước cất vào bình định mức đến thể tích mong muốn, khuấy đều

- Đổ dung dịch stock vào chai, ghi tên stock và nồng độ lên chai; bảo quản lạnh

2.3.2 Pha stock các chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,01 đến 10 mg/l Một

số chất điều hòa sinh trưởng ít tan trong nước nên phải được hòa tan trong dung môi trước khi thêm nước vào

 Đối với 2,4 D; NAA, IAA, IBA và GA3, dung môi là ethanol 90 o

 Đối với BA và 2Pi, dung môi là HCl hoặc KOH

Bảng 2 Thành phần môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)

(mg/l)

Khối lượng (g)

Thể tích

dd stock

Thể tích dd stock/lít mt

Đa lượng

KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370

CaCl 2 2H 2 O 440

KH2PO4 170

Vi lượng

CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025

H3BO3 6,2

KI 0,83 MnSO4.4H2O 22,3

Na2MoO4.2H2O 0,25 ZnSO4.H2O 8,6

FeSO4.7H2O 27,8

Vitamine

Glycine 2,00 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine-HCl 0,10

Để pha stock có nồng độ 1mg/ml: cân 100 mg hóa chất, hòa tan trong một lượng nhỏ (1- 50 ml) dung môi, sau đó thêm nước cất lên 100 ml Bảo quản dung dịch stock chất điều hòa sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA, 2,4D; NAA cần lọ màu nâu để tránh ánh sáng) và đặt ở ngăn đá của tủ lạnh

Bài 3

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 3.1 Giới thiệu

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật mô phỏng điều kiện sống ở môi trường bên ngoài, bao gồm các thành phần dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn carbon và giá thể Với điều kiện như vậy, cây có thể sinh trưởng bình thường hoặc phát triển theo ý muốn của người nuôi cấy với sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Mỗi loại cây thích hợp với những công thức môi trường khác nhau

Các bình môi trường sử dụng phải được hấp tiệt trùng trước khi dùng

3.2 Thiết bị - Hóa chất sử dụng để pha môi trường nuôi cấy

Các thiết bị dụng cụ và hóa chất

Thiết bị, dụng cụ Hoá chất

- Nồi hấp (Autoclave) - Dung dịch stock của môi trường cần chuẩn bị

- Máy khuấy từ - Dung dịch chuẩn độ (KOH 1N, HCl 1N)

- Cân điện tử (Cân 2 số)

- Becher, ống đong (50 ml, 10 ml)

- Pipette thủy tinh (5ml, 2ml)

- Đũa thủy tinh

- Muỗng, vá

3.3 Cách tiến hành pha môi trường

3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Cách pha 1 lít môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) được thực hiện như sau:

o Cho khoảng 200 ml nước cất vào becher 1lít

o Lần lượt thêm các stock theo công thức môi trường cần pha với thể tích thích

hợp (được ghi trên bình chứa stock) Sau mỗi lần thêm stock phải tráng ống

đong, pipett với nước cất; cho thêm nước cất để tránh hiện tượng kết tủa

o Hòa tan đường (30 g/l) với nước cất, đổ vào becher

o Thêm nước cất vào cho đủ 1lít dung dịch