Xây dựng quy trình Định lượng các hoạt chất chính trong cây sói rừng (sarcandra grabra (thunb ) nakai) bằng phương pháp uv vis và hplc

Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó chưa có được các cơ sở khoa học đề

PHUONG PHAP UV- VIS VA HPLC

Nién luan Ngành Hóa dược

(Chương trình đào tạo Chất lượng cao)

Hà Nội, 2022

DAI HOC QUOC GIA HA NOI TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN

KHOA HOA HOC

PHUONG PHAP HPLC

Nién luan Ngành Hóa dược

(Chương trình đào tạo Chất lượng cao)

Giảng viên hướng dân:

PGS.TS Chu Ngoc Chau, Khoa Héa Hoc, Truong DHKHTN

TS Tran Thanh Ha, Khoa Công nghệ chiết xuất, Viện Dược Liệu

Hà Nội, 2022

LOI CAM ON

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành niên luận này em luôn nhận được

sự giúp đỡ tận tình của quý thây cô, gia đình, bạn bè

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến các giảng

viên hướng dẫn của em PGS.TS Chu Ngọc Châu, TS.Trần Thanh Hà và ThS

Đỗ Thị Thùy Linh, cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ hướng dẫn tận tình tạo mọi điều kiện giúp em tích lũy thêm nhiều kiến thức quý báu để em có cái nhìn sâu sắc và hoàn thiện hơn trong nghiên cứu này

Thứ hai, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô và các bạn của trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô của bộ môn Hóa hữu cơ và khoa Hóa học, về những kiến thức, kinh nghiệm và những bài học qua ba năm đại học vừa qua Chính những điều đó đã giúp em tiếp thu được những kiến thức quý giá làm hành trang bước vào tương lai

Đề có được bài niên luận nay, em cing xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy

giáo, các anh chị tại Viện Dược Liệu đã hết sức hỗ trợ cũng như cho phép em được

sử dụng các trang thiết bị trong thời gian em thực tập tại đây Đặc biệt, em xin cảm

ơn ThS Đỗ Thị Thùy Linh người đã trực tiếp hướng dẫn em trong bài niên luận

này

Trong quá trình thực tập, cũng như là trong quá trình làm bài niên luận, khó tranh khỏi sai sót, rất mong các thầy cô bỏ qua Đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài niên luận không thể tránh khỏi được những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp đề hoàn thiện tốt hon Cuối cùng, cảm ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suôt quá trình học tập hoàn thành niên luận này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 04 năm 2022

Sinh viên

Nguyễn Đỗ Khánh Linh

DANH MUC KY HIEU

ky long hiệu nang cao

3 U-HPLC-LTQ- Sắc ký lỏng siêu cao áp (U-HPLC) kết hợp với tứ

lượng Orbitrap có độ phân giải cao

4 UHPLC-QQQ-MS _ | Sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ đầu dò

DANH MUC HINH ANH

Hình 1: (A-C) Toan cay (A), Chim hoa (B) va qua (C) của S giabra 2

Hinh 2: Công thức Hóa hoc của một sỐ hop chat Flavonoids trong S glabra 7

Hình 3: Công thức Hóa học của một số hợp chất Coumarins trong S glabra 8

Hinh 4: Công thức Hóa học của một số hợp chất Terpenoids trong S glabra 12

Hình 5: Công thức Hóa học một số acid hữu cơ có trong Š giabra 14 Hinh 6: Công thức Hóa học của một số hợp chất lignins, anthraquinones va steroids trong S @Í/1ÖFŒ SA SH 2H» H* HH HH TH HH KH KH HH kg 16 Hình 7: Các lực tương tác trong quá trình sắc ký -2-7+52+c+cx+cszxecse 19 Hinh 8: Sơ đồ hệ thống HPLC 2-5-5252 S52 SE+EE+EE2EE2E2EE2EE2EEEEvEErrrerrerre 21 Hình 9: Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 5555: 21

DANH MUC BANG Bang 1: Cac hop chat Flavonoids trong S glabra Bảng 2: Các hợp chất Coumarins trong S glabra Bang 3: Cac hop chat Terpenoids trong S glabra Bảng 4: Các acid hữu cơ có trong S giabra Bảng 5: Các hợp chất khác cé trong S glabra

LADD, PH@n LOdi NOC ceeecsccccessccecennsceesnnsecesnncecesancecennncensoneecesoncacensaceesnsoneeensense 2 1.1.2 Đặc điểm thu Vithessecccvecesvssssvesesvesesvescsvssssvsssssssssssssssssssscsssscsnsscsssscsnees 2 n1): n6 6 sa H,)H.H 3 1.1.4 Phân bố, thu hái và sơ CHẾ ccecvesesereEkiErErtttrtketrsersrksrreererre 3 1.2 TÁC DỤNG DƯỢC LÍ CỦA CÂY SĨI RỪNG -. << 4 1.2.I Tác dụng dược lí theo Ân gÍAH uc Son ng ng ven 4 1.2.I Tác dụng dược lí theo nghiên cứu khoa hỌc -««.e<essseeeeses 4 1.3 THANH PHAN HĨA HỌC CỦA CÂY SĨI RỪNG .- 5 1.3.1 Các hợp chất FlavoinoiilL -o- csss csceecese sec sereesereerererrsrerree 5 1.3.2 Cc hop chitt COUMATIN weseccsssscsssssessssesvssesvsscsvsscsvsvescssessssescssescssescseees 7 1.3.3 Các hợp chất Terpenoids cccccccssscessscssvsscsvsscsvsscsvsscsvsscsssscsssscsssscscsscsssses ỡ 1.3.4 Các acid hữu cơ cĩ trong S gÌÏÙF( con ng nen 12 1.3.5 Các hợp chất khác cĩ trong ®S gÌaÙa -. -s-sccscscscscssesesee 15 1.4 TONG QUAN VE CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH

1.4.1 Phép phân tích HPLC-PAD/ESI-MS11 0 c.cccccccccsscssssssseseeeeeeees 17 1.4.2 Phép phân tích UHPLC-QQQ-MS Q-SS nereec 18 1.5 TONG QUAN VE PHUONG PHAP SAC Ki LONG HIEU NANG

1.5.1 NGUYÊN tC sesccccscsscscsscscsscscsscscsvescsvesssvescsvescsvescssessssssessssessesssssssssssssseees 19 1.5.2 Cơ SỞ lý CHU yet esessesessesessvsessvsvsscsssscsusscsnsscsssscssscsssscsssscsssscsssscssssesssses 20 1.5.3 Nguyên tắc cầu tạo hệ thống HPLC 5s cscsscscsseecrsrecsee 20 1.5.3.1 Hệ thống bơm 2-52 SE E22E2E1211211212212211.21 1111 xe 20 1.5.3.2 Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơii 20

1.5.3.3 Hệ tiêm mẫu . 5-52 SE SES2SESE2E2122121215122111 211121 1.2x 20 1.5.3.4 Cột sắc ký lỏng HPIL/C - 2722222212212 EEEEEEcre 20 1.5.3.5 Detector trong trong HPLC 5 S5 + sseerresres 21 1.5.3.6 Hệ thống thu nhận và xử lý $6 H@U eee eects 21

1.5.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký c-csesecscs 21

1.5.4.1 Thời gian buu (OR) .0 cccccccccecceseesesseeseeeseeseesesseseessesesseeeeteseeses 22 1.5.4.2 H@ s6 phn BG (KK) cesceccccecc ces ecesessessesseseeseeseeseesesssesseeseseeseess 22 1.5.4.3 Hé sé dung lwong (k’) 0 cscccceses css eseeseeseesesesessesseseeseeeeeeees 22 1.5.4.4 Hệ số chọn lọc (ơ) (selectivity — factor) 5-ccccsccccee: 22 1.5.4.5 Độ phân giải (Rs) (Resolution) - SĂS Sex 23 1.5.4.6 Hệ số bất đối 5 ST S2 2 2112122122222 21k 23 1.5.4.7 Số đĩa lý thuyết N 2-52 22 S221 2121121221222 erce 23 1.5.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký . 23 1.5.5.1 Lựa chọn cột (pha fĩnh) - - 0S St + + Hkeg 2 1.5.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLUC - 2-5 5 S<<S+S<sx+sserseee 24 1.5.5.3 Chọn đệm pIH -22-S2+S<+EE2E2E2EE2E1215212212211.21 11.11 xe 25 1.5.5.4 Tốc độ đòng - 22 S22 22H22 22222122121121121 2122212120 25 L.S.6 Cache Aan 5.7 an 25 1.5.7 Úng dụng của HPLC - sec e£esreersreersreersrsrrsrsrrsrsrrsrree 25 1.5.7.1 Định tính và thứ độ tỉnh khiết: -2- 2-52 SeSeSzecxerxersrea 25 1.5.7.2 Sắc ký điều chế: 5222 3 TH T222 cre 25

vi

MO DAU

Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới âm gió mùa nên có nguồn

dược liệu rất phong phú và đa dạng Nhân dân ta từ lâu đã biết dùng cây có để chữa

bệnh và phòng bệnh, nhưng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian tùy theo từng địa phương Phần lớn các cây thuốc Việt Nam chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhất là về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và hàm lượng các hoạt chất do đó chưa có được các cơ sở khoa học đề tạo được các sản pham ứng dụng mới trong các

lĩnh vực dược phâm, thực pham và nông nghiệp Trong số đó có cây SóI rừng

(Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) là một loại cây có nhiều ứng dụng trong cuộc song

Cây Sói rừng là một vị thuốc nam sẵn có ở các vùng miền núi của Việt Nam

được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học quý như kháng viêm, kháng virus, kháng

tế bảo ung thư, chống oxi hóa, hạ huyết áp [11] Các nhà khoa học đã phát hiện trong sói rừng có nhiều hợp chất thuộc các nhóm sesquiterpen, acid phenolic, flavonoid, polysaccharid va coumarin Trén thé giới đã có một số công trình nghiên cứu về cây Sói rừng, trong đó tập trung nhiều các nghiên cứu về tác dụng dược liệu của Sói rừng Tại Trung Quốc, hiện đang lưu hành 38 loại thuốc có thành phần dược liệu Sói rừng Trong Dược điển Việt Nam V, chuyên luận sói rừng mới chỉ đưa ra phương pháp định tính, vi phẫu, soi bột, mà chưa có chỉ tiêu định lượng Do đó,

để đóng góp cơ sở khoa học cho việc nâng cấp các tiêu chí định lượng cho cây Sói

rừng, chúng tôi chọn đề tài: “Xây dựng quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Sói rừng (Sarcandra Giabra (Thunb.) Nakai) bằng phương pháp HPLC”, ti dé dua ra quy trình định lượng tối ưu các hợp chất Hóa học và ứng dụng của dược liệu này trong đời song Vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho chúng tôi là:

I Xây dựng được quy trình định lượng các hoạt chất chính trong cây Sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) bằng phương pháp HPLC

2 Thâm định phương pháp vừa xây dựng

CHUONG I: TONG QUAN

1.1 TONG QUAN VE CAY SOI RUNG

Chlorathus glaber (Thunb.) Makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thu6c ho

Hoa séi Chloranthaceae

Ở Việt Nam cây sói rừng còn có một số tên gọi khác như sói lãng, sói nhăn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên,

thảo sách hồ, tiếp cốt mộc

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Hình 1: (A-C) Toàn cây (A), Chùm hoa (B) và quả (C) của S glabra

Sói rừng là loại cây bụi nhỏ, cao I - 2m, nhánh tròn, không có lông, lá mọc

đối, có phiến dai xoan bau duc, dai 7 - 18cm, rộng 2 - 7cm, đầu nhọn, mép có răng nhọn, gân phụ 5 cặp, cuống ngắn 5- &mm Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn Hoa

nhỏ, màu trắng, không cuống Quả nhỏ, khi chín có màu đỏ gạch, mọng, gan tron 6

x 4mm Cây có hoa vào tháng 6 - 7, quả vào tháng 8 - 9 [2], [4]

Theo Võ Văn Chí [2] cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước như: Trung Quốc,

Triều Tiên, Nhật Bản, An Độ, Việt Nam và Malaixia Cây có thể mọc hoang hoặc cũng được trồng dé ướp trà hoặc làm thuốc Ở Việt Nam, cây mọc hoang ở vùng núi

đất, ở bìa rừng và ven đổi âm nhiều nơi như: Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên, Hòa Bình đến Kon Tum, Lâm Đồng

Gân lá: Gân phía trên hơi lồi, phía dưới lỗi nhiễu Biểu bì trên và đưới là một

hang tế bào hình chữ nhật nhỏ xếp đều đặn, phía ngoài phủ một lớp cutin mỏng Hạ

bì gồm một lớp tế bào hình gần tròn nhỏ xếp đều đặn Mô mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng hình đa giác hay hình trứng, kích thước không đều Rải rac trong

mô mềm có các đám tế bào cứng Giữa gân lá có hai bó lige- gỗ lớn năm đối xứng nhau qua trục giữa của gần lá, môi bó có một cung mô cứng gồm các tế bào có thành dày hóa gỗ, phía trên là cung mạch gỗ, ở giữa là libe [1]

Phién lá: Biéu bi trén và dưới là một hang tế bào hình chữ nhật tương tự phần gân lá nhưng có kích thước nhỏ hơn Lớp tế bào mô giậu quan sát không rõ Mô

mêm là những tê bào có kích thước lớn, thành mỏng [1]

1.1.4 Phân bố, thu hái và sơ chế

* Phân bố

Sói rừng đã phi nhận phân bồ tự nhiên tại 8 tỉnh Việt Nam Trữ lượng Sói rừng theo thành phần nguyên liệu, thân chiếm 50,5%, lá chiếm 30,8%và rễ chiếm 18,6%

* Thu hai va so ché

Về quy trình thu hái và sơ chế nguyên liệu cây Sói rừng, quy trình thu hái

nguyên liệu, bao gồm 5 bước: Xác định vùng thu hái; xác định tuổi cây thu hái; xác định bộ phận thu hái; xác định mùa thu hái và số lần thu hái trong năm; xác định kỹ thuật thu hái Tiếp theo là khảo nghiệm và xây dựng quy trình sơ chế nguyên liệu, gồm 4 bước: Tuyên chọn nguyên liệu; xử lý nguyên liệu; phơi sấy và bảo quản nguyên liệu Tiếp theo là các công đoạn phơi, sây, bảo quản

1.2 TAC DUNG DUOC LI CUA CAY SOI RUNG

1.2.1 Tác dụng dược lí theo dân gian

Theo Đông y, Sói rừng có vị dang, cay, tinh hoi am, cung có độc, vào kinh tâm, can, có tác dụng hoạt huyết, chỉ thống, khu phong, trừ thấp, thanh nhiệt giải

độc, kháng virus, kháng khuẩn, kháng u [2], [4]

Ở Trung Quốc, cây được dùng để chữa một số bệnh như: ung thư tụy, dạ dày, trực tràng, gan, ly, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo, kinh nguyệt không đều Liều dùng 20 - 40g, đun sôi uống hoặc tán bột uống với rượu hoặc dùng bột phối thành tế uống Hoa dùng dé ướp trà [2], [4]

Ở Việt Nam, vị thuốc mới được dùng trong dân gian Rễ ngâm rượu uống chữa đau tức ngực Lá tươi giã đắp chữa rắn cắn, gãy xương, bong gân, mụn nhọit Dạng thuốc sắc đùng liều 20 - 40g/ngày [2], [4]

1.2.1 Tác dụng dược lí theo nghiên cứu khoa học

Kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy, sói rừng có tác dụng ức chế đối với tụ

cầu khuẩn vang staphylococcus aureus, truc khuẩn ly, trực khuẩn bacillus coli, trực

khuẩn mủ xanh bacillus pyocyaneus; trực khuẩn thương hàn và phó thương hản

salmonella typhosa Lá có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất; rễ và cành tươi có

tác dụng mạnh hơn rễ và cành khô

Lá cây sói rừng có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất; rễ và cành tươi có tác

dụng mạnh hơn rễ và cành đã khô Đối với các loại tụ cầu khuẩn và trực khuẩn đều

có tác dụng ức chế ở mức độ nhất định Thử nghiệm đối với các bệnh nhân viêm phổi, viêm phế quản, viêm dạ dày ruột cấp tính, ly trực trùng hiệu quả đạt tới 75

- 80%

1.3 THANH PHAN HOA HOC CUA CAY SOI RUNG

Từ những năm 1970, các thành phan hóa học của S glabra da nhan duoc su

quan tâm của các học giả trong và ngoài nước Cho đến nay, hơn 200 hợp chất đã

được phân lập và xác định từ S glabra Cac kết quả nghiên cứu của các nhà khoa

học Trung Quốc, Mỹ, Nhật trong thời gian gần đây vé cây thuốc này cho thấy thành phần hóa học của cây Sarcandra giabra (Thunb.) Nakai là sesquiterpen, coumarin, flavonoid, triterpenoid, saponin, caroten, chat béo, polysaccharide Trong đó saponin, coumarin, sesquiterpen va flavonoid 1A các nhóm chất chính voi flavonoid duoc coi 1a thanh phan hoạt động chính trong S glabra [7], [9], [10], [12], [19], [20]

Những nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học đã xác định Sói rừng có chứa một số các hợp chất thuộc nhóm flavonoid nhu chloranoside A: Tertorigenin 7-glucoside có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương

khớp và tiêu hóa, hợp chất isofraxidin, một vị thuốc trong bài thuốc trị bệnh vảy nến

tại Trung Quốc Bên cạnh đó, bột cây Sói rừng còn có hoạt tính kháng gốc tự do, có

tác dụng ức chế sự phát triển của các khối u, hỗ trợ trong điều trị bệnh ung thư Các

kết quả thử nghiệm in vitro cho thay dịch chiết sói rừng có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bảo ung thư người Hep-A549, HCT-29, BGC-823 [36], [37] 1.3.1 Các hợp chất Flavonoid

Flavonoid có mặt trong hầu hết các bộ phân của các loài thực vật bậc cao, đặc biệt là hoa, tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ thu hút các loại côn trùng giúp cho sự

thụ phần của cây FElavonoid là nhóm hợp chất phenol có cầu tạo khung theo kiểu

C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với

nhau qua một mạch 3 carbon, là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong được liệu

có nguồn gốc thực vật Phần lớn chúng có màu vàng, ngoài ra còn có những chất màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu

Cho đến nay, có hơn 40 Flavonoid đã được tìm thấy trong S glabra (1-40)

Flavonoid là thành phân chính trong S glabra, và hiện nay được coi là thành phần hoạt tính sinh học chính trong điều trị giảm tiêu cầu Các flavonoid cũng thường được sử dụng làm chat chi thi quan trong dé kiêm soát chất lượng của S glabra Astilbimn (11), là một trong, những thành phân tích cực của 5 glabra, được báo cáo

là có vai trò chống giảm tiêu cầu trong tế bào megakaryocytes của tủy xương chuột bằng cách điều chỉnh hàm lượng yếu tô tăng trưởng chuyên dạng beta (TGF-B1) va Nhựa nhiệt déo dan héi Thermoplastic Polyolefin (TPO), c6 thé 14 thanh phan hiệu

qua chống giảm tiêu cầu (Tang và cộng sự, 2014) [24] Bên cạnh đó, có sự khác biệt

về tổng hàm lượng flavonoid trong các phần khác nhau của S glabra Tổng hàm lượng flavonoid trong lá đạt 3,17%, cao hơn ở rễ (2,38%) và thân (2,11%) (Li và

cong su, 2007) [12] Các két qua cho thay rang phan thuốc có thể được lựa chọn

theo nhu cầu lâm sàng, điều này có lợi cho việc sử dụng bền vững S glabra

Thanh phan flavonoid duoc xac dinh tir loai S.glabra duoc trinh bay trong bang | nhu sau:

Bang 1: Cade hop chat Flavonoids trong S glabra

1o, | (3 3.355:5 ⁄7-pentahydroxy- EIOH Toàn cây

27 methoxydihydrochalcone Dichloromethane không của cây

Hiện nay, có hơn một chục coumarin đã duoc phan lap tir S glabra (41-56)

La coumarin tiéu biéu nhat c6 hoat tinh được ly manh, isofraxidin (45) được Dược điển Trung Quốc sử dụng làm chỉ số để kiểm soát chất lượng của S glabra và các chế phẩm của nó Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng isofraxidin có nhiều tác dụng dược

ly (L¡ và cộng su, 2014; Liu va cộng sự, 2015; Jin và cộng sự, 2020) [I1], [13], [17]

bao gồm tác dụng chống viêm, chống vi rút và chống khối u, cũng như ức chế kết

tập tiêu cầu Hơn nữa, 3,3’-biisofraxidin (52) di duc bdo cáo là gây ra quá trình tự chết của tế bào ung thư dạ dày băng cách kích hoạt con đường tự chết qua trung gian ty thê (Wu và cộng sự, 2015) [30]

Các coumarins đã được tìm thấy được nêu trong bảng 2 như sau:

Bảng 2: Các hợp chất Coumarins trong S glabra

glucopyranoside

glabra da dugc bao cdo 1A c6 tac dung chong viém, khang khuan va chéng khéi u,

v.v (He và cộng sự, 2010; Wang P và cộng su, 2015, Wang va cong sy, 2016) [8],

[25] [29] Ví dụ, chloranthalactone E (59), atractylenolide III (90) va sarcandrolide

A-C (108-117) thể hiện tác dụng chống khối u được báo cáo (Wang và cộng sự,

2007; He và cộng sự, 2010), trong khi shizukaol B (121), shizukaol G (125) va sarglabolide A (129) cho thấy các hoạt động chống viêm (Wang P và cộng SỰ, 2015) [29] Sarglaperoxide A (146) có tác dụng chống viêm và kháng khuẩn, ức chế sản xuat 53,6% nitric oxide (NO) 6 25 uM va 64,5% Staphylococcus aureus phat triển

không của cây

ølucopyranoside

không của cây

76 8.1 2 0l ic EtOH Toan cay

không của cây

không của cây

Phan trén

92 | 415) 701 1)-dien 8a, 12-olide EtOH Toan cay

la,8a,9a-trihydroxyeudesman- ¬

94 | 3(4),7(11)-dien-8B.12-olide EtOH Toàn cây

10