Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình vi nhân giống cây hoa hạnh phúc (Alpinia purpurata)

TÓM TẮTNghiên cứu Ảnh hưởng của chất điều hoa sinh trưởng thực vật lên quá trình vi nhân giống cây hoa Hanh Phúc Alpinia purpurata được tiễn hành nhằm góp phan xâydựng quy trình vi nhân

; BỘ GIAO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HOC SINH HOC

ANH HUONG CUA CAC CHAT DIEU HOA SINH TRUONG

THUC VAT LEN QUA TRINH VI NHAN GIONG

CAY HOA HANH PHÚC (Alpinia purpurata)

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : NGUYÊN HUỲNH LÊ

Mã số sinh viên : 19126081

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOTNGHIEP

ANH HUONG CUA CÁC CHAT DIEU HÒA SINH TRUONG

THUC VAT LEN QUA TRINH VI NHAN GIONG

CAY HOA HANH PHÚC (Alpinia purpurata)

Huong dan khoa hoc: Sinh vién thuc hién:

PGS.TS TRAN THI LE MINH NGUYEN HUYNH LE

TP Thủ Đúc, 3/2024

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô khoa Khoa học

Sinh Học, trường Dai học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tâm day bảo vàcung cấp những kiến thức hữu ích cho em trong suốt quá trình học tập và trau đồi kinhnghiệm chuyên ngành.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Thị Lệ Minh là giáo viên hướngdẫn khoa học đã giúp đỡ, hướng dẫn rat tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi dé em cóthê thực hiện và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin trân trọng cảm ơn ThS Nguyễn Thị Quyên, người đã dành rấtnhiều thời gian để đồng hành, truyền đạt những kiến thức vô cùng quý báu và luôn hỗtrợ hết sức có thé dé giúp đỡ em hoàn thành đề tài một cách tốt nhất Cam ơn tat cả cácanh/chi, thành viên phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật BIO203 đã hỗ trợem/minh trong quá trình hoạt động tại phòng thí nghiệm.

Cuối lời, con xin được cảm ơn gia đình vì đã ủng hộ, động viên, tiếp thêm động

lực cho con trong suốt thời gian học tập tại trường Đại học Nông Lâm thành phô Hồ Chí

Minh.

Trân trọng cảm ơn.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Huỳnh Lê, MSSV: 19126081, Lớp: DH19SHD, ngành Công nghệSinh học, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây làKhóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trongnghiên cứu là hoàn toản trung thực và khách quan Tôi xin hoản toàn chịu trách nhiệmtrước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 02 năm 2024

Người việt cam đoan

Nguyễn Huỳnh Lê

ii

TÓM TẮT

Nghiên cứu Ảnh hưởng của chất điều hoa sinh trưởng thực vật lên quá trình vi

nhân giống cây hoa Hanh Phúc (Alpinia purpurata) được tiễn hành nhằm góp phan xâydựng quy trình vi nhân giống cây hoa Hạnh Phúc, mang lại nguồn giống ổn định đápứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường và nguồn vật liệu cho các quá trình nghiêncứu Mục tiêu chính của đề tài là tạo được nguồn vật liệu khởi đầu bằng việc khảo sát

sự ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu chôi thân củ cây hoa Hạnh Phúc bang dungdich Povidone Iodine (PVP-I) ở nồng độ 0,1 g/L (10%) và khảo sát sự ảnh hưởng củacác chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên khả năng nhân chéi và tạo rễ cây hoa HạnhPhúc Kết quả khảo sát cho thấy dung dịch PVP-I nồng độ 10% với thời gian khử trùng

là 15 phút cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ mẫu sạch đạt 57,69% và tỷ lệ mẫu sạch tái sinhđạt 88,92% Khi kết hợp giữa nồng độ 1 mg/L BA va 1 mg/L Ki được ghi nhận là nồng

độ phù hợp cho sự nhân chồi của mẫu cây hoa Hạnh Phúc, sau 6 tuần nuôi cay cho thaymẫu xanh, khỏe với trung bình 3,31 chồi/mẫu và chiều cao trung bình đạt 3,77 cm vả

chất lượng các chồi đồng đều nhau Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ

NAA và IBA lên khả năng hình rễ, ghi nhận nồng độ phù hợp nhất ở 0,5 mg/L IBA kếthợp 0,5 mg/L NAA cho số rễ trung bình đạt 31,38 rễ/mẫu, chiều dai trung bình đạt 3,22

cm, rễ xanh, to, khỏe và nhiều lông hút

Từ khóa: Alpinia purpurata, dung dịch Povidone Iodine (PVP-I), chất điều hòa sinh

trưởng thực vật, BA và Ki, NAA và IBA.

iti

objective of the project was to create a material source by investigating the impact of sterilization

time of Red Ginger bulb bud samples with Povidone Iodine solution (PVP-I) at a

concentration of 0.1 g/L (10%) and investigating the influence of plant growth regulators

on the ability to multiply buds and root Red Gingers The survey results showed that

PVP-I solution with a concentration of 10% with a sterilization time of 15 minutes gave the best results with a clean sample rate of 57.69% and a clean sample regeneration rate

of 88.92% When the combination of 1 mg/L BA and | mg/L Ki is noted as a suitable concentration for the bud multiplication of the Red Ginger sample, after 6 weeks of

culture, the sample was green and healthy with an average of 3.31 buds/sample and an average height of 3.77 cm and the quality of the shoots was uniform In an experiment

investigating the effect of NAA and IBA concentrations on root formality, the most appropriate concentrations were recorded at 0.5 mg/L IBA combined with 0.5 mg/L

NAA for an average number of roots of 31.38 roots/sample, average length of 3.22cm,

green, large, strong, and hairy roots.

Keywords: Alpinia purpurata, Povidone Iodine solution (PVP-I), plant growth

regulator, BA and Ki, NAA and IBA.

IV

MỤC LỤC

TrangLOI CAM 09 iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN 5- 22212 122122122121221212121212121212121 21x iiTOM TAT ooo iiiABSTRACTT 2-52 222212212212212212112212112112111111111111111111211112111111122 1e 1V

MUC LUC 92211 Vv

DANH SÁCH CAC BẢNG ©222222222221221221122121121121121121121121121 121 xe ixDANH SACH CAC HINH vccssesscssssssssssccsscssssscsssssvsssssesosessssecesencessessstucessssssestesesessseevenees xChurong 089(95271077 7a 1

Ấn In TT ch 0 0/0 0/4 |

|; TSU scassiess ceases n181016586/GSÀ5)24830/10813988855530-1880G385&5i3SS831Đ38G8ERGGl83EiENSSSii0SdSiiSSuLS8BS8380.858/6885 2 1.3 NGI dane (W611 Ci eee 2Chương 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 22 2¿22222EE22EE22EE22EE22EE22EE22EE22Ezzxczre 32.1 Tổng quan về cây hoa Hạnh Phúc (Alpinia purpurat 2-©-2-5s55z555z<: 32.1; Lo CHƠI THEW CHUNG soánssesseesissis6i 16068 c0 0 túi 000106391861194883555883E35W63960003G03608IG042830149 08 32.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý - ó5 2211222122 0120020122010012 1166 L6 3

5.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh KHÁI e:-.-sscscecceseoessEiecbkosidcchhoshoEkikgSEUEE10.160033.210301056:6800657 42.1.3 Giá trị kinh tẾ 2-5 s+S<+E‡2E£EEEEE2EE21215211121121112112111111111111111 2111121212111 cre 43.1.4.G16 trị được LEW senueiasrorrisriindlototonitnotosiltosesefiocstsslrikugrodb9xgptnbrbzl33140gkg0888rgngH147 4

%3 Pihudrie CC, | ee 62.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống cây hoa Hanh Phúc - 62.2.2 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cay mô tế bảo thực vật . - 62.2.3 Quy trình cơ bản phương pháp nuôi cấy mô tế bao thực vật -. - 7

2.2.3.1 Giai đoạn 1: Tạo vật liệu ban đầu - 2-2 2 +s+S+EE+E+EEE£EEEE2EEEEE2E E22 cxe 7

2.2.3.2 Giai đoạn 2: Nhân nhanh chủồi -22222¿+222222ctrrEErrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrre 8

2.2.3.3 Giai đoạn 3: Tao cây hoàn chỉnh - cee 25+ 221221221221 212212 1E re 8

2.2.3.4 Giai đoạn 4: Đưa cây ra Vườn ƯƠI - 2< +2 *** + Essreeerrerrrerrreerrerre 82.2.3.5 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô - 22-22 5222+222+2z++2zxzr+d 92.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy -22©225522s+2s22z2zz>xzzx 9

cs | 06 9

2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy - 2-22 2212222 22122322212212211271211211211211211211221 21c xe 9

2.2.4.3 Anh hưởng của pH va chat làm đông 2-22 2 2222+22E2E+zz+zzzzzzxzex 102.2.4.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật -¿-2- 2222++2z+2z++zxrrxrzzreex 102:3, [phiến cin trong’ Va ngoài THƯỚC sesecossses04555236066405484558585559684680351460095705g800186 5855 12 2.3.1.:ÌNEH1ỆN GỮU ONE HH xs cscsccsnsvesnnssnssasnsoneacesemersee 3u g4 gáE0966 60:5 00830481600/900388626194518 12

2 Sede, NEDISH GỮU Tgöãi TU OC sexe eeawersreesre cent renastrernesnieeeenenece erates mene 12Chương 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP -22©22+222222Z22E+zzzEzzzzezsez 143.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - +22 +2+++2+£E+£E+2E+Ezx+zzzxzxrrrrzree 14K4) 001 i6i3i2i0u 1 153.21 Đối tượng nghiền ŨU ee 153.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2-22 ©S2E£SE£EE£EES2EEEE2E22E225225221222.22.2e 153.3.3 Hóa chất sử dụng c S65 2< 01001111011 10100111011011 1101101001010 g01104 10 00 0 0 153.3.4 Điều kiện nuôi cấy 2- 2-52 2S+212212212212212121121211211211212121121212121 2e l63.3.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của dung dịch Povidon iodine10% đến khả năng sống của mẫu cây hoa Hạnh Phúc -2 -222222z22++>+2 16

3.3.2 Nội dung 2: Anh hưởng nồng độ phối hợp của chất điều hòa sinh trưởng BA và

Ki đến kha năng nhân chồi của cây hoa Hạnh Phúc -2222222222222255+2 173.3.3 Nội dung 3: Ảnh hưởng của chat điều hòa sinh trưởng IBA kết hop NAA đến khanăng tạo rễ của cây hoa Hạnh Phúc ¿2 2©22222E+2E£2E£2E2E£2E2E2EzEzrerrrrerree 19X1 Ftrtmprrfldtrsit a 20

Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-©22©22222222222E2222221222222122222222- 21

4.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của dung dịch Povidon iodine 10%

đến khả năng sống của mẫu cây hoa Hạnh Phúc -2- 2 2222222+22++2++zz+22+zz2 21

4.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng nồng độ phối hợp của chất điều hòa sinh trưởng BA và Kiđến khả năng nhân chỗi của cây hoa Hạnh Phúc -22©22252252+S2S22S2zz25+2 25Thí nghiệm 2: Khao sát ảnh hưởng nồng độ phối hợp của chất điều hòa sinh trưởng BA

và Ki đến khả năng nhân chồi của cây hoa Hạnh Phúc 2-22 ©52222+252222zz2 254.3 Nội dung 3: Anh hưởng của chat điều hòa sinh trưởng IBA kết hop NAA đến khamững la rễ gia cây hưua [lanh Dữ essesuaesnvuinnnotidsBihsts0A/0E44241013620810203800/010/,g088/G0000 28Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng IBA kết hợp NAA

đến khả năng tạo rễ của cây hoa Hạnh Phúc - 2 2 2222222z+2E++EE2E++2+zzzzzzzzex 28

Chương 5 KẾT LUẬN VA DE NGHỊ, - 2¿©22E+2E+2E22E22E22E22E221221222222222222e2 32

5.1 Kết luận - 2222 2221221211212212112111121121111211211121121111121111112111211212121211 re 32

TAL LIB TAM FAG 9 ỚớẢẲẢẲẢớớee ment ererevnenunenne 33PHU LUC

vii

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

: Povidone Iodine

: N-Nitroso-N-methylurea

viii

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 3.1 Bảng thành phần môi trường MS -2¿ 522 +2+2E+2E22E22E2E2Ezzzzze2 16Bảng 3.2 Bồ trí nghiệm thức ảnh hưởng của thời gian khử trùng của dung dịch Povidon

iodine 10% đến khả năng sống của mẫu cây hoa Hạnh Phúc - - ily

Bang 3.3 Ảnh hưởng nồng độ phối hop của chất điều hòa sinh trưởng BA và Ki đếnkhả năng nhân chỗi của cây hoa Hanh Phúc Error! Bookmark not defined.Bảng 3.4 Bảng bó trí nghiệm thức khảo sát sự ảnh hưởng của IBA và NAA lên quá

trình tạo rễ của cây hoa Hạnh Phúc - ¿2-2 222222 +*2E£EE2E£E2E2E£EEZE£EEEEzErzxzxrrrrree 19

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng dung dịch PovidoneTodine (10%) dé tạo vật liệu khởi đầu 2- 27222222 HE E2 221211121212 ceg 22

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và Ki đếnkhả năng nhân nhanh chồi của cây hoa Hạnh Phúc 22 2222222£+2222222£- 25

Bang 4.3 Kết qua khảo sát sự anh hưởng của chat điều hòa sinh trưởng IBA kết hợpNAA đến khả năng tạo rễ của cây hoa Hạnh Phúc - 2-2: 222+22222z+2x+zzzzze2 29

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hìnhi2.1: Gây boa Hành, PHỦ sescsassssness sso mmnausuxecen snesnsammnensenxnceseasssennnsreuaaeareanansmannnensn 3Hình 2.2 Hoa và chồi phat sinh từ hoa của cây hoa Hạnh Phúc - - 4Hình 4.1 Mẫu cây hoa Hanh Phúc sau 14 ngày nuôi cấy -z©5-+¿ 22Hình 4.2 Kết quả mẫu chồi cây hoa Hanh Phúc sau 6 tuần nuôi cấy 25Hình 4.3 Kết quả mẫu rễ cây hoa Hạnh Phúc sau 8 tuần nuôi cấy . - 31Hình 4.4 So đồ bước đầu xây dựng quy trình vi nhân giống cây hoa Hanh Phúc 32

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây hoa Hạnh Phúc (Alpinia purpurata) hay còn gọi là gừng tia, gừng hồng, riéng

đỏ là một loài cây thuộc chi Apinia, có nguồn gốc từ Samoa và cũng là quốc hoa củaquốc gia này Tại Samoa, loài hoa này được gọi với cái tên thân thương là “Teuila” tượngtrưng cho sức mạnh, quyền lực và sự kiên cường Ngoài ra, trong lĩnh vực phong thủy,

hoa Hạnh Phúc còn mang ý nghĩa về tài lộc và sự thịnh vượng Cây hoa Hạnh Phúc có

3 màu sắc phổ biến là đỏ, hồng và trắng Trong đó, hoa đỏ là loài hoa được ưa chuộng

và phận bố rộng rãi nhất Với màu sắc rực rỡ, độ bền cao, do đó hoa được sử dụng kháphô biến trong các dip quan trọng như các lễ hội truyền thống, lễ cưới hay các bữa tiệc

ở nhiều quốc gia trên thế giới

Mặt khác, cây hoa Hạnh Phúc còn là một vị thuốc dân gian được sử dụng đề chữatrị một sô bệnh liên quan đến hệ tiêu hóa như đau da dày, rối loạn đường ruột, khó tiêu.Các bệnh về da liễu như chàm, vảy nến, tác dụng giảm đau nhức, giảm đau cơ và điều

hòa cơn đau bụng kinh cũng là công dụng nổi bật trong đông y Các tác dụng này đã

được chứng minh thông qua một số nghiên cứu về các hoạt chất nổi bật như nghiên cứucủa Raj va ctv năm 2012 từ dịch chiết ethyl acetate của Alpinia purpurata cho kết quả

hầu hết các hợp chất phytochemical có nguồn gốc từ thực vật với tác dụng trị liệu như:

kháng khuẩn và chống ung thư Ngoài ra, còn có một số hợp chất khác như vitamin C,glutathione, ascorbate oxidase, malondialdehyde cho thay Alpinia purpurata có khả

năng loại bỏ các gốc tự do và bảo vệ chống lai stress oxy hóa gây bệnh Trong tương lai,

Alpinia purpurata có thé đóng vai trò là tác nhân được lý trị liệu tốt (Raj va ctv, 2016)

Ở một số quốc gia, chéi non của cây được sử dụng như một loại cây gia vi, tạo nên vi

cay the và hương vi đặc trưng cho các món ăn.

Trong một vài năm gần đây, nhu cầu về việc sử dụng hoa Hạnh Phúc trên thị trường

ngày càng tăng, không chỉ về khía cạnh cảnh quan, trang trí hay gia vị mà tính dược liệu

của loài cây này cũng đang được nghiên cứu và ứng dụng nhiều Phương pháp nhângiống chủ yếu là tách chdi từ bụi cây mẹ Tuy nhiên, phương pháp nay lại ảnh hưởng rat

lớn đến sức sống và sự phát triển của ca bụi cây mẹ lẫn cây con sau khi tách, bụi cây dé

bị sâu bệnh hại tấn công, mắt nhiều thời gian dé cây thích nghỉ và phát triển

Việc ứng dụng quy trình vi nhân giống vừa có thể giúp nhân nhanh, đồng loạt, tăng

tỉ lệ sống cho cây con, tạo cây sạch bệnh và cung cấp số lượng lớn cho thị trường Đây

có thê là biện pháp tối ưu khắc phục những hạn chế và phát huy tối đa giá trị của câyhoa Hạnh Phúc Xuất phát từ những yếu tô trên, nghiên cứu “Ảnh hưởng của các chat

điều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình vi nhân giống cây hoa Hạnh Phúc (Alpiniapurpurata)” được thực hiện nhằm mở ra hướng đi mới trong việc nhân giống và phát

triển bền vững các giá trị của cây hoa Hanh Phúc

1.2 Mục tiêu

Xác định được thời gian khử trùng tốt nhất của dung dịch Povidon iodine 10% đếnkhả năng sống của mẫu cây hoa Hạnh Phúc

Xác định được nồng độ kết hợp thích hợp của các chất điều hòa sinh trưởng thực

vật ảnh hưởng đến quá trình nhân chdi và kha năng tạo rễ của cây hoa Hạnh Phúc

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng dung dịch Povidon Iodine

10% dé tạo vật liệu khởi đầu

Nội dung 2: khảo sát ảnh hưởng nồng độ phối hợp của chất điều hòa sinh trưởng

BA và Kinetine đến khả năng nhân chồi của cây hoa Hạnh Phúc

Nội dung 3: khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng IBA kết hợpNAA đến khả năng tạo rễ của cây hoa Hạnh Phúc

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về cây hoa Hạnh Phúc (Alpinia purpurata)

2.1.1 Giới thiệu chung

Phân loại khoa học:

Giới : Plantae

: Angiospermae : Monocots

Tên gọi khác: gừng đỏ, gừng hồng, riéng tia, se tia, cây hoa Hanh Phúc

Nguồn gốc: Alpinia purpurata được tìm thay đầu tiên tại Samoe, sinh trưởng nhiều

ở Malaysia và Tây Nam Thái Bình Dương (New Caledonia, quần đảo Solomon và

Vanuatu) Được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới và du nhập vào Việt Nam như một loạicây cảnh mới.

2.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Là cây thảo mộc lâu năm, có mùi thơm, dạng bụi nhỏ, có rễ mọc ngang hoặc thân

củ lớn trong đất (Acevedo và Strong, 2005)

Lá dạng khuôn bầu dục dài từ 30 đến 80 cm, rộng từ 10 - 20 cm, nhọn ở đầu, xanh

bóng đậm, nồi gân lớn ở chính giữa, lá có bẹ ôm lay nhau tạo thân giả, cao từ 1 - 5 m

Hoa ở đỉnh tạo thành cụm dai từ 10 cm đến 40 cm, cánh hoa màu đỏ thầm đến đỏ

tươi, là biến thể của lá, xếp chồng lên nhau theo dạng đuôi chồn Ở các nách của cánhhoa có thể hình thành chéi non hoặc chéi hoa tùy theo điều kiện thô nhưỡng Tại Việt

Nam, cây thường hình thành chồi thay vì ra hoa và tạo quả

Thân rễ phát triển thành củ bám sâu và chặt trong đất, củ nhỏ, có nhiều đốt, hình

thành đỉnh sinh trưởng và chổi cây con (Wagner và ctv, 1999)

2.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái

Cây hoa Hạnh Phúc là loài chịu bóng hoàn toàn, nhu cầu nước cao Tuy nhiên, câykhông chịu được ngập úng và dễ bị thối rễ, củ Bụi cây sẽ tự lụi tàn sau khoảng 4 đến 5năm do nhu cầu dinh dưỡng cao, cần phải chuyên sang khu vực đất mới dé cây tiếp tục

sinh trưởng Cây chiu nam và chiu hạn kém (Kobayashi va ctv, 2007).

Ở Việt Nam, cây ra hoa rộ vào khoảng tháng 7 đến tháng 12 và hoa có thê giữ

khoảng 25 đến 30 ngày, sau khi tàn từ hoa có thé mọc ra các chỗi con

2.1.3 Giá trị kinh tế

Hình 2.2 Hoa va chôi phát sinh từ hoa của cây hoa Hạnh Phúc

Giá trị kinh tế chính mà cây mang lại hiện nay đến từ việc cung cấp hoa cắt cành

và cây cảnh quan đô thị Với cái tên ý nghĩa, hương thơm dịu nhẹ và độ bền cao, câyhoa Hạnh Phúc được sử dụng phổ biến trong các dip quan trọng như lễ, Tết Ngoài ra,

về mặt phong thủy, cây mang ý nghĩa của con sé 8 nên rất phù hợp cho việc kinh doanh,

tượng trưng cho tài lộc, sự thịnh vượng và thành công Ở một vài nước như Thái Lan,

khu vực Đại Tây Dương, cây hoa Hạnh Phúc đã được sử dụng như một loại cây gia vi

bằng việc sử dụng các chồi non và củ trong môt số món ăn Các bộ phận của cây cũng

được sử dụng như một loại trà giúp tăng sức đề kháng, giảm đau, giảm viêm

Trên thị trường hiện tại, giá cho một bụi cây hoa Hạnh Phúc giống gồm từ 3 - 5

cây trưởng thành sẽ được bán khoảng 120000 đồng và ở thị trường hoa cắt cành, nhucầu ngày càng tăng cao đặc biệt là vào các dịp lễ, Tết, giá cho 1 bông hoa Hạnh Phúc cóthê lên đến 20000 - 25000 đồng

2.1.4 Giá trị dược liệu

Các chùm hoa Alpinia purpurata được báo cáo là có chứa lectin (protein liên kết

với carbohydrate) Tim thấy 42 loại thành phần tinh dầu với B-caryophyllene, B-pinene

và a-pinene là hợp chất chính đã được xác định trong tinh dầu bởi GC-MS (Santos vactv, 2012) Đây cũng là các thành phần phô biến trong hầu hết các cây thuộc chỉ Alpinia,cây hoa Hạnh Phúc mang vị cay, tính ấm và được sử dụng trong các bài thuốc dân giangiúp giảm đau bụng day hơi, hỗ trợ tiêu hóa, trị ho, điều hòa cơn đau bụng kinh Bên

cạnh đó, cây còn mang một số hoạt chất kháng khuẩn cao nên thường được dùng đề điều

trị các bệnh về da

Nhiều công trình nghiên cứu trên thé giới cho thấy đây là một loại được liệu mớimang nhiều tiềm năng và cần được nghiên cứu sâu rộng hơn về các thành phần hợp chấttrong cây Điển hình là nghiên cứu của Villaflores va ctv vào năm 2010 khi phân tíchthành phan hợp chất có trong dịch chiết từ lá cây Alpinia purpurata in vitro kết quả trongdịch chiết chứa nhiều thành phan ức chế chống lại vi khuan Lao Mycobacterium

tuberculosis, tiêu biêu là kumatakenin, sitosteryl-3-O-6-palmitoyl-B-D-glucoside và

b-sitosteryl galactoside Trong đó, nghiên cứu của Murillo va ctv vào năm 2003 chứngminh rằng hoạt động của kumatakenin có tác dụng đối với M tuberculosis H 37 Rv

Trong nghiên cứu của Fukai và ctv (2000) hợp chất kumatakenin còn có hoạt tính kháng

virus, chống lại HIV - là loại virus làm trầm trọng thêm vấn đề về bệnh lao (TB) do tínhnhạy cảm với mam bệnh phi Sterol thực vật, đặc biệt là B-sitosterol và glucoside cua

nó, đã được nghiên cứu như là chất điều hòa miễn dịch đối với hoạt động của tế bào T

(Bouic va ctv, 1996) và là tác nhân duy trì số lượng CD4* khi không điều trị bằng thuốc

kháng vi-rút ở bệnh nhân nhiễm HIV (Breytenbach va ctv, 2001) Sterol thực vật có hiệu

quả ở những bệnh nhân được điều trị bệnh lao phổi, làm tăng số lượng tế bào lymphotrong máu ngoại vi và số lượng bạch cầu ái toan (Donald và ctv, 1997) Thành phầnkumatakenin trong cây hoa Hạnh Phúc được chứng minh làm giảm viêm dai tràng doDSS (dextran sodium sulfate) phần lớn bằng cách ức chế bệnh ferroptosis biểu mô, có

liên quan đến việc kích hoạt Eno3 và sau đó làm thoái hóa IRP1 (Iron regulatory protein

1) cũng như cân bằng nội môi của nồng độ sắt trong tế bào (Arenbaoligao và ctv, 2023).Ngoài ra, nhờ đặc tính kháng khuẩn của các hợp chất có trong cây mà còn có thể sảnxuất các sản pham điều trị mun và các bệnh da liễu khác (Yustica va ctv, 2019)

Chiết xuất $ aromaticum và A purpurata đã được chứng minh là giải pháp thaythé trong điều trị tình trạng kháng nắm Candida krusei (Aisy và ctv, 2023) Một nghiêncứu khác của nhóm các nhà khoa học tại trường Đại học Karpagam (Ấn Độ) về hoạt

động chống oxy hóa, gây độc tế bào và gây chết tế bào của chiết xuất thô từ lá cây

5

Alpinia purpurafa trên dòng tế bào Hela — dòng tế bào ung thư cổ tử cung trên chuột,nghiên cứu đã mang lại kết quả đầy khả quan về khả năng chống lại các tế bào ung thưnày (Oirere va ctv, 2016).

Trong một nghiên cứu mới đây của Palanirajan năm 2022 về hoạt động chống ung

thư của Alpinia purpurata chéng lai ung thư tuyến tiền liệt do MNU va testosterone gây

ra ở chuột đực Wistar bach tang cho thay rang Alpinia purpurata có thé được sử dungnhư một tac nhân chống ung thư dé kiểm soát ung thư biểu mô trong tương lai

2.2 Phương pháp nhân giống

2.2.1 Phương pháp nhân giống truyền thống cây hoa Hạnh Phúc

Tương tự các loài cây họ nhà riềng, gừng Cây hoa Hạnh Phúc thường được nhângiống bằng phương pháp tách bụi hoặc trồng bằng củ Bên cạnh đó, hoa của cây cũng

có thé phat sinh tạo thành các chỗồi con và có khả năng nhân giống từ các chdi con đó

Thời gian thích hợp cho việc nhân giống là sau mùa rộ của hoa hoặc vào mùa mưa

Bụi cây con hoặc củ sau khi được tách từ cây mẹ nên được trồng ở các vùng đất

tơi xốp, đủ độ 4m và thông thoáng Là một loài cây chịu bóng và ưa âm nên cần chon

những nơi có bóng ram và tưới đủ nước dé cây có thể nhanh chóng thích nghỉ

Phương pháp nhân giông truyền thống với ưu điểm là dé dàng, tiện lợi và ít tốn chiphí Tuy nhiên, các phương pháp này làm ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của cây

mẹ và bụi cây con sau khi tách ra Là một loài cây liên rễ nên cây mẹ rất dễ bị mat sức

dẫn đến lụi tàn nếu tách bụi thường xuyên, sâu bệnh hại dễ tan công vào các vết cắt hoặccây con làm giảm khả năng thích nghi của cây, kéo dài thời gian nhân giống

2.2.2 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nhân giống bằng nuôi cay mô tế bào thực vật là một hình thức nhângiống mới và được ứng dụng nhiều trong nền nông nghiệp công nghệ cao Có thể địnhnghĩa đơn giản phương pháp này là quá trình tổng hợp các phương pháp nuôi cấy cơquan, tế bào, mô trong điều kiện dinh dưỡng nhân tạo ở điều kiện vô trùng (Thorpe, 2007)

Các nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy mô tế bào thực vật từ những năm dau thé ki

XX khi Gottlieb Haberlandt thực hiện các thí nghiệm để duy trì các tế bào trung mô

trong môi trường nuôi cấy dựa trên các ý tưởng được đề xuất thiết lập “tính toàn năng

của tế bào thực vật” (Garcia-Gonzales và ctv, 2010) Tính toàn nang của tế bào thực vật

là khả năng của các tế bào đã được biệt hóa (trừ một số loại tế bao đã được biệt hóa sâunhư ống mạch mao dẫn) có khả năng thê hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thê trong

6

điều kiện phù hợp có thể phát triển theo chu kì giống sự phát triển của phôi và đi đếnhình thành cây hoàn chỉnh.

Một trong những yếu tô quyết định sự thành công của phương pháp nuôi cấy mô

tế bào thực vật chính là môi trường nuôi cấy Hiện tại, môi trường MS (Murashige và

Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng phô biến và thích hợp với nhiều loại cây Do

đó, nó thường được sử dụng làm môi trường nuôi cấy khởi đầu Khoáng đa lượng,

khoáng vi lượng, vitamin, đường, chất làm đông, chất điều hòa sinh trưởng là các yếu

tố tạo nên môi trường Thành phan và nồng độ các chất có thể được điều chỉnh dé phù

hợp với từng loại cây và từng giai đoạn phát triển

Khoáng đa lượng rất cần cho cây và có ảnh hưởng rất lớn cho sự hấp thu từ cácmẫu cây Nhu cầu khoáng đa lượng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây

trồng tự nhiên như nitơ (N), kali (K), magie (Mg) và canxi (Ca) Khoáng vi lượng là

khoáng mà cây trồng chỉ cần ít nhưng không thê thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển.Tuy nhiên có một số trường hợp, một số khoáng vi lượng là không cần thiết Các khoáng

vi lượng thường dùng trong nuôi cấy mô như mangan (Mn), boron (B), kẽm (Zn), đồng

(Cu), cobalt (Co), molybden (Mo) và idodine (I) Thực vật cần vitamin cho sự tăngtrưởng và phát triển, xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau các vitamin thườngđược sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là thiamine (B1), pyridoxine (B6), glycine,

nicotinic acid và myo-inositol Các mẫu tế bào, mô nuôi cay không thé quang hợp hoặc

quang hợp rất thấp do thiếu clorophin, nồng độ CO: và nhiều điều kiện khác Vì vậy,hợp chất carbohydrate được đưa vào thành phần nuôi cấy Đường được sử dụng phổbiến vì vừa là nguồn carbohydrate cung cấp cho mẫu cấy vừa điều chỉnh khả năng thầmthấu của môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

2.2.3 Quy trình cơ bản phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.3.1 Giai đoạn 1: Tạo vật liệu ban đầu

Đây là giai đoạn quan trọng và quyết định cho cả quá trình nuôi cấy mô

Việc lựa chọn vật liệu ban đầu rất quan trọng, không nên chọn mẫu quá non hoặcquá già, cây trồng được chon làm vật liệu khử trùng cần được cách ly 2 - 3 ngày dé hạnchế tối da các tác nhân gây nhiễm nam và nhiễm khuẩn Mẫu có thé là đỉnh sinh trưởng,chéi, hoa, hạt, lá, thân, rễ, củ hoặc các mô, cơ quan khác của cây

Quá trình khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu là một kỹ thuật khó bao gồm nhiềubước và ứng với từng loại mẫu và từng loại cây khác nhau sẽ có các quy trình riêng biệt

về thời gian và nồng độ các chất khử trùng Một vài chất khử trùng thông dụng như:

Javel, cồn, xà phòng, thuốc nắm đối với các mẫu khó va dé nhiễm có thé sử dụng thêm

kháng sinh, nano bạc, HgC]a Các chất khử trùng phải được sử dụng ở nồng độ hợp lý,không gây độc cho người cũng như mẫu cấy Sau khi khử trùng, mẫu phải được rửa sạch

lại với nước cất vô trùng, loại bỏ các phần bị hoại tử, hư hại và chuyên sang môi trừngnuôi cay (Tran Thị Dung, 2003)

2.2.3.2 Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi

Tái sinh mẫu nuôi cấy: ở gian đoạn này, mẫu sạch được thích nghi và dan tái sinhtrong môi trường dinh dưỡng Ngoài ra, khi khử trùng thì cần quan tâm đến tuôi sinh lýcủa mau cấy, nếu mau quá non thì khi khử trùng mẫu cấy rất dé bị tốn thương, gây ngộđộc dẫn đến chết mẫu cấy, nếu mẫu cấy quá già thì khó có khả năng tái sinh vì mẫu đã

phân hoá thành một mô hoặc một cơ quan của cây (Trần Thị Dung, 2003)

Sau giai đoạn tái sinh, mẫu cay có thé được định hướng phát triển bằng cách bỗsung các chất kích thích sinh trưởng thực vật vào môi trường nuôi cấy Quá trình này

được xem là giai đoạn then chốt quyết định số lượng cây có thê tạo ra, dé tăng hệ số

nhân thì cần bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng như

là auxin, cytokinin giúp kích thích chéi bất định hoặc phát triển chồi bên từ mẫu cấy,ngoài ra tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, số lượng cây tạo thành cũng phụ thuộc

vào số lần cấy chuyền, các yếu tố độ âm, nhiệt độ và ánh sáng cũng cần được chú ý

(Trần Thị Dung, 2003)

2.2.3.3 Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh

Cây được coi là cây hoàn chỉnh khi cây có đủ các điều kiện về chiều cao, số lá vàđặc biệt là bộ rễ khỏe mạnh, đủ sức dé có thé nhanh chóng thích nghỉ với điều kiện bênngoài Sau quá trình nhân chi, giai đoạn tạo rễ cho cây dé tạo nên một cây giống hoàn

chỉnh được thực hiện nhờ sự bố sung auxin vào môi trường nuôi cay Giúp các choi hình

thành nên bộ rễ khỏe mạnh, là cơ sở vững chắc cho quá trình ra vườn

Ngoài nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng auxin được bé sung vào môi trườngnuôi cấy thì độ pH, nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến việc hình thành bộ rễ

2.2.3.4 Giai đoạn 4: Đưa cây ra vườn ươm

Khi cây đáp ứng đủ các điều kiện để được đánh giá là một cây giống khỏe mạnh,cây được đưa ra môi trường trong nhà lưới để làm quen với môi trường xung quanh Sau

đó, cây con được xử lí loại bỏ thạch từ môi trường nuôi cấy, ngâm với các thuốc kích rễ

§

và thuốc nam dé bảo vệ hệ rễ Đây là giai đoạn quan trong trong quá trình nhân giống ởgiai đoạn ex vitro va néu khong can than sé gay thất thoát một lượng lớn cây con Do

đó, cần tạo một môi trường tương tự như trong in vitro (độ ầm, nhiệt độ, ánh sáng) hoặcđiều kiện môi trường khác biệt không quá lớn so với in vitro dé cây có thê tập thích nghi

Các điều kiện môi trường này sẽ được thay đổi dần đến khi giống với các điều kiệnngoài đồng ruộng

2.2.3.5 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cây mô tế bào thực vật đang được phát triển, phố biến rộng rãi

trong nghiên cứu tế bào (sinh lý, sinh hóa, di truyền), chọn tạo giống thực vật, sản xuất

phục vụ cho nền nông nghiệp Từ những mẫu cây nhỏ, ít, phương pháp này đã đem lạimột lượng lớn cây giống và đồng nhất về mặt di truyền trong một khoảng thời gian ngắn

Các cây giống được tuyên chọn và sản xuất trong điều kiện vô trùng nên được đảm bảo

về mặt chất lượng và sạch bệnh

Có thé sử dụng phương pháp này dé nhân nhanh va bảo tồn các nguồn giống quý

hiểm với nguồn vật liệu ít Bảo tồn nguồn gen

Phương pháp nuôi cấy mô được thực hiện trong điều kiện môi trường nhân tạo nên

có thé chủ động thay đổi dé tạo môi trường phù hợp nhất cho sự phát triển của cây, chủ

động được về thời gian san xuất, không phụ thuộc vào thời tiết hoặc vụ mùa.

2.2.4 Các yếu tố ảnh hướng đến quá trình nuôi cấy

2.2.4.1 Nguồn mẫu ban đầu

Nguồn mẫu và mô nuôi cấy quyết định rất lớn đến sự thành công của quy trìnhnuôi cấy mô tế bao thực vật Day là nguồn vật liệu khởi dau, là nền tảng, nguồn gen chotoàn bộ cây con sau này Việc chọn mẫu làm vật liệu phải đáp ứng các yêu cầu về: tínhtrạng, nguồn gen, tuổi sinh lý, loại mẫu và đặc biệt là không bị sâu bệnh hay nhiễm vi

sinh vật Tùy vào từng loại mẫu (chồi, đốt thân, củ, lá, phát hoa) sẽ có các phương phápkhử trùng khác nhau dé tạo nên vật liệu khởi đầu cho quá trình vi nhân giống sau này

2.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy

Phương pháp nuôi cây mô được thực hiện trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, do

đó có thé chủ động thay đổi dé phù hợp với đặc tính sinh trưởng của từng loại cây vàtừng giai đoạn phát triển Các yếu tố như: nhiệt độ, ánh sáng, độ 4m ảnh hưởng trực tiếpđên sự sinh trưởng của mẫu, do đó cần được điều chỉnh và theo dõi can thận Nhiệt độ

phù hợp là từ 20 - 25°C, độ âm từ 50 - 70%, phòng cấy phải được đồng nhất về nhiệt độ

và độ âm

2.2.4.3 Ảnh hưởng của pH và chất làm đông

Độ pH của môi trường nuôi cấy mô thực vật là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng

đến lượng dinh dưỡng sẵn có và sự phát triển trong môi trường nuôi cấy (Arnon, 1942;

George, 2008) Trong khi nhiều loài thực vật trong nuôi cấy mô có thể phát triển trongphạm vi giá trị pH rộng trong khoảng 4,0 đến 7,2, kết quả tăng trưởng tốt nhất thườngthu được với môi trường có tính axit nhẹ, điển hình là khoảng pH 5,8 (George, 2008).Hơn nữa, độ pH của môi trường thực sự ảnh hưởng lớn đến các đặc điểm hình thái của

vật liệu cấy, chăng hạn như sự phát sinh hình thái của nuôi cay tế bào thành mô sẹo, rễ

và nuôi cấy chồi bat định (Leifert, 1992)

Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng mà không có giá thé đỡ mẫu

thì mô mẫu có thé bị chìm va sẽ chết vì thiếu oxy Dé tránh tình trạng này, chat làm đôngđược thêm vào với mục đích giữ nước, giữ chất dinh dưỡng và làm tạo nên giá thể giữ

mẫu Agar là chất được sử dụng phổ biến nhất bên cạnh các chất như: phytagel, agarose,bột sẵn dây Nồng độ thường giao động từ 6 - 10 g/L

2.2.4.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Có 4 nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

là auxin, cytokinin, gibberelin và acid abscisic Mỗi nhóm nhất sẽ ứng với các tác dụngđiều hòa, điều hướng sự phát triển của các mô cơ quan thực vật khác nhau Trong đó 2nhóm auxin và cytokinin là 2 nhóm được sử dụng chủ yếu Cả auxin và cytokinin đềuđược bổ sung vào môi trường nuôi cấy dé kích thích sự phát sinh hình thái và tỷ lệhormone sử dung đề kích thích sự tạo chi hay tạo rễ không giống nhau Tùy theo giống,loài thực vật mà nhu cầu về loại và nồng độ của auxin va cytokinin khác nhau trong sựphát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Auxin là nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật thúc đây sự sinh trưởng và giãn

nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tong hợp và trao đổi chất Auxin tự nhiênđược tìm thấy ở thực vật là IAA, auxin tổng hợp là 2,4 - dichlorphenolxyacetic acid(2,4-D), ơ - napthanlene acetic acid (NAA) va indole - 3 - butyric acid (IBA) Ở thựcvật, auxin thường được vận chuyền bằng hai con đường riêng biệt Trong toàn bộ cây,hầu hết auxin có thê được vận chuyền ra khỏi các mô nguồn (lá non và hoa) bằng mộtkênh vận chuyền không được kiểm soát trong các mô vận chuyên (phloem) trưởng

10

thành Ngoài ra, sự vận chuyên định hướng từ tế bào đến tế bào qua trung gian bằng chất

mang, được điều hòa, đi chuyền chậm, vận chuyền auxin trong mô mạch từ chéi về phía

đỉnh rễ (Goldsmith, 1977) và cơ chế này cũng làm trung gian cho sự di chuyển auxintrong phạm vi ngắn trong các mô khác nhau (Jan va ctv, 2009)

Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy

dé kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bao và điều hòa sự phát sinh hình

thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin Sự áp dụng loại va

nồng độ auxin trong môi trường nuôi cay phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc pháttriển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy, khả năng tổng hợp auxin

tự nhiên của mẫu cấy, sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh Vai

trò của các chất thuộc nhóm auxin: kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào, kích thích

chồi bên sản sinh ra ethylen làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh, kích thích sự mọc rễ

ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chỗồi phụ trong nuôi cấy mô Auxin có ảnh hưởngkhác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa

trong mối quan hệ với điều kiện mô trường, tạo và nhân nhanh mô sẹo, kích thích tạo

chéi bắt định, tao phôi soma

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếuđến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chdi trong nuôi cấy mô

Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6 benzylaminopurine (BAP) hoặc 6

benzyladenin (BA) 6-y-y dimethyl-aminopurine (2-iP), N-2-furfurylamino)- | 6- amine (kinetin), và 6-(4-hydroxyl-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin), (TDZ) thidiaruzon Zeatin va 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA, TDZ va kinetin làcác cytokinin nhân tạo Cytokinin có thé kích thích sự trưởng thành của diệp lục và lamchậm sự lão hóa của cây Khi phối hợp cùng với auxin, cytokinin sẽ kích thích sự phân

H-purine-chia tế bao và điều khiển sự phát sinh hình thái Khi được b6 sung vào trong môi trường

nuôi cấy chéi thì những hợp chất này sẽ phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn vakích thích sự hoạt động của chỗồi bên Ty lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho hìnhthành rẻ và thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chỗồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằngthì thuận lợi cho phát triển mô sẹo Kinetin, BA, TDZ là các cytokinin tổng hợp thườngđược sử dụng trong nuôi cấy mô (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Theo nghiên cứu của LêVăn Hoàng năm 2018 , chức năng chủ yếu của cytokinin như sau: kích thích phân chia

tế bào, tạo và nhân callus, kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô, kích thích phát

11

sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thé của chéi đỉnh, làm tăng diện tích phiến lá

do kích thích sự lớn lên của tế bào, có thể làm tăng sự mở của khí không ở một số loài,tạo ch6i bất định, ức chế sự hình thành rễ, ức chế sự kéo dài chồi, ức chế quá trình già

(hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục.

BA và Ki là các loại cytokinin tong hợp kích thích mạnh mẽ sự phân chia tế bao,

tăng kích thước của tế bao và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn can sự lão hóa mô,

thúc đây sự hình thành chồi non nhưng ức chế sự tạo rễ Hầu hết các loại cytokinin được

sử dụng trong việc tạo chéi ở các loài thực vật khác nhau

2.3 Nghiên cứu trong và ngoài nước

Hầu hết các nghiên cứu về cây hoa Hạnh Phúc được thực hiện nhằm mục đích tìmhiểu và chứng minh tác dụng các thành phần hoạt tính có trong cây Đây là một loài

dược liệu mới, tiềm năng và cần được phát triển nhiều hơn Các nghiên cứu về việc vi

nhân giống cây vẫn còn ít và hạn chế về phương pháp cũng như quy trình

2.3.1 Nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, cây hoa Hạnh Phúc được biết đến như một loài cây cảnh quan trang

trí, ít được biết đến và còn rất ít nghiên cứu Nồi bật có thé kế đến như “Nghiên cứuthành phần hóa học và xác định cấu trúc một số chất trong dịch chiết thân rễ của câyriéng (Alpinia purpurata) ở thành phố Hội An - Quảng Nam” của Lê Vũ Châu và H6Thế Hà năm 2011 cho thấy dựa trên sắc kí đồ GC/MS của dịch chiết thân rễ trong dungmôi n-hexan, thấy có 61 chất Trong nó, cau tử có hàm lượng cao nhất là este methylHexadecanoat (23,85%) với thời gian lưu là 34,63 phút Ngoài ra, những cấu tử có hàmlượng lớn phải kể nến nó là ester methyl 9,12- Octadecadienoat (21,05%) với thời gian

lưu 38,6 phút, 18- este methyl 9,12,15- Octadecatrienoat (10,24%) với thời gian lưu

38,74 phút, B - Himachalene (4,38%) với thời gian lưu 27,74 phút, Germacrene B(CAS) (2,74%) với thời gian lưu 27,62 phút, B - Elemene (2,05%) với thời gian lưu 19,77 phút).

Từ các hợp chất được phân tích trên cho thấy đây là một loại cây dược liệu tiềm năng

và cần được nghiên cứu nhiều hon, đặc biệt là nghiên cứu về quy trình vi nhân giống détạo nên một nguồn giống chất lượng, đảm bảo số lượng và đáp ứng được nhu cầu của

thị trường về nhiều mặt khác nhau

2.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, các chi gừng, riềng đang là xu hướng nghiên cứu mới về các hoạt

tính và tác dụng dé ứng dụng vào các phương pháp điều trị theo hướng dược liệu thiên

12

nhiên vì chúng ít tác dụng phụ và ít gây hại đến môi trường như các phương pháp tônghợp hóa học khác Trong các nghiên cứu mới nhất, Arenbaoligao và ctv năm 2023 đãchứng minh được kumatakenin trong cây hoa Hạnh Phúc có tác dụng làm giảm các triệu

chứng viêm đại tràng ở chuột do dextran sodium sulfate (DSS) gây ra, làm giảm sản

xuất cytokine và phục hồi tình trạng mất hàng rào biểu mô ở chuột bị viêm đại tràng, ức

chế bệnh ferroptosis trong tế bào biểu mô đại tràng từ chuột bị viêm dai tràng Sản pham

tự nhiên sở hữu một số ưu điểm (ít tác dụng phụ, ít độc tính tế bào, tiết kiệm hơn, đa

mục tiêu) trong điều trị bệnh so với các thuốc sử dụng trên lâm sàng Vì vậy, các sản

phẩm tự nhiên được coi là nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn cho việc khám phá thuốcInflammatory Bowel Disease (IBD) Trong nghiên cứu của Ferreira và ctv năm 2018 vềkhả năng kháng khuẩn của Alpinia purpurata lectin (ApuL) cho thay cụm hoa Alpinia

purpurata chứa lectin có hoạt động điều hòa miễn dịch trên tế bào người Trong nghiên

cứu này, người ta đã đánh giá tác dụng kháng khuẩn và kháng nam của ApuL đối vớimam bệnh ở người ApuL cho thấy hoạt tính kháng khuan đối với chủng Staphylococcus

Aureus không kháng thuốc và chủng Staphylococcus Aureus kháng oxacillin với nồng

độ ức chế tối thiểu (MICso) lần lượt là 50 và 400 pg/mL Ngoài ra, nó còn cho thấy tác

dụng diệt khuẩn đối với chủng phân lập không kháng thuốc (nồng độ diệt khuẩn tối

thiểu: 200 g/mL) Đối với Candida albicans va Candida parapsilosis, ApuL cho thaytac dụng diệt nắm (MICso: 200 và 400 ug/mL tương ứng) Ở một số quốc gia, các nhà

máy sử dụng cây hoa Hạnh Phúc để sản xuất nhiều sản phẩm hữu ích như thực phẩm,gia VỊ, thuốc, nước hoa, thuốc nhuộm và giấy sợi (Delira và ctv, 2015) Ở Án Độ, thân

rễ được sử dụng trong y học dân tộc dé chữa đau dau, đau họng, thấp khớp và nhiễm

trùng thận cũng như cải thiện giọng nói, vi giác va sự thèm ăn Ở Venezuela, việc truyền

nước nóng từ chùm hoa Alpinia purpurata được sử dung để điều trị triệu chứng ho

(Palanirajan và ctv, 2022) Cac lectin từ chùm hoa của Alpinia purpurata cho thay khả

năng chống bệnh bach cau (Brito va ctv, 2023)

Các nghiên cứu về xây dựng quy trình vi nhân giống hoa Hạnh Phúc trên thé giớivẫn còn khá it, có thé kế đến như nghiên cứu Đánh giá sucrose và GA3 trong nuôi cấychỗi in vitro loài Alpinia purpurata (Zingiberaceae): Sucrose và GA3 trên chỗi in vitro

A purpurata của Suarez vào năm 2020 kết luận rằng việc cung cấp GA3 ngày càng tăngtrong môi trường nuôi cấy làm giảm số lượng chồi trên mỗi lần cấy của A purpurata,nhưng tăng chiều dài của chúng Ngoài ra, chiều dài và số lượng lá trong chồi của A

13

purpurata giảm khi hàm lượng sucrose tăng lên trong môi trường nuôi cấy Cuối cùng,

các mam vi nhân giống có chiều dai tốt hơn, vì chúng tăng lên khi mức GA3 là 1,0 mg/L,

bat kế mức sucrose (Suarez và ctv, 2020)

Rutin là flavonoid tự nhiên có tác dụng hỗ trợ hạ đường huyết, hạ huyết áp vàchống oxy hóa Dé nghiên cứu quá trình sản xuất rutin in vitro, Kale và Namdeo đã thiếtlập quy trình vi nhân giống Alpinia purpurata Mục tiêu cụ thé của nghiên cứu này làkiểm tra một số phương pháp đơn giản và tiết kiệm chi phí hơn cho quá trình vi nhângiống Alpinia purpurata nhằm xác định lượng rutin có trong loài cây này Sự tích lũyflavonoid được đánh giá thông qua các mẫu cây của Alpinia purpurata in vitro bằngphương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Alpinia purpurata được nuôicấy trên môi trường MS bồ sung các chất thay thé chi phí thấp như nước dừa, đường và

bột ngô thương mại làm chất tạo gel thay thế, bé sung các chất điều hòa sinh trưởng

thực vật bao gồm: BA, Kinetin, NAA, IAA va 2,4 D ở các khoảng nông độ khác nhau

đối với mô sẹo, chồi và sự hình thành rễ Với sự kết hợp của các chất phu gia chi phi

thấp trong môi trường MS, kết qua tốt nhất của Alpinia purpurata được ghi nhận ở 2,4D

2 mg/L va kinetin 2 mg/L dé khởi tao mô sẹo Số chéi tối đa dat 9 -11 chồi được quansát thay trong môi trường MS có bồ sung NAA 0,1 mg/L va BA 3,0 mg/L Sự phát sinhcủa rễ được ghi nhận trong môi trường bé sung IAA với nồng độ 3 mg/L Kết quả củaphương pháp HPTLC cho thấy hàm lượng rutin trong dịch chiết lá Alpinia purpuratacao hơn khi cây trồng nuôi cấy mô chỉ phí thấp với 20% nước dừa, 3% đường và chấttao gel 100 gm/1 so với cây trồng tự nhiên Nghiên cứu này chi ra rang môi trường chiphí thấp trong nuôi cay mô Alpinia purpurata có thé là một phương pháp thay thế có giátrị dé sản xuất rutin (Kale và Namdeo, 2015)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian va địa diém nghiên cứu

Thời gian thực hiện từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật (BIO203),Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

14

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện với đối tượng là cây hoa Hạnh Phúc, tên khoa học là

Alpinia pupurata Cây được trồng và chăm sóc tại khu vực thực nghiệm của phòng thí

nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật (BIO203), Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại

học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

Chồi non phát sinh từ thân củ là vật liệu chính được sử dụng làm thí nghiệm Chéiđược chọn là những chồi non khỏe, sạch bệnh

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Dụng cu: dao cấy, dia cấy, kéo, kẹp, bình thủy tinh, bình nuôi cấy, bình xịt cồn,đèn cồn, găng tay, bông gon

Thiết bị: tủ cay vô trùng, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, máy khuấy từ, cân kỹ thuật,

máy đo pH, máy cất nước, máy điều hòa nhiệt độ, đèn led nuôi cấy, kệ nuôi cây

3.3.3 Hóa chất sử dụng

Các hóa chất sử dụng cho quá trình khử trùng mẫu bao gồm: Ethanol 70°, dung

dịch Ca(OC])a 15%, kháng sinh và dung dịch Povidone Iodine 10%.

Môi trường dinh dưỡng MS (Muraskige và Skoog, 1962) có bổ sung 30 g/L đường

và 7,5 g/L agar được sử dụng làm môi trường nuôi cấy, giá trị pH của môi trường nuôi

cấy trước khi hap khử trùng khoảng 5,7 - 5,8 B6 sung các chất điều hòa sinh trưởng là

BA, Kinetine (Ki), NAA và IBA với nồng độ tùy theo từng nghiệm thức của các thínghiệm Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm trong

15 phút.

15

Bảng 3.1 Bảng thành phần môi trường MS

Thành phân Hoá chất Nông độ (mg/L)

KNO3 1900 NH4NO3 1650 Khoáng đa lượng MgSOx.7HaO 370

CaCl2.2H20 440

KH2PO4 170 CoCl2.6H20 0,025 CuSO4.5H20 0,025 H3BO3 6,20 Khoáng vi lượng KI 0,83

MnSOx.4H2O 22,30 Na2Mo04.2H20 0,25 ZnSO4.7H20 8,60 Na2EDTA.2H20 37,3

" FeSO¿.7H›O 57/8

Glycine 2,0 Myo-Inositol 10,0

Vitamin Nicotinic acid 0,5

Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine-HCI 0,1

3.3.4 Diéu kién nudi cay

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

Nhiệt độ nuôi cấy: 25 - 27°C

Cường độ chiếu sáng: 2500 lux

Độ ẩm: 65 - 70%

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng của dung dịch Povidoniodine 10% đến khả năng sống của mẫu cây hoa Hạnh Phúc

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng dung dịch Povidonlodine (10%) dé tạo vật liệu khởi đầu

16

Các bước tiến hành:

Mau chồi thân củ của cây 1 năm tuổi sẽ được thu nhận từ nhà lưới phòng Nuôi cấy

mô tế bào thực vật, khoa Khoa học Sinh học, rửa sạch và loại bỏ các phần không cần

thiết Chọn các mẫu chồi to, khỏe, sạch bệnh, khoảng 2 đến 3cm và chưa hình thành bẹ

lá để làm vật liệu

Mẫu được ngâm xà phòng loãng trong 15 phút, rửa lại với nước Ngâm mẫu trong

dung dịch Bavistin 1% 15 phút, rửa lại 2 lần với nước Lau mẫu lại bằng cồn 70° Chovào bình tam giác Mẫu được đưa vào tủ cấy và tién hành bồ trí thí nghiệm

Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 yếu té là sựảnh hưởng của thời gian khử trùng thay đổi từ 5 đến 30 phút, gồm 7 nghiệm thức với 3

lần lặp lại Mỗi nghiệm thức gồm 7 bình Tổng số mẫu của thí nghiệm là 147 mau Thí

nghiệm được bồ trí như bảng 3.2

Bảng 3.2 Bồ trí nghiệm thức ảnh hưởng của thời gian khử trùng của dung dịch Povidon

iodine 10% đến kha năng sống của mẫu cây hoa Hanh Phúc

Nghiệm thức Marea ae Miu/lan lặp lại A0®C) 0 9

Al 5 9 A2 10 9 A3 15 9 A4 20 9 A5 15 9 A6 30 9

Chi tiêu theo dõi va ghi nhận số liệu sau 14 ngày nuôi cấy

mm 4 (9) _ sé mẫu không nhiễm 100

Tied h tái sinh 5⁄4 = 3 số mẫu sống và không nhiễm —

oie mau seen tet GÌ 2) = ® số mẫu không nhiễm của nghiệm thức ö

3.3.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng nồng độ phối hợp của chất điều hòa sinh trưởng BA

và Ki đến khả năng nhân chồi của cây hoa Hạnh Phúc

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ phối hợp của chất điều hòa sinh trưởng

BA và Ki đến khả năng nhân chỗi của cây hoa Hạnh Phúc

17