Mặt khác, điều kiện phân tích trong các chuyên luận Dược điên không phù hợp với điều kiện thực te cùa phòng thí nghiệm, nhằm phát triên thêm các phương pháp phân tích các che phâm đa thà
TỔNG QUAN
Tính cấp thiết của đề án
Trong bối cảnli sức kliòe hiện nay tại Việt Nam, bệnh tăng huyết áp và bệnh tim mạch đang là các van đề quantrọng,đặc biệt là trong dân số người lớn tuôi Bệnlităng huyết áp được coi là yếu tố nguy cơ tim mạch hàng đầu, gây tỷ lệ từ vong và mắc bệnh cao hơn so với nhiều nguyên nhân khác nliư hút thuốc lá hoặc tăng đường huyết Tuy có nhiều thuốc chống tăng huyết áp khả dụng, nhưng một số kliông ít các bệnh nhân không đạt được chi số huyết áp mong muốn và vì vậy vẫn có nguy cơ tim mạch cao.
Tan suất mắc bệnli tăng huyết áp ờ người lớn tại Việt Nam ngày càng tăng Đê đáp ứng nhu cầu này, các loại thuốc đa thànhphần đang được phát triên, kết hợp tác dụng của các dược chấtkhác nhauđê cung cấp giãi phápđiều trị hiệuquã hơn
Irbesartan phối hợp với hydroclorothiazid với liều cố định là một liệu pháp phối hợp chống tănghuyết áp được côngnhậnđê điềutrị bệnh nhânkhông kiêm soát được huyết áp một cách thỏa đáng bangđơn trị liệu và đêđiều trịban đầu cho bệnhnhân cókliả năng cần dùng nhiều thuốc đê đạtđược huyết áp mongmuốn.
Ngành công nghiệp dược phẩm ngàycàng phát triêntạo điều kiện cho việcphát triêncác loại thuốc đa thànhphần, kết hợp nhiều dược chất ngày càng phô biến Hiện nay, trên thị trường dược phàmxuất hiện nhiều chế phàm thuốc đa thànli phan trị tăng huyết áp dưới dạng phối hợp với thuốc lợi tiêu như: amlodipinphối hợp với hydroclorothiazin, các chấtnhóm sartan (irbesartan, valsartan, losartan, )phốihợp với hydroclorothiazid,
Hiện nay, đê kiêm soát chất lượng cũa các chế phàm đa thành phan là vấn đề khó kliăn cho cácphòng kiêm nghiệm Do các chuyênluận Dược điên vechế phẩmđathành phần cũngcòn hạn chế Mặt khác, điều kiện phân tích trong các chuyên luận Dược điên không phù hợp với điều kiện thực te cùa phòngthínghiệm, nhằm phát triên thêmcác phương pháp phân tích các chephâm đa thành phan,đề tài: "Xây dựng quy trìnhphân tích đồngthời hydroclothiazid và ỉrbesartan bang phương pháp sac ký lỏng hiệu năng cao" sẽ là một trong những đóng góp vào lĩnh vực kiêm tra chất lượng các chế phàm đa thành phần chứa irbesartan và hydroclorid trênthị tnrờng.
Mục tiêu của đề án
Dùng một quy trình đê địnli lượng một hoặc đong thời cả hai thànli phần Hydrochlothiazide vàIrbesartan trong một số chếphâm đanglưu hành trên thị tnrờng.
- Khảo sát điều kiện sắc ký đê định lượng đồng thời Hydrochlothiazide và Irbesartan bằng phương pháp sắc ký lònghiệu năng cao.
- Xây dựng và thâm định quy trình phân tích đong thời HydrochlothiazidevàIrbesartan bằng phương pháp sắc ký lỏnghiệu năng cao.
- ứng dụng phương pháp đã xây dựng đê kiêm nghiệmmộtsố chế phâm chứa IRB và HCTZ trên thị trường.
Phạm vi đề án
- Bộ môn Kiêm Nghiệm Thuốc, Khoa Dược- Tnrờng Đại Học NguyễnTất Thành,
300A-Nguyễn Tất Thành, Phường 13, Quận 4, Tp.HCM.
- Viện Kiêm nghiệmthuốc Thành phốHồ ChíMinh
Cở sở lý thuyết của đề án
1.4.1 Tongquan về hoạt chat Hydroclorothiazid (HCTZ)
- Tên hóa học: 6-chloro-3,4-dihydro-2 JỈ-l,2,4-benzothiadiazine-7-sulfonamide 1,1-dioxide.
- Công thức phân từ: C7H8CIN3O4S2
- Khối lượng phân từ: 297,7 g/mol.
Hình 1-1.Công thức cấutạo Hydroclorothiazid (HCTZ)
Cảm quan: Bộtmàu trang hoặc gần như trang, đa hình.
Rất khó tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong aceton, tan trong dung dịch hydroxyd kiềmloãng.
1.4.1.3 Dược lý và cơchế tác dụng a Dượcìực học [2]
Hydroclorothiazid và các thuốc lợi tiểu thiazid tăng bài tiết natri, clorid và nước bang cách ức chế tái hấp thu ion natri và clorid ờ ống lượn xa Sự tăng bài tiết các chất điện giải như kali và magnesi, cùng với giảm calci Hydroclorothiazid cũng giảm hoạt tính carbonic anhydrase, tăng bài tiết bicarbonat, nliưng tác dụng này ít so với bài tiết clorid và không ảnh hường đáng kêden pHnước tiêu Tác dụng lợi tiêu của thiazidmức vìra phải vì phần lớn ion natri đã được tái hấp thu trước khi đến ống lượn xa Hydroclorothiazid hạ huyết áp bang cách giảm thê tích huyết tương và dịch ngoại bào liên quan đến bài tiết natri Tác dụng nàyphụ thuộc vào sự giảm sức cản ngoại vi và thích nghi cùa mạch máu trước giảm nồng độ Na+ Hiệu ứng hạ huyết áp xuất hiện chậm sau 1-2 tuần, trong khi tác dụng lợi tiêu thấy ngay sau vàigiờ Hydroclorothiazid còntăng tác dụng của các thuốc hạhuyết áp khác. b Dược độĩig học[2]
Hydrocortison được hấp thu tốtklii dùng qua đườnguống và đạt nồng độ cao trong cơ thê kill dùng đường tiêmtĩnh mạch dạng ester tantrong nước Dạng hỗn dịch tiêmbap có tác dụng kéo dài Khi sử dụng tại chỗ hoặc trên diệnrộng, lượng thuốc hap thu có thê đù gây tác dụng toàn thân, bao gồm ức chế trục dưới đồi - tuyến yên - thượng thận Khoảng 90% hydrocortisongan với protein huyết tương sau khi hấp thu, nhưng chiphần tự do mới có khả năng xâm nhập vào te bào đích và gây ra tácdụng dược lý Nửa đời củahydrocortison khoảng
100 phút và chatnàyđược chuyên hóa thành dạng hydro hóa và giáng hóa tetrahydrocortison và tetrahydrocortisol, sauđó bài tiết qua nước tiêu, chủ yếu dưới dạng liên hợp glucuronid và một lượng nhò dưới dạng không biếnđôi Hydrocortison cũng qua được nhau thai. c Chi định [2]
Phù do suy tim và các nguyên nhân kliác (gan, thận, do corticosteroid, oestrogen) Đê điều trị phù phôi, furosemid là thuốc lợi tiêu mạnh nênưu tiên lựa chọn chứkhông phải là thiazide.
Tăng huyết áp dùng đơn độc hoặc phối hợp (với các thuốc hạ huyết ápkhác nhưchất ức che enzym chuyên angiotensin(ACE) hoặc thuốc chẹn beta ).
Bệnh Morbus Ménière. d Chong chi định [2]
Mần cảm với các thiazid và các dần chat sulfonamid, bệnh gút, tăng acid uric huyết, chứngvô niệu, bệnh Addison, chứng tăng calci huyết, suy gan và thận nặng.
1.4.2 Tongquan về hoạt chat Irbesartan (IRB)
- Tên hóa học: 2-butyl-3-[[2'-(tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]-methyl]-l,3-diazaspiro[4,4]non-l -en-4-one
- Khối lượng phân từ: 428.5 g/mol.
Hình 1-2 Công thức cấu tạo của Irbesartan
Câm quan: Bột màu trắng hoặc gần như trang, đa hình.
Thựcte kliông tantrong nước,hơi tan trong methanol, klió tantrongmethylen clorid
I.4.2.3 Dược lývà cơchế tác dụng a Dượcìực học [2]
Irbesartan là một chất đối kháng thụ thê typ I cùa angiotensin II Không giống như losartan, ừbesartan không phải làtiền dược chất nên kliông phụ thuộc vào sựthủy phân ờ gan. Irbesartan phong be hoạt động sinh lý của angiotensin II bang cáchgan chọn lọc vào thụthê ATI của angiotensin II Không ức chế ACE, không gây ho khan dai dăng nliưcác thuốc ức chế menchuyênkhác Irbesartan giảmhuyết áp nhưng không ành hưởng den tan số tim Tác dụng chống tăng huyết áp thấy rõ trong 1-2tuần và duy trì ít nhất 24 giờ Irbesartan cũng được sử dụngđê chăm sóc bệnh lý thận ờ người đái tháo đường, kê cà trong phối hợp điều trị với các thuốc kliác như chất ức chếACE. b Dược độnghọc [2]
Irbesartanhấpthu nhanh qua đường tiêu hóa vớisinh khả dụngtừ60-80%, không bị ành hường nhiêu bời thức ăn Thuốc kết hợp chặt chẽ với protein huyết tương (klioàng 96%) và có thê phân bố trong cơ thê với thê tích từ 53-93 lít Nồng độ cao nhất trong huyết tương thường đạt được sau khoảng 1-2 giờ sau khi uông Nông độ cân băng trong máu đạt sau 3 ngày sữ dụng Irbesartan được chuyênhóa ờ gan thông qua quá trình liên họp glucuronic và oxyhóa, chùyếudo isoenzym CYP2C9 cùa cytochrom P450 Sau khi được chuyên hóa,thuốc và các sản phẩm metabolit được đào thải qua mật và nước tiêu Khoảng 20% lượng thuốc được thải qua nước tiêu, còn lại qua phân, với mộtphần nhò dưới 2% không biến đôi Nừa đời thải trìr của thuốc làkhoảng 11-15 giờ. c Chi định [2] Điều trị tăng huyết áp động mạchvô căn.
Bệnh thậndo đái tháo đường typ 2 có tăng huyếtáp d Chong chi định [2]
Quá mẫn với irbesartan hoặc với một thành phần của chế phâm.
Phụ nữ đang thời kỳ cho con bú.
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cờ sở cùa sự phântách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyên của pha động lỏng dưới áp suất cao sắc ký lòng dựa trên cơ che hấp phụ, phân bố, trao đôi ion hay loạicỡ tùy vào loại pha tĩnh sữ dụng [3].
Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc ký lóp mỏng áp suất cao (HPTLC) và sắc ký lòng hiệu năng cao (HPLC) Trong nhóm HPLC, tùy theobăn chất của quá trình sắckí của pha tĩnli trong cộttáchmà người ta chia thành:
- Sắc kíphânbốcủa chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau.
- Sac kí hấp phụ pha thường.
- Sắc kí hấp phụ pha ngược hay pha đào.
- Sắc kí trao đôi ion và cặp ion.
I.4.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thốngHPLC [4] [5]
Hình 1-3 Sơ đồcấu tạo hệ thống HPLC
1 - Bình duradung môi pha động.
4 - Bộ phậntiêm mầu (tiêm bang syringehay auto sampler).
5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) đêngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt.
6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu).
7 - Hệthốngmáy tính điện từ cài đặtphanmềm nhận tín hiệu,xử lý số liệu và điều khiên toàn bộ hệ thống.
Hiện tại máy HPLC thườngcó 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần đê lira giải theo tỷ lệ mong muốnvà tông tỷ lệ dung môi cùa 4 đường là 100% Tuy nhiên theo kinhnghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung mòi cùng một lúc mà chúng ta chì sừ dụngtối đa là 3 hoặc 2 đường đêcho hệ pha động luônđược pha trộn đồngnhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn đê quá trình lira giải ôn định.
Mụcđíchcùa bộkhửkhí nhăm loạitrừ các bọt nhò còn sót lại trong dung môi phađộng.Neu nhưtrongquá trình phântíchmàdungmôi pha động còn sót cácbọt khí thì một số hiện tượng sau đâysẽ sảy ra: - Tỳ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian hru của peak thay đôi - Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thê loại trìr hết được thì có thê Pump sẽ không hút được dung môi kill đó áp suất không lên và máy sac kýsẽngừng hoạt động Trong bất cứtrường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.
1.4.3.6 Bơm cao áp Đê bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trinh sắc kí, lira giải chấttan ra khôi cột sắc kí Bơm phải điều chinhđược áp suất (0 - 200 bar) đê tạo ra được những tốc độ nhất định cùa pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ nằm trong vùng 0,5 - 2 ml/phút.
1.4.3.7 Bộ phận tiêm mẫu Đê đưa mẫu vào cột phân tích theo phương phápkhông ngừng dòng chảy Với dung tích của loop là 5 - 100 pl Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mâu thủ công (tiêm bằng syringe)và tiêm mẫu ựrđộng (auto sampler).
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lòng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thông thường làm bang thép không ri, chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường kính trong 1-
10 mm, hạt chấtnhoicỡ 5 - 10 um Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kíchcỡ hạt Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiêu sắc ký (trongcác dirợc điên USP 23,
24 có tiêuchuânhóa các lọaicột) Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagelđã được silan hóa hoặc được bao một lớp mònghữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chấttrao đôi ion Đối với một số phirơng pháp phân tíchđòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơnnhiệtđộ phòng thi cộtđược đặttrongthiết bịđiều nhiệt.
=> Lira ý: Tuyệt đối kliông đánh siêu âmvìsẽ làm hư cột.
ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
Dung môi hóa chất, trang thiết bị nghiên cứu
Bảng 2-1 Danh mục chấtđối chiếu
Chất đối chiếu Thông số tinh khiết Hãng sản xuất
Hydroclorothiazid 99,5% Viện KNthuốc Tp.HCM
Irbesartan 99,6% Viện KNthuốc Tp.HCM
Bảng 2-2 Danh mục dungmôi -hoá chất
Dungmôi, hóa chất Loại Hãng sản xuất
Kali dihydrophosphat Dùng cho phân tích Merck
Triethylamin Dùng chophân tích Merck
Tricloroacetic acid Dùng choHPLC Merck
Acid phosphoric đậm đặc Dùng cho phân tích Merck
2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ
Thiết bị Mã hiệu Nhà sản xuất
Máysắc ký lỏng hiệu năngcao LC-2030C 3D SHIMADZU Cột sắc kýNucleosil 100
Bê siêu âm Ehnasonic s 180 H Đức
Máy đo pH Mettler Toledo ThụySỹ
- Bình định mức, pipet bầu, cốc có mò, ống đong và các dụng cụ thủy tinh khác dung trong kiêmnghiệm.
Tat cả các thiết bị và dụng cụ đều đtrợc đạt theo đúng quy định ISO/IEC và tiêu chuân thực hành tốt.
Các chế phàm dùng trong nghiên cứu là các chế phân có chứa HCTZ và IRB đang lưu hành trên thị trường.
- Mau được sử dụng trongquá trình thâm định: Viên nén bao phim
- Mầu sừ dụng trongứng dụng quy trinh:
Bảng 2-4 Các chế phẩm được sử dụng trong ứng dụng quy trình
Công ty Số lô Hạn dùng
Cổ phần Dược phâm Agimexpharm
Cổ phần Dược phẩm Dược liệu Pharmedic
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
Tham kliảo các công trinh nghiên cứu trong và ngoài nước đê lựa chọn pha tĩnhphù hợp với cấu trác và bản chất hóa học của IRB và HCTZ, đong thời phù hợp với điều kiện thực tếcủa phòng thí nghiệm Trong đề tài này, chúng tôi chọn pha tĩnh Octyldecylsilan (C18) đê phân tíchđồng thời IRB và HCTZ.
Sau đó, tiếp tục khao sát các yếu tố ảnh hường đến quá trình tách: pH cùa pha động, thành phần đệm, tỳ lệdung môi, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng,
2.2.1 Khảo sátđiều kiệnđe phân tích đồngthòiHCTZ,IBR trong viênnénbangphưong pháp sac ký lỏng hiệu năng cao.
2.2.1.1 Khảo sát điều kiện sac ký a Kháosát điềukiệusắc ký: Sừ dụng chương trình dung môi đăng dòng (isocratic) Điều kiện sắc ký cố định
- Cộtthép không gi (25 cm X 4,6 mm) được nhồipha tĩnh octyldecylsilan (kíchthước hạt 5 pm).
- Pha động: dung dịchđệm KH2PO4 và AcCN
- Detector PDA Bước sóng phát hiện 205 nm
- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút
Các điều kiên sắc ký cần khảo sát
+Khão sát pH cùa dung dịchđệm: pH 2,5; pH 3,5; pH 4,5
+Khão sát nồng độ đệm KH2PO4: 25 mM, 50 mM, 75 mM
+Khảo sát tỷ lệ dung môi AcCNtrong pha động b Kháo sát điềukiệusấc ký: Sữ dụng chương trình gradientdung môi
- Điều kiện sắc ký cố định
+ Cột thép khônggi (25 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh octyldecylsilan (kíchthướchạt
Pha động A: acid trifluoroacetic acid 0,1% trong nước
Pha động B: acid trifluoroacetic acid 0,1% trong AcCN
+Detector PDA Bước sóng phát hiện 270 nm
+Tốc độ dòng: 1,5 ml/pliút
- Khào sát chương trinhgradientdung môi
2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lýmẫu
Cân20 viên, xác định khối lượng trung bình viên.Nghiền thành bột mịn.
Cânmộtlượngbộtviên tương đương 75 mg IRB chovào bìnhđịnh mức 100 ml Thêm khoảng
60ml dung môi pha mẫu, siêu âm20phút, đê nguội, thêm dungmôi phamẫu vừa đủ thê tích, lắc đểu Lọc (bỏ 20 ml dịch lọc đầu).
2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời IRB và HCTZ bang phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Chuân bị dung dịch chuân gôc
+ Dung dịchchuângốc IRB: Cân chính xác khoảng 75 mg IRB cho vào binh định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu lắc cho tan hoàntoàn, sau đó thêm dung môipha mâu vừa đủ thê tích lắc đều.
+ Dung dịch chuân gốc HCTZ: Cân chính xác khoảng 6,25 mg HCTZ cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng60 ml dung môi pha mầu lac chotan hoàn toàn, sau đó thêm dung môi pha mẫu vìra đủ thê tích lac đều.
- Dung dịch chuồn hỗn hợp: Lấy chính xác 10 ml dung dịch IRB và 10 ml dung dịch HCTZ chovào bìnli định mức 100 ml, thêm dung môi phamẫuvừa đù thêtích lắc đều Lọcqua giấy lọc Millipore 0,45 pm Dùng dung dịch này tiêm sắc ký.
Cân20 viên, xác định khối lượng trung bình viên Nghiền thành bột mịn.
Cânmộtlượngbột viên tương đương 75 mg IRB chovào bìnhđịnh mức 100 ml Thêm klioảng
60ml dung môi pha mẫu siêu âm20 phút, đê nguội, thêmdung môi pha mẫu vừa đủ thê tích, lắc đều Lọc (bò 20 ml dịch lọc đau).
Laychínhxác 10 ml dịch lọc chovào bình định mức 100ml, thêm dung môi pha mầulac đều Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 pm Dùng dung dịch này tiêm sắc ký.
Cânmộtlượng placebo tương đươngplacebo của */2 viên chovàobìnhđịnlimire 100 ml Thêm khoảng 60 ml dung môi pha mầu siêu âm 20 phút, đê nguội, thêm dung môipha mầu vừađù thê tích, lắc đều Lọc (bò 20 ml dịch lọc đầu).
Lấychínhxác 10 nil dịchlọc cho vào bình định mức 100 ml,thêm dung môi pha mầu lắc cho tan hoàn toàn Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 pm Dùng dung dịch này tiêm sắc ký.
Dựa vào diện tích pic IRB /HCTZ trong dung dịch chuẩn (Sc) và dung dịch thừ (St), hàm lượng chuân(C%), độ pha loãng cùa chuân (Dc), độ pha loãng của mầu thử (Dt) đê xác định hàm lượng IRB (HCTZ) có trong mầu thử.
Tính hàm lượng (%) IRB/HCTZ dựatheo công thức: st Dc
- St: Diện tíchpic IRB/HCTZ trong sắc ký đồ cùadung dịchthừ
- Sc: Diện tíchpic IRB/HCTZ trong sắc ký đồ của dung dịch chuân
- Dc: Độ phaloãng của mẫu chuẩn.
- Dt: Độ pha loãn của mẫu thừ.
2.2.3 Tham định quy trình phân tích đồng thời IRB và HCTZ bang phương pháp sac ký lỏng hiệu năng cao
Thâm định quy trình phântíchđịnh lượngbang kỹ thuậtHPLC trên mẫu được thâm định theo hướng dẫncùa ASEAN về thâm định quy trìnhphân tích [3] Thâm địnhphươngpháp phân tích theo các chi tiêu:
- Tínli phù hợp hệ thống (System Suitability)
2.2.3.1 Tính phù họp hệ thống
Các tính phù hợp hệ thống làphầnkhôngthê thiếu cùa quy trìnhphân tích
Phép thử này dựa vào kháiniệmlà tất cà cácthiết bị, dụng cụ điện từ, sự vận hành hệ thống, mầu phân tích, cấu thành nên hệ thống hoàn chinh của một quy trình phân tích, nên cần đượcđánh giá đêđảm bảo toànbộ hệ thốngcó hiệu năng phù hợp.
Trong phương pháp sắc ký: số đĩa lý thuyết, hệ số dung lượng, hệ số chọn lọc, hệ số đối xứng (hệ số kéo đuôi) là những thông số thường được dùng đê đánh giá hiệu năng cùa cột sac ký.Tiến hành sắc ký 6 lan liên tiếp mẫu chuânhỗ hợp được chuân bị nhiĩ mục 2.2.2 theo điều kiện sắc ký đãchọn.
Các tham số khác nliau được tính toán bao gồm diệntích pic (S), thời gian hru (tR), độ phân giải (Rs)cùa các pic.
+ % RSD của thờigian hm < 1,0% và diệntíchpic (S) < 2,0%
+Hệ số phângiãigiữa pic HCTZ và pic IRB phải lớn hơn 1,5 (Rs > 1,5).
Khảnăng cùa quy trìnhchophépxác định chínhxác và đặchiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hường bời sự có mặt cùa các chất kliác có trong mầu thử (tạp chất, sản phẩm phân hủy )
+Cần chứng minh mẫu thừ có chấtphân tích thi dương tính, khôngcó chất phân tích thi âm tính.
+ Đối với thành phần can chứng minh các thànhphần khác trong công thức bào chế kliông ảnh hường đến phép thử (mẫuplacebo):
' Không cho phản ứng hóa học.
' Trong sắc ký lóp mỏngkhông cho vết có Rf giống vết chuẩn
' Trong HPLC và GC không chopic có thời gian lưu như vết chuân
' Không có phô IR và phô UV-Vis giống phô chuân hoặc phô của chất chuẩntươngứng
- Quytrình định lượng vả thử tạp chất:
+ Đối với quy trình định lượng kliông hoặc kém đặc hiệu đối với hoạt chat can phân tích (ví dụ định lượng nguyên liệu bằng phương pháp chuân độ thê tích) cần có phương pháp phân tích khác hỗ trợ đê chứng minh đặc hiệu.
+ Đối với quy trình sắc ký:
• Cầnđưa ra các sac ký đồ của mẫu chuẩn, mầu thử, mầu placebo/mẫu trang đê chứngminh tínhđặc hiệu.
• Độ tinh khiết cùa pic cần được xác định bang detector DAD hay detectorklioiphô
- Ví dụ: Thâm địnli tính đặc hiệu của quy trình phân tích bằng HPLC-DAD:
+ Tiến hànli sac ký mầu trang, mẫu placebo, mầu chuẩn, mẫu thử.
+ Ghi lại các sắc ký đồ Xác định thời gian lưu cùa hoạt chất cầnphân tích, độ tinh khiết của pic hoạt chất trong SKĐ mầu thử; phô uv cùa pic hoạt chất trong SKĐ mầu chuân và mẫu thử.
Tiến hành sắc ký các mẫuchuẩn,mâu thừ,mầu placebo thêm chuẩn,mầu placebo được chuân bị như mục 2.2.2 theo điều kiện sac ký đã chọn.
- Sac ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tưong ứng với thời gian lưu của pic HCTZ và IRB trong dung dịch chuân
- Săc ký đô các mâu thừ và mâu placebo thêm chuân có các pic có thời gian hm tương ựr với các pic cùa HCTZ và IRB trong sắc ký đồ cácdung dịch chuân.
- Phô uv tại thời gian lưu cùa các pic chính trong sắc ký đồ các mẫu thừ và mẫu chuân giống nhau.
- Pic chính cùa chấtphân tích trong sắc ký đồ các mẫuthử có độ tinh kliiết pic > 99,0%
KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
KÉT QUẢ NGHIÊN cứu
3.1.1 Khảo sátđiều kiệnđế phân tích đồngthòiHCTZ,IBR trong viênnénbằngphương pháp sac ký lỏng hiệu năng cao
3.1.1.1 Khảo sát điều kiện sac ký a Khảo sát điều kiện sắc ký: Sừ dụng chương trình dung môi đăng dòng Điều kiện sắc ký cố định
- Cột thép không gi (25 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh octyldecylsilan (kích thước hạt 5 pm).
- DetectorPDA Bước sóng phát hiện205 nm
- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 pl, a.1 Khảo sát pH của dung dịch đệm
- Điều kiện sắc ký thay đổi: KH2PO4 50 mM(pH 2,5; 3,5; 4,5)
Dung dịch đệm KH2PO4 50 mM (pH 2,5; 3,5; 4,5) 65
Chuẩn bị dung dịch đệm KH2PO4 50 mM: Cân 6,8 g KH2PO4hòa tan trong 1000 ml nước. Dung dịchđược chinh pHbang H3PO4 đậm đặc
+ Dung môi pha mầu: AcCN
- Tiến hành tiêm dung dịch chuân hỗn hợp (mục 2.2.2) s pH 3,5
Hình 3-1 Các sắc ký đồ khảo sát pHcủa dung dịch đệm
Nhậnxét: Ớ điều kiện pH3,5 và 4,5 thi HCTZ và IRB khôngthề tách Haipic HCTZvà IRB tách hoàn toàn trong điều kiện pH 2,5 Như vậy, dung địch đệm pH 2,5được chọnđê kliảosát các diều kiện khác. a.2 Khảo sát nồng độ cũa dung dịch đệm
- Điều kiện sắc ký thay đôi lànồng độ KH2PO4:25 mM, 50 mM, 75 mM
Dung dịch đệm KH2PO4 25 mM, 50 mM,75 mM (pH 2,5) 65
+ Dung môi pha mẫu: AcCN
- Tiến hành tiêm dung dịch chuân hỗnhợp
Hình 3-2 Các sắc ký đồ khảo sát nồng độ dungdịchđệmKH2PO4
+ ơ nồng độ dung dịchđệm 25 mM: pic HCTZ và IRB tách hoàn toàn Nhưng đường nen nhiễu, tín hiệu đáp ứng của các pic kém và các pic không đạtđộ tinhkhiết
+ ơ nồng độ dung dịch đệm 75 mM: pic HCTZ và IRB cũng tách hoàn toàn Nhưng pic HCTZ không đạtđộ tinh khiếtpic, pic IRB chân pic bị giãn rộng và cũng không đạt độ tinh khiếtpic
+ ơ nồng độ dung dịch đệm50 mM: Các pic tách hoàn toàn và các pic đạt độ tinh khiết pic (> 99%)
Như vậy, nồng độ dung dịch đệm được chọn là 50 mM a.3 Kliảo sáttỳ lệ dung môi trong phađộng
- Điềukiện sac kýthay đôi là nồng độAcCN: 25.35, 75
Dung dịch đệm KH2PO450 mM(pH 2,5)
+Dung môi pha mẫu: AcCN
- Tiến hành tiêm dung dịch chuân hôn hợp
Hình 3-3 Các săc ký đồ kliảo sát nông độAcCN
+Ở tỷlệ 25% AcCN: chi xuất hiệnmột pic, nếu phân tíchquá 30 phút cũng không thât xuât hiện pic IRB
+ ơ tỳlệ 75%AcCN: dotỷ lệ dung môi lớn nên các chất rửa giãi nhanh và như vậy kliông tách được hai chất
+ ơ tỷ lệ 35% AcCN: Các pic tách hoàn toàn Thời gian phân tích khoảng 20 phút là rửa giãi hoàn toàn và các pic đạt độ tinh kliiết pic (> 99%)
Nhưvậy, tỷ lệAcCN 35% sẽ được chọn. b Khâo sát điều kiệu sac ký: Sữ dụng chương trình gradient dung tnôi Điều kiện sắc ký cố định
+ Cột thép không gi (25 cm X 4,6 mm)được nhồi pha tĩnh octyldecylsilan (kích thướchạt
Pha động A: acid trifluoroacetic acid 0,1% trong nước
Pha động B: acid trifluoroacetic acid 0,1% trong AcCN
+ Detector PDA Bước sóng phát hiện 205 nm
Các chươngtrinh gradientkhảo sát được trình bàytrong bảng 3.1
Hình 3-4 Sắcký đồ khảo sát chươngtrình gradient
- ơ chươngtrình gradient 1: Pic HCTZ có thời gianlưu khoảng 1 phút và Pic IRB có thời gian hru khoảng 2,5 phút Hai pic tách hoàn toàn Nhưng khi phân tích trên mẫu thừ thì do thời gianlira giải quá nhanh nêncác pic tạp kliông tách khỏi pic chính nêndẫn đến các pic kliông đạtđộtinh khiết pic.
- ơchương trình gradient 2: Pic HCTZ có thời gianhru klioảng 5 phút và Pic IRB có thời gian lưu khoảng 6,5 phút Haipic tách hoàn toàn (Độ phân giãi 9,7) và khi phân tíchtrênmẫu thử các pic đạtđộ tinh khiết pic >99,0%.
Nhưvậy, chượng trình gradient 2 được chọn
3.1.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
HCTZ và IRB đều hòa tan trong AcCN và MeOH Nêntrong quá trình xử lý mẫu, MeOHvà AcCN được sử dụng làm dung môi pha mâu.
Chuân bị mẫu thừ và chuân theo mục 2.2.2.
Tiếnhành tiêm dung dịch mẫuthừ theo điều kiện sắc ký đãchọn.
Ket quà khảo sát được trìnli bày trong bảng 3.2.
Bảng 3-2 Ket quả khảo sát dungmôi pha mầu Điều kiện sắc ký
Lượng cân mẫu thử (mg)
Nhậnxét: AcCN và MeOH đềuhòa tanđượchai hoạt chất HCTZ và IRB.Nhưng khi sử dụng MeOH thì sẽ hòa tan nhiều tạp Đồng thời đê thích hợp với điều kiện dung môi trong pha động, nên AcCN là phù hợpđê sửdụng làm dung môi pha mẫu.
3.1.2 Xây dựng quy trình phân tích đồng thòiHCTZ, IBRtrongviên nén bang phưoiĩg pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.1.2.1 Điều kiện sắc ký a Quy trình 1
- Cột thép không gi (25 cm X 4,6 mill) được nhồi pha tĩnh octyldecylsilan (kích thước hạt 5 pm).
+ Dung địchđệm KH2PO4 50 mM(pH 2,5) 65 (tt/tt)
- DetectorPDA Bước sóng phát hiện 205 mn
- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 pl. b Quy trình 2
- Cột thépkhông gi (25 cm X 4,6 mill) được nhoi pha tĩnh octyldecylsilan (kích thước hạt 5 pm).
+Pha động A: acid trifluoroaceticacid 0,1% trong nước
+ Pha động B: acid trifluoroacetic acid 0,1% trong AcCN
- DetectorPDA Bước sóng phát hiện 205 nin
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Sử dụng chương trình gradientdung môi
Thòigian (phút) PhaiđộngA(%) Pha độngB (%)
- Chuân bị dung dịch chuân góc
+ Dung dịch chuân gốc IRB: Cân chinh xác khoảng 75 mg IRB cho vào bình định mức 100 ml, thêmkhoảng 60 mlAcCN lăc cho tan hoàn toàn, sau đó thêm AcCN vừa đủ thê tích lăc đều.
+ Dung dịch chuân gốc HCTZ: Cân chinh xác khoảng 6,25 mg HCTZ cho vào bình định mức 100ml,, thêmkhoảng 60 ml AcCN lac cho tan hoàn toàn, sauđó thêm AcCN vừa đũ thê tích lắc đều.
- Dung dịch chuân hỗn hợp: Lấy chính xác 10 ml dung dịch IRB và 10 ml dung dịch HCTZ chovào bìnli định mức 100 ml, thêm AcCN vừađù thêtíchlắc đều Lọcqua giấy lọc Millipore 0,45 pm Dùng dung dịch này tiêm sắc ký.
Cân20 viên, xác định khối lượng trung bìnhviên Nghiền thành bột mịn.
Cânmộtlượngbột viên tương đương 75 mg IRB chovào bình định mức 100 ml Thêm khoảng
60 ml AcCN siêu âm 20 phút, đê nguội, thêm AcCNvừa đủ thê tích, lắc đều Lọc (bỏ 20 ml dịch lọc đầu).
Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, thêm AcCN lac đều Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 pm Dùngdung dịch này tiêm sac ký.
Cânmộtlượng placebo tương đương placebo của 16 viên chovàobìnhđịnh mức 100 ml Thêm khoảng 60ml AcCN siêu âm20 phút, đê nguội, thêm AcCN vìrađù thê tích, lac đều Lọc (bỏ
Lay chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, thêm AcCN lac cho tan hoàn toàn Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 pm Dùng dung dịch này tiêm sac ký.
Tiêm dung dịch chuân , thữ, placebo vào hê thống sắc ký.
- Tính phùhọp hệ thống: Tiêm 6 lan dung dịchchuân Độ lệch chuân tương đối cùa thời gian lưu RSD 1,5).
Nhận xét: Giá trịRSD của thời gian hru, diện tíchpic với các chấtphântích không quá 2%, độphângiải giữa haipic HCTZ và IRB lớn hơn2,0 nêncả hai quy trìnhđều đạt tính phù hợp của hệ thống.
Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn, mẫu thừ, mầu placebo thêm chuẩn, mẫu placebo được chuẩn bị như mục 2.2.2 theo điều kiện sac ký đã chọn.
Hình 3-7 Sắcký đồ khảo sát tính đặc hiệu của quy trình 1
Hình 3-8 Săc ký đô khảo sát tính đặc hiệu cùa quy trình 2
Hình 3-9 Phôtinhkhiếtpíc cùa quy trình 1 (a) Hydroclorothiazid, (b) Irbesartan
Hình3-10 Phô tinh khiết píc của quy trình2 (a) Hydroclorothiazid, (b) Irbesartan
- Sắc ký đo mẫu placebo không xuất hiện pic ờ trong khoảng thời gian hru tiĩơng ứng với thời gian lưu cùa pic HCTZ và IRB trong dung dịch chuân
- Sac ký đo các mẫu thử và mẫuplacebo thêm chuân có các pic có thời gian lưu tươngtự với các pic của HCTZ và IRB trong sắc ký đồ cácdung dịch chuân.
- Phô uv tại thời gian hru cùa các pic chính trong sắc ký đo các mẫu thừ và mẫu chuân giống nhau.
- Pic chính của chấtphân tích trong sắc ký đồ các mẫuthử có độ tinh khiết pic > 99,0%
Ket quả thâm định tính đặc hiệu cho thấy:
- Sắc ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic có thờigian lưu trùngvới thời gian hm cùapic HCTZvà IRB trong dung dịch chuẩn.
- Sắc ký đo dung dịch mầu thử, mầu placebo thêm hỗn hợp chuân có các pic có thời gian hnitươnghr vói các pic của HCTZ và IRB trong sắc ký đồ dung dịch chuân
- Phô uv tại thời gian lưu của các pic trong sắc ký đocác mẫu thừ và mẫuchuân giốngnhau. (Phụlục 2 và phụ lục 9)
- Pic của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch mẫu thừvà mầu chuân tinh khiết (theo phổ UV) (Phụ lục 1 và phụ lục 2)
Nliư vậy, quy trinhphân tích có tính đặchiệu.
Tiếnhành các dung dịch chuân hỗn hợp theo điều kiện sac ký đãchọn
Ket quả klião sát sự tương quan giữanồng độ và diện tích pic được trình bày trong bàng 3.5 và bảng 3.6 (Phụ lục 4và phụ lục 11)
- Dung dịch chuân gốc IRB: 732 pg/ml (quytrình 1) và 727 pg/ml (quytrình 2).
- Dung dịch chuân gốc HCTZ: 67,1 gg/ml (quytrình 1) và 66,5 gg/ml (quy trình2).
Bảng 3-5 Ket quả khão sát tuyến tính (quy trình 1)
Bảng3-6 Ket quả khào sát tuyến tính(quy trình 2)
Hình 3-11 Đường biêu diễn tương quan giữa diệntíchpic với nồng độcủa
Hình 3-12 Đường biêu diễntươngquan giữadiện tíchpic với nồng độcùa IRB
Hình 3-13 Đường biêu diễn tương quan giữa diệntíchpic với nồng độcủa
Hình3-14 Đường biêu diễn tương quan giữadiện tíchpic với nồng độcủa IRB
Ghi lại sắc ký đồ và xác định diệntíchpic của cácdung dịch.
Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic cùa các dung dịch Thiết lập phương trình hoi quygiữa nồng độ và diện tích pic, tính hệ số tương quan (r) dựa vào phương pháp bìnli phương cực tiểu.
Sử dụng trắc nghiêmF đê kiêm tra tínli thích hợp củaphương trìnli hồi quy và trắc nghiệmt đê kiêm traỷ nghĩa cùa hệ số trong phương trình hồi quy.
Nhận xét: Quy trình 1 và quy trình 2 đều có sự tươngquan tuyên tính giữa nồngđộ và diện tíchpic
3.1.3.4 Độ chính xác a Độ lặp lại
Chuân bị 6 dung dịch mầu thừ được chuẩnbị như mục 2.2.2.
Ket quà độ lặp lạiđược trìnli bày trongbảng 3.7 và bàng 3.8 (Phụ lục 5 và Phụ ỉục 13)
Bảng3-7 Ket quả khảo sát độ lặp lại (quy trình 1)
KLTB Lượngcân mâu , Hàm lượng s chuan s thử
Bảng3-8 Ket quả khảo sát độ lặp lại (quy trình 2)
Lượngcân mẫu , s chuấn thử (mg) s thử Hàm lượng
RSD (%) 0,52 b Độ chính xác trnng gian
Ketquàđộ chính xác trunggian được trìnhbàytrong bâng 3.9 vàbàng 3.10 (Phụ lục 6 và Phụ lục 13)
Bảng 3-9 Ket quả khảo sát độ chính xác trung gian (quy trìnli 1)
Lượngcân mẫu thử (mg) s chuân s thử
Bâng 3-10 Kết quã kháo sát độ chính xác trung gian (quytrình 2)
Lượng cân mẫu , s chuan thử (mg) s thử
Bảng 3-11 Kết quà độ chính xác cùahai ngày
Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày
- Yêu cầu: Quy trìnhđạtđộ chính xác khi
- % RSD của hàm lượng IRB, HCTZ có trong mẫu thử trongcùng một ngày phải không quá 2%.
- % RSD cùa hàm lượng IRB, HCTZ cótrong 12 mẫu phải không quá 2%.
Nhận xét: Ket quà độ chính xác cùa hai ngày có RSD < 2% Như vậy, cả hai quy trình đều đạtđộ chính xác
Các khó khăn vướng mắc gặp phải khi thực hiện đề tài
• Kinli phí dung môi, hóachất, thiết bị nhir cột sac ký khá cao
• Nhiều học viên cùng thực hiệnđề án nênthời gian chờ đợisừ dụng máyHPLC khá lâu
•Vừa làm đe án, vìrahọc sửdụng nênchưa có nhiều thời gian nghiên cứu thật tỉ mỹ.
•Môi trường học tập, làm việc thân thiệt Tuynhiên, thiếu sựkếtnối giữa các học viên với nliau.
•Được sự hướng dân chân thành,nhiệt tình cùa cô tiến sĩ Lê Thị Thu Cúc Tuynhiên, thời gian thựchiện đề án có thời hạn ngan nên chưa tiếp thu được toàn bộ các kiếnthức klioa học Vì vậy, đề án còn một số thiếu sót.
• Kínli mong quý thầy cô, đồngnghiệp đóng góp ý kiến đê đề án được hoàn thiệnhơn.
KÉT LUẬN VÀ KIẺN NGHỊ
KÉT LUẬN
Đe án đãhoàn thành cácmục tiêu trongphần đặt vấn đề vớinhững kết quả như sau:
- Đã khảo sát được hai điều kiện sắc ký đê định lượng đồng thời hydroclorothiazid và irbesartan bang phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
+ Quytrình 1: Cột thép không gi (25 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnli octyldecylsilan (kích thước hạt 5 pm) Pha động: Dung địch đệm KH2PO4 50 mM (pH 2,5) - acetonitril (65:35, tt/tt) Bước sóng pháthiện205 nm.Tốc độ dòng 1,3 ml/phút Thê tích tiêm20 pl.
+ Quytrình 2: Cột thép không gi (25 cm X 4,6 mm)được nhồi pha tĩnh octyldecylsilan(kích thước hạt 5 pm) Bước sóngphát hiện205 nm.Tốc độ dòng 1,5 ml/phút Thê tích tiêm 20 pl.
Sừdụng chương trình gradient: pha động B từ 0 phút (15 %) - 5 phút (95 %) - 7 phút (15 %)
- 10 phút (15 %) (Pha động A là triflouroacetic acid 0,1 %/niĩớc và pha động B là triflouroacetic acid0,1 %/acetonitril.
- Đã xây dựng và thâm địnhhai quy trình phân tích đồng thờihydroclorothiazidvàirbesartan bang phương pháp sắc ký lòng hiệu năng cao Quy trình có tính đặc hiệu, đạt độ chính xác (RSD