Xây dựng quy trình định lượng Metformin và Linnagliptin trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Rp-HPLC)

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH ——oOo BÁO CÁO TÔNG KẾT ĐỀ TÀI CHƯƠNG TRÌNH SINH VIÊN NGHIÊN cứu KHOA HỌC • NĂM 2020 TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN VÀ LINAGLIPTIN TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẨC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (RP - HPLC) Mã số đề tài: Chủ nhiệm đề tài: NGUYỀN THỊ THU TRANG Giảng viên hướng dẫn: DS Dương Đình Chung ThS Nguyền Thị Ngọc Yen Khoa: Dược học Các thành viên tham gia: STT Họ tên MSSV Nguyền Thị Thu Trang Đinh Minh Nguyên 1511540657 1611540467 Lớp 15DDS7D 16DDS6A Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2020 Nguyễn Thị Thu Trang MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đồ THỊ DANH MỤC BẢNG TÓM TÁT CHƯƠNG TỔNG QUAN CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.1 Chất chuẩn đối chiểu 11 2.1.2 Hóa chất, dung môi .11 2.1.3 Thiết bị 11 2.1.4 Dụng cụ 11 2.2 Phương pháp nghiên cứu 12 2.2.1 Chuẩn bị mẫu 12 2.2.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký tối ưu 14 2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích 16 2.2.4 ứng dụng định lượng chế phẩm nghiên cứu 21 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LƯẬN 23 3.1 Kết khảo sát điều kiện tối ưu 23 ỉ.l Khảo sát bước sóng 23 3.1.2 Khảo sát pha động 23 3.1.3 Khảo sát pha tĩnh 25 3.1.4 Khảo sát nồng độ SDS 27 3.1.5 Khảo sát nồng độ ion dung dịch đệm 28 3.1.6 Khảo sát độ pH 30 3.1.7 Khảo sát tốc độ dòng 30 3.1.8 Khảo sát thể tích tiêm mẫu 31 3.1.9 Khảo sát nhiệt độ cột 31 Nguyễn Thị Thu Trang 3.2 Kết thẩm định phương pháp 33 3.2.1 Độ đặc hiệu 33 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống 37 3.2.3 Khoảng tuyến tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 37 3.2.4 Độ 39 3.2.5 Độ xác 41 3.3 Phương pháp định lượng chế phẩm nghiên cứu 43 3.4 Bàn luận 46 3.4.1 lựa chọn phương pháp phân tích 46 3.4.2 điều kiện sắc ký 46 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Thu Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng anh tên khoa học ACN Acetonitril ADA American Diabetes Association Hiệp hội tiểu đường Hoa Kỳ FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ GIP Glucose-dependent insulinotropic polypeptide Polypeptide insulintropic phụ thuộc glucose GLP-1 Glucagon-like peptide Peptide giống Glucagon-1 HQC Hight Quality control Mầu kiêm chứng cao ICH International Conference on Harmonization Hội nghị Quốc tế hài hịa hóa đăng kí dược phẩm IDF International Diabetes Federation Liên đoàn Đái tháo đường Quốc te LN Lot number Số lô LNG Linagliptin LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOỌ Limit of Quantification Giới hạn định lượng LỌC Low Quality control Mầu kiểm chứng thấp MeOH Methanol MH Metformin hydroclorid MỌC Medium Quality control Mầu kiểm chứng trung bình PDA Photo-diode Array Dãy diod quang PN Part number Số lô QC Quality control Mầu kiêm chứng RP - HPLC Reverse Phase - High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn WHO World Health Organization Tô chức y te giới ws Working Standard Mầu chuẩn Tiếng việt Nguyễn Thị Thu Trang DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 3.1 Phổ hấp thu ƯV: (a) LNG, (b) MH, (c) Chồng phổ MH LNG 23 Hình 3.2 Sắc ký đồ hệ 24 Hình 3.3 Sắc ký đồ hệ 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ hệ 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát cột Zorbar eclipse plus C18 100 X 4,6 mm, 3,5pm 25 Hình 3.6 Sac ký đồ khảo sát cột Pursuit XRs C18 150 X 4,6 mm, 5pm 26 Hình 3.7 Sắc kỷ đồ khảo sát cột Gemini NX C18 250 X 4,6 mm, 5pm .26 Hình 3.8 Biểu đồ diện tích pic MH LNG nồng độ SDS 27 Hình 3.9 Biểu đồ hệ số kéo đuôi MH LNG nồng độ SDS 27 Hình 3.10 Biểu đồ độ lệch chuẩn tương đối MH nồng độ ion 29 Hình 3.11 Biểu đồ độ lệch chuẩn tương đối LNG nồng độ ion 29 Hình 3.12 Biểu đồ độ lệch chuẩn tương đối MH nhiệt độ khác 32 Hình 3.13 Biểu đồ độ lệch chuẩn tương đối LNG nhiệt độ khác 32 Hình 3.14 Sắc ký đồ MH LNG điều kiện tối ưu 33 Hình 3.15 Sắc ký đồ mầu trắng (A), mẫu placebo (B),mầu chuẩn (C), mầu thử thêm LNG chuẩn (D), mầu thử thêm MH chuẩn (E) 35 Hình 3.16 Sắc ký đồ chứng minh độ tinh khiết pic MH LNG 35 Hình 3.17 Phổ uv thời gian lưu MH chuẩn (a,b) LNG chuẩn (c, d) 36 Hình 3.18 Phổ uv thời gian lưu MH thử (e, f) LNG thử (g, h) 36 Hình 3.19 Đồ thị tính tuyến tính MH 38 Hình 3.20 Đồ thị tính tuyến tính LNG 39 Nguyễn Thị Thu Trang DANH MỤC BẢNG • Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 Bảng 2.2 Chất chuẩn đối chiếu 11 Bảng 2.3 Thiết bị dùng thí nghiệm 11 Bảng 2.4 Cách chuẩn bị đường chuẩn 12 Bảng 2.5 Cách pha mầu kiêm chứng 13 Bảng 2.6 Khảo sát nồng độ SDS 15 Bảng 2.7 Tóm tắt tiêu thẩm định 20 Bảng 3.1 Ket thông số sắc ký hệ đệm 23 Bảng 3.2 Ket khảo sát nồng độ ion dungdịch 28 Bảng 3.3 Kết khảo sát pH 30 Bảng 3.4 Ket khảo sát tốc độ dòng 30 Bảng 3.5 Ket khảo sát thể tích tiêm mầu 31 Bảng 3.6 Ket khảo sát nhiệt độ cột 31 Bảng 3.7 Điều kiện sắc ký tối ưu 33 Bảng 3.8 Ket tính thích họp hệ thống mầuchuẩn 37 Bảng 3.9 Ket xác định khoảng tuyến tính vàphương trình hồi quy 38 Bảng 3.10 Kết giới hạn phát LOD, giới hạn địnhlượng LOỌ 39 Bảng 3.11 Ket thẩm định độ ngày 39 Bảng 3.12 Ket thẩm định độ khác ngày 40 Bảng 3.13 Kết thẩm định độ ngày vàkhác ngày 41 Bảng 3.14 Ket khảo sát độ lặp lại 42 Bảng 3.15 Ket độ xác ngày khácngày 42 Bảng 3.16 Tóm tắt kết tiêu thẩm định 43 Bảng 3.17 Kết định lượng MH lô 43 Bảng 3.18 Kẻt định lượng LNG lô 44 Bảng 3.19 Kết định lượng MH lô 44 Bảng 3.20 Kết định lượng LNG lô 45 Bảng 3.21 Tóm tắt kết định lượng lô chế phẩm 45 Nguyễn Thị Thu Trang TĨM TẮT KHỐ LUẬN TĨT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC - NĂM HỌC 2020 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN VÀ LINAGLIPTIN TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHUONG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (Rp-HPLC) Nguyễn Thị Thu Trang Hướng dẫn khoa học: Ds Duong Đình Chung, ThS Nguyễn Thị Ngọc Yen Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng metformin linagliptin viên nén phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Đối tượng phương pháp: Đoi tượng: Viên nén chứa 500 mg metformin 2,5mg linagliptin (Traịenta Duo 500: 2,5) Phương pháp: (i) Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu (bước sóng, pha động, pha tĩnh, pH, nồng độ chất SDS, ion ); (ii) Thẩm định quy trình phân tích xây dựng theo hướng dần ICH (2005) Ket quả: Điều kiện sắc ký để định lượng metformin linagliptin là: cột Zorbar Eclipse plus Cl8 (100 X 4,6 mm, 3,5pm), đầu dò PDA (bước sóng phát 226 nm) Pha động hỗn hợp methanol-acetonitril-dung dịch đệm phosphate chứa 1,75 mM SDS pH 6,8 (7:33:60, v/v/v); Tốc độ dòng ml/phút; Thể tích tiêm mầu 10 pl; nhiệt độ cột 40°C Khoảng tuyến tính metformin linagliptin 7,66 45,97 pg/ml 1,25 - 7,52 pg/ml (hệ số tương quan R2> 0,99 cho hai chất phân tích) Ket luận: Đã xây dựng thẩm định thành công phương pháp định lượng metformin linagliptin sắc ký lỏng hiệu cao (Rp-HPLC) Ket đề tài áp dụng cho quy trình định lượng lơ chế phẩm viên nén chứa metformin linagliptin (Trajenta Duo) lưu hành thị trường Từ khóa: Rp-HPLC, Metformin, Linagliptin, định lượng, thẩm định Nguyễn Thị Thu Trang CHƯƠNG TÓNG QUAN Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh phổ biến toàn cầu gia tăng năm gần đây, bệnh gây rối loạn chuyển hóa làm tăng nồng độ glucose máu Nghiên cứu Liên đoàn ĐTĐ quốc tể cho thấy, năm 2017 gần nửa dân số (49,7%) giới sống chung với bệnh đái tháo đường mà khơng chuẩn đốn [7], bệnh để lại biến chứng nghiêm trọng ảnh hưởng tới đời sống người gây gánh nặng lớn cho xã hội [29] Khi thuốc đon trị liệu không đảm bảo mục tiêu đường huyết điều trị, việc phối hợp nhóm thuốc hạ đường huyết khác giúp kiêm soát đường huyết tốt hơn, thuận tiện Hiện thị trường có chế phẩm viên nén chứa đồng thời Metformin Linagliptin dùng điều trị bệnh Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng nước Châu Á cho thấy việc kết hợp Metformin Linagliptin mang lại hiệu kiểm soát đường huyết đáng kể [13] Nhu cầu sử dụng chế phẩm kết hợp ngày tăng, đòi hỏi cần có phương pháp đánh giá chất lượng chúng Một số báo khoa học giới công bố thiết lập phương pháp định lượng Metformin Linagliptin sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (Rp-HPLC) [4], [10], [15], [27], [28], [30], [31], [32], Tính đến thời điểm Việt Nam nghiên cửu định lượng Metformin Linagliptin phương pháp sắc ký lỏng chưa có báo cáo khoa học Tuy nhiên, năm 2016, Nguyễn Đức Tuấn cộng báo cáo phương pháp Rp-HPLC định lượng đồng thời Metformin chất nhóm ức chế DPP-4 (Sitaglitin) [3] Đầu năm 2020, Phan Thanh Dũng báo cáo phương pháp định lượng đồng thời Metformin Vildagliptin phương pháp Rp-HPLC [2] Phương pháp thẩm định theo hướng dẫn ICH đạt yêu cầu tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, độ đúng, độ xác Từ thực tế đó, đề tài tiến hành với mục tiêu: V Xây dựng thẩm định quy trình định lượng Metformin Linagliptin viên nén phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (Rp-HPLC) V ứng dụng phương pháp để đánh giá Metformin Linagliptin chế phâm viên nén có thị trường Nguyễn Thị Thu Trang CHƯƠNG ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu Viên nén bao phim (Trajenta Dou) chứa 500 mg Metformin HC1 2,5 mg Linagliptin lưu hành thị trường Bảng 2.1 Đối tượng nghiên cứu Viên nén bao phim (Trajenta Duo) Số lô Hạn dùng Lô 002140 26/08/2021 Lô 905613 20/02/2021 2.1.1 Chất chuẩn đối chiếu Bảng 2.2 Chất chuẩn đối chiếu Chất chuẩn Số lô Hàm lượng Nguồn gốc Metformin hydrocloric (MH) QT 168 070319 99,9 % Viện kiểm nghiệm TP.HCM 99,5 % Công ty Toronto research chemicals (Canada) L 465900 Linagliptin (LNG) 2.1.2 Hóa chất, dung mơi Acetonitril (ACN), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn dùng HPLC, acetic acid, amonium acetate (CH3COONH4), formic acid, ortho - phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4), di-potassium dihydrogen phosphate (K2HPO4), sodium dodecyl sulfate (SDS) đạt tiêu chuẩn phân tích 2.1.3 Thiết bị Bảng 2.3 Thiết bị dùng thí nghiệm STT Loại thiết bị Hãng Hệ thống sắc ký lỏng 1260, đầu dò PDA Agilent - Technologies Be siêu âm gia nhiệt SH80 Elma (Đức) Cân phân tích MS105DU Mettler - Toledo (Thụy Sỳ) Hệ thống lọc nước Casada II.I Pali (USA) Máy ƯV- 1800 Shimadzu (Nhật) Máy đo pH Mettler - Toledo (Thụy Sỳ) Máy ly tâm Z306 Hermle (Đức) 2.1.4 Dụng cụ - Bình định mức 100 ml, 10 ml 11 Nguyễn Thị Thu Trang - Pipet xác 1ml, ml, 5ml, 10ml - Cốc thủy tinh 50 ml, 100 ml - Falcon 15ml, bơm tiêm dùng lần, syringer filter 0,45 pm, vials 2.2 Phuong pháp nghiên cứu Từ tài liệu tham khảo định lượng MH, LNG cơng bố kỳ thuật sắc ký lỏng pha đảo với hệ dung môi phân cực áp dụng [15], [16], [17], [22], [27], [30] Sau khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp tiến hành thâm định quy trình phân tích theo ICH tiêu tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, độ đặc hiệu [9], Áp dụng quy trình thẩm định để định lượng MH LNG chế phẩm viên nén lưu hành thị trường 2.2.1 Chuẩn bị mầu a Dung dịch chuẩn gốc pha đường chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc MH 3060 pg/ml (C|): Hòa tan MH (30,63 mg) 10 ml MeOH để thu dung dịch chuẩn gốc S| (3060 pg/ml) - Dung dịch chuẩn gốc LNG 500 pg/ml (C2): Hòa tan LNG (10,05 mg) 20 ml MeOH để thu dung dịch chuẩn gốc S| (500 pg/ml) - Dung dịch trung gian Si: Hút xác 5,0 ml dung dịch Ci 5,0 ml dung dịch C2 vào bình định mức 100 ml bổ sung MeOH 50% đến vạch, lắc Từ dung dịch tiến hành pha đường chuẩn theo Bảng 2.4 Bảng 2.4 Cách chuẩn bị đường chuẩn Nồng độ MH (pg/ml) Nồng độ LNG (pg/ml) 0,5 7,65 1,25 WS2 1,0 15,30 2,50 WS3 1,5 22,95 3,75 30,60 5,00 Mẩu chuẩn Thể tích dung dịch SI (ml) WS1 Thể tích pha lỗng (ml) 10,0 WS4 2,0 WS5 2,5 38,25 6,25 WS6 3,0 45,90 7,50 12 Nguyễn Thị Thu Trang •DAbl •OAD1 ■DAD1 •DAD1 •DAO1 220 1.706 (28.2 Fl ) Ref- 1.653 & 2.059 of 001-0101.0 1.726 (88.3Fl ) Ref- 1.653 & 2.059 of 001-0101.0 1.739 (112 Fl - ) Ref- 1.653 & 2.059 of 001-0101.0 766 (65.2Fl ) Ref- 653 & 2.059 of 001-0101.0 1.786 (22.0FL - ) Ref- 1.653 & 2.059 of 001-0101.0 '240 260 ' '280 ' 300' ' 320* ' '340 ' '360' '380' " r.'rr Hình 3.17 Phổ ưv thời gian lưu MH chuẩn (a, b) LNG chuẩn (c, d) Hình 3.18 Phổ uv thời gian lưu MH thử (e, f) LNG thử (g, h) Nhân xét: Kết sắc ký đồ cho thấy - Mầu trắng (A) mầu placebo (B) không xuất pic thời gian lưu hoạt chất - Sắc ký đồ mầu thử (D, E) xuất pic có thời gian lưu tương đương với pic mẫu chuẩn (C) - Các pic mẫu thử tách hoàn toàn tách khỏi pic tạp 36 Nguyễn Thị Thu Trang - Thêm MH chuân vào mầu thử (E), chiều cao diện tích pic MH tăng lên so với trước thêm chất chuẩn, pic có thời gian lưu tương ứng với pic mầu chuẩn - Thêm LNG chuân vào mầu thử (D), chiều cao diện tích pic LNG tăng lên so với trước thêm chất chuẩn, pic có thời gian lưu tương ứng với pic mầu chuân - Phổ uv thời gian lưu pic MH LNG mầu chuẩn (Hình 3.17) thử (Hình 3.18) giống - Độ tinh khiết pic MH LNG lớn 99% Vậy quy trình định lượng MH LNG đạt yêu cầu độ đặc hiệu 3.2.2 Tỉnh thích hợp hệ thong Tiến hành mô tả mục 2.2.3.1 Kết thu sau: Bảng 3.8 Kết tính thích hợp hệ thống mẫu chuẩn MH Thống kê Thòi gian lưu tR (phút) Diện tích pic s (mAU.s) Hệ số đối xứng Số đĩa lý thuyết N TB (n=6) 1,78 978,06 0,81 5602 RSD (%) 0,09 0,36 0,78 0,63 TB (n=6) 6,11 316,03 0,91 11309 RSD (%) 0,16 0,49 0,54 0,70 LNG Nhân xét: Kết từ bảng số liệu cho thấy - Độ lệch chuẩn tương đổi RSD (%) thời gian lưu diện tích pic MH LNG mẫu chuẩn không 2,0% - Hệ số đoi xứng pic nam khoảng từ 0,8 - 1,5 - Số đĩa lý thuyết lớn 3000 Như quy trình định lượng MH LNG đạt yêu cầu tính thích hợp hệ thống 3.2.3 Khoang tuyến tính giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Tiến hành mô tả mục 2.2.3.2 Ket thu sau: 37 Nguyễn Thị Thu Trang Bảng 3.9 Kết xác định khoảng tuyến tính phương trình hồi quy LNG MH STT Nồng độ chất chuẩn (ụg/ml) X Diện tích pic (mAU.s) Y Nồng độ chất chuẩn (pg/ml) X 1Diện tích pic (mAU.s) Y 7,66 308,83 1,25 81,88 15,32 621,08 2,51 161,05 22,99 931,60 3,76 245,87 30,65 1262,94 5,01 332,11 38,31 1505,29 6,26 393,53 45,97 1823,04 7,52 480,40 Phương trình hồi quy: y = ■39,36x + 19,96 Phương trình hồi quy: y = 63,33x + 4,84 Hệ số tương quan R2 = 0,9987 Hệ số tương quan R2 = 0,9983 MH 2000 J 1600 =, 1200 y = 39,36x + 19,96 R2 = 0,9987 ôãã I 800 I 400 0 10 20 30 40 50 Nồng độ (gg/ml) Hình 3.19 Đồ thị tính tuyến tính MH Nhận xét: Kết khảo sát tính tuyến tính cho thấy MH khoảng nồng độ từ 7,66 pg/ml - 45,97 pg/ml LNG khoảng nồng độ từ 1,25 pg/ml - 7,52 pg/ml có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic Hệ số tương quan R nằm khoảng 0,995 < R