Xây dựng quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

Giới thiệu chung về flurbiprofen

Cấu trúc, tính chất

Flurbiprofen, có danh pháp quốc tế là 2 – (3–fluoro–4–phenylphenyl) propanoic acid, thuộc nhóm acid phenylalkanoic với công thức phân tử C15H13FO2 và khối lượng mol 244,26 g/mol Cấu trúc phân tử của flurbiprofen được thể hiện trong hình 1 Các mã ATC của flurbiprofen bao gồm M01AE09, M02AA19, R02AX01, S01BC04, trong khi mã Pubchem của nó là

3394 [28] và mã Drugbank là DB00712 [16]

Hình 1 Công thức cấu tạo flurbiprofen

Flurbiprofen có hai dạng đồng phân quang học là (+) S và (–) R, cả hai đều có tính chất vật lý tương tự và đạt độ hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 247 nm.

Flurbiprofen là một hợp chất tồn tại dưới dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần trắng, có nhiệt độ nóng chảy từ 114 đến 117 độ C Ở nhiệt độ 22 độ C, độ tan của flurbiprofen trong nước là 8 mg/L, với các chỉ số LogP và LogS lần lượt là 4,16 và -4,49.

Tác dụng dược lý

Flurbiprofen là thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) thuộc nhóm acid 2–arylpropionic mạnh về hoạt động ức chế tổng hợp prostaglandin

Prostaglandin là một chất trung gian hoá học của phản ứng viêm và cảm nhận đau Flurbiprofen có tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase

COX không chọn lọc ức chế cả hai enzyme COX-1 và COX-2, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp prostaglandin G2 (PGG2) và prostaglandin H2 (PGH2) từ axit arachidonic Việc giảm nồng độ prostaglandin giúp cải thiện tình trạng viêm, đau, sưng và sốt.

Flurbiprofen hiện có trên thị trường dưới dạng hỗn hợp của hai đồng phân quang học (+) S và (–) R Đồng phân (+) S chủ yếu chịu trách nhiệm cho tác dụng chống viêm, trong khi cả hai đồng phân đều có khả năng giảm đau.

Flurbiprofen được chỉ định để điều trị triệu chứng cấp tính hoặc kéo dài của bệnh gút, viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp, viêm cột sống dính khớp, đau thắt lưng và viêm gan cấp tính Thuốc cũng có tác dụng giảm đau trong các trường hợp như đau bụng kinh và đau nhẹ đến trung bình kèm theo viêm Ngoài chức năng chống viêm, hạ sốt và giảm đau, flurbiprofen còn có khả năng ức chế kết tập tiểu cầu mạnh mẽ Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng lâu dài flurbiprofen có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer và trì hoãn sự xuất hiện của bệnh Thêm vào đó, flurbiprofen được sử dụng trong phẫu thuật nhãn khoa để phòng co đồng tử trong quá trình mổ.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích quan trọng, dựa trên nguyên tắc phân tách các chất trong một pha tĩnh được chứa trong cột Quá trình này diễn ra nhờ dòng chảy của pha động lỏng dưới áp suất cao, cho phép tách biệt và phân tích các thành phần trong mẫu một cách chính xác.

Hình 2 Sơ đồ hệ thống HPLC

Phân tích HPLC là phương pháp nhanh chóng và hiệu quả, có khả năng phát hiện lượng mẫu nhỏ đến 200pg, đồng thời tách các hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao Trong quá trình sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và quá trình tách thường diễn ra ở nhiệt độ phòng, giúp bảo vệ các thuốc không bền với nhiệt khỏi sự phân hủy Với nhiều ứng dụng đa dạng, HPLC đã trở thành công cụ thiết yếu trong lĩnh vực khoa học và công nghiệp.

Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký cho đến khi đạt nồng độ cực đại Thời gian chết t0 là thời gian mà pha động cần để di chuyển qua hệ thống sắc ký Thời gian lưu thực tR' được tính bằng công thức tR' = tR – t0.

W1/2: chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic

Hình 3 Minh hoạ các thông số sắc ký

Vs : thể tích pha tĩnh; Vm: thể tích pha động

Q s : lượng chất trong pha tĩnh; Q m : lượng chất trong pha động Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu 1 < k’< 8

Qui ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a > 1 Để tách riêng

- Hệ số bất đối xứng As

Hệ số bất đối As cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ Trong đó:

Chiều rộng của pic được đo ở tỷ lệ 1/20 chiều cao của pic Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic được xác định là a.

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ As ≤ 2 Giá trị của As càng gần 1 thì pic càng cân đối

- Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số Số đĩa lý thuyết N của cột:

W: chiều rộng đo ở đáy pic

W 1/2 : chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Trong đó: tRB, tRA: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB , WA: độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2B, W1/2A: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn vị Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5

Quá trình định lượng bằng HPLC có thể chia thành 4 bước Mỗi bước đều có ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng Các bước này là:

- Đo tín hiệu đầu dò

Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao thường dùng

Có 4 phương pháp định lượng bằng HPLC thường dùng [5, 6]:

Phương pháp chuẩn ngoại là một phương pháp định lượng cơ bản, trong đó mẫu chuẩn và mẫu thử được sắc ký dưới cùng điều kiện Bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử với mẫu chuẩn, ta có thể tính toán nồng độ các chất trong mẫu thử một cách chính xác.

Phương pháp chuẩn nội là kỹ thuật sắc ký trong đó cả mẫu chuẩn và mẫu thử được bổ sung một lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, được gọi là chuẩn nội Bằng cách phân tích diện tích hoặc chiều cao của pic cùng với lượng hoặc nồng độ của chuẩn, có thể xác định chính xác hàm lượng thành phần cần định lượng trong mẫu thử.

Phương pháp thêm chuẩn là kỹ thuật phân tích, trong đó các chất chuẩn với nồng độ đã biết được thêm vào mẫu thử Sau đó, mẫu sẽ được xử lý và thực hiện sắc ký trong cùng điều kiện Phương pháp này giúp xác định nồng độ chưa biết của các thành phần có trong mẫu thử một cách chính xác.

The copyright for the School of Medicine and Pharmacy, VNU is determined by the difference in concentration of the added substance and the corresponding increase in the area or height of the peak.

Phương pháp chuẩn hoá diện tích là cách xác định hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần Cách tính này dựa vào tỷ lệ phần trăm diện tích pic của chất đó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò huỳnh quang dựa trên cơ chế hấp phụ, trong đó chất tan được giữ trên bề mặt pha tĩnh và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ) Sắc ký hấp phụ rất hiệu quả trong việc tách các chất ít phân cực và các hợp chất hữu cơ không tan trong nước có phân tử lượng dưới 5000 đvC Phương pháp này vượt trội hơn các phương pháp khác trong khả năng tách đồng phân.

Hiện tượng quang – phát quang xảy ra khi một vật hấp thụ ánh sáng với bước sóng nhất định và sau đó phát ra ánh sáng có bước sóng khác, thường nằm trong miền ánh sáng nhìn thấy Theo định luật Stokes về sự phát quang, ánh sáng phát ra sẽ có bước sóng dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích, tức là λpq > λkt.

Huỳnh quang là hiện tượng phát xạ bức xạ điện từ, chủ yếu là ánh sáng nhìn thấy, xảy ra ở chất lỏng và khí khi phân tử hấp thụ năng lượng nhiệt (phonon) hoặc quang (photon) Thời gian phát quang rất ngắn, chỉ từ 10^-8 đến 10^-9 giây, và electron tồn tại ở trạng thái kích thích trong khoảng thời gian khoảng 10^-9 giây.

Quá trình phát xạ năng lượng của huỳnh quang diễn ra qua hai bước: đầu tiên, năng lượng được phát xạ dưới dạng nhiệt (phonon), sau đó dưới dạng quang (photon) Do đó, năng lượng photon phát xạ không tương đương với năng lượng mà phân tử đã hấp thụ trước đó Đầu dò huỳnh quang là một trong những bộ phận quan trọng trong hệ thống này.

Máy phân tích sắc ký tại Trường Đại học Y Dược, VNU, sử dụng đầu dò có khả năng phân tích cả định tính và định lượng Đầu dò huỳnh quang hoạt động dựa trên hiện tượng nhiều hợp chất hấp thụ chùm tia UV và phát ra bức xạ với bước sóng dài hơn, có thể xảy ra ngay lập tức (huỳnh quang) hoặc sau một thời gian ngắn (lân quang) Mặc dù phần năng lượng phát xạ trở lại thường thấp, một số hợp chất có thể phát xạ với độ lớn từ 0.1 đến 1 năng lượng hấp thụ, làm cho chúng trở thành lựa chọn phù hợp cho việc dò tìm huỳnh quang.

Bảng 1 Đặc điểm của một số đầu dò

Kiểu đầu dò Đáp ứng Mức ồn Giới hạn phát hiện (g/cm 3 )

Đầu dò huỳnh quang là một ứng dụng quan trọng trong quang phổ huỳnh quang, nơi phổ huỳnh quang được hình thành từ sự phát xạ của các phân tử Khi phân tử hấp thụ năng lượng từ bức xạ tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác, nó sẽ được kích thích và sau đó trở về trạng thái cơ bản, giải phóng năng lượng dưới dạng bức xạ huỳnh quang Cường độ huỳnh quang (F) của dung dịch loãng tỉ lệ thuận với nồng độ (C) trong điều kiện xác định, với cường độ và bước sóng kích thích là hằng số Để đảm bảo độ chính xác, việc đo phổ huỳnh quang chỉ nên thực hiện với dung dịch có nồng độ C < 10 -4 mol/l nhằm tránh ảnh hưởng từ sự suy giảm cường độ bức xạ phát ra.

Hình 4 Nguyên tắc hoạt động của đầu dò huỳnh quang

Đầu dò huỳnh quang (FLD) là thiết bị nhạy nhất trong các loại đầu dò HPLC, có khả năng phát hiện phân tử chất duy nhất trong buồng đo Độ nhạy của FLD cao gấp 10 – 1000 lần so với đầu dò UV – Vis, đồng thời nó cũng chính xác và có tính chọn lọc vượt trội hơn so với các đầu dò quang học khác.

Khoảng 15% hợp chất tự nhiên có khả năng huỳnh quang, và đầu dò huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các chất hữu cơ có huỳnh quang tự nhiên cùng các dẫn xuất của chúng Sự hiện diện của các liên kết liên hợp, đặc biệt trong các hợp chất thơm với nhiều nhân, góp phần tạo ra cường độ huỳnh quang cao Ngoài ra, nhiều hợp chất không có phổ huỳnh quang có thể chuyển đổi thành các dẫn xuất có phổ này thông qua việc xử lý với các thuốc thử phù hợp.

Các phương pháp định lượng flurbiprofen

Phương pháp chuẩn độ

Theo Dược điển châu Âu (EP) 2010 và Dược điển và Công thức Quốc gia Hoa Kỳ (USP 40 – NF 35), phương pháp chuẩn độ flurbiprofen dựa vào phản ứng acid – base của gốc acid trong cấu trúc của nó Phương pháp này được thực hiện bằng cách hòa tan 0,200 g flurbiprofen trong 50 ml ethanol 96% và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 M, sử dụng phenolphthalein làm chỉ thị, dừng lại khi dung dịch chuyển sang màu hồng bền hơn 30 giây Có thể thay thế phenolphthalein bằng phương pháp xác định điểm cuối qua phép đo điện thế Mỗi 1 ml dung dịch NaOH 0,1 M tương đương với 24,43 mg C15H13FO2.

Phương pháp này nổi bật với tính đơn giản, chi phí thấp và dễ thực hiện Tuy nhiên, nó cũng có nhược điểm là độ chính xác không cao, độ nhạy kém và phụ thuộc vào chất lượng của chất chuẩn cũng như kỹ năng của người phân tích.

Phương pháp quang phổ phân tử

Phương pháp quang phổ phân tử, bao gồm phổ UV-Vis, phổ hồng ngoại và phổ huỳnh quang, đóng vai trò thiết yếu trong kiểm nghiệm thuốc Các dược điển chủ yếu sử dụng những phương pháp này để thực hiện định tính, định lượng và kiểm tra độ tinh khiết của thuốc và chế phẩm.

Nghiên cứu của các tác giả Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015) đã giới

The School of Medicine and Pharmacy at VNU has developed and validated two molecular spectroscopic methods for the quantification of flurbiprofen, following guidelines set by ICH and EMA.

Quy trình định lượng flurbiprofen được thực hiện bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang sử dụng máy quang phổ UV – Vis hai chùm tia (HEλIOSβ, Thermo Spectronic, Cambridge, UK) Cuvet có kích thước 1 cm được sử dụng trong quá trình này với tốc độ quét được điều chỉnh phù hợp để đảm bảo độ chính xác trong kết quả.

Tín hiệu được xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 10.0 trên hệ điều hành Windows với dải quét từ 190 đến 320 nm và độ rộng khe 2 nm Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 1 – 14 μg/ml, với giá trị RSD thấp hơn 3,2% và giới hạn định lượng (LOD) là 0,60 μg/ml.

Nghiên cứu giới thiệu phương pháp định lượng flurbiprofen bằng máy đo huỳnh quang, sử dụng máy đo phổ huỳnh quang SHIMADSU RF–5301 với đèn Xenon 150 W Hệ thống hoạt động với độ rộng khe 5,0 nm, bước sóng kích thích λex= 248 nm và bước sóng phát xạ λem 308 nm Phần mềm xử lý dữ liệu là Statistical Product Service Solutions (SPSS) phiên bản 10.0 trên hệ điều hành Windows Độ tuyến tính được thiết lập trong khoảng nồng độ 0,05 – 0,35 μg/ml, với giá trị RSD thấp hơn 3,8% và LOQ là 0,03 μg/ml.

Các phương pháp này có ưu điểm như thời gian thực hiện ngắn, chi phí thấp, và độ chính xác cao, cho phép phát hiện và định lượng mẫu ở nồng độ rất nhỏ Chúng được áp dụng hiệu quả trong phân tích dược phẩm, kiểm soát chất lượng sản phẩm thương mại, và nghiên cứu dược động học Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phương pháp không cao do ảnh hưởng từ các tạp chất lạ, nên cần kết hợp với các phương pháp khác để kiểm tra độ tinh khiết của mẫu.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

USP 40 – NF 35 [15] và BP 1993 [29] đều đề xuất phương pháp HPLC để phân tích flurbiprofen tinh khiết và ở dạng phân liều (thuốc viên và thuốc nhỏ mắt) Cả hai phương pháp đều đề nghị sử dụng pha động acetonitril : nước :

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò UV – Vis

Theo EP 2010, flurbiprofen trong viên nén được định lượng bằng hệ thống HPLC – DAD Dung môi hòa tan mẫu là hỗn hợp acetonitril và nước theo tỷ lệ 45:55, với 0,20 g chế phẩm được hòa tan để phân tích trong 100 ml dung môi Pha tĩnh sử dụng octadecylsilyl silica gel kích thước 5 μm trong cột thép 3,9 × 150 mm, trong khi pha động là hỗn hợp axit axetic, acetonitril và nước theo tỷ lệ 5:35:60 Tốc độ dòng là 1 ml/phút và thể tích tiêm là 10 μl Thời gian sắc ký gấp khoảng 2 lần thời gian lưu của flurbiprofen, với đầu dò DAD phát hiện tại bước sóng 254 nm.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển quy trình định lượng flurbiprofen trong viên nén bao phim 100 mg bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp đầu dò DAD Cột sắc ký sử dụng là silica gel pha đảo C8 với kích thước 5 μm, 120 Å, 4,6×150 mm, và pha động là hỗn hợp acetonitril, nước, và acid acetic băng với tỷ lệ 65:32,5:2,5 (v/v/v), với tốc độ dòng 1 ml/phút Mẫu được tiêm với thể tích 10 μl, thời gian sắc ký là 8 phút, và bước sóng phát hiện là 247 nm, với thời gian lưu của flurbiprofen là 3,73 phút Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ 2 – 20 μg/ml, diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (μg/ml) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ.

Phương pháp nghiên cứu cho thấy hệ số tương quan tuyến tính R² đạt 0,9993 với hệ số 0,680x Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml Phương pháp này đảm bảo tính đặc hiệu đối với flurbiprofen, với độ chính xác cao, tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, độ lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,71% và độ lệch chuẩn tương đối của độ chính xác trung gian ≤ 2,34%.

Phương pháp này nổi bật với độ chính xác cao và khả năng nhạy cảm với nồng độ nhỏ, cho phép tách biệt hoàn toàn các chất Nó đặc biệt hiệu quả với những chất không bền nhiệt và dễ bay hơi, nhờ vào tính đặc hiệu cao của đầu dò.

DAD (Diode Array Detector) có khả năng quét phổ hấp thụ, rất hữu ích trong việc kiểm tra độ tinh khiết của mẫu Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là cần sử dụng các dung môi đắt tiền và yêu cầu hệ thống máy móc hiện đại để đạt hiệu quả tối ưu.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ

Nghiên cứu đã phát triển phương pháp định lượng flurbiprofen và các chất chuyển hóa của nó trong dịch sinh học như huyết tương và nước tiểu bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với đầu dò khối phổ (LC-MS/MS).

Nghiên cứu định lượng flubiprofen trong huyết tương được thực hiện bởi các tác giả Chenghan Mei, Bin Li, Qiangfeng Yin, Jing Jin, Ting Xiong, Wenjuan He, Xiujuan Gao, Rong Xu, Piqi Zhou, Heng Zheng, và Hui Chen vào năm 2015 Nghiên cứu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu UFLC LC–30 AD kết hợp với máy khối phổ QTRAR 4500 từ AB SCIEX Flurbiprofen được tối ưu hóa bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm, với các điều kiện chạy nguồn hóa ESI được liệt kê trong bảng 2.

Bảng 2 Điều kiện chạy nguồn hoá ESI

Thông số Giá trị Áp suất khí phun 30 psi

Thế phun điện tử –4,5 kV

Nguồn ion 40 psi Đầu dò với các thông số Năng lượng va chạm (CE) = –12 V, Thế phân nhóm (DP) = –26 V, Thế đầu vào (EP) = –8 V, Năng lượng (CXP) = –8 V Ion có dạng 242,9 → 198,7

Pha tĩnh: cột silica gel C18 kớch thước 5 àm, 2.1 ì 50 mm kết nối với một tiền cột 4 × 3,0 mm I.D Phenomenex

Pha động gradient được thực hiện như trong bảng 3

Bảng 3 Chương trình pha động gradient

Thời gian (phút) Tốc độ dòng

Nhiệt độ cột 40 o C và thể tớch tiờm mẫu là 5 àl Phương phỏp đó xỏc định được khoảng định lượng là 0,04–10 μg/ml Độ chính xác đạt 2,2 – 3,4%

Phương pháp này có độ nhạy và giới hạn phát hiện cao, cùng với độ đặc hiệu tốt nhờ vào tính phân mảnh riêng biệt của các ion Thời gian phân tích nhanh và khả năng định lượng các chất có thời gian lưu tương tự với độ phân giải cao là những ưu điểm nổi bật Tuy nhiên, phương pháp này không phù hợp cho các chất kém bền nhiệt và dễ bay hơi, đồng thời yêu cầu hệ thống thiết bị đắt tiền.

Phương pháp HPLC–MS/huỳnh quang do Kuma và các cộng sự phát triển cho phép định lượng flurbiprofen, dextromethorphan, midazolam và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong huyết tương lợn Các chất được phân tách qua cột Luna C8(II) với thời gian chạy mẫu là 20 phút Flurbiprofen và 4-hydroxyl-flurbiprofen được phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang, trong khi dextromethorphan, dextrorphan, midazolam và 1-hydroxyl-midazolam sử dụng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI Hệ thống sắc ký của Shimadzu bao gồm hai máy bơm LC–10ADVP và một bộ lấy mẫu tự động Pha động sử dụng methanol và đệm ammonium acetate 20 mM, với tốc độ dòng 0,2 ml/phút và điều kiện sắc ký ở nhiệt độ môi trường Nồng độ methanol tăng từ 40% đến 90% trong 10 phút và duy trì đến hết quá trình sắc ký Flurbiprofen và 4-hydroxyl-flurbiprofen được kích thích ở bước sóng λEx = 260nm và phát xạ ở λEm = 320nm.

Một nghiên cứu đã trình bày phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo để xác định flurbiprofen trong huyết thanh người Phương pháp này được áp dụng nhằm mục đích nghiên cứu dược động học, sử dụng pha động bao gồm axetonitrile, nước và acid phosphoric.

Quy trình định lượng flurbiprofen và acid 4-biphenylacetic được thực hiện với tỷ lệ dung môi là 650:350:0,5 (v/v/v) và tốc độ dòng 1,0 ml/phút Thể tích

Nghiên cứu của Knadler và các cộng sự (1989) đã áp dụng pha động acetonitril : nước với tỷ lệ 62 : 38, sử dụng tốc độ dòng 1ml/phút qua cột C18 Quy trình định lượng được thực hiện bằng đầu dò huỳnh quang với bước sóng kích thích λEx 200nm và bước sóng phát xạ λEm = 320nm.

Phương pháp sắc ký khí

Cơ sở tách bằng sắc ký khí dựa vào sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha: pha tĩnh với bề mặt tiếp xúc lớn và pha động là khí thẩm thấu qua toàn bộ bề mặt tĩnh.

Nghiên cứu của Yilmaz, Bilal và Emrah Alkan (2015) đã phát triển phương pháp định lượng flurbiprofen bằng hệ thống sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ Sử dụng hệ thống sắc ký khí Agilent 6890 N với đầu dò MS 5973, tiêm mẫu tự động 7673 và phần mềm Agilent ChemStation, cột HP–5 MS (0,25 μm, 30 m x 0,25 mm) được dùng để tách mẫu Quá trình tiêm mẫu không chia dòng với khí mang helium ở tốc độ 1 ml/phút, và nhiệt độ đầu phun cùng máy dò là 250°C Các thông số đầu dò MS bao gồm nhiệt độ dòng truyền nhiệt 280°C, độ trễ dung môi 3 phút và năng lượng electron 70 eV Phương pháp cho miền giá trị từ 0,25 – 5,0 μg/ml với độ chính xác nhỏ hơn 3,64%, độ thu hồi đạt 99,4%, LOD và LOQ lần lượt là 0,05 và 0,15 μg/ml Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là khả năng phân tích đồng thời nhiều chất, độ phân giải cao, độ nhạy cao, thể tích tiêm mẫu nhỏ, thời gian phân tích nhanh và tính đặc hiệu cao.

Trường Đại học Y Dược, VNU, có một nhược điểm đáng lưu ý là chi phí cao Ngoài ra, phương pháp này không thể áp dụng cho các chất không bền nhiệt và những chất dễ bay hơi.

Thẩm định quy trình phân tích

Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu của quy trình phân tích xác định khả năng nhận diện chính xác chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác trong mẫu thử, như tiền chất và tạp chất Khi áp dụng kỹ thuật HPLC với đầu dò DAD và/hoặc khối phổ, việc kiểm tra độ tinh khiết của pic là cần thiết để tránh nhầm lẫn với các hợp chất tương tự và chứng minh rằng pic sắc ký chỉ đại diện cho một thành phần duy nhất.

Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:

Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê so với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.

- Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [3, 5, 31, 33]

Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp Độ nhiễu càng thấp, tính đặc hiệu càng cao

Trong phương pháp HPLC sử dụng đầu dò DAD hoặc khối phổ, chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic là rất quan trọng Nó giúp phân biệt rõ ràng giữa các hợp chất có cấu trúc tương tự và xác nhận rằng sắc ký không phải là sự chồng chéo của hai thành phần trở lên.

Khi chưa xác định liệu chế phẩm có sản phẩm phân huỷ hay không, cần tự tạo mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với mẫu không có sản phẩm phân huỷ.

Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình khi áp dụng phương pháp cho cùng một mẫu thử trong cùng điều kiện Nó thể hiện mức độ dao động của các kết quả đo lường so với giá trị trung bình và bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.

Phương pháp xác định độ lặp lại thể hiện độ chính xác của các thử nghiệm được thực hiện trong cùng một điều kiện Cụ thể, độ lặp lại được đánh giá khi một người tiến hành thử nghiệm trong cùng một phòng thí nghiệm, sử dụng thiết bị giống nhau và trong khoảng thời gian ngắn.

Để đảm bảo độ chính xác của quy trình phân tích, cần thực hiện ít nhất 9 lần định lượng mẫu thử trong miền giá trị của quy trình (bao gồm 3 lần phân tích cho mỗi nồng độ ở 3 nồng độ khác nhau) hoặc tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100% Độ chính xác trung gian được đánh giá qua các biến số trong phòng thí nghiệm trong nhiều ngày khác nhau, với sự tham gia của nhiều kiểm nghiệm viên và sử dụng các trang thiết bị khác nhau.

Tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể để đưa ra những cách thức xác

Nguyên tắc chung trong phân tích dữ liệu là thực hiện nhiều lần với nhiều mẫu khác nhau, đồng thời xem xét các yếu tố ảnh hưởng như thời gian, địa điểm và hệ thống máy Việc này giúp đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.

Tiêu chuẩn cho giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) phụ thuộc vào loại phân tích mẫu Trong các quy trình định lượng thường quy, RSD thường đạt dưới 2% Đối với phân tích mẫu sinh học, độ chính xác khoảng 20% ở giới hạn định lượng thấp và 15% ở nồng độ cao hơn Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng chính xác.

Độ đúng

Độ đúng của quy trình phân tích được định nghĩa là mức độ gần gũi giữa giá trị thu được và giá trị thực khi áp dụng phương pháp cho cùng một mẫu thử trong cùng điều kiện Độ đúng này có thể bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống.

Phương pháp xác định độ đúng yêu cầu thực hiện ít nhất 9 lần thử nghiệm với tối thiểu ba nồng độ khác nhau trong quy trình phân tích Cụ thể, cần tiến hành 3 lần phân tích cho mỗi nồng độ, tổng cộng là 3 nồng độ khác nhau Tỷ lệ phục hồi được sử dụng làm đại lượng đặc trưng cho độ đúng và được xác định theo công thức cụ thể.

Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được à là giỏ trị mẫu theo lý thuyết

Tỷ lệ phục hồi trong phân tích mẫu được chấp thuận dựa vào quy trình xử lý và nồng độ phân tích, thường đạt giá trị 100 ± 2% trong các định lượng quy chuẩn Tỷ lệ phục hồi càng gần 100% cho thấy độ chính xác của quy trình càng cao.

Tính tuyến tính

Tính tuyến tính trong quy trình phân tích phản ánh khả năng suy luận kết quả của phương pháp thông qua mối quan hệ giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được, chẳng hạn như chiều cao hoặc diện tích pic (y), và nồng độ (x).

Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R 2 [3, 5, 31, 33]

- Khoảng tuyến tính cần được khảo sát ở khoảng 10 (ít nhất 5 [5, 33] hoặc 6 [3, 31]) mức nồng độ khác nhau

- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp

Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu và trong quá trình thẩm định phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo ít nhất ba lần để kiểm tra độ lặp lại của các nồng độ chuẩn.

Để đánh giá tính tuyến tính của mô hình, cần áp dụng các phương pháp thống kê phù hợp, bao gồm trắc nghiệm t nhằm kiểm tra ý nghĩa của các hệ số a và b, cùng với trắc nghiệm F để xác định tính thích hợp của phương trình.

Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,90 ≤ R 2 ≤ 1 [5].

Miền giá trị

Miền giá trị của quy trình phân tích xác định khoảng nồng độ từ cao nhất đến thấp nhất của chất cần phân tích trong mẫu thử Tất cả các nồng độ trong khoảng này phải đảm bảo độ chính xác, độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp phân tích.

Miền giá trị được thể hiện qua khoảng nồng độ, trong đó mối quan hệ giữa giá trị đo được và nồng độ vẫn duy trì tính tuyến tính.

- Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định

- Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không

Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của miền giá trị là phải đạt 80% – 120% nồng độ của mẫu thử [3, 5, 31, 33].

Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện (LOD) trong một quy trình phân tích là lượng tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện trong mẫu thử mà không cần xác định chính xác hàm lượng.

Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất (LOD) được xác định thông qua việc phân tích mẫu có hàm lượng đã biết Quá trình này giúp thiết lập mức nồng độ tối thiểu mà quy trình phân tích đang thẩm định vẫn có khả năng phát hiện được.

Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện giữa mẫu trắng và mẫu thử là một kỹ thuật quan trọng, đặc biệt khi quy trình sử dụng thiết bị và gặp phải hiện tượng nhiễu đường nền Trong đó, tín hiệu thu được từ mẫu trắng được ký hiệu là N, trong khi tín hiệu từ mẫu chuẩn sẽ được xác định để so sánh.

S LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3.

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng

SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng

Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (LOQ) trong quy trình phân tích là mức tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có thể được định lượng với độ chính xác và độ đúng phù hợp.

LOQ (Limit of Quantitation) được xác định thông qua việc phân tích mẫu có hàm lượng đã biết, nhằm thiết lập mức nồng độ tối thiểu mà tại đó quy trình phân tích vẫn đảm bảo độ đúng và độ chính xác chấp nhận được Điều này cho phép đánh giá khả năng phát hiện tín hiệu trong điều kiện pha loãng nồng độ mà vẫn duy trì chất lượng phân tích.

Để lập tỷ số phát hiện cho mẫu trắng và mẫu thử, phương pháp này áp dụng cho các thiết bị có hiện tượng nhiễu đường nền Giả sử tín hiệu từ mẫu trắng là N và tín hiệu từ mẫu chuẩn là S LOQ được xác định là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt khoảng 10.

- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ

SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ

NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, trang thiết bị

Flurbiprofen đạt tiêu chuẩn chất chuẩn theo dược điển châu Âu (code: EPF0285200)

Natri hydroxid, acid chlorhydric, acid acetic, hydropeoxid từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

Acetonitrile (ACN) từ nhà sản xuất Merck KGaA, Đức đạt tiêu chuẩn HPLC

Nước (H2O) được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure UV–TOC đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m

Mẫu dược phẩm được định lượng là viên nén Antadys 100mg Theramex, Pháp số lô 1M620 01 2014

The Ultimate 3000 HPLC system from Thermo Scientific features a high-pressure four-pump setup and an automatic sample injection unit It includes the FLD 3100 Fluorescence Detector, which operates with a Xenon lamp and measures wavelengths from 200 to 880 nm Additionally, the DAD 3000 Diode Array Detector utilizes a Deuterium (D2) lamp for the UV range and a tungsten (W) lamp for the visible range, covering wavelengths from 190 to 800 nm.

Cột Thermo Scientific Acclaim C 8 120 kích thước 5 μm, 4,6 × 150mm

Hệ thống máy vi tính chạy hệ điều hành Microsoft Windows 7 có trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478

The Ultrasonic Cleaners AC – 150H from MRC Ltd in Israel, along with the Shimadzu AUW220 analytical balance from Japan and the Finnpipette F3 from Thermo Scientific in the USA, are essential laboratory tools Additionally, the equipment includes volumetric flasks, graduated cylinders, mortar and pestle, and Whatman® filter paper, all of which are vital for precise measurements and sample preparation in scientific research.

40, đầu lọc cellulose tỏi sinh Minisart đ RC 0,45àm, Sartorius, Đức

Phương pháp nghiên cứu

Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang là một bước quan trọng trong việc thẩm định quy trình phân tích Nghiên cứu này áp dụng phương pháp đã thẩm định để định lượng flurbiprofen trong viên nén Antadys 100 mg của Theramex, Pháp, nhằm đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong kết quả phân tích.

Trước khi sắc ký, các mẫu đều được lọc bằng đầu lọc cellulose tái sinh Minisart đ RC 0,45àm, tiờm mẫu 3 lần, lấy giỏ trị trung bỡnh

Xử lí thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel

2.2.1 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký

Khi phát triển phương pháp HPLC, mục tiêu là đạt được mức độ tách chấp nhận được cho tất cả các cấu tử quan tâm trong mẫu, với thời gian và độ phân giải hợp lý Đối với một số mẫu, chỉ cần phân tích một hoặc vài cấu tử Sự tách có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nhiệt độ, cột tách, tốc độ dòng của pha động, đầu dò, thể tích tiêm mẫu, và đặc biệt là thành phần của pha động, là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát quá trình tách.

Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen bằng phương pháp HPLC – DAD, chúng tôi đã sử dụng dung dịch chuẩn flurbiprofen với nồng độ 20 μg/ml để khảo sát và xác định các điều kiện sắc ký tối ưu.

- Pha tĩnh cột silica gel C 8 5 μm, 120 Å trong cột 4,6 mm x 150 mm

- Pha động ACN : H2O : CH3COOH tỷ lệ 65 : 32,5 : 2,5 (v/v/v)

- Tốc độ dòng 1 ml/phút

- Đầu dò ghi nhận tín hiệu tại bước sóng 247 nm

Trong nghiên cứu này, thời gian sắc ký được thiết lập là 8 phút, với các thông số ban đầu tương tự Cần xác định thêm các yếu tố như nhiệt độ buồng đo, độ nhạy của đầu dò, nồng độ dung dịch khảo sát, cũng như bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu để đạt được kết quả chính xác.

Nhiệt độ của mẫu có ảnh hưởng lớn đến phổ huỳnh quang, do đó biến đổi nhiệt độ môi trường tác động mạnh đến tín hiệu thu nhận từ đầu dò huỳnh quang Đầu dò được nghiên cứu cho phép nâng và kiểm soát nhiệt độ trong buồng đo ổn định, duy trì khoảng cách 15˚C cao hơn nhiệt độ môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất Độ nhạy của ống quang tử đo cường độ ánh sáng phát xạ sau khi qua bộ tán xạ đơn sắc, được điều chỉnh và tối ưu hóa theo 8 mức trong quá trình sắc ký để cải thiện tỷ lệ S/N Mức 8 đạt độ bão hòa ≥ 100%, với mỗi mức tăng tương ứng với sự gia tăng khoảng 2 lần cường độ quang phổ phát xạ huỳnh quang.

- Nếu lựa chọn độ nhạy quá nhỏ, chiều cao pic giảm xuống và tỉ lệ S/N không tối ưu

Khi chọn độ nhạy quá cao, tín hiệu của ống quang tử sẽ bị bão hòa, dẫn đến việc đầu dò tự động điều chỉnh giảm độ nhạy đã cài đặt Nếu độ nhạy được cài đặt quá lớn, sắc ký đồ sẽ xuất hiện hình dạng giống như mức 8 trong hình 5, sau đó hệ thống sẽ tự động khôi phục lại độ nhạy trước đó.

Hình 5 Thang độ nhạy của đầu dò FLD

Nồng độ dung dịch khảo sát

Trong nghiên cứu định lượng flurbiprofen trong chế phẩm dược phẩm bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang của Bilal Yilmaz và cộng sự

(2015), khoảng tuyến tính được sử dụng là 50 – 350 ng/ml, bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm [11]

Từ đó, chúng tôi tiến hành sắc ký dung dịch flurbiprofen chuẩn nồng độ

Để đánh giá hình dạng pic trên sắc ký đồ, sử dụng nồng độ 400 ng/ml với bước sóng kích thích λEx = 248nm và bước sóng phát xạ λEm = 308nm Dựa vào tín hiệu thu được và độ bão hòa tối đa của ống quang tử trên phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex, cần điều chỉnh nồng độ khảo sát cho đến khi giá trị độ bão hòa của ống quang tử đạt mức tối ưu từ 30% đến 80%, như được trình bày trong bảng 4.

Bảng 4 Tối ưu hóa điều kiện sắc ký theo giá trị độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử

Giá trị độ bão hòa lớn nhất của ống quang tử Giải pháp

< 30% - < 30%: Tăng độ nhạy lên 1 mức

- < 15%: Tăng độ nhạy lên 2 mức

30% – 80% Giá trị độ nhạy là tối ưu

Giảm độ nhạy đi 1 mức để tránh độ bão hòa của ống quang tử không mong muốn khi nồng độ thay đổi

≥ 100% Giảm độ nhạy đi ít nhất 1 mức

Bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu

Hệ thống máy HPLC Model Ultimate 3000 của tập đoàn Thermo Scientific Hoa Kỳ, sử dụng đầu dò FLD – 3100, cho phép xác định một bước sóng kích thích và một bước sóng phát xạ tối ưu, mang lại tỉ lệ S/N tốt nhất ngay cả với những mẫu có nồng độ thấp Phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1 cung cấp nhiều chế độ dò bước sóng khác nhau.

Chế độ Zero Order cho phép bộ tán xạ đơn sắc xử lý toàn bộ quang phổ thay vì chỉ một bước sóng cụ thể Bước sóng kích thích được thiết lập trước với một giá trị cố định Đầu dò FLD – 3400RS tích hợp chức năng lọc các bước sóng không mong muốn, sau đó người dùng có thể cài đặt thuộc tính bước sóng phát xạ và tiến hành quét.

Chế độ Zero Order là lý tưởng cho các mẫu có nhiều chất phát xạ huỳnh quang với phổ phát xạ rộng Trong chế độ này, cường độ ánh sáng phát xạ cao hơn so với hoạt động bình thường, giúp hệ thống phát hiện chất ở nồng độ rất thấp.

Với đầu dò FLD – 3100, hệ thống có khả năng ghi lại phổ 2D bằng cách quét các bước sóng kích thích hoặc phát xạ, hoặc cả hai, trên một dải bước sóng đã được cài đặt Cường độ tín hiệu huỳnh quang sẽ được tính toán và ghi lại liên tục cho từng bước sóng, cho phép chế độ quét 2D xác định được bước sóng kích thích và phát xạ tối ưu.

Có 3 chế độ quét 2D như sau:

Khi bước sóng kích thích được quét trong phạm vi đã cài đặt, bước sóng phát xạ cũng được quét với khoảng cách chênh lệch cố định Chức năng quét đồng thời giúp xác định sơ bộ bước sóng kích thích và phát xạ Tuy nhiên, để xác định chính xác cặp bước sóng tối ưu, cần sử dụng chức năng quét riêng biệt cho từng bước sóng.

Quét bước sóng kích thích

Bước sóng phát xạ được giữ cố định, trong khi bước sóng kích thích được quét trên một dải bước sóng đã được cài đặt, tạo ra phổ kích thích của mẫu.

Quét bước sóng phát xạ

Bước sóng phát xạ được giữ cố định trong khi bước sóng kích thích được quét trên một dải đã được cài đặt, dẫn đến việc tạo ra phổ kích thích của mẫu.

Từ phiên bản Chromeleon 7.1 trở đi, chức năng quét 3D được hỗ trợ cho đầu dò huỳnh quang, cho phép xác định thời gian lưu giữ và mức hấp thụ tối đa của hỗn hợp chất trong dung dịch Khác với chế độ quét 2D, chế độ quét 3D quét liên tục trên toàn bộ dải phổ mà không cần chọn trước phạm vi bước sóng, tương tự như chế độ quét phổ 3D của đầu dò DAD.

Cũng như chế độ quét 2D, chế độ quét 3D bao gồm 3 chế độ Quét bước sóng kích thích, quét bước sóng phát xạ và quét đồng thời

Quá trình tối ưu hóa bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ có các tiêu chí chính sau:

- Tốt nhất là lựa chọn bước sóng kích thích là bước sóng hấp thụ tối đa của thành phần trong mẫu

Tiêu đề	Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Flurbiprofen Trong Viên Nén Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao Ghép Đầu Dò Huỳnh Quang
Tác giả	Trần Mai Anh
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Thanh Bình
Trường học	Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	78
Dung lượng	1,66 MB