T Ổ NG QUAN
T Ổ NG QUAN V Ề SÂM VŨ DIỆ P
SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax L), họNgũ gia bì (Araliaceae) [2].
Sâm vũ diệp là cây thân thảo lâu năm, ưa bóng và độ ẩm cao Thân rễ dài có nhiều đốt và vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân khí sinh cao từ 20 - 30 cm, thường mọc thẳng và rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông và mọc chồi mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 Lá kép chân vịt gồm 2 - 3 chiếc mọc vòng, với lá chét dài từ 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu nhọn, xẻ thùy không đều và có mép răng cưa cùng với lông.
Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21]
1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái
Sâm vũ diệp là loài sâm quý hiếm, mọc tự nhiên tại dãy núi Hoàng Liên Sơn, bao gồm huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Gần đây, loài này đã được nghiên cứu và thử nghiệm trồng tại một số địa phương như Hà Giang và Lào Cai Tuy nhiên, vùng phân bố của SVD đang bị thu hẹp và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng, vì vậy cần có biện pháp bảo tồn và gìn giữ để phát triển trong tương lai.
Sâm vũ diệp thường phát triển rải rác hoặc tập trung dưới tán rừng ẩm, nơi có sương mù gần như quanh năm Vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3 hàng năm, từ phần đầu mầm của cây bắt đầu mọc lên.
Thân rễ phân nhánh ngang gần mặt đất sẽ phát triển thành một hoặc vài chồi thân, với tốc độ sinh trưởng nhanh chóng trong vòng một tháng Đến tháng 4, mỗi chồi mang lá có khả năng cho ra một cụm hoa, trong khi quả xanh xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6 Quả chín vào tháng 7 và rụng xuống xung quanh gốc cây mẹ, nhưng do thời điểm này trùng với mùa mưa lớn, hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của sâm vũ diệp Tuổi của cây có thể được xác định qua những vết sẹo trên thân hình thành sau khi quả chín.
Saponin được coi là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc chi Panax L., với gần 300 saponin đã được các nhà khoa học chiết tách và xác định Nghiên cứu trước đây của SVD cũng cho thấy saponin là thành phần chủ yếu trong lá và rễ cây sâm vũ diệp, bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng cao và một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn.
Vào năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã thành công trong việc phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá cây ginseng, trong đó có nhiều ginsenosid đặc trưng như F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3.
Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự vào năm 2002 chỉ ra rằng thân rễ và rễ củ SVD chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Vào năm 2003, thành phần saponin ở thân rễ SVD được xác định chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan, bao gồm các chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1 và ginsenosid Ro, bên cạnh đó còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2.
Vào năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập và xác định 10 saponin khung oleanan (1-10) là thành phần chính trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, bao gồm 3 chất mới bifinosid A-C (1-3).
Hình 1.2 Các hợp chất tách được từ rễcây sâm vũ diệp [33]
Tính vị, công năng: Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [3]
Nghiên cứu về tác dụng dược lý của SVD cho thấy nó có độc tính cấp rất thấp khi thử nghiệm trên động vật, đồng thời tăng cường chức năng sinh lý và ảnh hưởng tích cực đến hệ thần kinh trung ương SVD cũng giúp tăng sức dẻo dai, sức đề kháng và có tác dụng tán huyết Đặc biệt, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự chỉ ra rằng SVD có khả năng chống stress, chống trầm cảm, bảo vệ gan và kích thích tăng cường miễn dịch.
Sâm vũ diệp là một loại thảo dược quý, nổi bật với khả năng chống ung thư, chống oxy hóa và bổ dưỡng, đặc biệt có lợi cho phụ nữ sau sinh Nó giúp cải thiện trí nhớ, chữa thiếu máu và tình trạng xanh xao, gầy yếu Ngoài ra, sâm vũ diệp còn có tác dụng cầm máu, tán ứ và tiêu sưng Khi dùng ngoài, rễ phơi khô được tán bột mịn để chữa chảy máu và làm vết thương mau lành Rễ cây cũng có thể ngâm rượu để chiết xuất tinh chất, hỗ trợ sức khỏe và chức năng sinh dục Bên cạnh đó, người dân ở vùng trồng còn sử dụng thân và lá để nấu cao, pha với nước hoặc rượu nhằm tăng cường sức khỏe.
5 để uống cũng có tác dụng như rễ Ở Trung Quốc, sâm vũ diệp còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ huyết, đòn ngã tổn thương [7,22].
T Ổ NG QUAN V Ề STIPULEANOSID R2
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của stipuleanosid R2 [41]
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:
(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- carboxylic acid [40]
Chất bột màu trắng Độ tan: 0,57 g/L [42] Điểm nóng chảy 210 - 215 0 C [41]
Stipuleanosid R2 là một saponin quan trọng trong các loại dược liệu như sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis và Aralia elata, nổi bật với các hoạt tính sinh học đáng chú ý Nghiên cứu đã chỉ ra rằng stipuleanosid R2 có khả năng gây độc tế bào ung thư, đặc biệt là ức chế sự gia tăng tế bào ung thư bạch cầu dòng K562 và U937 Ngoài ra, hợp chất này còn có tác dụng chống oxy hóa, hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và giảm lipid máu.
1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào công bố về định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu bằng phương pháp HPLC trên thế giới, chủ yếu chỉ dừng lại ở việc phân lập chất này Vì vậy, việc xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 là rất cần thiết để ứng dụng dược liệu trong thực tiễn.
T Ổ NG QUAN V Ề S Ắ C KÝ L Ỏ NG HI ỆU NĂNG CAO (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách các chất từ hỗn hợp phân tích, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa pha tĩnh và pha động Pha động trong HPLC là chất lỏng, trong khi pha tĩnh có thể là chất rắn dạng tiểu phân hoặc chất lỏng được phủ trên chất mang rắn, hoặc chất mang đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Phương pháp này hoạt động dưới áp suất cao, giúp cải thiện hiệu suất tách biệt các thành phần trong mẫu phân tích.
Quá trình sắc ký lỏng được thực hiện dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân bố theo kích cỡ, tùy thuộc vào loại pha tĩnh được sử dụng.
Tốc độ di chuyển của các chất khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha, phản ánh ái lực tương đối của chúng với pha tĩnh và pha động Sự khác biệt này dẫn đến thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột, từ đó hỗ trợ trong việc phân tách các thành phần.
Các chất sau khi được tách ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector, giúp đo lường và xác định nồng độ chính xác của các chất phân tích Hiện nay, có nhiều loại detector được ứng dụng, bao gồm detector UV-Vis, detector huỳnh quang (FLD), detector diode array (DAD) và detector điện hoá Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn sử dụng detector DAD để phân tích và đo nồng độ các chất.
Quá trình tách sắc ký hỗn hợp nhiều thành phần sẽ tạo ra một sắc đồ với nhiều pic riêng biệt Sắc ký hiệu quả sẽ giúp tách rời từng thành phần trong hỗn hợp, cho phép thu được các pic rõ ràng trên sắc ký đồ.
1.3.2 Một số thông sốđặc trưng [2,3,5,9,10,15]
Thời gian lưu t0, hay còn gọi là thời gian chết, là khoảng thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký Thời gian lưu tR được tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống cho đến khi nó được phát hiện với nồng độ cực đại Thời gian lưu thực tR' được xác định bằng công thức tR' = tR – t0.
Trong thực nghiệm hệ sốdung lượng k’ được tính theo công thức:
Hệ số dung lượng phản ánh khả năng phân bố của chất tan giữa hai pha, cụ thể là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động tại thời điểm cân bằng Khi hệ số k’ nhỏ, thời gian rửa giải tRc cũng sẽ giảm, cho thấy chất tan gần đạt đến trạng thái bơm.
Hệ số bất đối AF, hay còn gọi là yếu tố doãng, có vai trò quan trọng trong việc giảm khả năng tách của mẫu Nếu giá trị k’ quá lớn, điều này có thể dẫn đến hiện tượng doãng pic, làm giảm độ nhạy và kéo dài thời gian lưu Trong thực tế, giá trị k’ lý tưởng nằm trong khoảng từ 2 đến 5 để đảm bảo hiệu quả
Hệ số bất đối AF cho biết mức độcân đối của pic trên sắc ký đồ:
- W1/20: là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
- a: là khoảng cách từđường vuông góc hạ từđỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic
Yêu cầu trong phép định lượng: 0,9 < AF < 2
Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối d) Hệ số chọn lọc
Độ phân giải (resolution) trong sắc ký phản ánh khả năng tách biệt hai chất, với yêu cầu α nằm trong khoảng từ 1,05 đến 2 Khi α càng khác 1, khả năng tách biệt càng rõ ràng hơn Độ phân giải của hai pic kề nhau được tính theo công thức cụ thể, cho thấy mức độ hiệu quả trong việc phân tách các thành phần trong mẫu.
- RS = 1,5: độ phân giải cơ bản đạt được, khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3%
- Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%
- RS= 0,75: Hai pic chưa tách nhau
1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC a) Yêu cầu chung
Các quy trình phân tích HPLC cần được thẩm định nếu chưa được công nhận trong tiêu chuẩn Dược điển của các quốc gia Việc thẩm định phương pháp được hướng dẫn rõ ràng trong các tài liệu phân tích và được quy định bởi các Dược điển Nội dung thẩm định đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ tin cậy và chính xác của các quy trình phân tích.
Khi thẩm định phương pháp định lượng dược chất chính và đa lượng bằng kỹ thuật HPLC, cần đánh giá các thông số đặc trưng như tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng.
1.3.4 Tổng quan các nghiên cứu định lượng thành phần hóa học của Sâm vũ diệp bằng HPLC
Năm 2009, Trần Công Luận và nhóm nghiên cứu đã xác định hàm lượng saponin tổng số trong thân rễ và rễ củ của Sâm vũ diệp, đạt mức 5,86% theo phương pháp trọng lượng của Namba.
Năm 2017, nhóm nghiên cứu của Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội do Nguyễn Thị Huệ dẫn đầu đã thực hiện khảo sát và tối ưu hóa điều kiện sắc ký để xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic và saponin toàn phần trong dược liệu sâm vũ diệp bằng kỹ thuật HPLC - DAD Kết quả cho thấy hàm lượng acid oleanolic trong cao sâm vũ diệp là 0,034% (340 μg/g) và trong rễ sâm vũ diệp là 0,0066% (66 μg/g) Đồng thời, hàm lượng saponin trong cao sâm vũ diệp đạt 0,364% (3640 μg/g) và trong dược liệu SVD là 0,0698%.
Nghiên cứu này cung cấp những kết quả ban đầu về định lượng thành phần hóa học của sâm vũ diệp (SVD) và xác định hàm lượng saponin tổng số Hiện tại, chưa có nhiều công bố về phân tích và định lượng các thành phần saponin cụ thể trong SVD Chúng tôi sử dụng phương pháp HPLC để phân tích định lượng saponin, phương pháp này được Dược điển các nước công nhận là tiên tiến hơn so với các phương pháp quang phổ hay khối lượng hiện nay HPLC có độ chính xác cao, đáp ứng tốt yêu cầu phân tích từng thành phần riêng lẻ, đặc biệt là với các mẫu phức tạp như cao chiết từ dược liệu.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
ĐỐI TƯỢ NG NGHIÊN C Ứ U
2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp
Mẫu nghiên cứu được thực hiện với thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) trồng tại Sa Pa, Lào Cai, thu hái vào ngày 15/7/2016 Để đảm bảo tính chính xác, mẫu nghiên cứu đã được giám định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Quỳnh Nga và CN Phan Văn Trường thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản (PB-150716) hiện đang được lưu giữ tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.
Mẫu nghiên cứu thân rễ sâm vũ diệp có đặc điểm nhiều đốt và vết sẹo, với hình dạng cong ngoằn ngoèo, chiều dài từ 7-12 cm và đường kính 1,2-1,8 cm Chất liệu của thân rễ cứng chắc, giòn và dễ bẻ, mặt cắt lởm chởm với màu vàng nâu nhạt Sâm vũ diệp có mùi thơm nhẹ, vị đắng và hơi ngọt.
Thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa được xử lý bằng cách rửa sạch, cắt thành miếng mỏng và sấy khô ở nhiệt độ 50 độ C Sau đó, nguyên liệu này được bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo và thoáng mát, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu.
Hình 2.1 Mẫusâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào
Cai vào ngày 15/7/2016 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2
Chúng tôi đã sử dụng chất stipuleanosid R2, được phân lập từ dược liệu sâm vũ diệp, trong một nghiên cứu trước đó của nhóm nghiên cứu chúng tôi.
Stipuleanosid R2 sau khi được phân lập sẽ được đánh giá độ tinh khiết để đảm bảo đạt tiêu chuẩn sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp định lượng nồng độ của hợp chất này trong SVD bằng kỹ thuật HPLC.
Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập được 2.1.3 Dung môi, hóa chất
Dung môi, hóa chất: Các hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA) và loại tinh khiết dùng trong HPLC
- Dung môi dùng cho chiết xuất và phân lập: Ethanol 70%, methanol (MeOH), ether, ethylacetat (EtOAc), n-butanol (BuOH)
- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, Acetonitril, Acid acetic) của Merck, Đức; nước cất hai lần dùng cho phân tích HPLC đạt tiêu chuẩn Dược điển
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng thiết bị và dụng cụ đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tựđộng
- Tủ sấy Memmert (Memmert –Đức)
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001 g, Precisa - Thụy Sĩ)
- Cân xác định độẩm Prescisa HA 60
- Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000 ml
- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)
- Bếp điện, bếp đun cách thủy
- Cột sắc ký các loại kích cỡ
- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 ml, ống nghiệm, pipet chính xác
N Ộ I DUNG NGHIÊN C Ứ U
1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD bằng HPLC với chất chuẩn là stipuleanosid R2 tinh khiết được phân lập từ SVD
2 Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD thu hái ở Sa Pa, Lào Cai bằng phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định ở trên.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
2.3.1 Phương pháp chiết xuất các hợp chất
Nghiên cứu cho thấy sâm vũ diệp chứa saponin là thành phần chính, và việc tham khảo tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu là cần thiết để xác định phương pháp chiết xuất tối ưu cho mẫu thân rễ SVD.
- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70%
- Phương pháp chiết phân đoạn: phương pháp chiết lỏng - lỏng
Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:
1 Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 70 0 C, chiết 3 lần
2 Tiến hành lọc loại bã dược liệu, các dịch chiết ethanol thu được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng ethanol
3 Cao ethanol này đem phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetate và n-butanol lặp lại 3 lần theo tỷ lệ1:1 Các phân đoạn ether, ethyl acetat, n-butanol đem cất quay chân không dưới áp
13 suất giảm để thu hồi dung môi, sấy dưới áp suất giảm thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn
4 Cao butanol thu được trong quá trình chiết xuất sẽ được sử dụng để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong sâm vũ diệp
2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD bằng HPLC a) Lựa chọn điều kiện sắc ký
Chúng tôi đã khảo sát các yếu tố như bước sóng, tỷ lệ dung môi, thành phần pha động, tốc độ dòng và thể tích bơm mẫu để lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu nhằm phân tích chính xác stipuleanosid R2 có trong thân rễ SVD Đồng thời, chúng tôi cũng thẩm định stipuleanosid R2 được phân lập từ SVD để đảm bảo đủ tiêu chuẩn làm chất chuẩn trong quy trình định lượng.
* Yêu cầu của chất sử dụng làm chất chuẩn [35]:
Nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn cần có độ tinh khiết cao, đặc biệt đối với hợp chất hóa dược phải đạt trên 95% Những nguyên liệu này được lựa chọn từ các lô sản xuất thuốc chất lượng cao, đảm bảo tính đồng nhất và được cung cấp từ các nguồn đáng tin cậy, như các nhà sản xuất gốc.
* Phương pháp thẩm định: Độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được được kiểm tra dựa vào ba phương pháp sau:
1 Sắc ký lớp mỏng: Sti phân lập được sẽ tiến hành sắc ký trên silicagel RP-
Để phát hiện chất F254S (Merk), sử dụng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong Ethanol 96% Phun đều dung dịch lên bản mỏng, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 120°C và hơ nóng trên bếp điện từ cho đến khi màu sắc xuất hiện Cuối cùng, quan sát vết xuất hiện dưới ánh sáng thường.
Yêu cầu: Sau khi phun thuốc thử trên sắc ký đồ phải xuất hiện một pic duy nhất màu hồng tím của stipuleanosid R2
Phương pháp đánh giá độ tinh khiết thông qua tổng tạp dựa theo phương pháp chuẩn hóa diện tích khi tiến hành định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Tiến hành định lượng 01 dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 06 lần bằng HPLC Dựa vào kết quả sắc ký đồtính lượng tạp bằng phương pháp phần trăm diện tích pic
Yêu cầu: độ tinh khiết > 95%
3 Đo độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được từ SVD
Yêu cầu: stipuleanosid R2 phân lập được phải có nhiệt độ nóng chảy nằm trong khoảng 210 - 215 0 C [41] c) Thẩm định phương pháp định lượng stipuleanosid R2 trong SVD [4,5,40]
Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá rõ ràng chất cần phân tích khi có sự hiện diện của tạp chất hoặc các chất cản trở khác Phương pháp HPLC được xem là có tính đặc hiệu đối với chất cần phân tích khi đáp ứng các tiêu chí nhất định.
Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không thể so sánh một cách thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
* Kiểm tra tính thích hợp hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống phân tích được xác định qua độ chính xác của thiết bị, được đo bằng cách lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã xử lý Để kiểm tra, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn và ghi lại các giá trị thời gian lưu cùng với diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.
Độ tuyến tính của đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hoặc chiều cao) và nồng độ chất phân tích trong mẫu thử Khoảng tuyến tính được xác định từ nồng độ thấp nhất đến cao nhất trong đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Độ tuyến tính được diễn đạt qua phương trình hồi quy y = ax + b, với hệ số tương quan tuyến tính R², trong đó y đại diện cho đáp ứng của pic và x là nồng độ chất cần phân tích.
15 Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ
- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp.
- Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau
* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính
LOQ, hay giới hạn phát hiện tối thiểu, là lượng chất cần phân tích thấp nhất có trong mẫu thử mà vẫn có thể được định lượng với độ chính xác và độ tin cậy phù hợp.
Để xác định LOD và LOQ, cần dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu nền (S/N) Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ tối thiểu có thể phát hiện bằng sắc ký Tiến hành đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng và mẫu thử, sau đó thiết lập tỷ số S/N.
LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà tại đó có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3/1)
LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu đường nền (S/N /1)
Độ lặp lại của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử nghiệm riêng biệt khi áp dụng quy trình thử nghiệm nhiều lần trên cùng một mẫu Để xác định độ lặp lại, cần thực hiện phân tích nhiều lần từ công đoạn đầu tiên như cân, pha, xử lý mẫu cho đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.
Tiến hành pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký và lặp lại quá trình tiêm nhiều lần để lấy giá trị trung bình Độ lặp lại được thể hiện qua giá trị RSD (%) của các đáp ứng phân tích.
* Độđúng Độđúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực
PHƯƠNG PH ÁP X Ử LÝ S Ố LI Ệ U
Dữ liệu nghiên cứu được phân tích bằng phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 với các công thức tính toán để xử lý kết quả thống kê.
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 xRSD S
K Ế T LU Ậ N VÀ BÀN LU Ậ N
KI ỂM TRA ĐỘ TINH KHI Ế T C Ủ A STIPULEANOSID R2 PHÂN L Ậ P ĐƯỢ C
3.1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Stipuleanosid R2 được phân lập và kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM trên bản mỏng silicagel RP-18 F254S, sử dụng hệ dung môi Methanol:H2O với tỷ lệ 2:1 Kết quả phân tích sắc ký đồ thể hiện như hình 3.1.
Hình 3.1 Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun H 2 SO 4
Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, SKĐ của stipuleanosid R2 xuất hiện vết màu hồng đậm, sau đó chuyển sang màu tím, đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen Điều này cho thấy stipuleanosid R2 phân lập được là chất tinh khiết.
3.1.2 Phương pháp HPLC a) Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên việc phân tích tài liệu tham khảo và khảo sát các yếu tố như thành phần pha động, tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng, chúng tôi đã phát triển một chương trình sắc ký sử dụng hệ thống HPLC Agilent 1260 Infinity.
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)
- Detector DAD phát hiện ởbước sóng: 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: Acetonitril (kênh A): Acid acetic 0,5%/H2O (kênh B) với chương trình dung môinhư bảng 1
Bảng 1 Chương trình dung môi
Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid acetic 0,5% (%) Kiểu rửa giải
Dưới điều kiện sắc ký đã thiết lập, các thành phần saponin trong mẫu thử từ dịch chiết n-butanol SVD được tách biệt hiệu quả với pic cân đối Điều này cho thấy các điều kiện sắc ký hiện tại có thể được áp dụng để phân tích định lượng stipuleanosid R2 trong sâm vũ diệp Ngoài ra, độ tinh khiết của stipuleanosid R2 được phân lập từ SVD sẽ được xác định bằng phương pháp HPLC.
Để pha mẫu stipuleanosid R2, cần cân chính xác khoảng 1,0 mg Sti để phân lập, sau đó pha thành dung dịch gốc với nồng độ 1,0 mg/mL (1000 ppm) trong methanol Tiến hành siêu âm trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau đó pha loãng thành dung dịch có nồng độ 500 ppm.
Tiến hành phân tích dung dịch stipuleanosid R2 lặp lại 6 lần nhằm kiểm tra tính thích hợp của hệ thống HPLC đã chọn Qua đó, xác định được độ tinh khiết của stipuleanosid R2 đã được phân lập.
Kết quả thẩm định độ tinh khiết được thực hiện thông qua phương pháp chuẩn hóa diện tích Để tính toán, sử dụng phương pháp phần trăm diện tích pic, loại trừ pic của pha động và pic có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) nhỏ hơn 2/1 Kết quả cuối cùng xác định độ tinh khiết của mẫu.
19 phương pháp HPLC được ghi nhận ở bảng 2 và hình 3.2
Bảng 2 Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết
TT % Diện tích pic chính
% Tổng diện tích pic tạp
Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 bằng HPLC
* Nhận xét: Kết quảSKĐ của chất stipuleanosid R2 phân lập được cho thấy xuất hiện 2 pic:
- Tại thời gian lưu t R = 15,539: xuất hiện 1 pic chính là pic của stipuleanosid R2 chiếm 96,183% tổng diện tích pic trên SKĐ
Tại thời gian lưu t R = 16,173, có một pic phụ chiếm 3,817% tổng diện tích pic trên SKĐ Độ lệch chuẩn tương đối về diện tích của pic stipuleanosid R2 giữa các lần tiêm cùng nồng độ là 0.32% ( 95%)
3.1.3 Phương pháp đo độ nóng chảy
Kết quảđo độ nóng chảy của stipuleanosid R2 phân lập được là 214 0 C
Nhiệt độ nóng chảy được đo cho thấy trùng khớp với nhiệt độ nóng chảy của stipuleanosid R2 tinh khiết, điều này xác nhận rằng stipuleanosid R2 phân lập được là chất tinh khiết.
Kết luận từ việc xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 thông qua sắc ký lớp mỏng, HPLC và đo độ nóng chảy cho thấy rằng chất này đạt yêu cầu về độ tinh khiết Stipuleanosid R2 đã được phân lập và sử dụng làm chất chuẩn trong quy trình định lượng nồng độ của chất này trong các mẫu SVD.
XÂY D ỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢ NG STIPULEANOSID R2
Thực hiện chương trình sắc ký đã lựa chọn ở mục 3.1.2
3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng a) Chuẩn bị mẫu
Dung dịch mẫu trắng: Dung dịch MeOH
Để chuẩn bị dung dịch mẫu thử, cân chính xác khoảng 0,1 g cao BuOH của sâm vũ diệp và hòa tan trong MeOH, sau đó cho vào bình định mức 10 ml Tiến hành siêu âm ở nhiệt độ phòng và lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 μm để thu được dung dịch thử, sẵn sàng cho quá trình sắc ký.
Để xây dựng dãy dung dịch chuẩn, chúng tôi đã chuẩn bị 21 gốc bằng MeOH với các hệ số pha loãng khác nhau, từ đó thu được các dung dịch có nồng độ thích hợp Quá trình này cho phép chúng tôi đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp, đảm bảo rằng kết quả thu được là chính xác và đáng tin cậy.
* Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu
- Mẫu trắng: Dung dịch MeOH
- Mẫu chuẩn: Stipuleanosid R2 phân lập được từ sâm vũ diệp pha trong MeOH
- Mẫu thử: Cao BuOH của thân rễ SVD hòa tan trong MeOH
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn stipuleanosid R2 và mẫu thử theo các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn Ghi lại sắc ký đồ và xác định thời gian lưu của pic stipuleanosid R2 trong sắc ký đồ của các mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn.
Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn
Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử
Kết quả phân tích cho thấy tín hiệu pic của Sti xuất hiện tại thời gian lưu tR= 15,565, tương ứng với thời gian lưu của stipuleanosid R2 trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn Tín hiệu này tách biệt rõ ràng khỏi các tín hiệu pic khác, trong khi sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic nào trong khoảng thời gian lưu của stipuleanosid R2 Điều này chứng tỏ phương pháp phân tích có độ đặc hiệu cao và phù hợp để xác định stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD.
Để tiến hành phân tích, thực hiện sắc ký 01 dung dịch chuẩn của stipuleanosid R2 với nồng độ 150 µg/ml, lặp lại 06 lần theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn (mục 3.1.2) Sau khi hoàn tất quá trình sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic cùng với hệ số đối xứng.
Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối về thời gian lưu, diện tích pic và hệ số bất đối lần lượt là 0,16%, 3,01% và 1,33%, tất cả đều thấp hơn 5% (Bảng 3) Điều này chứng tỏ rằng các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho việc phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp.
Bảng 3 Tính thích hợp hệ thống
(phút) Diện tích pic (mAU*s) Hệ số bất đối
Để tiến hành, trước tiên cần chuẩn bị các dãy dung dịch chuẩn bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc 1000 μg/ml bằng MeOH với các hệ số pha loãng khác nhau Kết quả sẽ thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 15,625 - 37,5 - 75 - 150 - 200 - 300 - 400 μg/ml.
Lọc qua màng lọc có kích cỡ 0,45 μm được dung dịch dùng để triển khai sắc ký
Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự tương quan tuyến tính mạnh mẽ giữa diện tích pic trên sắc ký đồ và nồng độ stipuleanosid R2 trong dung dịch, được mô tả bởi phương trình y = 2,6081x + 49,1185 với hệ số tương quan R² = 0,9988 Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 15,625 đến 400 µg/ml, mối liên hệ này thể hiện sự tương quan chặt chẽ với hệ số tương quan rất cao.
Bảng 4 Kết quả khảo sát khoảngtuyến tính của stipuleanosid R2
TT Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic (mAU*s)
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2 e) Giới hạn phát hiệu (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp, tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 và phân tích bằng HPLC cho đến khi tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đạt khoảng 2-3 Trong đó, S là chiều cao pic stipuleanosid R2 và N là chiều cao tín hiệu nhiễu lớn nhất Nồng độ xác định được là LOD của phương pháp định lượng Qua khảo sát các điều kiện sắc ký, tại nồng độ 1,953 µg/mL, tỉ số S/N đạt 3,03 Khi pha loãng ở nồng độ thấp hơn, không còn đáp ứng, do đó đây được xem là giới hạn LOD của hệ thống Phương trình hồi quy là y = 2.6081x + 49.1185 với R² = 0.9988.
Nồng độ (àg/ml) Đồ thị đường chuẩn của stipuleanosid R2
Giới hạn định lượng (LOQ): Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện theo công thức LOQ = 3,3 x LOD
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện (LOD) là 1,953 àg/ml và giới hạn định lượng (LOQ) là 6,445 àg/ml, tương ứng với 3,3 lần LOD Điều này chứng tỏ phương pháp có độ nhạy cao và giới hạn phát hiện cũng như định lượng thấp hơn nhiều so với nồng độ định lượng, làm cho nó phù hợp để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu SVD.
- Tiến hành định lượng 6 mẫu thửđộc lập, mỗi mẫu tiêm 3 lần
Để xác định hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu thử, cần sử dụng đường chuẩn trong phần xác định khoảng tuyến tính Độ lặp lại được xác định bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của các lần định lượng, và kết quả khảo sát độ lặp lại được đánh giá thông qua RSD Các kết quả này được trình bày chi tiết trong bảng 5.
Bảng 5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Nồng độ cao (mg/ml)
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng trung bình của Sti trong cao SVD đạt 2,477% với độ lệch chuẩn tương đối RSD là 2.02% (< 5%) Điều này chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt và có khả năng ứng dụng hiệu quả trong phân tích stipuleanosid R2 trong SVD.
- Dung dịch thử: Hòa tan 6 mẫu cao SVD trong MeOH Xác định được lượng stipuleanosid R2 có sẵn trong mỗi mẫu thử
Dung dịch thử thờm chuẩn được sử dụng bằng cách thêm 50 µg Sti chuẩn vào mỗi mẫu cao dược liệu Sau đó, tiến hành chạy sắc ký với 6 mẫu thử thêm chuẩn Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng, có thể tính toán lượng Sti trong các mẫu và xác định độ thu hồi của phương pháp Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 6.
Bảng 6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Lượng tìm lại (àg) Độ thu hồi (%)
ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢ C LI ỆU SÂM VŨ
Kết quả thẩm định phương pháp HPLC cho thấy rằng phương pháp này hoàn toàn phù hợp để định lượng hàm lượng stipuleanosid R2 có trong dược liệu sâm vũ diệp.
Để tiến hành phân tích stipuleanosid R2, cần chuẩn bị 6 mẫu cao sâm vũ diệp, hòa tan chúng bằng methanol (MeOH) Sau đó, sử dụng siêu âm và lọc qua màng lọc có kích thước 0,45 μm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.
- Tiến hành sắc ký Xác định thời gian lưu, diện tích pic tương ứng với thời gian lưu của Sti trên sắc ký đồthu được
Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính và phương pháp nội suy, chúng tôi đã xác định hàm lượng Sti trong mẫu cao BuOH của SVD cũng như trong dược liệu được sử dụng trong nghiên cứu Kết quả định lượng được trình bày trong bảng 7.
Bảng 7 Kết quả định lượng stipuleanosid R2 trong thân rễ sâm vũ diệp
Diện tích pic stipuleanosid R2 (mAU.s)
Hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao (%)
Hàm lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu khô (%)
* Kết quả trình bày ở bảng 7 cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao BuOH của sâm vũ diệp là 2,477% và trong dược liệu sâm vũ diệp là 0,117%.
BÀN LU Ậ N
3.4.1 Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC
Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và trang thiết bị của Khoa Y Dược, chúng tôi đã tham khảo tài liệu đã công bố để phát triển phương pháp phân tích stipuleanosid R2 trong dược liệu sâm vũ diệp bằng kỹ thuật HPLC.
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm)
- Detector DAD phát hiện ởbước sóng: 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: Acetonitril (A) - Acid acetic 0,5%/H2O (B) theo chương trình dung môi trong 45 phút: (0-5 phút: 20% A; 5-15 phút: 20→40% A; 15-20 phút: 40% A; 20-30 phút: 40→100% A; 30-35 phút: 100% A; 35-40 phút: 100→20%A; 40-45 phút: 20% A)
* Đường chuẩn: y = 2,6081x + 49,1185; R 2 = 0,9988; khoảng nồng độ 15,625 – 400 àg/ml
* Độ đúng: Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 96,25% đến 104,64%, RSD 3,18 %; n=6
* Giới hạn phỏt hiện: 1,953 àg/ml
* Giới hạn định lượng: 6,445 àg/ml
Kết quả phân tích stipuleanosid R2 bằng HPLC cho thấy độ tin cậy cao, xác nhận đây là phương pháp định lượng đầu tiên được xây dựng cho stipuleanosid R2 trong SVD Kết quả thẩm định đáp ứng yêu cầu của một phương pháp phân tích, cho phép ứng dụng phương pháp này để phân tích stipuleanosid R2 trong sâm vũ diệp và các loài dược liệu khác.
3.4.2 Về định lượng stipuleanosid R2 trong dược liệu và cao sâm vũ diệp
Saponin khung oleanan là thành phần chính và đặc trưng của sâm vũ diệp, hiện đang được trồng thử nghiệm tại Sa Pa và Hà Giang Nghiên cứu hóa học và tác dụng dược lý của sâm vũ diệp đang được tiến hành, trong đó stipuleanosid R2 chưa được phân tích cụ thể Nghiên cứu này khảo sát hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa Sử dụng phương pháp phân tích HPLC, kết quả cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong cao BuOH sâm vũ diệp là 2,477% (24,77 mg/g) và trong thân rễ sâm vũ diệp là 0,117% (1,17 mg/g) Đây là lần đầu tiên hàm lượng stipuleanosid R2 được định lượng trong dược liệu sâm vũ diệp.
Kết quả đóng góp cơ sở khoa học đầy đủ hơn về thành phần hóa học của dược liệu
Hiện nay, có 30 loại sâm vũ diệp được trồng tại Việt Nam Bài viết cũng định hướng cho các nghiên cứu về tác dụng dược lý của các thành phần trong sâm vũ diệp, cũng như ứng dụng của dược liệu này trong tương lai.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN Đề tài đã thực hiện được các mục tiêu nghiên cứu đã đềra như sau:
1 Xây dựng được phương pháp định lượng stipuleanpsid R2 và thẩm định được phương pháp HPLC về các mặt: tính thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độđặc hiệu, độ chính xác Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp phân tích
2 Định lượng được thành phần stipuleanosid R2 trong sâm vũ diệp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - DAD Kết quả thu được cho thấy hàm lượng stipuleanosid R2 trong mẫu cao BuOH của thân rễ sâm vũ diệp là 2,477% tương đương với 24,77 mg/g và trong dược liệu SVD là 0,117% tương đương với 1,17 mg/g
Với những kết quả đầy tiềm năng và hứa hẹn mà đề tài đã thực hiện được, tôi xin phép được kiến nghị đề tài cần tiếp tục:
1 Thiết lập thêm điều kiện cho chất chuẩn stipuleanosid R2 sử dụng trong đề tài để có thể cho kết quả xác định hàm lượng chất này trong dược liệu SVD được chính xác và ổn định hơn.
2 Áp dụng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 bằng HPLC trong dược liệu SVD và các loài Panax khác có chứa chất này
[1] Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, Hà Nội
[2] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXBY học, Hà Nội
[3] ĐỗHuy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng
Dong cùng cộng sự (2003), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam tập
2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, tr 711 - 714
[4] Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích -
Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009 TT-BYT Quy định vềđăng ký thuốc
[5] Bộ Y tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đảm bảo chất lượng thuốc và một sốphương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-113, 216-250
[6] Bộ Y tế, Vụ khoa học và đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr 79-82, 84-110
[7] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương
(2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội, tr 263-266
[8] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr 8-99, 162-196, 234-242
Nghiên cứu của Đỗ Thị Hà và Lê Thị Loan (2016) đã xây dựng thành công phương pháp định lượng tanshinon IIA trong dược liệu đan sâm trồng ở Việt Nam bằng kỹ thuật HPLC - DAD Phương pháp này đã được công bố trên Tạp chí dược liệu, số 21(1+2), trang 50-54 Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp này có độ chính xác và độ tin cậy cao, có thể áp dụng để định lượng tanshinon IIA trong dược liệu đan sâm.
[10] Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp thu hái ở Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc Gia Hà Nội
[11] Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic và saponin tổng số trong rễ cây sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Trường ĐH Quốc
[12] Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích và Đoàn Thị Ngọc Hạnh (2005),
"Nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam và đinh lăng trên trí nhớ", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr 196-200
[13] Nguyễn Thị Thu Hương và Bùi Thị Kim Cúc (2006), Nghiên cứu phát triển dược liệu và Đông dược ở Việt Nam, Tác dụng bảo vệ gan của sâm Việt Nam
V NU trong tổn thương gan thực nghiệm bằng ethanol, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 288-295
[15] Nguyễn Thị Thu Hương và và cộng sự (2001), Công trình nghiên cứu Khoa học 1987-2000, Tác dụng kích thích miễn dịch của sâm Việt Nam, NXB
Khoa học và Kỹ thuật, tr 464-466
[16] Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y
Feng)”, Tạp chí dược liệu, 14(1), tr 17-23
[19] Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp- Trường ĐH Dược Hà Nội
[20] Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương - Bộ y tế
[21] Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76
[23] Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y học – Bộ Y tế, tr 191-213
Pa, Lào Cai”, Tạp chí Dược liệu, 2(23), tr 82-88
[25] Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Xây dựng thử nghiệm tránh né thụ động để nghiên cứu tác dụng của sâm Việt Nam trên trí nhớ",
Tạp chí Dược liệu, 11(5), tr 202-206
[27] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn hoá phân tích (2006), Hoá phân tích
[28] Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr 199 – 222, 493 – 685
[29] Y Fan, D Y Guo, Q Song, and T Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", "Zhong Yao Cai", 36(4), pp 604-607
[30] C Liang, Y Ding, H T Nguyen, J A Kim, H J Boo, H K Kang, et al
(2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", "Bioorg Med Chem Lett", 20(23), pp 7110-7115
[31] Zhitao Liang, Zhihong Jiang, David Wangfun Fong, ZhongzhenZhao (2009),
“Determination of acid oleanolic and ursolic acid in Oldenlandia diffusa and its substitute using high performance liquid chromatography”, Journal of food and drug analysis, 17(2), pp 69-77
[32] B Mutschlechner, S Schwaiger, T V A Tran, and H Stuppner (2018),
"Development of a selective HPLC-DAD/ELSD method for the qualitative and quantitative assessment of commercially available Eurycoma longifolia products and plant extracts", "Fitoterapia", 124,pp 188-192
[33] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", "Chem Pharm Bull (Tokyo)", 59(11), pp 1417-1420
[34] Y Satoh, S Sakai, M Katsumata, M Nagasao, M Miyakoshi, Y Ida, et al
(1994), "Oleanolic acid saponins from root-bark of Aralia elata",
[35] M Schwarz, B Klier, and H Sievers (2009), "Herbal reference standards",
[36] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997),
"Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", "Yao Xue
[37] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al
(1989), "[Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng]", "Yao Xue Xue Bao", 24(8), pp 593-599
[38] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014),
"Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type 2 diabetic rats", "J Ethnopharmacol", 152(3), pp 553-560
[39] M Xi, C Hai, H Tang, A Wen, H Chen, R Liu, et al (2010), "Antioxidant and antiglycation properties of triterpenoid saponins from Aralia taibaiensis traditionally used for treating diabetes mellitus", "Redox Rep", 15(1), pp 20-
[40] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva
[41] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top
[42] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855
Phụ lục 01 Phiếu kết quả giám định mẫu
Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính
Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính
Phụ lục 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH)
Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp
Phụ lục 01 Phiếu kết quảgiám định mẫu
Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R 2 n ồng độ 15,625 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 37,5 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 75 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 150 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 200 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 300 àg/ml
S ắc ký đồ dung d ị ch chu ẩ n stipuleanosid R2 n ồng độ 400 àg/ml
Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Kiểm tra tính thích hợp hệ thống
PHỤ LỤC 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH)
PHỤ LỤC 05 Sắc ký đồcao sâm vũ diệp