Định lượng stipuleanosid r2 trong thân rễ sâm vũ diệp ( panax bipinnatifidus seem ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

KHOA Y DƯỢC dP rm ac y DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ,V NU HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP an (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) Me dic ine BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Co py rig ht @ Sc ho ol of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 dP rm ac y KHOA Y DƯỢC ,V NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI DƯƠNG THỊ PHƯỢNG ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG THÂN RỄ SÂM VŨ DIỆP an (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) ine BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG of Me dic HIỆU NĂNG CAO ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Sc ho Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Co py rig ht @ ThS NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH Hà Nội - 2018 ,V NU LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận này, tơi nhận nhiều giúp đỡ vô quý báu thầy cô giáo Khoa Y Dược, dP rm ac y Đại học Quốc gia Hà Nội với gia đình bạn bè Thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - người thầy dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hồng an Anh dành thời gian hướng dẫn động viên q trình hồn thiện khóa luận kiện cho tơi hồn thành khóa luận ine Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô Khoa Y Dược đặc biệt Bộ môn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc ln tạo điều dic Tôi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2013.Y, đặc biệt of Me bạn Thùy, Phương, Chuyên đồng hành với suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thành viên nhóm nghiên cứu tơi chị Thủy chị Huệ ln giúp đỡ nhiệt tình bảo tơi suốt trình thực đề tài Co py rig ht @ Sc ho ol Lời cuối cùng, vô biết ơn gia đình ni dạy, khích lệ sát cánh, giúp tơi có thêm động lực cố gắng để có kết ngày hơm Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2018 Sinh viên Dương Thị Phượng Acetonitril BuOH Buthanol DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd Dung dịch EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performace liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Sti Stipuleanosid R2 SVD Sâm vũ diệp TB Trung bình TT Thứ tự UV Ultra violete an ine dic Me of ol Sc ho @ Visible ht py rig dP rm ac y ACN VIS Co ,V NU DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Bảng Chương trình dung mơi 18 dP rm ac y Bảng Sự phù hợp hệ thống để xác định độ tinh khiết Bảng Tính thích hợp hệ thống 19 23 24 Bảng Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 26 Bảng Kết khảo sát độ phương pháp 27 Bảng Kết định lượng stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp 28 ht @ Sc ho ol of Me dic ine an Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính stipuleanosid R2 py rig Co ,V NU DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo stipuleanosid R2 dP rm ac y Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp Hình 1.4 Sắc ký đồ chất thông số đặc trưng Hình 2.1 Mẫu rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa 10 Pa, Lào Cai vào ngày 15/7/2016 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập sau phun H2SO4 10% /EtOH 17 Hình 3.2 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 HPLC 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu trắng 21 dic Me Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch thử ine an Hình 2.2 Hình ảnh stipuleanosid R2 phân lập Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn py rig ht @ Sc ho ol of Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn stipuleanosid R2 Co ,V NU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 21 22 24 ,V NU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ dP rm ac y CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học .2 1.1.2 Đặc điểm thực vật .2 an 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý .4 1.1.6 Công dụng 1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ine 1.2.1 Cơng thức hóa học 1.2.2 Tính chất lý hóa dic 1.2.3 Tác dụng sinh học .6 1.2.4 Một số nghiên cứu định lượng stipuleanosid R2 HPLC Me 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.3.1 Nguyên tắc HPLC .6 ol of 1.3.2 Một số thông số đặc trưng 1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC 1.3.4 Tổng quan nghiên cứu định lượng thành phần hóa học Sâm vũ diệp Sc ho HPLC CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 @ 2.1.1 Nguyên liệu sâm vũ diệp 10 2.1.2 Chất tinh khiết stipuleanosid R2 .10 ht 2.1.3 Dung môi, hóa chất 11 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 11 py rig 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 Co 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.3.1 Phương pháp chiết xuất hợp chất 12 2.3.2 Phương pháp định lượng stipuleanosid R2 cao rễ SVD HPLC 13 ,V NU 2.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp 16 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 17 dP rm ac y 3.1 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA STIPULEANOSID R2 PHÂN LẬP ĐƯỢC 17 3.1.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 3.1.2 Phương pháp HPLC 17 3.1.3 Phương pháp đo độ nóng chảy 20 3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 BẰNG HPLC 20 an 3.2.1 Chương trình sắc ký 20 3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng .20 ine 3.3 ĐỊNH LƯỢNG STIPULEANOSID R2 TRONG DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP 27 3.4 BÀN LUẬN 28 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic 3.4.1 Về xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 HPLC 28 3.4.2 Về định lượng stipuleanosid R2 dược liệu cao sâm vũ diệp 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 ,V NU ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), gọi Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất vị dP rm ac y thuốc quý phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [3,22] Gần sâm vũ diệp hóa bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Về mặt y học, sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ thành phần số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc [3,22] Theo tài liệu công bố sâm vũ diệp cho thấy saponin thành phần hoạt chất mang lại tác dụng dược lý giá trị sử dụng dược liệu quý y học Do vậy, việc tập trung nghiên cứu thành phần saponin SVD định lượng thành phần có ý nghĩa quan trọng việc ứng dụng dược liệu SVD thực tiễn an Qua trình tra cứu tài liệu, thấy nước ta có nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học tác dụng dược lý sâm ine vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax Trên sở đó, chúng tơi thực đề tài nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ Me dic SVD thu hái Sapa, Lào Cai với hợp chất saponin phân lập từ phân đoạn buthanol xác định stipuleanosid R2 thành phần saponin có thân rễ SVD [24] Tiếp nối nghiên cứu trên, thực đề tài “Định lượng ol of stipuleanosid R2 thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu thị trường tối ưu hóa quy trình chiết xuất Sc ho saponin SVD sau Mục tiêu đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng stipuleanosid R2 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Co py rig ht @ Xác định hàm lượng stipuleanosid R2 cao sâm vũ diệp dược liệu sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc Đề tài phần đề tài cấp Nhà nước thuộc Chương trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)”, mã số: KHCNTB.07C/13-18 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Tên khoa học ,V NU CHƯƠNG - TỔNG QUAN dP rm ac y SVD có tên khoa học Panax bipinnatifidus Seem [3,21], SVD thuộc chi Sâm (Panax L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) [2] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng đặc biệt ưa ẩm [3,21] Thân rễ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng hàng năm để lại Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa đông, mọc chồi thân từ tháng đến đầu ol of Me dic ine an tháng dương lịch Lá kép chân vịt, gồm - mọc vòng Lá chét - (ít 3) thn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - cm, gốc trịn, đầu thn thành mũi nhọn, xẻ thùy khơng đều, mép có cưa, có lơng Sc ho Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)[3,21] 1.1.3 Đặc điểm phân bố sinh thái Sâm vũ diệp loài sâm mọc tự nhiên phát tương đối sớm py rig ht @ nước ta Trong tự nhiên, SVD phân bố dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc nước ta [3,21,22] Gần sâm vũ diệp nghiên cứu bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Hiện vùng phân bố SVD bị thu hẹp dần đứng trước nguy tuyệt chủng Do SVD loài dược liệu quý cần Co bảo tồn gìn giữ để phát triển tương lai Sâm vũ diệp thường mọc rải rác hay tập trung tán rừng ẩm, gần quanh năm có sương mù Hàng năm vào cuối tháng đầu tháng 3, từ phần đầu mầm ,V NU [35] M Schwarz, B Klier, and H Sievers (2009), "Herbal reference standards", "Planta Med", 75(7), pp 689-703 [36] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997), dP rm ac y "Oleanolic acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", "Yao Xue Xue Bao", 32(9), pp 685-90 [37] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "[Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng]", "Yao Xue Xue Bao", 24(8), pp 593-599 [38] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total an saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type diabetic rats", "J Ethnopharmacol", 152(3), pp 553-560 ine [39] M Xi, C Hai, H Tang, A Wen, H Chen, R Liu, et al (2010), "Antioxidant and antiglycation properties of triterpenoid saponins from Aralia taibaiensis traditionally used for treating diabetes mellitus", "Redox Rep", 15(1), pp 20- dic 28 Me [40] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva of C Trang web [41] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top Co py rig ht @ Sc ho ol [42] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855 ,V NU PHỤ LỤC Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu dP rm ac y Phụ lục 02 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 03 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Phụ lục 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu ,V NU Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính an dP rm ac y Phụ lục 02 of Me dic ine Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 15,625 µg/ml Co py rig ht @ Sc ho ol Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 37,5 µg/ml dP rm ac y ,V NU Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 75 µg/ml of Me dic ine an Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 150 µg/ml Co py rig ht @ Sc ho ol Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 200 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 300 µg/ml ,V NU dP rm ac y Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 nồng độ 400 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn stipuleanosid R2 – Kiểm tra tính thích ,V NU Phụ lục 03 Co py rig ht @ Sc ho ol of Me dic ine an dP rm ac y hợp hệ thống ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU PHỤ LỤC 04 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU PHỤ LỤC 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp ht py rig Co @ ol Sc ho of ine dic Me an dP rm ac y ,V NU