21 8 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu Bạch truật chiết với Ethanol 96%.. Phương pháp sử dụng cao chiết bạch truật này dẫn đến sự tăng n
T Ổ NG QUAN
Gi ớ i thi ệ u chung v ề cây bạ ch tru ậ t
Bạch truật có tên khoa học là Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc (Compossitae) [1]
1.1.2 Mô tả thực vật, bộ phận dùng Đặc điểm : Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc dưới đất Thân thẳng, cao
Cây có chiều cao từ 0.3-0.8m, thường đơn độc hoặc phân nhánh ở phần trên, với phần dưới thân hóa gỗ Lá mọc cách, dài, lá dưới có cuống dài, trong khi lá trên có cuống ngắn và gốc lá rộng ôm lấy thân Phiến lá xẻ sâu thành 3 thùy, thùy giữa lớn, hình trứng tròn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, gốc không đối xứng Các lá gần ngọn thân có phiến nguyên, hình thuôn hoặc hình trứng mũi mác, mép có răng cưa Hoa có đầu lớn, phần dưới có lá bắc hình lá xẻ sâu, bao hình chuông với 7 hàng lá bắc mỏng Lá bắc dưới nhỏ hình tam giác, to dần lên phía trên Hoa nhiều, tràng hình ống với phần dưới màu trắng và phần trên màu đỏ tím, xẻ thành 5 thùy hình mũi mác Nhị hàn liền nhau, chỉ nhị hình sợi dẹp, bầu thon có lông nhung màu nâu nhạt, đoạn trên có lông hình lông chim, vòi hình chỉ màu tím nhạt với đầu nhị xẻ.
2 thùy nông hình đầu, mặt ngoài có lông ngắn Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2]
Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng ngà [2,10]
1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến
Bạch truật chủ yếu được trồng tại Trung Quốc, nhưng từ những năm 1970, cây này đã được di thực và hiện nay được trồng tại các tỉnh như Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội và Lâm Đồng.
Cây trồng bạch truật được thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11, thường là từ 8 đến 22/11 Để đảm bảo chất lượng, nên chọn ngày nắng ráo và đất khô khi thu hoạch Sau khi nhổ từng cây nhẹ nhàng, cần sử dụng dao để cắt bỏ thân cây và mang củ về chế biến.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Thổ Bạch truật là một loại thảo dược được chế biến từ bạch truật phiến Để chế biến, bạch truật phiến cần được sao với bột mịn phục long cán cho đến khi bề mặt có màu đất Sau đó, cần rây bỏ phần đất thừa Tỷ lệ sử dụng là 100 kg bạch truật phiến với 20 kg bột mịn phục long cán.
Để sao bạch truật, đầu tiên cần lấy cám mật chích cho vào nồi nóng Khi khói bốc lên, cho bạch truật phiến vào sao cho đến khi có màu vàng sém và tỏa ra mùi thơm cháy Sau đó, lấy ra và rây bỏ cám mật chích Tỷ lệ sử dụng là 100 kg bạch truật phiến với 40 kg cám mật chích, và có thể thay thế bằng cám gạo.
Cây bạch truật chứa 67 hoạt chất chính, được phân loại thành các nhóm như sesquiterpenoids, triterpenoids, polyacetylenes, coumarins, phenylpropanoids, flavonoids và flavonoid glycosides Bên cạnh đó, cây cũng có hai nhóm hoạt chất khác là steroid và benzoquinones, với tổng cộng 4 hoạt chất có tỉ lệ thấp hơn.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 1: Công thức hóa học một số chất chính trong cây Bạch truật.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Cải thiện chức năng đường tiêu hóa: Một nghiên cứu lâm sàng trên chuột cho thấy việc sử dụng cao bạch truật với liều lượng 0,035 g/kg và 0,105 g/kg đã giúp tăng trọng lượng chuột và nâng cao khả năng tiêu hóa của vi khuẩn đường ruột.
Nghiên cứu lâm sàng cho thấy việc sử dụng cao ethanol bạch truật với nồng độ từ 1 đến 4 mg/ml trong 24 giờ giúp giảm đáng kể số lượng tế bào ung thư ở những người mắc bệnh.
Bạch truật đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng điều hòa miễn dịch, đặc biệt khi sử dụng bột bạch truật đường uống với liều cao (1g/kg) cho heo con trong 30 ngày Kết quả cho thấy sự tăng sinh tế bào lympho ngoại biên, chỉ số tăng trọng, nồng độ immunoglobulin G (IgG) trong huyết thanh, nồng độ IL-1 và IL-2, cùng với biểu hiện mRNA PR-39 Những chỉ số này chỉ ra rằng bạch truật có khả năng cải thiện trao đổi chất và chức năng miễn dịch ở heo con.
Cao chiết bạch truật (100mg/kg) đã cho thấy tác dụng chống viêm rõ rệt trong các thử nghiệm trên chuột bị viêm đại tràng cấp tính do dextran sulfate gây ra, với việc giảm biểu hiện của các yếu tố viêm như COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α và NF-κB.
B Ngoài ra, những nghiên cứu sử dụng polyacetylenes (25 – 300 mg/kg) trên chuột có hiện tượng viêm gây ra bởi acetic acid hoặc dimethyl benzene thì trong 3 − 5 ngày đã được tìm thấy đểức chếđáng kể phản ứng viêm [26,7] Điều trị bệnh Alzheimer và bảo vệ hệ thần kinh: Trong một mô hình thử nghiệm có sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol (0,5 – 2 mg/kg) được xây dựng để tăng cường trí nhớ, giảm tần suất sai lệch và giảm cholinesterase (AChE) Tác dụng của cao chiết bạch truật với ethanol có thể cải thiện tình trạng suy giảm trên chuột già Ngoài ra, phương phỏp điều trị 3 ngày với atractylenolide III (30 àg/ml) được xây dựng để cải thiện hoạt động của tế bào và ức chế apoptosis Những tác dụng này cho thấy rằng atractylenolide III có hoạt tính bảo vệ thần kinh quan trọng [4,7]
Cao bạch truật đã được chứng minh là có tác dụng chống lão hóa và chống oxy hóa, thể hiện rõ qua các nghiên cứu trên mô hình chuột Những kết quả này cho thấy khả năng của cao bạch truật trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do oxy hóa, góp phần làm chậm quá trình lão hóa.
Trường Đại học Y Dược, VNU đã nghiên cứu tác dụng của D-galactose và cao chiết bạch truật, cho thấy rằng chúng làm tăng hoạt động NO synthase (NOs), sản xuất NO và giảm lipid peroxide (LPO) trong mô não Sau 6 tuần điều trị polysaccharides (100−200 mg/kg) cho chuột, nồng độ MDA, lipofuscin (Lipo) và hoạt động monoamin oxidase (MAO) giảm, trong khi glutathione peroxidase (GSH-Px), CAT, SOD và tổng hoạt động chống oxy hóa (T-AOC) tăng Nghiên cứu cũng chỉ ra cao methanol bạch truật (0,5−0,8 g/kg) cải thiện chu kỳ động dục và điều chỉnh hormone sinh dục, giảm testosterone và tăng cường biểu hiện aquaporin-9 (AQP-9) Thêm vào đó, cao bạch truật (100-300 mg/kg) cho chuột béo phì trong 16 tuần giúp giảm trọng lượng cơ thể, lipid gan, cholesterol và cải thiện nồng độ insulin, ngăn ngừa béo phì Cao bạch truật cũng tăng cường giải phóng glucose và biểu hiện PGC1α trong tế bào C2C12, đồng thời giảm axit béo tự do.
Bạch truật có khả năng kích thích chức năng ty thể và tăng cường chuyển hóa năng lượng trong các mô cơ khi được kết hợp với các tác động khác.
T ổ ng quan v ề v ị thu ố c B ạ ch thu ậ t
Tính vị quy kinh : Khổ, cam, ôn Vào kinh Tỳ và Vị [1]
Kiện tỳ, ích khí, táo thấp, lợi thủy, cố biểu, liễm hãn, an thai.
Chủ trị: Tiêu hóa kém, bụng trướng, tiêu chảy, phù thũng, tự hãn, động thai
Cách dùng: Ngày dùng từ 6–12g, dạng thuốc sắc hoặc bột Bạch truật sao cám, tẩm mật ong tăng tác dụng kiện tỳ, sao cháy có tác dụng chỉ huyết [1]
Kiêng kỵ: Đau bụng do âm hư nhiệt trướng, đại tiện táo, háo khát không dùng [1].
Vài nét về ho ạ t ch ấ t Atractylenolide III
Hình 2: Công thức cấu tạo của Atractylenolide III
Atractylenolide III có công thức phân tửlà C 15 H 20 O 3
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Danh pháp IUPAC: (4 S,8 R,9 S)-9 -hydroxy-3,8 -dimethyl-5-methylidene 4,4 ,6,7,8,9-hexahydrobenzo(1)benzofuran-2-one
- Atractylenolide III là dạng bột màu trắng hoặc tinh thểmàu trắng
- Atractylenolide III tan tốt trong nước, methanol, ethanol, và một số dung môi hữu cơ khác.
- Atractylenolide III cho phổ hấp thụ cực đại ở 220nm [27]
Atractylenolide III có nhiều tác dụng dược lý quan trọng, bao gồm bảo vệ thần kinh và dạ dày, chống ung thư, cũng như chống viêm Hoạt chất này còn giúp điều chỉnh chức năng miễn dịch thông qua việc tác động lên tế bào IL-6 trong tế bào mast.
Các nghiên cứ u định lượ ng Atractyl enolide III trong cây bạ ch tru ậ t
Nghiên cứu của nhóm tác giả Hao Cai và các đồng nghiệp vào năm 2012 đã định lượng hai hoạt chất Atractynolid I và Atractynolid III trong Bạch truật, sử dụng bước sóng cực đại 220nm Phương pháp phân tích được thực hiện trên máy Agilent Zorbax Eclipse XDB Cột C-18 với kích thước 250 mm x 4.6 mm và kích thước hạt 5 μm Tốc độ dòng là 1 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, và nhiệt độ cột được duy trì ở 25°C.
Hệ được sử dụng trong nghiên cứu này là ACN (A) và nước (B) với tỉ lệ 0-10 phút
30-60% A; 10-20 phút 60-65% A; 20-25 phút 65-100% A; 25-37 phút 100% A. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp xửlý mẫu với Ethanol 80%, chiết siêu âm trong
30 phút , sau đó lọc để thu được dịch chiết [7,13]
Theo dược điển Hong Kong, hoạt chất Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật được định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng, sử dụng bước sóng hấp thụ cực đại 220nm, cột silicagen liên kết ODS (5µm, 250 x 4,6mm), với tốc độ dòng 1ml/phút và dung môi Methanol : Nước = 70 : 30 trong 25 phút Mẫu được xử lý bằng phương pháp siêu âm với 2g bột dược liệu trong 50 ml dung môi Ethanol 70%, cho phép thực hiện chiết xuất nhiều lần với thời gian phù hợp với mục đích nghiên cứu.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tượng nghiên cứ u
Mẫu nghiên cứu là thân rễ khô của Bạch truật, có tên khoa học là Atractylodes macrophala Koidz, thuộc họ Compossitae Mẫu này được thu thập từ Hà Nội, Việt Nam và Liêu Ninh, Trung Quốc, do Viện Dược Liệu cung cấp.
Trang thi ế t b ị , dung môi, hóa chấ t
Hóa chất thuốc thửđược cung cấp bởi nhà sản xuất có uy tín với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng
Bảng 1: Hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu.
Nguyên vật liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn
Atractylenolide III Trung Quốc Độ tinh khiết 98%
Thiết bịmáy móc được sử dụng đảm bảo chính xác và độ tin cậy theo thông tin như nhà sản xuất
Bảng 2: Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Shimadzu LC – 20AD Nhật Bản
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
4 Shimadzu CTO – 10AS Nhật Bản
6 Máy siêu âm MRC Việt Nam
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Khảo sátđiều kiện sắc ký
Chúng tôi thực hiện sắc ký sử dụng cột Supleco C18 (5µm, 250 x 4,6mm) với tốc độ dòng 1ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20µl để khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại và hệ dung môi pha động.
- Khảo sát bước sóng: Tiến hành sắc ký với chất chuẩn Atractylenolide III bằng phương HPLC-DAD đểtìm ra bước sóng hấp thụ cực đại của chất
- Khảo sát hệ dung môi pha động: Phương pháp khảo sát với các hệ dung môi ACN:Nước và Methanol:Nước
- Dung dịch gốc: Cân chính xác khoảng 1mg chất chuẩn Atractylennolide III trong 1ml Methanol trong bình định mức 1ml
- Tiến hành pha dãy chuẩn trong bình định mức 1ml với các nồng độ 104; 52; 32,5; 26; 19,5; 13; 6,5; 3,25; 1,675; 0,65 và 0,065àg/ml từ dung dịch mẹ
Để xử lý mẫu, cân khoảng 0.2g bột dược liệu và chiết xuất với 5ml dung môi gồm Nước, Methanol, và Ethanol ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, 90% và 96% bằng phương pháp siêu âm Sau đó, định mức dung dịch về 5ml bằng dung môi tương ứng Cuối cùng, lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi thực hiện phân tích định lượng.
2.3.3 Thẩm định quy trình phân tích
According to the ICH document "Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology," issued in November 2005, several key factors are essential for the validation process.
Tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, quy trình phân tích định lượng cần được thẩm định qua các tiêu chí như độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Khả năng phát hiện chất phân tích trong sự hiện diện của các tạp chất như tiền chất, chất chuyển hóa và các chất tương tự là một khái niệm quan trọng Trong phân tích định lượng, điều này liên quan đến việc xác định chính xác chất phân tích trong mẫu, bất chấp sự ảnh hưởng của các yếu tố khác, nhằm đạt được kết quả chính xác nhất.
Phương pháp xác định tính đặc hiệu trong phân tích mẫu thường sử dụng kỹ thuật thêm chuẩn sau khi đã chuẩn bị mẫu Cụ thể, sau khi phân tích mẫu thử trên thiết bị sắc ký để thu được các pic sắc ký, ta tiến hành thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất Việc so sánh sắc ký đồ của hai mẫu sẽ giúp đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp phân tích.
Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử phải trùng với vịtrí của pic chất chuẩn và sắc ký đồ của chất nền không có pic nào
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) trong quy trình phân tích là lượng tối thiểu của chất phân tích có thể được phát hiện trong mẫu thử mà không cần xác định chính xác hàm lượng.
Giới hạn định lượng (LOQ) là lượng tối thiểu của chất phân tích trong mẫu thử có thể được xác định với độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu.
Phương pháp xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) là một kỹ thuật quan trọng Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị từ 2 đến 3, trong khi giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N gần bằng 10 Độ tuyến tính cũng là một yếu tố cần xem xét trong quá trình xác định này.
Tính tuyến tính của quy trình phân tích đề cập đến khả năng suy luận kết quả dựa trên mối quan hệ giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được, chẳng hạn như chiều cao hoặc diện tích pic (y), và nồng độ (x).
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương quan tuyến tính R 2
- Khảo sát ởít nhất 5 hoặc 6 mức nồng độkhác nhau
- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp
- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu
Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ R 2 ≤ 1 Độthích hợp hệ thống
Đánh giá độ thích hợp của hệ thống là quá trình xác định xem hệ thống có phù hợp cho việc phân tích hay không Điều này bao gồm các phép thử nhằm chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng đã định.
Phương pháp xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong hệ thống sắc ký được thực hiện bằng cách tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần Cần thực hiện ít nhất 5 lần bơm để đạt được RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD vượt quá 2%, cần sử dụng 6 điểm để đảm bảo độ chính xác trong kết quả.
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2% Độ lặp lại
Khái niệm: Độ lặp lại là sự ổn định trong phương pháp phân tích định lượng mẫu trong quá trình thực hiện
Trong phân tích hàng ngày, việc thực hiện ít nhất hai lần song song là cần thiết để giảm thiểu sai số ngẫu nhiên Đánh giá sự chênh lệch giữa hai lần thực hiện và giá trị trung bình là quan trọng, và sự chênh lệch này cần phải đáp ứng các yêu cầu cụ thể của từng phương pháp.
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2% Độđúng
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Độ đúng của phương pháp là mức độ gần gũi giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.
Phương pháp xác định bao gồm việc thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng Sau đó, tiến hành phân tích các mẫu đã thêm chất chuẩn, thực hiện lặp lại tối thiểu bốn lần bằng phương pháp khảo sát Cuối cùng, tính độ thu hồi theo công thức đã được quy định.
: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn
: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử : Nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn
: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn
Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại
Yêu cầu: Độ thu hồi đạt 98 - 102% và RSD ≤ 2%
2.3.4 Phương pháp xửlý và đánh giá kết quả
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê với chương trình
K Ế T QU Ả
Xây dựng phương pháp định lượ ng Atractylenolide III
3.1.1 Xác định bước sóngphát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III
Khảo sát được thực hiện với mẫu chuẩn Atractylenolide III ở nồng độ 6.5 µg/ml, sử dụng cột Supleco C18 với tốc độ dòng 1 ml/phút Chế độ chạy sắc ký gradient với dung môi ACN từ 20% đến 80% trong 60 phút đã cho kết quả như hình 3.
Hình 3: Sắc ký đồ HPLC và bước sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III trong đó: A – sắc ký đồ chất chuẩn ởbước sóng 1- 254nm và 2- bước sóng 220nm;
B –Bước sóng hấp thụ cực đại
3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD
Chuẩn bị một mẫu thử bằng phương pháp xử lý mẫu với dung môi Ethanol 96% Tiến hành sắc ký khảo sát pha động sử dụng cột pha đảo Supleco C18, với tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl, nhiệt độ phòng 25°C và chế độ chạy đẳng dòng Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Bảng 3: Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các chương trình chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm.
Hệdung môi Sắc ký đồ
0-30 43 tR= 23,356 t R (phút): Thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích Atractylenolide III
Dataf ile Name:Et-AMTQ.2.lcd
Dataf ile Name:EtOH-AM-ACN-20-80.lcd
Datafi l e Name:n-hexan-AM-ACN gradi ent 45-50.lcd
Dataf ile Name:Et-AM-43ACN.5.lcd
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hệ dung môi tối ưu cho sắc ký đồ là ACN và Nước với tỷ lệ 43:57, cho kết quả phân tách rõ ràng mà không có hiện tượng kéo đuôi Thời gian lưu đủ dài giúp rửa giải hiệu quả và đảm bảo các pic không chồng lên nhau.
3.1.3 Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu
Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung môi Nước, Ethanol 30%, 50%,
Theo kết quả từ phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, việc xử lý mẫu bằng dung môi Ethanol 96% cho hiệu quả tốt nhất so với các dung môi khác như Methanol và n-hexane.
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung dịch Ethanol 96% chiết bằng phương pháp siêu âm 3 lần trong 3 giờ Kết quảthu được dưới bảng 4
Bảng 4: Kết quả diện tích pic của các lần chiết mẫu bạch với Ethanol 96% khi phân tích bằng HPLC-DAD
Kết quả: Sau 2 lần chiết, hàm lượng dược chất trong dược liệu đã hết hoàn toàn. Lần chiết thứ 2, diện tich pic bằng 1/10 diện tích pic chiết lần 1
Nhận xét: Từ kết quảtrên, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết sau âm mẫu Bạch truật 1 lần trong 1 giờ
3.1.4 Điều kiện chạy sắc ký HPLC
Dựa vào các nghiên cứu trên, chúng tôi đã xác định được điều kiện chạy sắc ký như sau:
- Cột pha đảo Supleco C18 (5àm, 250 x 46mm)
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
- Pha động là đẳng dòng với hệ dung môi ACN và Nước (43:57) trong 30 phút
Các thông số của peak được trình bày trong bảng 5
Bảng 5: Các thông số HPLC đánh giá đối với Atractylenolide III
STT Thông sốđánh giá Giá trị
2 Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn có nồng độ 26àg/ml)
Th ẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Tính đặc hiệu của phương pháp
Phân tích 4 mẫu bao gồm dung dịch Atractylenolid III chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn và dung dịch mẫu trắng được thực hiện theo điều kiện phân tích HPLC đã nêu Kết quả thu được được đánh giá thông qua sắc ký đồ tương ứng, như thể hiện trong hình 4.
Hình 4: Sắc ký đồ HPLC đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trong đó: 1-
Mẫu trắng; 2- Mẫu thử; 3-Mẫu thửthêm chuẩn; 4- Mẫu chuẩn
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Kết quả và nhận xét: Trên sắc ký đồ thu được cho thấy, thời gian lưu của 3 mẫu
Atractylenolid III ở mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn là tương ứng với nhau và trên mẫu trắng không có Pic Atractylenolid III không bị trùng với các pic khác.Phương pháp đã được xây dựng phù hợp với chất Atractylenolide III cần phân tích.
3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Chúng tôi thực hiện chạy nền theo các điều kiện đã thiết lập trước đó Dựa vào diện tích pic của chất nền, chúng tôi tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn cho đến khi đạt được tỷ lệ S/N từ 2-3, và sẽ tiếp tục pha loãng thêm một lần nữa nếu cần thiết.
S/N không nằm trong khoảng giới hạn trên thì giá trịđó là giá trị giới hạn phát hiện LOD, từ đó suy ra giới hạn định lượng LOQ
Tại nồng độ 0,065 àg/ml, tỷ lệ S/N đạt 5, cho thấy hiệu suất tốt trong việc xác định nồng độ Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N=3, giá trị LOD được xác định là 0,039 àg/ml Kết quả thu được cho thấy khả năng phát hiện chính xác của phương pháp.
- Giới hạn phỏt hiện (LOD): 0,039 (àg/ml)
- Giới hạn định lượng (LOQ): 0,117 (àg/ml)
Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn Atractylenolide III có nồng độ từ
Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ Atractylenolide dao động từ 104 àg/ml đến 1,625 àg/ml, với các điều kiện đã được thiết lập Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của dung dịch Atractylenolide được trình bày trong bảng 6.
Hình 5: Sắc ký đồ HPLC của Atractylenolide III với nồng độ lần lượt là
0,065àg/ml và 0,65àg/ml.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Bảng 6: Kết quả độ tuyến tính của phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide
III với dãy nồng độ chuẩn
Nồng độ ( à g/ml) Diện tớch pic (mAU.s) Nồng độtớnh lại từđường chuẩn ( à g/ml)
Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu chuẩn Atractylenolide III
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Kết quả phân tích cho thấy hệ số tương quan R² đạt 0,9987, chứng tỏ đường chuẩn có độ tuyến tính cao, điều này đảm bảo tính chính xác cho phép phân tích định lượng Atractylenolide III.
3.2.4 Tính thích hợp của hệ thống
Hệ thống sắc ký tiêm được kiểm tra tính thích hợp qua 5 lần phân tích mẫu chuẩn Atractylenolide III với nồng độ 26 µg/ml Kết quả được đánh giá thông qua giá trị độ lệch tương đối RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 5 lần lặp lại Thông tin chi tiết được trình bày trong bảng 7.
Bảng 7: Kết quảđánh giá tính thích hợp hệ thống của phương pháp định lượng
Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26àg/ml
STT Diện tích pic ( mAU.s) Thời gian lưu ( phút )
Kết quả và nhận xét cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 2%, chứng minh tính thích hợp của phương pháp đã xây dựng.
3.2.5 Độ lặp lại Độ lặp lại được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên Độ lặp lại được đánh giá thông qua chỉ sô độ chệch tương đối (RSD) của hàm lượng dược chất trong dược liệu 2% Kết quảthu được trình bày trong bảng 8
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Bảng 8: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Atractylenolide
III với mẫu bạch truật chiết với Ethanol 96%
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5
Kết quả và nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao
3.2.6 Độđúng Độ đúng được đánh giá theo phương pháp đã trình bày ở trên Độ đúng được đánh giá qua độ thu đồ dược chất cần phân tích Atractylenolide III là 98-102% theo quy định của ICH và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 3 lần lặp lại mẫu đánh giá độ thu hồi 2% Kết quả được trình bày dưới bảng 9
Bảng 9: Kết quảđánh giá độ thu hồi của phương phápđịnh lượng trong mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III
Nồng độdược chất thu hồi Độ thu hồi RSD
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Kết quả và nhận xét: Độ thu hồi trung bình của phương pháp định lượng
Atractylenolide III trong dược liệu bạch truật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đạt trong khoảng 98-102%, chứng tỏ phương pháp đã xây dựng có độ đúng cao.
Ứ ng d ụng phương pháp xác định hàm lượng dượ c ch ấ t trong c ủ B ạ ch tru ậ t
Phân tích hàm lượng Atractylenolide III trên 3 mẫu dược liệu Việt Nam và Trung
Kết quả nghiên cứu về phương pháp xây dựng được trình bày trong bảng 10, trong đó so sánh sắc ký đồ của hai mẫu bạch truật từ Việt Nam và Trung Quốc như thể hiện trong hình 8.
Bảng 10: Kết quảxác định hàm lượng Atractylenolide III trong mẫu bạch truật Việt
Mẫu Tên Mẫu Hàm lượng Atractylenolide III(%)
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
Hình 7: Sắc ký đồphân tích Atractylenolide III trong mẫu Bạch truật bằng HPLC-
DAD trong đó A- Bạch truật Việt Nam, B- Bạch truật Trung Quốc
Hình 8: Phổ hấp thụ UV của thành phần khác trong mẫu bạch truật Việt Nam
Nhận xét: Dựa vào kết quả cho thấy trong bạch truật trồng tại Việt Nam và Trung
Hàm lượng Atractynolide III trong Quốc là 0,06% và 0,08%, tương ứng So sánh phổ đồ cho thấy bạch truật Việt Nam có một số pic khác, điều này chỉ ra rằng cần có thêm nghiên cứu về thành phần hóa học của bạch truật Việt Nam Sự khác biệt này giải thích lý do tại sao việc áp dụng điều kiện chạy dược điển Hồng Kông không thành công với mẫu dược liệu Việt Nam.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
BÀN LUẬ N
Nghiên cứu này trình bày phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây bạch truật, được xây dựng và thẩm định với điều kiện pha động HPLC-DAD là MeOH:H2O theo tỷ lệ 43:57 Độ chính xác của phương pháp đã được xác nhận theo hướng dẫn của ICH.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng Atractynolide III trong mẫu bạch truật trồng tại Việt Nam thấp hơn so với mẫu từ Trung Quốc Mặc dù số lượng mẫu thu thập còn hạn chế, cần thực hiện nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để xác định sự khác biệt một cách chắc chắn Tuy nhiên, giá trị thu được vẫn cao hơn nhiều lần so với tiêu chuẩn của dược điển Hồng Kông, chỉ yêu cầu 0,019% Điều này chứng tỏ rằng bạch truật tại Việt Nam đủ điều kiện để thâm nhập vào thị trường dược liệu Hồng Kông, mở ra cơ hội giao thương với Trung Quốc và các thị trường quốc tế khác.
Hai phổ đồ thu được cho thấy sự khác biệt rõ rệt về peak phụ, điều này chỉ ra rằng tiềm năng sinh học và thành phần hóa học của cây trồng tại Việt Nam vẫn chưa được khai thác triệt để Hơn nữa, điều này gây khó khăn trong việc áp dụng dược điển Hồng Kông để phân tích mẫu Bạch truật tại Việt Nam Phương pháp phân tích mới được xây dựng có thể áp dụng hiệu quả cho các dược liệu có nguồn gốc từ Trung Quốc.
Chúng tôi khuyến nghị tiếp tục nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của bạch truật tại Việt Nam Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tăng số lượng mẫu để xác định giới hạn hàm lượng Atractynolide III trong tiêu chuẩn cơ sở của bạch truật trồng tại Việt Nam.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Điều kiện phân tích HPLC của Atractynolide III trên mẫu bạch truật như sau:
- Cột sắc ký pha đảo: Supleco C-18(5àm, 250 x 4,6mm)
- Bước sóng cực đại: 220 nm
- Thời gian sắc ký: 30 phút
Bạch truật thu hái tại Việt Nam chứa hàm lượng Atractynolide III là 0,06%, thấp hơn so với 0,08% của Trung Quốc Ngoài ra, phổ đồ của Bạch truật Việt Nam cũng cho thấy sự khác biệt so với Trung Quốc về peak phụ.
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
[1] Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam Bạch truật IV, Nhà xuất bản Y học, pp
[2] Bộ Khoa học và công nghệ (2007), Thực vật chí Việt Nam họ Cúc tập 7, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, pp 523 – 524
[3] Trường Thụ Sinh (2012) , Trung Dươc Lâm Sàng, Nhà xuất bản Y học, pp 314 – 316
[4] Viện Dược Liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam Bạch truật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật liệu, pp 360 – 382
[5] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật, pp.10-59
[6] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and
Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the
Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4)
[7] Bo Zhu (2018), “The traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of
Atractylodes macrocephala Koidz”, Journal of ethnopharmacology
[8] Brian A Bidlingmeyer (1992), Practical HPLC Methodology and Applications, Wiley Series in Engineering and Technology Management, pp 67 – 103
[9] Danilo Corradini (2016), Handbook of HPLC second edition, Chromatographic science series, pp 207 – 232
[10] Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Pharmacopoeia of the peoples republic of China – English Edition(2015), Chemical Industry Press, pp 524 –
@ Sc hool of Me di ci ne a nd Pha rm ac y, VNU
[11] Elsevier Science (2017), “Application of Atractylodes Macrocephala Koidz Extract in Methicillin - Resistant Staphylococcus Aureus”, Procedia engineering, 174, pp 410 -415
[12] George Lunn, Norman R Schmuff (2000) - HPLC Methods for
Pharmaceutical Analysis, Wiley-Blackwell, pp 232 – 250
Hao Kai (2012) conducted a study on the chemical fingerprinting of both crude and processed Atractylodes macrocephala sourced from various locations in Zhejiang province Utilizing reversed-phase high-performance liquid chromatography in conjunction with hierarchical cluster analysis, the research aimed to identify and compare the chemical profiles of this medicinal plant The findings contribute valuable insights into the quality and consistency of Atractylodes macrocephala, highlighting its significance in pharmacognosy.
[14] Hildebert Wagner, Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal
Medicines: Thin-layer and High Performance Liquid Chromatography of Chinese Drugs, Springer Science & Business Media, pp 113 - 123
[15] Hson-Mou Chang(1986), Pharmacology and Applications of Chinese Materia
[16] Kokane Vikrant (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and
[17] Jiaju Zhou (2003), Traditional Chinese Medicines: Molecular Structures,
Natural Sources and Applications, Wiley, pp 235 - 242
[18] Joel K Swadesh (2000), HPLC: Practical and Industrial Applications, Second
[19] Lena Ohannesian (2001), Handbook of Pharmaceutical Analysis, CRC Press, pp 9 – 12
[20] Monika Waksmundzka-Ha nos, Joseph Sherma (2010), High Performance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis, CRC Express, pp 3 – 12
[21] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied