TỔNG QUAN
Công thức cấu tạo
Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu công nghiệp.
Công thức phân tử là C28H31ClN2O3
Tính chất vật lý
Rhodamin B là một loại thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tồn tại dưới dạng tinh thể màu tối có ánh xanh hoặc bột màu nâu đỏ Nhiệt độ nóng chảy của nó dao động từ 210°C đến 211°C Rhodamin B tan tốt trong methanol, ethanol và nước với độ hòa tan khoảng 50 g/l Cụ thể, trong 100 gam dung môi, Rhodamin B hòa tan 0,78 gam trong nước ở 26°C và 1,74 gam trong rượu etylic Dung dịch nước và rượu etylic của Rhodamin B có màu đỏ ánh xanh nhạt và phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ nét trong các dung dịch loãng Ngoài ra, dung dịch nước hấp thụ ánh sáng với bước sóng cực đại ở 526 nm và 517 nm.
Tính chất sinh học
Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính, gây ra các triệu chứng như dị ứng da, ho, khó thở và đau ngực khi tiếp xúc qua da hoặc hô hấp Qua đường tiêu hóa, nó có thể gây nôn mửa và tổn thương gan, thận Sự tích tụ của Rhodamine B trong cơ thể có thể dẫn đến nhiều tác hại nghiêm trọng cho gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh và nguy cơ ung thư Nghiên cứu trên chuột cho thấy Rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm tĩnh mạch, do nó chuyển hóa thành các amin thơm độc hại hơn Rhodamine B và các dẫn xuất của nó tác động mạnh mẽ đến quá trình sinh hóa của tế bào, đặc biệt là trong việc gây ung thư gan, vì gan là cơ quan đầu tiên lọc chất này Thêm vào đó, các thí nghiệm khác cũng chỉ ra rằng Rhodamine B có khả năng phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể trong nuôi cấy tế bào.
Ứng dụng
Rhodamine B là một thuốc nhuộm tracer phổ biến trong nước, giúp xác định tốc độ và hướng dòng chảy Nó được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học, bao gồm kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy và quang phổ huỳnh quang Hiện nay, Rhodamine B đang được thử nghiệm làm bio marker trong vacxin bệnh dại cho động vật hoang dã, như gấu trúc, nhằm xác định động vật đã được tiêm phòng Ngoài ra, nó còn được trộn vào thuốc diệt cỏ và sử dụng trong công nghiệp sợi để tạo màu và nhuộm màu trong phòng thí nghiệm nhờ tính bền màu của nó Rhodamine B cũng được ứng dụng trong sinh học như một thuốc nhuộm huỳnh quang, tận dụng đặc tính phát quang của nó.
Rhodamine B được sử dụng để kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt và cây lấy dầu Chất này có thể thấm vào ớt nếu dính dầu trong máy ép hoặc khi phơi ớt trên sàn được sơn, dẫn đến nguy cơ lây nhiễm Ủy ban Gia vị khuyến cáo không nên sử dụng túi cói nhuộm màu vì lo ngại chất nhuộm có thể thẩm lậu vào sản phẩm Tuy nhiên, con đường thâm nhập của hóa chất này vào sản phẩm cây trồng vẫn chưa được chú ý, đặc biệt ở các nước đang phát triển Ngoài ớt bột, Rhodamine B có nguy cơ xuất hiện trong hầu hết các sản phẩm lương thực và thực phẩm từ cây trồng có sử dụng phân bón hóa học.
Các phương pháp xác định Rhodamine B
1.2.1.1 Phương pháp sắc ký cổ điển (phương pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản mỏng- TLC)
Phương pháp này đơn giản, không cần thiết bị đặc biệt và hiệu quả trong việc đánh giá sơ bộ các chất phân tích Nó cho phép tiến hành nhiều mẫu song song, mang lại sự tiện lợi Khi kết hợp với máy đo quang, TLC có thể thực hiện phân tích định tính và định lượng Để xác định định tính, Rhodamine B chuẩn được hòa tan trong ethanol tuyệt đối với nồng độ khoảng 10μg/ml, sau đó sử dụng bản mỏng silicagel đã được hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút Pha động được sử dụng bao gồm hai hệ.
Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10), lấy lớp dưới; Hệ 2: EA- MeOH- H2O (100: 17: 13)
Để phát hiện vết, cần quan sát dưới ánh sáng thường hoặc sử dụng đèn tử ngoại với bước sóng 366nm Việc so sánh vị trí và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử với vết mẫu của Rhodamine B trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn sẽ giúp đánh giá kết quả.
Phương pháp sắc ký bản mỏng có nhược điểm về độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời gian xử lý mẫu lâu và yêu cầu sử dụng nhiều hóa chất độc hại, tốn kém Do đó, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) và sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang hiện đang được ưa chuộng Mặc dù các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện 10 ppb và giới hạn định lượng 35 ppb, nhưng chúng yêu cầu trang thiết bị hiện đại và thường cần chiết tách bằng các dung môi độc hại, cũng như làm sạch qua cột chiết pha rắn (SPE) trước khi đưa vào cột sắc ký.
1.2.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã trở thành công cụ quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong nhiều lĩnh vực như hóa dược, sinh hóa, hóa thực phẩm, nông hóa, hóa dầu, và phân tích môi trường, đặc biệt là trong việc xác định lượng vết Trên toàn cầu, HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định Rhodamine B trong thực phẩm, nhờ vào độ chính xác, nhạy và độ lặp lại cao Các detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện các chất sau khi rửa giải, với nhiều loại detector như detector khối phổ (MSD) được ưa chuộng cho phân tích dư lượng trong các mẫu phức tạp Detector UV-Vis cũng phổ biến, có khả năng xác định nhiều loại chất, trong khi detector huỳnh quang thường nhạy hơn và ít bị ảnh hưởng bởi các hợp chất trong mẫu nền Ngoài ra, còn có các loại detector khác như diode array (DAD) và detector điện hóa, thường được ứng dụng trong phân tích phẩm nhuộm.
1.2.3 Phương pháp UV- Vis xác định Rhodamine B
Vào năm 2006, Brian Stuart và M Walker đã phát triển một phương pháp xử lý mẫu nhanh chóng và đơn giản, giảm thiểu việc sử dụng dung môi độc hại Rhodamine B có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến rất nhạy, vì vậy thiết bị sắc ký lỏng với detector UV-Vis là phù hợp cho việc phân tích chất này Do đó, chúng tôi đã chọn phương pháp của Brian Stuart và M Walker cho nghiên cứu của mình Hiện nay, các phương pháp phân tích Rhodamine B trong gia vị vẫn đang được cải tiến để cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học Để xác định Rhodamine B, phương pháp UV-Vis được sử dụng bằng cách hòa tan mẫu trong dung môi thích hợp, sau đó lắc, rung siêu âm và chiết xuất dung dịch để đo bằng máy UV-Vis, từ đó xác định sự hiện diện của Rhodamine B trong mẫu.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích rhodamine B trong thực phẩm, bao gồm các mẫu như siro dâu, bánh xu xê, hạt dưa và nước ngọt hương dâu Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector hấp thụ phân tử UV-Vis đã được lựa chọn để thực hiện phân tích Quy trình phân tích được xây dựng nhằm xác định chính xác sự hiện diện của rhodamine B trong các sản phẩm thực phẩm này.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào việc tách và xác định rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp được thực hiện với cột tách pha ngược và sử dụng detector UV-Vis để đảm bảo độ chính xác trong việc xác định Rhodamine B.
Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng trong phân tích thực phẩm nhờ vào độ nhạy và độ chính xác cao Do đó, việc nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề liên quan là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm.
1 Tối ưu hóa các điều kiện tách và định lượng Rhodamine B bằng HPLC, cụ thể là:
Chọn bước sóng của detector
Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động
Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo
2 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu và xác định độ thu hồi
Chọn dung môi chiết Rhodamine B ra khỏi nền mẫu
3 Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác định hàm lượng rhodamine B trong một số loại thực phẩm để đánh giá mức độ an toàn của thực phẩm.
Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng phân tích trong nghiên cứu này là các mẫu thực phẩm với chất phân tích là phẩm màu Rhodamine B Do các mẫu thực phẩm thường có nhiều thành phần và nền phức tạp, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp HPLC (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) để khảo sát điều kiện tách và định lượng Rhodamine B một cách hiệu quả.
Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
1 Bình chứa dung môi pha động
4 Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5 Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt )
7 Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC
2.2.1 Phân tích định lượng bằng HPLC
Trong phân tích, thời gian lưu tRi của chất trên cột tách là đại lượng đặc trưng quan trọng Thời gian lưu này giúp định tính chất qua mẫu chuẩn và định lượng qua tín hiệu phân tích như chiều cao hoặc diện tích pic Để xác định tỷ số khối lượng của chất tan phân bố vào mỗi pha, chúng ta cần dựa vào hệ số lưu.
Trong đó, k'I là hệ số lưu, m(SP) và m(MP) lần lượt là khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh và pha động, còn tRi và tR0 là thời gian lưu của chất thứ i và thời gian chết của cột tách.
Việc xác định nồng độ chất phân tích có thể thực hiện qua hai phương pháp chính: đường chuẩn và thêm chuẩn Phương pháp đường chuẩn được ưa chuộng vì tính nhanh chóng và đơn giản, trong khi phương pháp thêm chuẩn thường được áp dụng cho mẫu phức tạp hoặc khi lượng chất cần xác định nhỏ Đối với các pic tách rời hoàn toàn, mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích cho kết quả tuyến tính lớn hơn Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic thường dễ dàng hơn so với đo diện tích Do đó, trong phân tích lượng nhỏ, chiều cao pic thường được sử dụng Trong trường hợp pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi, đo diện tích pic lại mang lại độ chính xác cao hơn Luận văn này thiết lập mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính và tiến hành xác định nồng độ chất bằng cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn.
Detector này là máy đo hấp thụ phân tử trong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (Vis), sử dụng cuvet đo dòng chảy (flowcell) thay vì cuvet thông thường Việc phát hiện các chất phân tích dựa trên tính chất hấp thụ quang của chúng trong dung dịch, cụ thể là pha động trong quá trình sắc ký, nơi chứa chất phân tích chảy liên tục qua buồng đo Các chất phân tích tan trong pha động có thể tạo ra phổ hấp thụ trực tiếp Tất cả các chất phân tích hay hợp chất có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóng trong vùng UV-Vis đều có thể được phát hiện và xác định bằng detector này, dựa theo định luật hấp thụ ánh sáng.
Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu
Các loại hoá chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích và HPLC.
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 50 ppm, cần cân chính xác lượng chất chuẩn Rhodamine B vào cốc 50 ml, sau đó hòa tan và chuyển vào bình định mức 50 ml Tiếp theo, định mức bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc đều và bảo quản dung dịch tránh ánh sáng ở nhiệt độ 40°C.
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn 2 ppm, lấy 2 ml dung dịch chuẩn gốc 50 ppm và cho vào bình định mức 50 ml Sau đó, định mức đến vạch bằng methanol và lắc kỹ Cuối cùng, bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 40°C, tránh ánh sáng.
Các dung dịch chuẩn nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc, sử dụng trong ngày Các loại hoá chất khác
Methanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Acetonitril loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Axit fomic loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Trietyl amin loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Ethanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk Axeton loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
2.3.2 Máy móc và thiết bị
Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent- Mỹ với dải phổ từ 190- 1100 nm, điều khiển bằng phần mềm Chemstation.
Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer- Đan Mạch với điện cực thủy tinh Red- Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản gồm: Bộ loại khí cho dung môi, Degasser- DGU- 14AM
Bộ trộn dung môi FCV- 10ALVP
Bơm dung môi bốn kênh LC- 10ATVP
Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO- 10ASVP
Van bơm mẫu 6 chiều VS- 7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích vòng mẫu (sample loop) 20 l
Detector UV-Vis SPD- 10AVVP
Hệ điều khiển SCL- 10AVP
Phần mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1
Cân phân tích độ chính xác 0,1mg, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy Dụng cụ
Các bình định mức: 5, 10, 20, 50 ml
Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, cột chiết pha rắn