Định lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh (eurycoma longifolia) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Thành phần hóa học trong rễ và lá cây bá bệnh

Bộ phận Dung môi chiết

Eurycolactones A-E,eurycomalides A-B, eurycomalactone, 6α - hydroxyeurycomalactone, 7α - Hydroxyeurycomalactone, eurycomanone, 13α(21)-epoxyeurycomanone,

12,15diacetyl-13α(21)-epoxyeurycomanone, 12-acetyl-13,21dihydroeurycomanone, 15-acetyl13α(21)-epoxyeurycomanone, 3,4εdihydroeurycomanone,

- Một số khác: Natri, Kali…

- Triterpenes: eurylene, hỗn hợp β-sitosterol và stigmasterol

The determination of eurycomanone content in Eurycoma longifolia, commonly known as Tongkat Ali, is essential for understanding its therapeutic properties High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) is an effective method used to accurately measure the concentration of eurycomanone in this medicinal plant This analysis plays a crucial role in ensuring the quality and efficacy of Eurycoma longifolia extracts for various health benefits.

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Lá Ethanol Quassinoids: lonilactone, 6-dehydro lonilactone,11- dehydroklaineanone…

Một số tác dụng dƣợc lý của bá bệnh đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh nhƣ sau:

 Cao chiết từ bá bệnh có tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét trên thí nghiệm nuôi cấy in vitro [1,2,11,21,28,32]

 Nghiên cứu trên in vitro và in vivo cho thấy dịch chiết rễ bá bệnh có khả năng chống ung thƣ dòng tế bào K-562 [16]

 Bá bệnh còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus [20,22,32]

Nghiên cứu cho thấy, việc áp dụng chế phẩm bao gồm bá bệnh, trâm bầu và xấu hổ trên bệnh nhân có chỉ định điều trị lợi mật đã giúp giảm đáng kể mức bilirubin trong máu.

 Một số quassinoid nhƣ eurycomanol, eurycomalactone có tác dụng làm giảm lipopolysaccharide gây ra sốt ở chuột sau 1 giờ và có khả năng mạnh hơn aspirin

 Nghiên cứu in vitro và in vivo đều chứng minh bá bệnh có tác dụng chống ung thư tiền liệt tuyến ở người [13]

 Dịch chiết nước từ rễ cây mật nhân có khả năng kháng oxi hoá nhưng hoạt lực tương đối yếu [9,12,22]

Trên cơ địa động vật, rễ bách bệnh cho thấy tác dụng làm tăng hàm lượng testosteron huyết và trọng lượng cơ quan sinh dục đực, đặc biệt rõ rệt ở liều cao trên động vật bình thường Nghiên cứu trên chuột bình thường và chuột bị giảm năng sinh dục cho thấy hàm lượng protein toàn phần trong huyết tương tăng, cùng với xu hướng tăng trọng lượng cơ nâng hậu môn, mặc dù không làm tăng thể trọng cơ thể Tác dụng tăng cường chức năng sinh dục cho nam giới là tác dụng chủ yếu và được nghiên cứu nhiều nhất, với hơn 200 công trình nghiên cứu về tác dụng này trong khoảng thời gian từ 1994 đến 2014.

 Ở Lào, bá bệnh đƣợc dùng để chữa bệnh cao huyết áp, dùng cho phụ nữ sau sinh [23]

 Shuid và cộng sự (2011) nghiên cứu trên mô hình chuột 12 tháng tuổi đã gây loãng xương Thực hiện đồng thời 2 nhóm Một nhóm cho uống

Năm 2006, Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu tác dụng dược lý của cây bá bệnh, do Dương Thị Ly Hương, Trịnh Thị Kim Anh và Nguyễn Thị Hải Hà thực hiện Nghiên cứu tập trung vào hoạt tính androgen trên chuột cống trắng thông qua dịch chiết nước từ rễ cây bá bệnh Kết quả cho thấy, khi sử dụng liều 10 mg/kg thể trọng, trọng lượng các cơ quan sinh dục, bao gồm tinh hoàn và túi tinh, đều tăng lên rõ rệt.

1.1.6 Tính vị và công năng

Theo kinh nghiệm dân gian Indonesia, nước sắc từ lá hoặc vỏ thân cây bá bệnh được coi là vị thuốc truyền thống hiệu quả nhất trong việc điều trị sốt rét, có tác dụng tương đương với viên nén cloroquin Việc sử dụng thuốc này không chỉ giúp chữa trị bệnh mà còn góp phần nâng cao sức khỏe, giảm triệu chứng như huyết áp cao và đau mỏi cơ bắp.

1.1.7 Một số bài thuốc dân gian từ cây bá bệnh [1]

Bài 1 : Chữa phong tê, liệt nửa người

Bá bệnh 4 g, rễ xấu hổ 8 g, dây đau xương 8 g, đậu chiều 8 g, trâu cổ 8 g, rễ đinh lăng 8 g, hồ tiêu trắng 5 g, quế chi 5 g, gừng sống 3 g

Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc với 400 ml nước còn 100 ml, uống 2 lần trong ngày

Bài 2 : Tư bổ âm huyết thang, chữa âm huyết suy kém, tê bại nửa người bên phái, nóng ran

Bách bệnh 6 g, đậu đen 12 g, hà thủ ô đỏ 12 g, dây gùi 8 g, huyết rồng 8 g, rau muống biển 8 g, rễ nhàu 8 g, rễ ô môi 8 g, rễ cỏ xước 8 g, tang chi 8 g, dây kí ninh 2 g Sắc nước uống

Bài 3 : Bá ứng tiêu hạ tán, chữa đau bụng, ăn không tiêu, đầy hơi chướng bụng

Bá bệnh 50 g, vỏ quýt 100 g, hoắc hương 100 g, củ bồ bồ 100 g, dây mơ 100 g, dây rơm 100 g, cam thảo nam 100 g, hậu phác 100 g, củ sả 50 g, củ gấu 50 g, tiêu lốt 50 g

Các vị tán nhỏ, ngày uống 12 gam (người lớn), trẻ em thùy theo tháng tuổi mà quy định liều

1.2 Tổng quan về nhóm quassinoid 1.2.1 Khái quát chung và quassinoid

Quassinoid là một triterpenoid thứ cấp, giàu oxy và có vị đắng, chủ yếu thuộc họ Thanh thất Simaroubaceae Ban đầu, chúng được biết đến với tên gọi Quassin Nghiên cứu cho thấy quassinoid chứa nhiều tiềm năng trong việc điều trị các bệnh, bao gồm tác dụng kháng khối u, kháng virus, kháng viêm, kháng amib, sốt rét, kháng vi trùng lao và hỗ trợ điều trị chán ăn.

Tính thích hợp hệ thống

 Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của eurycomanone

Thớ nghiệm Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ eurycomanone

Biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của eurycomanone y = 4.8425x + 7.4895

 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD

Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có giới hạn phát hiện với eurycomanone là 4,6875 àg/ml, tương ứng cú giới hạn định lượng là 15,46875 àg/ml

Kết quả độ lặp lại của phương pháp

Nồng độ eurycomanone chuẩn (àg/ml)

Nồng độ tính toán (àg/ml)

Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại chấp nhận được, với giá trị RSD (%) khi tiến hành phân tích 6 dung dịch chuẩn eurycomanone là 2,65% nhỏ hơn 5%

Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn

Thí nghiệm Mẫu đã cú (àg)

Tổng lƣợng tỡm lại (àg)

Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tốt:

- Độ đúng trung bình cao: 100,055%

- Độ lệch chuẩn tương đối là 3,26% (nhỏ hơn 5%)

- Tỷ lệ thu hồi mỗi lần đều nằm trong khoảng 96,00% đến 103,60%

3.1.3 Định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu rễ cây bá bệnh

Để chuẩn bị mẫu phân tích eurycomanone, cần hòa tan lượng chiết thu được bằng methanol (MeOH) Sau đó, tiến hành siêu âm và lọc qua màng lọc kích thước 0,2 micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC Điều kiện sắc ký được thực hiện theo mục 3.1.2.

- Xác định thời gian lưu, diện tích pic tương ứng với thời gian lưu của eurycomanone trên sắc ký đồ thu đƣợc

TN Khối lƣợng dƣợc liệu (mg)

Diện tích pic eurycomanone (mAU.s)

Khối lƣợng eurycomanone trong cao (àg)

Hàm lƣợng eurycomanone trong cao (%)

Hàm lƣợng eurycoman one trong dƣợc liệu khô (%)

Kết quả: Hàm lƣợng eurycomanone trong cao rễ bá bệnh và trong rễ cây bá bệnh lần lƣợt là 0,597% và 0,0761%

3.2 Thảo luận 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu

3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích eurycomanone bằng HPLC

+ Pha tĩnh: cột Agilent Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5àm) + Pha động: (acid formic 0,1%/nước) : B (ACN) với chương trình chạy nhƣ bảng 3.1 và 3.2

+ Detector D D: bước sóng 244 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

+ Thể tích tiêm mẫu: 10 μl + Nhiệt độ buồng cột: 20 ± 0,8 ◦ C + Dung môi pha mẫu: MeOH

- Đường chuẩn: y = 4,8428x + 7,4895, R 2 = 0,9997, khoảng nồng độ 18,75 –

- Giới hạn phỏt hiện: 4,6875 àg/ml

3.2.3 Định lƣợng eurycomanone trong dƣợc liệu bá bệnh

Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) là một dược liệu quý, đang được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ Việc đánh giá chất lượng và phân tích thành phần hoạt chất trong bá bệnh là rất quan trọng và cần thiết Đến nay, theo các tài liệu đã thu thập, chưa có công bố nào tại Việt Nam phân tích cụ thể định lượng hàm lượng eurycomanone trong cây bá bệnh.

Chúng tôi đã tiến hành định lượng một số mẫu bá bệnh và thu được kết quả như trong bảng 3.6 Eurycomanone, marker chính của cây bá bệnh, có hàm lượng trong cao là 0,597% (5,97 mg/g) và trong rễ là 0,0761% (761 µg/g) Kết quả này chứng tỏ rằng rễ bá bệnh chứa một lượng đáng kể eurycomanone, mở ra cơ hội cho các nghiên cứu về chiết xuất và phân lập eurycomanone nhằm phục vụ cho chăm sóc sức khỏe con người.

Theo tiêu chuẩn Malaysia, hàm lượng eurycomanone trong cao Eurycoma longifolia dao động từ 0,8% – 1,5% Kết quả phân tích của chúng tôi cho thấy hàm lượng eurycomanone chỉ đạt 0,597%, thấp hơn tiêu chuẩn này, từ đó mở ra cơ hội tối ưu hóa quy trình chiết xuất để gia tăng hàm lượng eurycomanone Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chiết xuất bằng ethanol có hàm lượng eurycomanone vượt ngưỡng cho phép nhưng ở dạng sáp dính, trong khi chiết xuất bằng nước cho năng suất cao hơn và ở dạng bột Chiết xuất nước không chỉ dễ thực hiện mà còn phù hợp hơn cho sản xuất thương mại, với dạng bột là lựa chọn tối ưu và tiện lợi Do đó, nghiên cứu chiết xuất eurycomanone bằng nước sẽ là hướng đi tiềm năng cho các nghiên cứu tiếp theo về dược liệu này.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Sau một quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã thu đƣợc một số kết quả đáp ứng mục tiêu của đề tài nghiên cứu đã đề ra nhƣ sau:

- Phương pháp có tính chọn lọc với eurycomanone, pic của eurycomanone tách riêng ra khỏi các pic khác

- Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ eurycomanone trong khoảng nồng độ khảo sát với R 2 = 0,9997

- Phương pháp có độ đúng cao

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH

Theo phân loại thực vật học thì bá bệnh thuộc:

Bá bệnh, scientifically known as Eurycoma longifolia Jack., belongs to the Simaroubaceae family and is commonly referred to by various names such as bách bệnh, mật nhơn, and Tongkat Ali in Malaysia This versatile plant is also recognized as Antong sar in Cambodia, Tho nan in Laos, and Pasak Bumi or Bedara Pahit in Indonesia.

Hình 1.1 Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.)

[http://thaoduocquy.org/cay-mat-nhan-ba-benh]

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Bá bệnh ra nhiều hoa quả, nhưng lượng cây con tái sinh từ hạt không nhiều do quả thường rụng vào mùa mưa lũ và bị cuốn trôi Tuy nhiên, khả năng tái sinh của bá bệnh vẫn cao, vì dễ dàng bắt gặp chồi của nó sau khi bị chặt phá Vì vậy, bá bệnh là cây quý, cần được bảo tồn và phát triển.

- Trong vỏ và gỗ bá bệnh, người ta đã chiết được một số hợp chất sau [1]:

 Các hợp chất quassinoid, có khoảng 150 loại:

 Từ rễ đã phân lập đƣợc 3 quassinoid:

 Các hợp chất triterpen: niloticin, dihydroniloticin, piscidinol A, melianon…

 Các alkaloid loại canthin-6-on đƣợc phân lập từ vỏ và gỗ:

9,10-dimethoxy-6-on, 10-hydroxy-9-methoxy-canthin-6-on, …

 Ngoài ra còn có alkaloid carbolin

- Trong rễ và lá cây bá bệnh đã xác định đƣợc một số hợp chất sau [37] ảng 1.1 Thành phần hóa học trong rễ và lá cây bá bệnh