THU HÁI Ở TÂY BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC Trang 2 ĐẶNG THỊ THUỲ CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.. Năm
Tổng quan
Tổng quan chung về sâm vũ diệp
1.1.1 Tên khoa học, tên đồng danh
Sâm vũ diệp, còn được gọi là vũ diệp tam thất, hoa diệp tam thất, trúc tiết nhân sâm, và nhiều tên khác như tam thất lá xẻ, sâm hai lần xẻ, phan xiết (Dao), hoàng liên thất, nữu tử thất, tam thất lá lông chim, và hương sơn tam thất (Trung Quốc), có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem.
Một số tên đồng danh của SVD:
Aralia bipinnatifida (Seem.) C B Clarke; Aralia quinquefolia (L.) Dec et
Plan.var.major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec.et Plan.var.elegantior Burk; Panax pseudoginseng Wall.var.bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax pseudoginseng
Wall var major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall spp Himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall.var.elegantior (Burk) Hoo et
Tseng; Panax Japonicus Mey.var.bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng [12]
Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), SVD thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
1.1.3 Đặc điểm thực vật, bộ phận dùng
Cây thân thảo sống nhiều năm với thân rễ dài, có nhiều đốt và vết sẹo do thân rụng hàng năm Thân khí sinh cao từ 20-30 cm, thường mọc đơn độc, thẳng đứng, rỗng giữa và có vạch dọc Cây thường lụi tàn vào mùa đông, nhưng sẽ mọc chồi mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 Lá cây là lá kép chân vịt, gồm 2-3 lá mọc vòng, với lá chét thường có 5-7 (thỉnh thoảng 3) chiếc, thuôn dài từ 2,5-14 cm và rộng từ 1,5-4 cm, có gốc tròn, đầu nhọn, xẻ thuỳ không đều, mép có răng cưa và có lông.
Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5-10 cm; cụm hoa có từ 20-
Hoa có cuống dài từ 1-1,5 cm, màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân với 5 cánh hoa và bầu 2-3 ô Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, đường kính từ 0,6-1,2 cm, có màu xám trắng và vỏ cứng với rốn hạt Bộ phận sử dụng làm dược liệu là thân rễ SVD.
1.1.4 Phân bố và sinh thái
Sâm vũ diệp (SVD) phân bố chủ yếu ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal và dãy núi Hoàng Liên Sơn, với điểm phân bố cuối cùng tại Sapa, Việt Nam Cây được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại núi Hàm Rồng, Sapa, ở độ cao 1600 m Hiện nay, vùng phân bố của SVD đang thu hẹp, và từ độ cao khoảng 1800 m trở lên, cây trở nên cực hiếm Gần đây, SVD đã được thuần hóa và thử nghiệm trồng tại một số địa phương như Hà Giang và Lào Cai Loài này đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam.
SVD là loài thân thảo ưa bóng và ẩm, thường mọc dưới tán rừng ẩm quanh năm có sương mù Vào cuối tháng 2 và đầu tháng 3, từ mầm rễ phân nhánh ngang, sẽ mọc lên một hoặc vài chồi thân, sinh trưởng nhanh và đạt chiều cao cực đại trong vòng một tháng Đến tháng 4, mỗi thân có thể cho ra một cụm hoa, với quả xanh xuất hiện từ cuối tháng 4 đến tháng 6 Quả chín vào tháng 7 và thường rụng xuống quanh gốc cây mẹ, nhưng do mưa lớn trong mùa này, hạt giống dễ bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên Sau khi quả chín, từ tháng 9-10, phần thân trên mặt đất tàn lụi, để lộ vết sẹo thân rễ, giúp xác định tuổi cây.
Năm 2016, một nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 loài cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trong số đó, Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) đã thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư.
Sâm vũ diệp có khả năng ức chế sự tập trung tiểu cầu in vitro với các phân đoạn khác nhau và mức liều đa dạng Cụ thể, phân đoạn tổng, n-butanol và ethylacetat cho thấy tác dụng ở các liều 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL và 5 mg/mL, trong khi phân đoạn ether có hiệu quả ở các liều 1, 2 và 5 mg/mL.
1.1.6 Tính vị và công dụng
Sâm vũ diệp có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng dƣỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ
Theo đông y, SVD có tác dụng bổ dưỡng, chữa thiếu máu, xanh xao, gầy yếu, đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh SVD cũng được sử dụng để cầm máu, tán ứ và tiêu sưng Khi dùng ngoài, rễ phơi khô, tán bột mịn có thể rắc lên vết thương để giúp lành nhanh Rễ SVD còn có thể ngâm rượu và chiết xuất dưới dạng tinh sâm, có tác dụng kích thích sinh dục Bên cạnh đó, người dân vùng trồng cũng sử dụng thân và lá để nấu cao, pha với nước hoặc rượu để uống, mang lại hiệu quả tương tự như rễ Tại Trung Quốc, SVD được sử dụng để chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam và tổn thương do ngã.
Rễ SVD chứa saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất nhƣ: chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1, và Rg2
In 1989, a Chinese research team identified 13 saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng, collected in the Qinling Mountains of Shaanxi, China This discovery included two novel saponins, bipinnatifidusoside F1 and F2, alongside 11 previously known saponins such as ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24S-pseudoginsenoside F11, panasenoside, and majoroside F1 The structures of the new saponins were determined to be dammar-25(26)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24 zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-D-glucopyranoside for bipinnatifidusoside F1 and dammar-22(23)-ene-3-beta, 12 beta, 20(S), 24-zeta-tetraol-(20-O-beta-D-glucopyranosyl)-3-O-beta-D-glucopyranosyl (1-2)-beta-D-glucopyranoside for bipinnatifidusoside F2.
Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự đã xác định rằng thân rễ của SVD chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin, cùng với acid béo và acid amin Bên cạnh đó, thông qua quá trình thủy phân saponin, các nhà nghiên cứu đã thu được sapogenin toàn phần, trong đó có acid oleanolic.
Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc đã phân lập thành công 10 saponin khung oleanan từ dịch chiết methanol của rễ cây SVD, trong đó có 3 hợp chất mới là bifinoside A-C (1-3) và 7 hợp chất đã được biết đến, bao gồm nacrissiflorine methyl este.
(4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl este (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl este (8), mormordin IIe (9) và stipuleanoside R2 methyl este (10) [25]
Hình 1 Cấu trúc hoá học của 10 saponin tách được từ rễ SVD
In 2017, Đỗ Văn Hào and colleagues successfully isolated three compounds from the ethyl acetate extract of the rhizome of SVD These compounds include β-sitosterol, oleanolic acid, and daucosterol.
Bảng 1 Các hợp chất saponin đã phân lập từ SVD
Đến nay, đã có 26 hợp chất saponin được phân lập từ SVD Qua nghiên cứu thành phần hóa học, chúng tôi nhận thấy saponin chiếm tỷ lệ lớn trong thân rễ SVD Vì vậy, chúng tôi quyết định tập trung nghiên cứu thành phần saponin, đặc biệt là ở phân đoạn n-butanol, nơi chứa nhiều saponin nhất.
Tổng quan các phương pháp sắc ký
Pha tĩnh trong sắc ký cột là những hạt có kích thước lớn (50-150 µm) được nạp trong cột thủy tinh Mẫu cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh, và được bảo vệ bởi một lớp thủy tinh để tránh xáo trộn Dung môi giải ly được đặt ở trên cao và chảy xuống dưới cột, được hứng vào các lọ nhỏ Mặc dù phương pháp này thường chậm và hiệu quả thấp hơn so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC), sắc ký cột vẫn có ưu điểm là pha tĩnh và dụng cụ dễ kiếm, có thể áp dụng cho lượng mẫu lớn Các bước thực hiện sắc ký cột bao gồm
Khi lựa chọn chất hấp phụ cho quá trình sắc ký, pha tĩnh thường sử dụng silicagel Các hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, trong khi các hợp chất phân cực được giải ly sau Đối với hai phân tử không phân cực, phân tử có trọng lượng phân tử lớn hơn sẽ có tính phân cực mạnh hơn, dẫn đến việc nó bị giữ lại lâu hơn trong cột Do đó, phân tử này di chuyển chậm hơn so với các phân tử nhỏ hơn, và đôi khi còn lưu lại trong cột lâu hơn cả các phân tử có tính phân cực.
Lựa chọn dung môi là bước quan trọng trong quá trình sắc ký Mẫu được hòa tan hoàn toàn trong dung môi với nồng độ 10 mg/ml, tạo thành dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng kích thước 2,5x10 cm và chấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A) lên mỗi tấm Mỗi tấm bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau và phát hiện bằng đèn UV hoặc thuốc thử Việc sử dụng đơn dung môi giúp xác định dung môi phù hợp Từ kết quả đó, tìm kiếm một hỗn hợp dung môi bao gồm một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực để tối ưu hóa quá trình sắc ký.
Để nạp chất hấp phụ dạng khô vào cột, trước tiên cần giữ cột thẳng đứng trên giá và cho dung môi kém phân cực vào khoảng 2/3 chiều cao cột Tiếp theo, cho chất hấp thụ vào cột một cách đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, kết hợp với việc gõ nhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp phụ đạt khoảng 2 cm, mở nhẹ khóa ở dưới để dung môi chảy ra và hứng vào bình trống bên dưới Dung môi này sẽ được rót lại lên đầu cột Cuối cùng, cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần cho đến khi chất hấp phụ trong cột đồng nhất.
Để nạp mẫu cho quá trình sắc ký, cần sử dụng mẫu ở dạng lỏng và trực tiếp nạp lên đầu cột sắc ký Đối với mẫu ở dạng rắn, cần hòa tan chúng trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi này sẽ được sử dụng để khởi đầu quá trình sắc ký.
Quá trình hứng và gom dịch rửa giải bao gồm việc rửa giải và thu thập dịch rửa bằng ống thuỷ tinh Các dịch rửa giải trong ống được gom lại dựa trên kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng.
1.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Dựa vào hệ số phân tách khác nhau giữa hai pha: pha động và pha tĩnh, chất cần phân tích sẽ được hấp phụ hoặc phân bố trên pha tĩnh Khi pha động chạy qua pha tĩnh, nó kéo theo chất cần phân tích Các thành phần sau khi được phân tách sẽ được lưu giữ riêng biệt trên pha tĩnh.
Có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường thông qua việc sử dụng thiết bị densitometer, đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến Tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, có thể áp dụng các phương pháp khác nhau để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.
Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích trong quá trình sắc ký Giá trị của Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động.
Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) và khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm) được đo trên cùng một đường đi của vết, với giá trị dao động giữa 0 và 1 Hệ số lưu giữ tương đối là một yếu tố quan trọng trong phân tích.
Đường đi của chất phân tích và chất chuẩn được đo bằng cm, và giá trị gần 1 cho thấy sự đồng nhất giữa chúng.
1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) a Nguyên tắc của HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích quan trọng, dựa trên sự phân tách các chất trong một pha tĩnh nằm trong cột, thông qua dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao Pha động thường là chất lỏng, trong khi pha tĩnh có thể là chất rắn dạng tiểu phân hoặc chất lỏng được phủ trên chất mang rắn, hoặc chất mang đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Quá trình sắc ký lỏng hoạt động dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và phân loại theo kích cỡ Tốc độ di chuyển của các chất trong quá trình này phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha, tức là ái lực tương đối của chúng với pha tĩnh và pha động Do đó, thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố này.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bằng detector Nếu ghi quá
Quá trình sắc ký hiệu quả sẽ tạo ra nhiều pic riêng biệt cho từng thành phần trong hỗn hợp trên sắc ký đồ Phương pháp HPLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích và tách biệt các hợp chất hóa học.
Định tính là quá trình xác định chất của mẫu thử dựa vào thời gian lưu và hình dạng pic so với mẫu chuẩn, hoặc bằng cách so sánh chồng phổ giữa pic thử và pic chuẩn.
Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc
1.3.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) a Nguyên tắc
Khi hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong từ trường, sự thay đổi của từ trường sẽ gây ra hiện tượng hấp thụ năng lượng từ sóng vô tuyến, tạo ra phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Các hạt nhân nguyên tử với khối lượng là số lẻ và số thứ tự nguyên tử là số lẻ có momen từ và phát tín hiệu NMR, trong khi các hạt nhân có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là số chẵn thì không có momen từ và không phát tín hiệu NMR Vị trí tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử xung quanh proton đó.
Độ chuyển dịch hoá học (δ) là sự khác biệt về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và proton của chất chuẩn.
(3) Trong đó: δ: độ chuyển dịch hoá học ν mau : tần số của mẫu phân tích ν TMS : tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane ν may : tần số làm việc của máy
- Hằng số tương tác spin
Khoảng cách giữa các vạch tín hiệu bội được đo bằng Hz, phản ánh hằng số tương tác spin (J) Giá trị của J phụ thuộc vào tương quan không gian và mật độ điện tử xung quanh hai proton tương tác.
Diện tích dưới tín hiệu trong phổ NMR tỷ lệ thuận với số lượng proton tương ứng Đường cong tích phân cho thấy số lượng tương đối của proton cho từng tín hiệu Ứng dụng của phổ NMR rất đa dạng trong việc phân tích cấu trúc hóa học và xác định thành phần của các hợp chất.
Bằng cách xác định độ chuyển dịch hóa học δ, hằng số tương tác J và diện tích dưới tín hiệu, người ta có thể phân tích và giải thích phổ, kết hợp với thông tin từ các loại phổ khác như IR và MS, từ đó xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ.
1.3.2 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) a Nguyên tắc
Sử dụng chùm điện tử có năng lượng trung bình từ 50-100 eV để bắn phá phân tử hữu cơ trong môi trường chân không cao (10 -3 - 10 -6 mmHg) sẽ dẫn đến ion hóa và phá vỡ các phân tử hữu cơ thành các mảnh nhỏ Các ion được hình thành trong buồng ion hóa sẽ được gia tốc và tách riêng thông qua bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được hiển thị dưới dạng các vạch (pic) có cường độ khác nhau, tạo thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.
Các đồng vị của một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân nhưng khác nhau về số neutron, dẫn đến khối lượng nguyên tử khác nhau Phương pháp khối phổ (MS) có thể được sử dụng để xác định thành phần các đồng vị trong mẫu nguyên tố.
Phân tích khối phổ cung cấp thông tin chính xác về khối lượng các ion phân tử như M+, (M+1)+, và (M+2)+, đây là những đặc trưng quan trọng của hợp chất hóa học Ngoài ra, việc xem xét các pic đồng vị và tỷ số cường độ của chúng, cùng với khối lượng của các mảnh ion, cho phép xác định công thức nguyên của chất phân tích.
Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có sẵn trong máy hoặc với phổ chất đối chiếu để xác định thành phần định tính của mẫu.
Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên mảnh ion, cần làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên kết hợp giữa phổ NMR và phổ IR để đạt được kết quả chính xác.
Định lượng khối phổ là quá trình phân tích sử dụng các kỹ thuật thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn, kết hợp với độ cường độ vạch phổ để xác định nồng độ chất cần đo.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là thân rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc thu hái ở Sa a, Lào Cai vào tháng 15-07-2016 và đƣợc giám định tên khoa học bởi
TS Phạm Thanh Huyền thuộc Khoa Tài nguyên Dược liệu tại Viện Dược liệu đã lưu mẫu dược liệu (DL-150716) tại Phòng Tiêu bản của Khoa.
Hình 2 Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào Cai 15/07/2016
Phương tiện nghiên cứu
Dung môi như ethanol (EtOH), methanol (MeOH), dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc) và n-butanol (BuOH) được sử dụng trong chiết xuất phân lập, tất cả đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và cần được cất lại trước khi sử dụng.
Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel (0,040 – 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 àm, YMC Co Ltd., Nhật Bản)
Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kiesel 60 F 254 và pha đảo TLC silica gel 60 RP-18 F254 S (Merk, Damstadt, Đức)
Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % trong ethanol hơ nóng để phát hiện vết chất
Dung môi chạy sắc ký HPLC (methanol, acetonitrile, acid acetic) của Merk, Đức, nước cất dùng cho phân tích
- Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter (Jasco, Nhật Bản): đo năng suất quay cực
- Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy
- Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ): đo phổ khối ion hoá phun mù điện tử (ESI-MS)
Máy JEOL ECX 400, sản xuất tại Nhật Bản, chuyên dùng để đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều Thiết bị này sử dụng dung môi CDCl3 và CD3OD, với tetramethylsilan (TMS) làm chất nội chuẩn.
- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu
- Phương pháp chiết mẫu: chiết hồi lưu đơn giản với dung môi ethanol 70
Phương pháp chiết phân đoạn sử dụng chiết lỏng lỏng, trong đó thân rễ sâm vũ diệp được chiết hồi lưu ba lần với ethanol 70% ở nhiệt độ 70ºC Sau khi lọc để loại bỏ bã dược liệu, dịch lọc được gộp lại và cô quay chân không dưới áp suất giảm ở 50ºC để thu được cao khô Cao khô này sau đó được phân tán trong nước và lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực khác nhau như ete, ethyl acetat và butanol, từ đó thu được các phân đoạn tương ứng.
2.3.2 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hoá học
Sử dụng các kỹ thuật sắc ký bao gồm:
- Sắc ký cột: cột nhồi silica gel pha thường và pha đảo
- Sắc ký lớp mỏng: để theo dõi quá trình phân lập, kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập
2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất phân lập được xác định thông qua các phương pháp phổ như phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Việc so sánh dữ liệu phổ thu được với các dữ liệu đã được công bố trong tài liệu là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác trong quá trình phân tích.
2.3.4 Phương pháp phân tích định tính các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phân tích định tính dấu vân tay của các thành phần trong mẫu hỗn hợp, như cao chiết dược liệu hay phân đoạn dịch chiết, dựa vào thông số thời gian lưu đặc trưng của từng chất trong điều kiện sắc ký xác định.
Kết quả thực nghiệm và bàn luận
Chiết xuất và tinh chế các hợp chất saponin từ thân rễ SVD
3.1.1 Chiết xuất và phân lập
Mẫu thân rễ sâm vũ diệp (500 g) với hàm ẩm 7,81% được rửa sạch, phơi khô và thái nhỏ trước khi ngâm chiết bằng dung môi ethanol 70% qua 3 lần (mỗi lần 1500 ml) sử dụng thiết bị chiết hồi lưu trong 3 giờ Các dịch chiết ethanol sau đó được lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 95,9 g cao chiết tổng ethanol Cao chiết được hòa tan trong 500 ml nước cất và chiết phân bố lần lượt bằng ether, ethyl acetate và n-BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 ml) Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được các phân đoạn tương ứng là Ê-te (5,82 g), EtOAc (2,70 g) và n-BuOH (21,7 g).
Hình 3 Sơ đồ chiết phân đoạn lỏng-lỏng
Tiến hành phân lập BuOH bằng phương pháp sắc ký trên cột silica gel (Φ 85 mm x 80 mm) với hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH (5:1 → 0:1, v/v), mỗi phân đoạn 600 ml, đã thu được 4 phân đoạn được ký hiệu là B1-B4.
Phân đoạn B2 (4,3 g) được phân lập bằng sắc ký cột pha thuận silica gel (Φ 45 mm x 350 mm) với dung môi CHCl3-MeOH-H2O (3:1:0,1), thu được 4 phân đoạn nhỏ (B2.1-B2.4) Tiếp theo, từ phân đoạn B2.2 (920 mg), sử dụng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 mm x 350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1), thu được hợp chất số 2 (bột màu trắng, 100 mg) Cuối cùng, từ phân đoạn B4 (5,1 g), tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 50 mm x 350 mm).
350 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:1, v/v, 1600 ml) thu đƣợc hợp chất số 1 (bột màu trắng ngà, 180 mg) Tóm tắt quá trình phân lập nhƣ hình 5
Hình 4 Sơ đồ phân lập sắc ký 2 hợp chất tinh khiết từ phân đoạn BuOH
3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết hai chất phân lập đƣợc bằng SKLM Chất số 1 và số 2 sau khi phân lập đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM
Silicagel RP-18 F254S trên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi methanol: nước=2:1; thu được sắc ký đồ bản mỏng như hình 6
Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, sắc ký đồ của chất số 1 và số 2 đều xuất hiện rõ ràng Điều này cho thấy sự tương tác hiệu quả của thuốc thử với cả hai hợp chất.
Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm)
CH 2 Cl 2 -MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL/PĐ)
SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × 350 mm) MeOH-H 2 O
Bột màu trắng, 100 mg Chất số 1
Bột màu trắng, với hàm lượng 180 mg, chứa các dẫn xuất triterpen có hệ số Rf lần lượt là 0,30 và 0,34 Kết quả này cho thấy hai hợp chất phân lập được là những chất tinh khiết.
Xác định cấu trúc của 2 saponin phân lập đƣợc
Chất số 1 (Stipuleanoside R2): chất bột màu trắng Góc quay cực: [α] D 25 =+7,5 (c=0,2; MeOH);
Phổ ESI-MS: m/z 1087 [M-H] - tương ứng với khối lượng phân tử là M1088
Phổ 1 H-NMR (MeOD; 500 MHz) và 13 C-NMR (MeOD; 125 MHz), DEPT: xem bảng 2
Bảng 2 Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMR, DEPT của hợp chất số 1
Vị trí C * δ C δ C a,b DEPT δ H a,c (độ bội, J= Hz) Aglycon
*c của chất stipuleanosid R 2 đo trong CD3OD [27]; a Đo trong MeOD, b 125 MHz, c500 MHz
Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng bột màu trắng với năng suất quay cực riêng [α] 25 D =+7,5 (c=0,2; MeOH) Khi phản ứng với H2SO4 10% ở nhiệt độ cao, hợp chất này xuất hiện màu hồng đậm và chuyển sang màu tím, đặc trưng cho các dẫn xuất triterpene Phân tích phổ 13C NMR và DEPT cho thấy có 7 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 6 nhóm CH, 6 nguyên tử C bậc 4 và 1 nhóm COOR Phổ 13C-NMR của hợp chất này mang đặc điểm của một saponin với phần aglycon là triterpene khung oleanan, tương tự như các saponin đã được công bố từ sâm vũ diệp Ngoài ra, phổ 1H-NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của các nhóm methyl bậc ba tại δ 0,81; 0,85; 0,93; 0,95; 0,96; 1,05; 1,17.
Phân tích phổ NMR cho thấy sự hiện diện của một nối đôi tại C-12/C-13 với tín hiệu tại δ 5,27 (1H, br s, H-12) Ngoài ra, phổ cũng ghi nhận các tín hiệu trong vùng δ 3,0-4,0, đặc trưng cho các nhóm oxymetin và oxymethylen của bốn phân tử đường, bao gồm một glucorunic acid (GluA), hai glucose (Glc) và một arabifuranose (Ara(f)) Các tín hiệu proton anomeric xuất hiện tại δ 4,01 (1H, d, J=1,0 Hz, H-1’), 4,92 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1”), 5,19 (1H, br s, H-1”’) và 5,40 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1”’’) cho thấy sự hiện diện của các đơn vị đường này Phổ 13C-NMR ghi nhận tổng cộng 53 tín hiệu carbon, trong đó 23 tín hiệu thuộc về bốn đơn vị đường (GluA, 2 Glc và Ara(f)), trong khi 30 tín hiệu còn lại thuộc phần aglycon oleanolic acid, bao gồm một oxymethin tại δ 91,03 (C-3), nối đôi tại δ 123,8 và 144,7 ppm, cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) Hơn nữa, phổ khối ESI-MS của mẫu cho thấy sự xuất hiện của pic ion.
1087 [M-H] - phù hợp với công thức phân tử C53H84O23 (M88) Từ những dữ liệu phổ trên kết hợp so sánh với số liệu phổ NMR trong tài liệu đã đƣợc công bố
Cấu trúc hoá học của stipuleanoside R2, một saponin chưa được công bố từ sâm vũ diệp, đã được xác định (Hình 6) Trước đó, dạng methyl ester của stipuleanoside R2 đã được công bố trong một nghiên cứu liên quan đến sâm vũ diệp.
Hình 6 Cấu trúc hóa học của chất số 1
Thể chất: bột màu trắng
Góc quay cực: = +16 (c 0,3, MeOH) Phổ ESI-MS: m/z 964 [M+Na] + , tươngứng với khối lượng phân tử là M= 940 Phổ 1 H-NMR (CD3OD; 400 MHz) và 13 C-NMR (CD3OD; 100 MHz): xem bảng 3
Bảng 3 Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất số 2
Vị trí C * δ C δ C a,b δ H a,c (độ bội, J= Hz)
*c của chất araloside A methyl ester đo trong CD3OD [27]; a Đo trong CD 3 OD, b100 MHz, c 400 MHz
Hợp chất 2 được thu nhận dưới dạng bột màu trắng từ phân đoạn BuOH, và tương tự như chất 1, phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất này thể hiện đặc trưng của một saponin với phần aglycon là acid oleanoic Các tín hiệu trong phổ cho thấy sự hiện diện của nối đôi ở C-12/C-13 với các giá trị δ lần lượt là 122,2 (C-12) và 143,2 (C-13).
13) và 5,22 (1H, br s, H-12)], một nhóm oxymethin tại δ 89,6 (C-3) và một nhóm carbonyl carboxylic tại δ 176,4 (C-28) mà tại đó các phân tử đường tạo liên kết trên cơ sở phân tích độ dịch chuyển hoá học [23; 25] Điểm khác nhau của chất 2 so với chất 1 là phần đường, các tín hiệu trên phổ NMR của chất 2 cho thấy sự có mặt của
3 đơn vị đường với một GluA, một Glc và một Ara(f) bởi 3 tín hiệu proton anomeric [δ 4,35 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1’), 5,03 (1H, br s, H-1’’), 5,38 (1H, d, J=8,0
Phân tử đường GluA có nhóm COOCH3 (δ 53,0) và phổ khối ESI-MS của hợp chất 2 cho thấy tín hiệu tại m/z 946, tương ứng với ion phân tử [M+Na]+ của C48H76O18 (M0) Qua các phân tích và so sánh với dữ liệu trong tài liệu tham khảo [21; 22], hợp chất 2 được xác định là araloside A methyl ester (Hình 7), một saponin chưa được công bố từ sâm vũ diệp.
Hình 7 Cấu trúc hoá học của chất số 2
3.3 Phân tích định tính và dấu vân tay hoá học của các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tham khảo các tài liệu [11] chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích định tính 2 saponin phân lập đƣợc nhƣ sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 x 100 mm; cỡ hạt 3,5 àm)
- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/min
- Thể tớch bơm mẫu: 20 àl
- Dung môi pha mẫu: Methanol
- Pha động: acid acetic 0,5 %/H2O (A) – acetonitrile (B) theo chương trình gradient trong 30 phút: (0-5 phút: 80 % A, 5-15 phút :80-60 % A, 25-30 phút: 80 % A)
Để pha mẫu chất sạch 1 và 2, sử dụng cân phân tích để cân chính xác khoảng 1,0 mg mỗi chất Sau đó, pha thành dung dịch gốc với nồng độ 1,0 mg/mL (1000 ppm) trong methanol Tiến hành siêu âm trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45 μm Cuối cùng, pha loãng dung dịch thành nồng độ 500 ppm để sử dụng cho sắc ký HPLC.
Để pha mẫu cao saponin tổng, cân chính xác khoảng 50,0 mg cao n-butanol sâm vũ diệp và hòa tan trong methanol với nồng độ 50,0 mg/ml Sau đó, siêu âm trong 10 phút và lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Hình 8 Sắc ký đồ HPLC của hai saponin phân lập được 1 (A), 2 (B) và cao butanol của SVD
Kết quả phân tích HPLC cho thấy chất 1 và chất 2 là hai hợp chất tự nhiên trong SVD, với thời gian lưu lần lượt là 15,565 phút và 16,577 phút trong dung dịch butanol Diện tích pic trên sắc ký đồ HPLC chỉ ra rằng hai hợp chất này là hai saponin chính trong thân rễ SVD thu hái tại Sa Pa, đặc biệt là stipuleanoside R2 Hai hợp chất này có thể được coi là chất đánh dấu hoá học của SVD.
Bàn luận
Về xử lý chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết
Phương pháp chiết hồi lưu đơn giản với nhiệt độ 70ºC sử dụng dung môi ethanol giúp thu được cắn toàn phần Ưu điểm của phương pháp này là tăng tốc độ chiết và đảm bảo hoạt chất trong dược liệu được chiết kiệt.
Dung môi chiết EtOH 70% là lựa chọn hiệu quả cho việc chiết xuất hầu hết các hoạt chất trong dược liệu nhờ vào tính chất giá cả phải chăng, dễ tìm, ít độc hại và khả năng chiết ở nhiệt độ cao Nghiên cứu này áp dụng hai phương pháp sắc ký cột: pha thường và pha đảo, là những kỹ thuật phổ biến trong việc phân lập các chất tại Việt Nam, sử dụng chất hấp phụ để tối ưu hóa quá trình chiết xuất.
Từ cao chiết toàn phần, các phân đoạn được chiết bằng phương pháp chiết lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat và n-butanol, thu được các phân đoạn với khối lượng lần lượt là 1,26% ether, 0,59% EtOAc và 4,71% BuOH so với nguyên liệu khô ban đầu Sau khi loại bỏ các tạp chất không cần thiết, phân đoạn BuOH được lựa chọn để tiến hành phân lập vì đây là phân đoạn giàu saponin nhất.
Xác định cấu trúc các hợp chất
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập thành công hai hợp chất chưa được công bố từ SVD tại Việt Nam, gồm stipuleanosid R2 và aralosid A methyl ester, dựa trên dữ liệu phổ khối (ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Mặc dù methyl ester của stipuleanosid R2 đã được ghi nhận trong nghiên cứu trước, aralosid A methyl ester cũng đã được tìm thấy ở các loài khác trong chi sâm Phân tích HPLC cho thấy hai hợp chất này là hai saponin chính trong thân rễ sâm vũ diệp thu hái tại Sa Pa, đặc biệt stipuleanosid R2 có thể được xem là chất đánh dấu hóa học của loại sâm này Việc phân lập hai saponin này góp phần quan trọng vào cơ sở dữ liệu hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa dược liệu sâm vũ diệp, đồng thời mở ra hướng nghiên cứu mới về hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của chúng.
Nghiên cứu cho thấy thành phần saponin của sâm vũ diệp thuộc nhóm oleanane, tương tự như saponin của tam thất hoang Các hoạt tính sinh học đã được công bố cho thấy stipuleanosid R2 và araloside A methyl ester có tác dụng gây độc tế bào và hạ đường huyết.
Xây dựng dấu vân tay sắc ký dƣợc liệu SVD bằng HPLC
Dựa trên các tài liệu tham khảo và điều kiện hiện có, chúng tôi đã chọn chương trình sắc ký phù hợp cho hai hợp chất saponin đã được phân lập.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity
- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (Φ 4,6 x 100 mm; cỡ hạt 3,5 àm)
- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203 nm
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/min
- Thể tớch bơm mẫu: 20 àl
- Pha động: acid acetic 0,5 %/H2O (A) – acetonitrile (B) theo chương trình gradient trong 30 phút: (0-5 phút: 80 % A, 5-15 phút :80-60 % A, 25-30 phút: 80 % A)
Dưới các điều kiện sắc ký đã nêu, các chất trong mẫu thử từ dịch chiết n-butanol của thân rễ SVD được tách ra một cách hiệu quả, với đỉnh sắc ký cân đối
Chương trình sắc ký mà chúng tôi phát triển cho phép phân tích định tính và định lượng hai hợp chất trong SVD Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định hàm lượng saponin trong SVD, từ đó góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu SVD.
Khi quan sát bằng mắt thường, việc phân biệt chính xác giữa loài sâm vũ diệp, tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng) và sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha) không phải lúc nào cũng dễ dàng.
Việc so sánh các thành phần hoá học giữa các loài sâm là cần thiết do hình thái của chúng rất giống nhau Nghiên cứu chỉ ra rằng hai saponin chính, stipuleanosid R2 và araloside A methyl ester, từ sâm vũ diệp có cấu trúc khung oleanan, khác với sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grush) có cấu trúc khung dammarane Dữ liệu “dấu vân tay HPLC” đóng vai trò quan trọng trong việc xác định nhanh mẫu sâm vũ diệp và phân biệt các loài tương tự, giúp tránh nhầm lẫn dược liệu Mặc dù chúng tôi chưa hoàn thành mục tiêu này do hạn chế về thời gian, chúng tôi sẽ tiếp tục cải thiện trong thời gian tới.
Do sự biến đổi của hàm lượng các thành phần trong dược liệu SVD theo tuổi, mùa, nơi trồng và phân bố, không phải lúc nào cũng đạt được sự trùng khớp 100% giữa các đỉnh Tuy nhiên, việc đánh giá sự phù hợp có thể dựa vào sự trùng khớp hầu hết các đỉnh, đặc biệt là các đỉnh chủ yếu.