Xây dựng quy trình phân tích Định tính, Định lượng drotaverin hydroclorid trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc,pda)

Hiện nay có nhiều phương pháp đê phân tích drotaverin hydroclorid trong sản phàm bao gồm phương pháp sử dụng sắc ký lòng hiệu năng cao HPLC, phương pháp đo quangphô uv -VIS, phương pháp

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC/PDA)

ĐÈ ÁN THẠC Sĩ KIẺM NGHIỆM THUỔC VÀ Độc CHÁT

THÀNH PHÓ HỎ CHÍ MINH - 2024

NGUYEN TAT THANH

LÃ HOÀNG DUY

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH

(HPLC/PDA)

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẨT

MÀ SỔ: 8720210

TS DS THÁI THỊ CẢM

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH - 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi Lã Hoàng Duy xin cam đoan nội dung đề án này được ghi nhận, thực hiệnmột cách tning thực Đe án này kliông có bất kỳ số liệu, văn bản, tài liệu đã đượcTnrờng Đại học Nguyền Tất Thànhhay Trường đại học khác chấp nhận đê cấp vănbằng đạihọc, sau đạihọc Đeán này không bao gom các giãipháp đã đượcthực hiện

và báo cáo tại bất kỳ cơ quan, đơn vị, địa phương nhằm giải quyết vấn đe tươngựr vớimục tiêu đềán đề ra

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tò lòng biết ơn sâu sắc đếnCô TS Thái Thị Câm là người

cô đã tận tìnli giúp đờ tôi trong suốt thời gian nghiên círu và hoànthành đề ánThạc

sĩnày

Tôi xin trân trọng cám ơn các Thầy, Cô Bộmôn Kiêmnghiệm thuốc - Độc chat học đã tận tình truyền đạt kiến thức, tạo mọi điều kiện giúp đờ tôi trong quá trìnhnghiên cứuvà hoànthành đềán

Tôi cũng xin chân thành cámơntậpthê phòng Kiêm nghiệm chất lượngcùa Công

tycôphần DượcPhâm TW25 đã tạo điềukiện cho tôi hoàn thành đề án này

Và cuối cùng tôixin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình, bạn bè,đong nghiệp, những người đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành đề án này

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẺT TẤT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH vui CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU TỎNG QUÁT VẺ ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN cứu 1

1.1 Tính cấp thiếu cùa đềán 1

1.2 Mục tiêu của đề án 2

1.3 Phạm vicủa đề án 2

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

1.3.2Địa điêm nghiên cứu 3

1.3.3 Thời gian thực hiện đề án 3

1.4 Cơ sờlýthuyết củađe án 3

1.4.1 Tông quan về drotaverin hydroclorid 3

1.4.1.1 Công thức cấu tạo cùa drotaverin hydroclorid 3

1.4.1.2 Tính chất lýhóa 3

1.4.1.3 Dược động học 3

1.4.1.4 Cơ chế tác dụng 4

1.4.1.5 Chiđịnh 4

1.4.1.6 Chống chi định và tác dụng phụ không mong muốn 5

1.4.1.7 Tương tác thuốc 5

1.4.2 Tông quanvề phươngpháp sắc ký lòng hiểu năng cao 5

1.4.2.1 Khái niệm về sắc ký lòng hiệu năngcao 5

1.4.2.2Nguyêntắc HPLC 6

1.4.2.3 Cơ sờlý thuyết cùa quá trình sắc ký 6

1.4.2.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC 6

1.4.2.5 Cơsờ lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 9

1.4.3 Tông quan về phương pháp thâmđịnli 10

1.4.3.1 Tính đặc hiệu 11

1.4.3.2 Tínhtuyến tính 11

1.4.3.3 Độ lặp lại 11

1.4.3.4Độ chínhxác trung gian 11

1.4.3.5 Khoảng xác định 12

1.4.3.6Giới hạn pháthiện (LOD) 12

1.4.3.7 Giới hạn định hrợng (LOQ) 12

1.4.4 Các chephàm hiện đang hru hànhtrên thị tnrờng 12

1.4.5 Các nghiên cứu xâydựng quy trình định tính,định lượng drotaverin hydroclorid ngoàinước 13

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊN cứu ĐẺ ÁN 15

2.1 Thiết bị dụng cụ, hóa chất và trangthiếtbị nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp thực hiện 15

2.2.1 Xây dựng phương pháp định tínhdrotaverin hydroclorid trongchế phâm 15 2.2.2 Xây dựng phươngpháp định lượng drotaverin hydroclorid trong chếphâm .16

2.2.2.1 Điềukiện sắc ký 16

2.2.2.2 Cách tiến hành định tính, định lượng 16

2.2.3 Thâm định phươngpháp định lượng drotaverinhydroclorid đã xâydựng 18 2.2.3.1 Tính tương thích hệ thống 18

2.2.3.2 Tính đặc hiệu 18

2.2.3.3 Tính tuyếntính 19

2.2.3.4 Độ chínhxác 20

2.2.3.5 Độ đúng 21

2.2.3.6 Klioàngxác định 22

2.2.3.7 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 22

2.2.4 Áp dụng phương pháp đê định tính, định lượng một chephẩmtrên thị tnrờng chứa hoạt chat Drotaverin hydroclorid 22

CHƯƠNG 3 KỂT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Xây dựng quy trình định tính, địnli lượng drotaverin hydroclorid 23

3.1.1 Khảo sát bước sóng phát hiện 23

3.1.2Khảo sát độ tinh khiết cùa chất chuẩndrotaverin hydroclorid 24

3.1.3 Khảosát pha động 24

3.1.4 Khảosát pH của hệđệm 27

3.1.5 Khảosát nhiệtđộ cột 28

3.1.6 Khảo sát tốc độ dòng 29

3.1.7 Khảosát thểtíchtiêm 30

3.1.8 Khảosát cộtsắc ký 31

3.1.9 Xây dựng quy trìnhphân tích 33

3.2 Thâm định phương pháp phân tích 33

3.2.1 Tính tương thích hệ thống 33

3.2.2 Tính đặchiệu 34

3.2.3 Tính tuyến tính 37

3.2.4 Độ chính xác 39

3.2.5 Độ đúng 43

3.2.6 Khoảngxác định 44

3.2.7 Giới hạn phát hiện (LOD), giớihạn địnlilượng (LOQ) 44

3.3 Áp dụng phương pháp đeđịnh tính, định lượng một chế phâm trên thịtrường chứa hoạt chat drotaverin hydroclorid 45

3.4Bàn luận 49

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHÁO 1

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CHỬ VIET TẤT

HPLC High PerformanceLiquidChromatography Sac ký lỏng hiệu năng cao

RSD RelativeStandard Devitation Độ lệch chuân tương đốiICH International Conference On Harmonization Hộinghị hòa hợp quốc tế

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Mầuplacebo tự tạo(thànhphần côngthức cho 1 viên) 2

Bảng 2.2 Thống kê thiết bị, dụng cụ, hóa chất được sử dụng 15

Bảng 2.3 Chuân bịcác dung dịchtuyến tính 20

Bảng 3.4 Ket quả khảo sátchu trình pha động 25

Bảng 3.5 kết quả khảo sát pH của dung dịchđệm 27

Bảng 3.6 Ket quả khảo sát nliiệt độ cột 28

Bảng 3.7 Ket quả kliao sáttốc độ dòng 29

Bảng 3.8 Khảo sát ờ các thê tích tiêm khác nhau 30

Bảng 3.9 Ket quả khảo sát cột sắc ký của mẫu drotaverin hydroclorid 32

Bảng 3.10 Ket quả tính tương thích hệthống 34

Bảng 3.11 Ket quả sắc ký đồ tính đặc hiệu 36

Bảng 3.12 Ket quả sắc ký đồ tính tuyến tinh 37

Bảng 3.13 Ket quả phân tíchhoi quy tuyến tính 38

Bảng 3.14 Ket quả độ chính xác mẫu thử cùakiêm nghiệm viên 1 39

Bảng 3.15 Ket quả sắc ký đồcủa dung dichmẫu chuâncủa kiêmnghiệm viên2 40

Bảng 3.16 Ket quả sắc ký đồcủa dung dich mâu thử của kiêm nghiệm viên 2 41

Bảng 3.17 So sáng kết quả giữ 2 kiêm nghiệm viên 42

Bảng 3.18 Kết quả sắc ký đồđộ đúng 80%,100%,120% 43

Bảng 3.19 Kết quả sắc ký đồ LOD và LOQ 45

Bảng 3.20 Ket quả độ hấp thu dung dịch chuẩn 46

Bảng 3.21 Ket quảđộ hấp thụ dung dịch thử No-spa 47

Bảng 3.22 Ket quả độ hấp thụ dung dịch thử Drotaverin STADA 40mg 48

Bảng 3.23 Ket quả độ hấp thụ dung dịch thử ExpasFrorte 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trác hóa học drotaverin hydroclorid 3

Hình 3.2 Phô quét PDA của mẫuchuân drotaverin hydroclorid 23

Hình 3.3 Phô quét PDA cùa mẫuthữdrotaverin hydroclorid 23

Hình 3.4 Sacký đồ của chấtchuân drotaverin hydroclorid 24

Hình 3.5 Phô sắc ký 3d của chất chuândrotaverinhydroclorid 24

Hình 3.6 Sắc kỷ đồ độ tinlikhiết của chat chuân drotaverin hydroclorid 24

Hình 3.7 Sắc ký đồ MeOH : ACN : Na2HPO4 (70 : 0 : 30) 25

Hình 3.8 Sắc ký đồ MeOH : ACN :Na2HPO4 (60: 10: 30) 25

Hình 3.9 Sắcký đồ MeOH : ACN : Na2HPO4 (50 : 10 : 30) 25

Hình 3.10 Sắcký đồ MeOH : ACN : Na2HPO4(45 : 30: 25) 25

Hình 3.11 Sắc ký đồ MeOH : ACN : Na2HPO4 (40: 35 : 25) 26

Hình 3.12 Sắc ký đồ MeOH : ACN : Na2HPO4 (35:40 : 25) 26

Hình 3.13 Sắc ký đồ MeOH: ACN : Na2HPO4 ( 25: 50 :25) 26

Hình 3.14 Sắc ký đồ MeOH: ACN : Na2HPO4 (10 :60: 30) 26

Hình 3.15 Sắc ký đồ MeOH: ACN :Na2HPO4 ( 0 : 70 : 30) 26

Hình 3.16 Sắcký đồ pH 2,5 27

Hình 3.17 Sắcký đồ pH 4,5 27

Hình 3.18 Sắc ký đồ pH 6,5 28

Hình 3.19 Sắc ký đồ pH 7,5 28

Hình 3.20 sắc ký đồ nhiệt độ cột 30 °C 28

Hình 3.21 Sắc ký đồ nhiệt độcột 40°C 28

Hình 3.22 sắc ký đồ nhiệt độcột 60 °C 29

Hình 3.23 sắc ký đồ tốc độ dòng ờ 1,0ml/phút 30

Hình 3.24 sắc ký đồ tốc độ dòng ờ 1,5 ml/phút 30

Hình 3.25 sắc ký đồ tốc độ dòng ở 2,0 ml/ phút 30

Hình 3.26 sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm 20 gi 31

Hình 3.27 sắc ký đồ khao sát thề tích tiêm 50 Lil 31

Hình 3.28 sắc ký đồ khảo sát thê tíchtiêm 80 pl 31

Hình 3.29 sắc ký đồcột C8 Inertsil (250 mmX4,6 mm, 5 pm) 32

Hình 3.30 sắc ký đồ Cột C18 Inertsil(150 mm X 4,6 mm, 5 pm) 32

Hình 3.31 Sắc ký đồ cột C18 Inertsil(250 mm X 4,6mm, 5 pm) 32

Hình 3.32 sắc ký đồ tínhtương thích hệthống 34

Hình 3.33 sắc ký đồ mẫu trang 35

Hình 3.34 sắc ký đồ mẫu Placebo 35

Hình 3.35 Sac ký đồ mẫu chuẩn 35

Hình 3.36 sắc ký đồ mẫu thử 35

Hình 3.37 sắc ký đồ dung dịchthử thêmchuẩn 36

Hình 3.38 Đồ thị biêu diễn tương quan giữa nồng độ và diệntíchpic drotaverin hydroclorid 38

Hình 3.39 Ket quả sắc ký đồ tính tuyến tính 38

Hình 3.40 Ket quả sắc ký đồ độ chính xác 40

Hình 3.41 Ket quà sắc ký đồ mầu chuẩn độchính xác của kiêm nghiệm viên2 41

Hình 3.42 Ketquà sắc ký đồ mẫu thừ độchínhxác của kiêm nghiệmviên 2 42

Hình 3.43 Kết quả sắc ký đồ độ đúng 80% 44

Hình 3.44 Kết quà sắc ký đồ độ đúng 100% 44

Hình 3.45 Kết quả sắc ký đồ độđúng 120% 44

Hình 3.46 Giới hạn phát hiện LOD 45

Hình 3.47 Giới hạn định hrợng (LOQ) 45

Hình 3.48 Ket quà phô sắc ký cùa 6 lan của dung dịch chuân 46

Hình 3.49 sắc ký đồ độ hấp thụ dung dịch mẫu thừ No-spa 47

Hình 3.50 sắc ký đồ độ hấp thụ dung dịchmẫu thừ Drotaverin STADA 40mg 48

Hình 3.51 Sắc ký đồ độ hap thụ dung dịchmẫu thừ ExpasFrorte 49

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU TÔNG QUÁT VỀ ĐỎI TƯỢNG NGHIÊN

CỨU

1.1 Tính cấp thiếu của đề án

Trong cơ thê của con ngirời, cơ trơn có một vai trò vô cùng quan trọng có các nội tạng như ruộtphe quàn, niệu đạo, bàng quang, tử cung, mạch máu, cơ mí mắt,

cơ mắt và cơ lông Cácchức năng củatiêu hóa,đàothảichất thải, giúplưu thông máu

và nước đều được điều klũên bờisự hoạt động của cơ trơn [5] Tuy nhiên, khi cơ trơn hoạt động khôngbìnhthường hoặckhi bịkích thíchdễ ảnli hường bời sự căng thăng,

lo langhoặc các yếu tố sức khỏe khác [6] Cơ trơn có thê co bóp mạnh và gâyra các triệu chứng nlnr đau bụng, đau bàng quang và đau kill đi tiêu [5] Đê giảm bớt các triệu chứng do các cơn co that gây ra người ta sừ dụng thuốc chống co that đê giúp giãn các cơ trơn và giảm tần suất các cơn co that [7]

Đê điều trị cơn đau that ta thường sừ dụng thuốc có hoạt chất giãn cơ làdrotaverin hydroclorid Hoạt chấtnày có công thức cấu tạo tương tự nhưpapaverineđược sừ dụng đê điều trị các cơn co thắt [8] Theo thống kê số lượng thuốc được sànxuất và được nhập khẩu ờ Việt Nammỗi năm lượngsử dụng thuốc ước lượngkhoảng

1 tỷviên/1 năm Hiện nay có nhiều phương pháp đê phân tích drotaverin hydroclorid trong sản phàm bao gồm phương pháp sử dụng sắc ký lòng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp đo quangphô uv -VIS, phương pháp chuẩn độ điện the và phươngpháp sắc ký khí LC-MS [9] Trong đó, phươngpháp sắc ký lòng hiệu năng cao đemlại độ chínhxác rất cao,dễ thựchiện vàthông dụng hơn các phương pháp còn lại.Trên thế giới đã có những công trình khoa học sử dụng cácphương pháp khácnhau đê định lượng drotaverine hydrochloride, và các phương pháp này đãđược công

bốvàáp dụng vào sàn xuất thuốc, nhưng ờ Việt Nam vân chưa tìm thấy bài báo chungnào liên quan đến xây dựng phương pháp định tính và định lượng drotaverinhydroclorid Do đó, chúng tôi đã dựa vào HPLC/PDA đê phát triên một quy trình phân tích phù hợp, hiệu quả hơn đê xác định (địnli tính, định lượng) drotaverinhydroclorid có trong che phẩm một cách chính xác nhất Đây cũng là lý do nhóm

chúng tôi chọn đề tài:

Xây dựng quy trình phân tích địnhtính,địnhhrợng drotaverin hydroclorid trong chế phàm bằng phương pháp sắc ký lóng hiệu năng cao (HPLC/PDA) đê tiến hànhnghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu.

Chấtchuẩn: drotaverin hydroclorid chuẩn số lô QT1840424 có hàm lượng 96,5

% tính theo nguyêntrạng được mua từ Viện KiêmNghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh

Mầu thử: Che phẩm chứa hoạt chat drotaverin hydroclorid

1.3.2 Địa điếm nghiên cứu.

Đe tài được thực hiện tại Công ty cô phần dược phâm TW25

1.3.3 Thòi gian thực hiện đề án.

Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2024 đến tháng 8/2024

1.4 Cơ sở lý thuyết của đề án.

1.4.1 Tông quan vê drotaverin hydroclorid

1.4.1.1 Công thức can tạo cùa drotaverin hydrocỉorid.

Tên UIPAC: (1 z )-l-[(3,4-diethoxyphenyl)methylidene]-6,7-diethoxy-3,4- diliydro-2 H -isoquinoline hydrochlorid [4]

Công thức phân từ : C24H31NO4 • HC1 [4].

Khối lượng phân từ: 433.97 g/mol [4]

1.4.1.2 Tính chất lý hóa.

Drotaverin hydroclorid có bột tinh thê màu vàng nliạt hoặc hơi xanh lục, không

có mùi Chất này cóđộ tan thấp trongnước và con Ethanol 96% Ngoàira, drotaverinhydrocloridcũng hòa tan dê dàng trong cloroform và íttantrong aceton [10]

1.4.1.3 Được động học.

Drotaverin hydroclorid được hấp thu nlianli sau kill uống, đạt nồng độ huyết

tương tốiđa sau 1-3 giờ sau khi uống [11].

Drotaverin hydroclorid có thê qua cả hàng rào nhauthai Với kliã năng phânbố lớn khoảng 200 lít và sự gắn kết cao với protein như albumin, gamma globulin và beta globulin từ 95% đến 98% [11]

Khi sử dụng thuốc Tmax trong khoảng 45 đến 65 phút, với klioàng 65% liều không thayđôi được duy tri trong tuần hoàn saulan chuyênhóa đầu tiên Drotaverin hydroclorid trải qua quá trình chuyên hóa tại gan, với thời gian bán hủy dao động hr

16 đến 22 giờ [12, 13, 11]

Sau 72 giờ, drotaverin gần như đượcthài trừ hoàn toàn, hơn 50% liều thuốc quathận(chủ yếu là các chất chuyên hóa)và klioang 30% qua đườngdạ dày - ruột (theođường bài tiết mật) Drotaverin chù yếu được bài tiết dưới dạng chất chuyên hóavàkhôngthê phát hiện trong nướctiêu [11],

1.4.1.4 Cơ che tác dụng.

Drotaverin hydrocloridức chế enzym phosphodiesterase dần đến tăng mức sảnsinh cAMP (cyclic adenosine monophosphate: adenosm monophosphat vòng) làm giãn tế bào cơ Drotaverin hydroclorid cũng ức chế sự hấp thu calci ban đầu của tếbào Đặc trưng của drotaverin hydroclorid là tác động kliời đầu nhanh chóng trongđiều trị hiệu quả các trường hợp co rút cơ cấp tính gây đau đớn Hệ thần kinh thựcvậtkhông bị drotaverin hydroclorid gây ảnh hường do thuốc chủ yếu tác động trên

cơ trơn [12, 14]

ỉ 4.1.5 Chỉ định.

Drotavermhydroclorid là một loại thuốcức che co thatcó tác động ảnhhườnglên các tế bào của cơ trơn thông qua việc hấp phụ trên bề mặt cùa chúng Thuốcthường được dùng trong đường tiêu hóa giúp điều trị các triệu chứng như đau bụng hay đau quặnbụng do co thăt cơ trơn [14]

Các vấn đề về co thắt trong đirờng tiêu hóa như viêm dạ dày, loét dạ dày, tátràng, co thắt viêm ruột non vàviêm đại tràng, co that đại tràng kèm theo táo bón và

hội chứng đại tràng kích thích đều có thê được cài thiện khi sừ dụng drotaverin hydroclorid Điều này giúp giảm triệu chứng không thoải mái và cải thiện chất lượngcuộc sống cùa người bệnh [15, 16].

1.4.1.6 Chống chỉ định và tác dụng phụ không mong ninon.

Hiện nay vần chưa có chứng minh rằng việc sử dụng drotaverinhydroclorid có thê gây racác tác độngtiêu cực đối với thai nhi hoặcảnh hường xấu đến sự phát triên của thai Các tác dụng phụ của việc sử dụng thuốc nhưgiảm huyết áp tạmthời, chóng mặt buồn nôn, đau đầu, khó ngủ thường không phô biến và xảy rahiếm khi [17, 16]

1.4.1.7 Tương tác th nốc.

Khi sử dụng cùng với Levodopa, giảm hiệu quả cùa Levodopa và gây ra tìnhtrạng run rây và co cứng cơ tăng lên [30] Ngoài ra, Drotaverin hydroclorid còn có thê tươngtác vớimột số loại thuốckhác nhưatropin, diclofenac và diazepam [12]

1.4.2 Tông quan về phương pháp sac ký lỏng hiếu năng cao.

1.4.2.1 Khái niệm về sắc ký lỏng hiện năng cao.

Máysắc ký lòng hiệu năng cao đượcviết tắt là HPLC(High Performance Liquid Clưomatography)là một công cụquan trọng trong lĩnh vực phântíchhóahọc vàsinh học Phương pháp đượcphát triên từ sắc ký lòng thông thường (LC) vào nliững năm

1960 bời hainhà khoa học người Ý,Prof Csaba Horváth và Dr Isratu Rehman [18].Banđầu, LC được sử dụng đê tách các hợp chathim cơ không bay, không phân cực.Tuy nhiên, do có nhiêu hạn chế về độ phân giải và tốc độ phân tích, nên HPLC đã rađời với khả năng phân tích cao hơn và nhanh hơn Hiện nay phươngpháp HPLC là một phương pháp phô biến được áp dụng rộng rãi trong nghiên cím và công nghiệp

ờ tất cả các nước trênthế giới Phương pháp giúp định tính, định lượng, tạp chất cùa các hợp chất hóa học trong mẫu với độ chính xác và độ nliạy cao HPLC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: y sinh, hóa học, sinhhọc, môi trường, thực phâm, dược phẩm [19] Công nghệ này đơn giảnhóa quá trinh phân tích các hợp chấtphức tạp,đem lại kết quả chính xác hơn [20], HPLC cỏn đóng vai trò quan trọng trong kiêm

soát chất lượng sản phâm vànghiên cíni phát triên [1].

1.4.2.2 Nguyên tắc HPLC.

HPLC là mộtkỹ thuật sắc ký được sừ dụng đê tách cáchợp chất trong hỗn hợp.Trong đó các chấtphân tích di chuyên qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động lỏng[2] Cácchất phân tíchcó thêtáchkhỏi nhau trong hỗn hợp do mỗichất có cấu trác khác nhau, tính chất khác nhau do ái lực củanó với pha tĩnh dưới tácdụng của pha độngkhácnhau Pha tĩnh dạng hạt đóngvào cộthình trụ, đóng một vaitrò quan trọng vì ảnh hường tiạrc tiếp đến quá trình phântích Cónhiều loại pha tĩnhphô biến được sử dụng như chất lỏng,chất hấp phụvà chất trao đôi ion [1,21].Khi pha tĩnh được chọn lựa và sử dụng phù hợp với nhất với mẫu nghiên cứu,

nó có thê giúp cãi thiện độ phân giãi, tăng cường khả năng phân tách các chất phức tạp giúp giảm thời gianphân tích Việc lựa chọn pha tĩnh phù hợp cũng đóng vai tròquan trọng trong việc đảm bảo kết quảphântíchchính xác và đáng tin cậy [1, 22]

1.4.2.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký.

Trong phương pháp HPLC, quá trình tách chất xảy ra do sựdi chuyên các chất hòa tan giữa hai pha kliácnliau Kill phađộng di chuyên vớimột vận tốc không đôi,

nó sẽ thúcđây các chất hòa tan ừr pha tĩnh trong cột ra khỏi hệ thống Quá trình này thường dựa vào tínli chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan đê loại bò chúngkhỏi cột [1]

Pic sẽ ghi lại mỗi chất được tách ra từ cột bằng máy dò Tínhiệu thu được từquá trình sắc kýcung cấp thông thi chi tiết về việc tách biệt các phân tử trong mẫu.Sắcký đồcó thê hiên thị một hoặc nhiều đỉnh tùythuộc vào thànhphần củamâu [1]

1.4.2.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC.

> Bình chứa dung môi.

Đê báo quản dung môi pha động nhạy cảm ánh sáng, bạn nên chọn bìnli thủy tinh trung tính hoặctối màuđêtrong điều kiện ônđịnli Việc sử dụng bình cónắp đậy kín là cần thiết đối với các loại dung môi dễ bay hơi Bình chứa dung môi bảo quàn chất lượng của pha động và tránh biến đôi thành phần [1]

Trước kill đô dung môi vào bình, cần phải sữ dung lọc có kích thước 0,22 pm hoặc 0,45 pm đê lọc các tạp chat gây thê ảnh hường đen sự ôn địnli cùa dung môi Khi sừ dụng dung môi nước cần sừ dụngmàng lọc chuyên dụng như cellulose nitrathoặc cellulose acetate đê đàm bão sự trong suốt của dung môi [1].

Trong trườngsử dụng hỗn hợp dungmôi hữu cơ,mànglọc tái sinhRC cellulose, polyamide hoặc nylon là lựa chọn ini tiên đê lọc bò các tạp chat và đảm bảo sự ônđịnh của dung môi Dung môi hữu cơ cũng cần sừ dụng màng lọc Teflon đê ngănchặn và lọc hoàn toàn cáctạp chất không mong muốn [1]

Khi dung môi đi vào bơmphảihruýloại bò các bongbóng nhỏ cònsót lại trong

hệ thống chứa dung môi pha động Điều này giúp hạn che được những hiện tượng xày ra không mongmuon Neu có quá nhiều bọt trongdung môi và quátrìnhkhử kill không thê loại bỏ hoàn toàn, bơm cao áp sẽ gặp khó khăn trong klii đây dung môi, gâynhiễuloạn hoạt động vàtần số của toàn hệ thống [1]

> Hệ thống bơm cao áp.

Pha động di chuyên qua cộtnliờ bơm với tốc độ nhấtđịnh

Đê đạtđượckếtquả tốt cần duy trì áp suất ônđịnh, đồng thời tạo dòng chảyliêntục Đê đảm bảo hiệu suất phân tích, tốc độ dòng bơm phải được điều chỉnli trong khoáng từ0,lmL/phútđến 10 mL/phút [1]

Cách tự động: Sừ dụng các thiết bị hoặc hệ thống ựĩ động đã cài đặt chương

trình đê đưa mẫu vào cộtphân tích một cách tự động Việc này giúp giảm thiêu sót

do con người và tăng hiệu suất công việc so với thực hiện quá trình này bang cách thủ công Công nghệ ựĩ động hóa giúp tối tăng độ chính xác và tối ưu quy trình của kếtquảphântích [1]

> Lọc tiền cột.

Bộ lọctiền cộtđược đặt tnrớc cộtphântích đê thực hiện chức năng lọc các tạpchất từdungmôi và mẫu, giữ cho hệ thống sắc ký hoạt độngônđịnh và hiệu quà cấutrúc của bộ lọc nàythường được thiết kếđê tươngthích với cột sac ký, đồng thời tạo

ra sựcânbang giữa pha động và pha tĩnh trong quá trìnhphân tích [1]

> Cột sắc ký.

Cột phân tích có cấu tạo bangthép kliông gi và mỗi nhà sãnxuất có cách tạo ra sản phâmriêng biệt nhau Thường cột cóchiều dài 50nm đến300mm và đường kínhtrong 2nm den 5 mm Cột này thường được lấp đầybang silica hoặc các hạtsilica lai

đê cung càp bẽmặt pha răn cho quá trìnhphân tích [1]

Khi vận hành phương pháp phải đảmbảo duy trì nhiệt độôn định củapha động

và cột trongquá trình vận hành đêkhông ảnh hường đếnkết quảphân tích Nhiều hệ thống HPLC hiệnnay đã được trang bị buồng ôn nhiệt mục đínhđê duy trì nhiệt độcột không đôi trong quá trình phân tích [1]

Mỗiloại chấtcó đặc tính riêngbiệt nên việc lựa chọnDetector sẽ phụ thuộc vàocác chất cụ thê cầnphân tích Có nhiều loại detector được sữ dụng trong phân tích như: Detector uv - VIS, Detector khối phô, Detector huỳnh quang, Detector điệnhoá [1]

Máy tính được trang bịphan men chuyên biệt [ 1 ]

1.4.2.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiệu sắc ký.

> Lựa chọn cột (pha tĩnh).

Pha tĩnh có đóng nhiệm vụ quan trọng trong việc phân tách các hỗn hợp chat khác nhau Pha tĩnh trong HPLC thườngđược sừ dụng là chấtran hoặc chất xốp với kích thirớc hạt dao động klioàng 3 đến 10 micromet, cơ chế tách có thê là trao đôiion, sắc ký hấp phụ, và phân bố [1,23]

Đê đàm bảo hiệu suất tách tốt, các chất pha tĩnh cần phải có khànăng tách biệt các chất trongđiều kiệncụ thê và phảicó tính chấtbềmặtôn định Ngoàira quátrinhtách phải có khả tách lặp lại tốtvànhanh chóng và kích thước hạt phải đồngđều đêđảm bào khả năng tách tốitru [ 1 ]

> Lựa chọn pha động cho HPLC.

Đê lira giải các chất ra khôi cột sắc ký thì ta phải lựa chọn pha động một cách phù hợp vàtối ưu nhất Dungmôisừ dụng cho pha độngkhá đa dạng nhưng cầnphài

có nguồn gốc rõ ràng và độ tinh khiết cao Thường sử dụng dung môi là nước, dung môi him cơ và dung môi hĩru cơ được trội! theocác tỳ lệ riêng biệt Khi lựa chọnphađộng can phảihm ý không được tác dộng đen pha tĩnh và có khả năng hòa tan mâu một cách tốt nhất Pha động phải nhanh chóng đạt trạng thái cân bằng đàm tính ônđịnh trong quá trình theothời gian chạy sắc ký [1]

N-hexan, N-heptanvà benzenlà những chất kém phâncực thường được sử dụng cho sac ký pha thuận Điều này giúp cho việc tách chất diễn ra hiệu quả hơn bời vì các chất ítphâncực sẽ tương tác tốt vớinhau [1],

Ngược lại, các dung môi phân cực như methanol, acetonitrile, nước hoặc các hôn hợp của chúng thường được sửdụng cho sắc ký pha đảo Việc sữ dụngcác dung môiphân cực này giúp tăng khả năng tách chất, đặc biệt là kill cần tách các chất có tính chất phân cực cao Bằng cáchnày, chúng ta cóthê kiêm soát quá trìnhtách chất một cách chính xác và hiệu quâ hơn [1]

> Chọn hệ đệm.

Đêduy trìđộ pH ônđịnh, trong quy trìnhphântích việcsử dụng dung dịch đệm

làrấtcầnthiết và quan trọng Đê phương phápđạt hiệu quảcaotrong khi tách thì việc kiêm soát môitnrờng pH phù hợp đối với từng loại mẫunên cầnđrrợc nghiên cứu kỹcàng Khisử dụng các chất hữucơ có tínliaxit, ta thườngcần sừ dụng dung dịch đệm

có tínhaxit đê đàm bàophântích hiệu quâ Khi thựchiện sắc ký cặp ion thì việc điều chinhđộ pH phụ thuộc vào đặcdiêmcủa mẫu và điều kiệnthừ nghiệmcụ thê [1],

Lựa chọntốcđộ dòng một cáchcânthậnđêđạt hiệu suất hiệu quả caotrongquátrìnhtách chất Điều này đòi hỏi sự thử nghiệm nhiều lần đê đánh giá được quá trìnhhoạt động đê đạt ôn định vàhiệu quâ nhất có thê [1]

1.4.3 Tông quan vê phương pháp thâm định.

Việc đánh giá phương pháp phân tích đóng vai trò quan trọng trong việc đàm bảo sựchínhxác và tincậycủa quá trìnhnày Điều này kliôngchi làyêu cầucần thiết khi tiênhành nghiên cứu và phát triêncác loại thuôcmới mà còn khi đăng ký và phêduyệt các sânphâmdượcphâm Trong quá trìnli thâm địnli, các đặc diêm quan trọng cần được xem xét kỹ lường bao gom độ đặc hiệu, độ chọn lọc, tính tuyến tính, độchínhxác vàđộ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn địnli lượng vàkhoảng xác định.Các quy định đi kèm theo hướngdẫn về việc đánh giá và xây dựng phương pháp phân tích đã được các tô chức quản lý uy tín nliư ICH (Uy ban Hợp tác Quốc tế vềThừ nghiệm Dược phâm)EMA(Cơquan Dược phâm Châu Au), US FDA (Cục Quàn

lýThựcphâm và Dược phâm HoaKỳ), và ASEAN (Hiệphộicác quốc giaĐôngNamÁ) chấp nhận vàcông nhận trong các tài liệuhướng dẫncũa họ Tại Việt Nam, thông

tư 32/2018/TT-BYT cũng quy địnhvềviệc thâm định phươngpháp phân tích trong đăngký và hruhành thuốc và nguyên liệu làmthuốc Với sựquan trọng cùa việc thâm định phương pháp phân tích trong ngành dược học, việc tuân thù các quy định vàhướng dẫn là không thê phớt lờ Đê thâm định quy trình theo đúng quy định, việc tuân thủ hướng dẫn làvô cùngquan trọng [4, 24],

1.4.3.1 Tỉnh đặc hiện.

Trong mẫu thử có chứa nhiều thành phần kliác nhau như chất nền, sản phâm phân hủy và tạp chất dù vậy phương pháp vẫn có kliả năng xác định chính xác được gọi là tínli chất đặc biệt [4]

1.4.3.2 Tính tuyến tính.

Khoảng tuyếntính đạt được sẽ phụ thuộc theo nồng độ của chất cầnphân tíchvà giá trị đođược trong mẫu nghiên cứu được biêu diễn theo phương trình hồi quy tuyến tính y=ax +b [1]

Đối với quy trìnhđịnh lượng: Tỷ lệ thu hồi 98- 102% ờmôi mức nồngđộ,RSDkhông lớn hơn2.0% ờ mỗi mức nồng độ

> Độ chính xác.

Tính chính xácchothay tínli nhấtquán của kếtquảthuđượccủamột mẫu nghiêncứu đồng nhất trong điềukiện nhất định Các phương phápnhư hệ số biến thiên phép

đo, độ biến thiên hoặc độ lệch chuân của cácphép đođirợc dùng đêthê hiện độchínhxác Độ chính xác thường được chia thành hai loại cơ bản [1].

1.4.3.5 Khoáng xác định.

Trong mầu thử klioàng cách giữa nồng độ cao nhất và thấp nhất của chất phân tích được gọi là khoảng xác định Nó đo lường sự chênh lệch giữa các mức độ nồng

độnày, cho phép xác định mức độ chínhxác và độ tuyến tính của quy trình phân tích

Đê kết quả phân tích một cách chính xác và tin cậy cần phải thực hiện khoảng xác định khi xây dựng phương pháp [1]

1.4.3.6 Giới hạn phát hiện (LOD).

Số lượng nliỏ nhất của chất phân tích có trong mẫu thử được gọi là giới hạn phát hiện Điều này giúp xác định khã năng của phương pháp trongviệc phát hiện và đánh giá các chất cómặttrongmẫu thừ một cáchđáng tin cậy [4],

1.4.3.7 Giới hạn định lượng (LOQ).

Lượng chấtthấp nhất có thêxác định hr mộtmẫu với độ chính xác và độ tin cậyyêu cầu Đây làchi số quantrọngtrong phân tíchhóahọc giúpxác định nồng độ thấp nhất cùa mộtchất trong mẫu Giới hạn định lượng thường được áp dụng đê xác định

sự có mặt của tạp chất hoặc sản phâm phân hủy trongmẫu [4],

1.4.4 Các chế phẩm hiện đang lưu hành trên thị trường.

Drotaverin hydrocloridđược sừ dụng qua nhiềudang bào che khác nliau như

1.4.5 Các nghiên cứu xây dựng quy trình định tính, định lượng drotaverin hydroclorid ngoài nước.

Năm 2012, p.Balan và cộng sự xây dựng quy trình xác định hàm lượngdrotaverin hydroclorid có trong chephâm viên nén bang HPLC Phương pháp HPLCpha đão được áp dụng đê phát hiện một cách chính xác và nhanh nhạy drotaverin hydroclorid trong các sản phàm dược phâm Quá trình phân tích sắc ký được thựchiện trên cột Hypersil C18 kích thước 150 X 4,6 mm, với kích thước hạt 5p từShimadzu, sử dụng điều kiện tách bằng cách duy trì pH 3,0 với dung dịch Kalidihydrogen photphatlàmpha động và dung dịchđệm di kali hydrophotphat cùng với Acetonitril Tốc độ dòng chảy được thiết lập là l,0ml/phút và bước sóng 210 nm.Thời gian lưu của drotaverin hydroclorid là 3,140 phút Phương pháp đề xuất đơn giãn, có tính chọn lọc, độ lặp lại, độ nhạy và độ chính xác cao [25]

Năm 2017, Smita Sharma và cộng sự công bố phương phápphântích địnlr lượngDrotaverine hydroclorid kết hợp với omeprazol bang phương pháp HPLC có trongchế phàm dạng viên Trongphương pháp này, sừ dụngcột C18 với pha động là hỗn hợp methanol và amoni axetat 0,lM được điều chinhở môi tnrờng pH 5,0 bang axit orthophosphoric theo tỷ lệ 60:40, sừ dụng tốc độ dòng 1,5 mL/phút và thực hiện ờbước sóng 319 nm Phương pháp được áp dụng thành công đê phân tích địnli lượng viên nén RanipasDVvới thời gian hru của drotaverin hydroclorid và omeprazole lầnhrợt là 7,969 và 6,538 phút [26]

Năm 2018, Rajan V Rele và công sự đã sửdụng phương pháp Đo lườngbằngphương pháp đạo hàm của uv spectrophotometric đê ước hrợng drotaverinhydroclorid trong dạng liều lượng dược phâm Mục tiêu của nghiên círu là pháttriên một thiết bị đo quang phô dẫn xuất tia cực tím, chính là việc áp dụng phươngpháp dẫn xuất bậc mộtvà bậc hai đê xác địnli drotaverin hydroclorid trong sảnphâm dượcphâm bang việc sửdụng methanol như dung môi Phương pháp này đã đượcxác thực theo hướngdân từ ICH Các phươngpháp đạo hàm được đềxuấtbao gồm việc đođộhấp thụ ờ bước sóng 266 nm cho bậc một và 254,7 mn cho bậc hai đê ước lượng

drotaverin hydroclorid trrơng ứng Các phương pháp cũng đã được kiêm chứng vềmặt thốngkê liên quan đến tính tuyên tính, độ chính xác và độ lặp lại [27],

Năm 2020, K Naga Prashant và cộng sự công bố phương pháp xác địnhdrotaverin hydroclorid có trong nền sinh học bằng phương pháp LC-MS Phươngpháp phân tích sắc ký lỏng đơn giản và chỉnh xác, kết hợpvới phương pháp LC-MSkhối phô,đã được dùng đêxác định vàđịnhlượngdrotaverin hydroclorid trong huyếttương người Thuốc được táchbangphươngpháp chiết lòng - lòng LLE sử dụng cộtC18 đê tách thuốc ờ chế độ gradient thông qua HPLC Giới hạn phát hiện dướicùa drotaverin hydroclorid là 1,013 ng/mL Đường cong chuân nam trong khoảng tìr 0,993 ng/mL đen 498,245 ng/mL với độ tuyến tính mong muốn và r2 > 0,99 Độ chính xác trong ngày daođộngtừ 100,583% đen 98,033% với hệ số biến thiên tìr 0,90đến 0,147 [28]

CHƯƠNG 2 NỘI DƯNG NGHIÊN cứu ĐỀ ÁN

2.1 Thiết bị dụng cụ, hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu.

Thiết bị

1 Máy sắc kýlòng hiệu năng cao Shimadzu LC2030 3D

PLUS đầu dò PDA

Nhật Bản

3 Máy lắc siêu âm TRANSSONIC Digital s Trung Quốc

4 Cột sắc kỷ C18 Inertsil (250 mm X 4,6 mm, 5 pm) Nhật bản

8 Giấy lọc cho bộ lọc hút chân kliông Regenerated

Cellulose Filter

Merck

Dụng cụ

Hoá chất

17 Acetonitril tinhkliiet sắc ký (HPLC) Fisher Mỹ

2.2 Phương pháp thực hiện

2.2.1 Xây dựng phương pháp định tính drotaverin hydroclorid trong chế phẩm

Định tính được ghi nhận kết quả dựa vào sắc ký đồ của phân tích định lượng yêu cầu dung dịch chuân có thời gian hru cùa pic là tương đương với cùa dung dịchmẫu thừ trong cùng một điều kiệnnhất định Phương pháp này giúp đảm bảo các kếtquả được đưa ra làchính xác, đồng nliất và có tính kliả thi cao [30]

2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng drotaverin hydroclorid trong chế phâm

Việc chọn điều kiện sắc ký trong quá trình sắc ký nhtr cột sắc ký, bước sóng pháthiện, dung dịch đệm, nhiệt độ cột, thành phan và ti lệ pha động, tốc độ dòng, cũng như thê tíchtiêm

Thê tích tiêm: Khảo sátcác thê tích tiêm khác nhau 20 pl, 50 pl, 80 pl

Dựa các kếtquảkhảo sát trêntasẽchọn điều kiện sắc ký tối IĨUnhất chophươngpháp đã xây dựng đê cho ra pic rõ ràng, chính xácvà cân đối nhất

2.2.2.2 Cách tiên hành định tính, định lượng

lệkhảo sát [30]

vào bình định mức 25 ml và thêm khoảng 15ml methanol sauđó lắc đê hoà tanbằngmáysiêu âm 10 phút Đê nguội tiếp tục thêm methanol vừa đù đenvạch và lắc đều Lọc bò 10 ml dịch lọc đầu sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này cho vào binhđịnh mức 50 ml, thêmpha động vừa đủ đến vạch, lac đều Lọc dung dịch mầu đã

phađược qua màng lọc 0,45 pm [30],

mịn,trộnđều Cân chính xácmộtlượng bột thuốc tương ứng khoảng 80 mg drotaverinhydrocloridvào bình định mức 50 ml, thêmklioảng30 ml methanol sauđólắc đê hoàtanbang máy siêu âm 10 phút Đê nguội tiếp tục thêm methanol vừađủ đến vạch vàlắc đều Lọc bỏ 10 ml dịch lọc đầu sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 50 ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lac đều Lọc dung dịch mẫu

đã pha được qua màng lọc 0,45 pm [30]

Kiêm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký: Tiêm lặp lại6 lần dung dịch chuẩnvào hệ thốngsắc ký, tiến hành theođiều kiện sắc ký mô tả ờ trên RSD của diện tíchpic Drotaveinhydroclorid giữa 6 lan tiêm lặp lại khôngđược lớn hơn 2,0 % [3],

ký,tiếnhành theo điều kiện sắc ký Ghi nhận sắc ký đồ

Hàm lượng %drotaverin hydroclorid trong một viên so với lượng ghi trên nhãn đirợc tính theo công thức:

ST : Diện tíchpic Drotaverin hydroclorid trên sắc ký đồ cùa dungdịch thử

sc : Diện tíchpic Drotaverin hydroclorid trên sắc ký đồ cùa dungdịch chuân

MC : Khối lượngDrotaverin hydroclorid chuẩn(mg)

MT : Khối lượng bột thuốc dùng đê định lượng (mg)

c% : Hàm lượng % Drotaverin hydroclorid chuẩn, C24H31NO4.HCI tính trênnguyên trạng

DC : Độ pha loãng củadung dịch chuân

DT : Độ pha loãng cùadung dịch thử

HLN : Hàm lượng nhãn của Drotaverin hydroclorid, C24H31NO4.HCI

2.2.3 Thâm định phương pháp định lượng drotaverin hydroclorid đã xây dựng

2.2.3.1 Tính tương thích hệ thống

vào bình định mức 25 ml Thêm vào khoảng 15 ml methanol sau đó lac đê hoà tanbằng máy siêu âm 10 phút Đê nguội tiếp tỊic thêm methanolvừa đũ đến vạchvà lắc đều Lọc bò 10ml dịchlọc đầu sauđó hútchính xác 5,0 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 50 ml thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch và lắc đều Lọc dung dịchmẫu đã pha được qua màng lọc 0.45 pm [1, 26, 29, 25].

Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuân theo điều kiện sắc ký

Yêu cầu:

RSD cùa diện tíchpic giữa 6 lần tiêm lặp lại không lớn hoai 2,0%

RSD của thời gian hm giữa 6 lầntiêm lặp lại không lớnhơn 2,0%

Hệ số đối xứng cùa pic phải hr 0,8 đến 1,5

2.2.3.2 Tỉnh đặc hiện

50 ml Thêm klioâng 30 ml methanol sauđólacđêhoàtanbằng máy siêu âm 10 phút

Đê nguộitiếp tục thêm methanol vìra đủ đenvạch và lac đều Lọc bò 10 1111 dịch lọcđầu sauđóhútchínhxác 5,01111dịchlọc này chovào bìnliđịnli mức 50 1111 thêm dung môi phamẫu vừa đù đến vạch và lắc đều Lọc dungdịch mầuđã pha được qua màng lọc 0,45 pm[l,26, 29, 25],

vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol sau đó lắc đê hoà tan bangmáy siêu âm 10 phút Đê nguội tiếp ựic thêm methanol vừa đù đếnvạch và lắc đều.Lọc bò 10 1111dịchlọcđau sau đó hút chínhxác 5,01111 dịchlọc này chovào bình định mức 50 mlthêm dung môi pha mẫuvừa đủ đen vạch và lắc đều Lọc dung dịch mẫu

đã pha được qua màng lọc 0,45 pm [1, 26, 29, 25].

theo phương pháp mô tả ờ mục 2.2.2.2

80 mg drotaverin hydroclorid vào bình định mức 50 ml, thêm klioảng 30 ml methanol sau đó lắc đê hoà tan bang máy siêu âm 10 phút Đê nguội tiếp ÍỊ1C thêm methanolvừa đù đến vạch và lắc đều Lọc bỏ 10 ml dịch lọc đầu sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này và 2,0 ml dungdịch chuẩn gốc ở phầntương thích hệ thống cho vào bìnhđịnh mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫuvừa đù đến vạch và lắc đều Lọc dung dich mầu đãpha được qua màng lọc 0,45 pm [1, 26, 29, 25].

Lần lượt tiếnhànhsắc ký các dung dịch trên theo điều kiện mô tả, ghi nhận sắc

2.2.3.3 Tỉtih tuyến tỉnh

chuân vào bình định mức 200 ml, thêm 70 ml methanol và methanol sau đó lắc đêhoà tan bang máysiêu âm 10 phút Đe nguội sau đó tiếp tục thêm methanolvừa đủđến vạch và lắc đều [1, 26, 29, 25].

Từ dung dịch chuẩn gốc, lần lượt pha 5 dung dịch tuyến tính tương đương

khoảng 40 % - 140 % nồng độđịnh lượngtheomô tảtrongBàng 1 và định mức bằngdung môi pha mẫu Tiến hành sắc ký theo phương pháp mô tả, ghi nhậnsắc ký đồ [1,

Bình định mức(ml)

Nồng độ Drotaverin hydroclorid

nhau tiến hành phân tíchtrênhệthống HPLC vào 2ngày khác nhau Chuân bị 6 dung dịch thử, mỗi dung dịch tiếnhành sắc ký 1 lan theo điều kiện sắc ký [25].

Yêu cầu:

RSD cùa hàmhrợng drotaverin hydroclorid trong 6 mẫu kliôngquá 2,0 %.RSD của hàm lượng drotaverin hydroclorid trong 12 mẫu kliông quá 2,0 %.Ket quả địnli lượng giữa 2 kiêm nghiệm viên khác nhaukliôngcó ý nghĩa thốngkê:

F-test cho p>0,05 (phương saikliácnliau khôngý nghĩa)

t-test cho p >0,05 (trung bình khác nhau không ý nghĩa)

2.2.3.5 Độ đủ tig

Thực hiện phương pháp thêm chuân vào mầu placebo đê được các mẫu thử ựrtạo có nồng độ 80 % - 120 % nồng độ định lượng Môi mức nồng độ làm 3 mầu tiếnhành theo điều kiện sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ, tính tỉ lệ phục hoi, RSD ờ mỗi mức nong độ

hydroclorid vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 30 ml methanol, sau đó lắc đêhoà tan bằng máy siêu âm 10phút Đê nguội tiếp tục thêm methanol vừađù đen vạch

và lac đều Lọc bò 10 ml dịch lọc đầu sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này chovào bình định mức 50 ml, thêmpha độngvìra đủ đếnvạch, lac đều Lọc dung dịch mầu đãpha được qua mànglọc 0,45 pm [25].

hydroclorid vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 30 ml methanol, sau đó lắc đêhoà tan bằng máy siêu âm 10phút Đênguội tiếp tục thêm methanol vìra đủ đến vạch

và lac đều Lọc bò 10 ml dịch lọc đau sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này chovào bình định mức 50 ml, thêmpha động vừa đù đếnvạch, lắc đều Lọc dung dịch mâu đã pha được qua màng lọc 0,45 pm [25].

hydroclorid vào bình định mức 25 ml, thêmkhoảng30 ml methanol sauđólắc đê hoàtanbằng máy siêu âm 10 phút Đê nguộitiếp ựic thêm methanol vita đùđến vạch vàlắc đều Lọcbò 10 ml dịch lọc đau sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 50 ml, thêm pha động vừađủ đến vạch, lac đều Lọc dung dịch mẫu

đã pha được qua màng lọc 0,45 pm [25]

Yêu cầu:

Tỷ lệ phục hồi ờ tất cả cácnồng độ phải từ 98,0 %- 102,0 %

RSD cùa tỷ lệ phục hồi ở mỗi mứcnồng độ không quá 2,0 %

2.2.3.6 Khoảng xác định

Dựa vào kết quả tíuli tuyến tính., độ chính xác và độ đúng, suy ra khoảng xác định cùa phương pháp [25].

Yêu cầu:

Khoảng xác định phải hr 80 % - 120 % nồng độ định lượng [1].

2.2.3.7 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Sừdụng kết quà cùa bảng Anova của chi tiêu độ tuyến tính đêtính LOD vàLOQ [1]

Giới hạn định phát hiện LOD được tính bằng công thức:

Giới hạn phát hiện: LOD = 3,3SD

Giới hạn địnli phát hiện LOQ đrrợc tính bang công thức:

Giới hạn địnlilượng: LOQ =—

2.2.4 Áp dụng phương pháp đê định tính, định lượng một chế phâm trên thị trường chứa hoạt chat Drotaverin hydroclorid

Trên cơ sờ phương pháp đã xây dựng, áp dụng đê định lượng drotaverin hydroclorid trong chế phẩm đơn thànhphan với các hàm lượng40mg, 80mg đãđượcsản xuất và lưu hành tại ViệtNam Mầu thừ được cân 2 lần, pha 2 mầu thửvà mỗimầu thữ được tiêm 1 lần trên hệ thống sắc kýđê và lấy giá trị trung bình Tiến hànhsắc kýdung dịch mầu chuân và dung dịchmầu thừtrong cùng một điềukiện

Yêu cầu: Hàmlượng drotaverin hydroclorid trong một viênphải ừr 98,0%- 102,0

% so với lượng ghitrênnhãn

CHƯƠNG 3 KẾT QƯẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng drotaverin hydroclorid

Triên khai pha mẫu chuân drotaverin hydroclorid trên hệ thống HPLC được trang bị đầu dò PDA với dải bước sóng phát hiện hr 200 - 400 nm

Dựa vào phô sac ký ta thấy đỉnli hấp thu cực đại nằm ờ bước sóng 226 nmvà

279 mm ơ bước sóng 226 nm cho thấy đường nền không đẹp và dung môi có thê

hấp thu ờ bxrớc sóng này và khi chọn bước sóng hấp thu cực đại là 279 nm thì thấydiện tíchpic lớn giúp sai số định lượng giãni từ đó cài đặt bước sóng 279 nni đê xây dựng quy trình địnhtính, định lượng drotaverin hydroclorid.

3.1.2 Khảo sát độ tinh khiết của chat chuan drotaverin hydroclorid

drotaverin hydroclorid

drotaverin hydroclorid

Kiêm tra độtinh khiết drotaverin hydroclorid bằngcông cụ puritypeakđikèm cho giá trị purityindex đạt 99,5% Nhưvậy, phươngpháp giúpxác định đirợc pic cùa chất không bị lân chất khác

3.1.3 Khảo sát pha động

Trong phương pháp HPLC pha động thường hay dùng nhất là methanol, acetonitril, nước có độ tinh kliiết Dựa vào các nghiên círu cho thấy hoạt chất

drotaverin hydroclorid có tính base yếu nên chúng tôi kliảo sát hệ pha động kliácnhau trong đó có methanol, acetonitril và đệm natri dihydrophosphat có pH 6,5:

Hệ pha động

(MeOH : ACN : Na2HPO4)

Thòi gian lun

Diện tích pic

Hệ số đối xứng

Số đĩa lý thuyết

Na2HPO4(50 : 10 : 30)

Na2HPO4 (45 : 30 : 25)

Trong quá trình nghiên círu, kill kết hợp acetonitril và methanol với đệmphosphat pH 6,8, nhận thấy rang khả năng lira giải cùa hỗn hợp này tốt hơn so với việc sử dụng riêng lẻ từng chất acetonitril hoặc methanol kết hợp với đệm Do đó,tiến hành thừ nghiệm với nhiều tỷ lệ khác nhau cùa dung môi này, đặc biệt là phốitrộn ờ tỷlệ thấp.

Ket quà cho thấy rằng hỗn hợp đệm methanol, acetonitril, đệm phosphat(40:35:25) có thời gian hm 7,547 tương đối nhanh, hệ số đối xứng 1,17;, số đĩa lý thuyết 3021, pic được cân đối phù hợp với yêu cầu của nghiên cứu so với các tỳ lệ cỏn lại.

Đặc biệt,khoảng dao động áp suất kill khảo sátờ mức 120 bargiúp hệ thốngônđịnhhơnkhixử lý các tỳ lệ kliác có cùng thời gian hru trong phân tích Điều này làrất quan trọng đê đảm bảo kếtquảphântích chính xác và đáng tin cậy

3.1.4 Khảo sát pH của hệ đệm

Phần lớn các nghiên círu sử dụng phương pháp HPLC đê tách hỗn hợp chất thường thiết lập các điều kiện pH trong khoảng từ 2 đến 8 Điều này giúp đảm bảorang cột tách chất hoạt độnghiệu quả nhất và cho kết quảôn định

Trong nghiên círu này, chúng tôi quyết địnli khảo sát các khoảngpH cụ thê là2,5; 4,5; 6,5 và 7,5 đê xem xét sự ảnh lưrờng của pH đến quá trinh tách chất Bằng cách này, chúng tôi hy vọng có thê hiêu rõ hơn vê cách mà các điêu kiện pH khácnhau có thê ảnh hường đến hiệu suất củaphươngpháp phân tích

3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột

Tiếnhành khảo sát đêxem xét ảnh hường của việc gia tăng nhiệt độ cột từ 30 °C lên 40 °C và 60 °C Mục tiêu của chúng tôi là đê tìm cách rút ngan thời gian chạy trong quá trìnhphàntích và chứng minh mẫu không bị ảnh hườngbờinhiệt độ

xứng

Sổ đĩa lý thuyết