Xây dựng quy trình Định tính, Định lượng febuxostat trong chế phẩm viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Đầu dò pda (hplc pda)

NGUYEN TAT THANHXÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG FEBUXOSTAT TRONG CHÉ PHẨM VIÊN NÉN BÀNG PHƯƠNG PHÁP SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐÀU DÒ PDA HPLC PDA MÀ SỐ: 8720210 ĐÈ ẤN THẠC Sĩ K

XÂY DựNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

PDA (HPLC PDA)

THÀNH PHỐ HÒ CHÍ MINH - 2024

NGUYEN TAT THANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG

FEBUXOSTAT TRONG CHÉ PHẨM VIÊN NÉN BÀNG

PHƯƠNG PHÁP SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐÀU

DÒ PDA (HPLC PDA)

MÀ SỐ: 8720210

ĐÈ ẤN THẠC Sĩ KIẺM NGHIỆM THƯÓC VÀ ĐỌC CHẤT

TS DS THÁI THỊ CẢM

Thành Phố Hồ Chí Minh - 2024

LỜI CAM ĐOAN

một cách tiling thực Đe án nàykhông có bất kỳ số liệu, văn bân, tài liệu đã đirợc

bằng đại học, sau đại học Đe án này kliông bao gom các giải pháp đã được thực hiện

và báo cáo tại bất kỳ cơ quan, đơn vị, địa phương nhằm giải quyết vấn đề tươngtư

với mục tiêuđề án đe ra

Ký và ghi rõ họ tên

LỜI CẢM ƠN

Dược phâm TrungƯơng 25 đã hỗ trợ chúng tôi trong việchoàn thànhđề án xây dựng

PDA (HPLC PDA) Sự hỗ trợ của Cô và Côngty đã gópphan quan trọng cho thành côngcùa đề án Xinchânthành cảm ơn!”

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 GIỚITHIỆU 1

1.1 Tính cap thiết cùa đề án 1

1.2 Mục tiêu của đề án 1

1.3 Phạm vi của đề án 2

1.3.1 Đối tượng 2

1.3.2 Địa điêm thựchiện đề án 2

1.3.3 Thời gian thực hiện đề án 2

1.4 Cơ sờ lý thuyết của đề án 2

1.4.1 Tông quan vê Febuxostat 2

1.4.2 Tông quan về phươngpháp sắc kýlònghiệu năng cao 4

1.4.3 Thâm định phương pháp phântích 11

1.4.4 Một số phirơng pháp định tính,địnhlượng Febuxostat 15

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG ĐÈ ÁN 18

2.1 Dung môi hóa chất, trangthiết bị nghiêncứu 18

2.1.1 Dung môi hóa chất 18

2.1.2 Trang thiết bị, dụng cụ 18

2.2 Nhiệmvụ và phươngpháp thực hiện 19

2.2.1 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng Febuxostat trong che phâm viên nénbang sắc ký lỏnghiệu năng cao đầu dò PDA (HPLC_PDA) 19

2.2.2 Thâm định phương pháp vừa xây dựng 20

2.2.3 ứng dụng phương pháp đã xây dựng đê định tính, định lượng Febuxostat trong một số chế phàm viên nén dược lưu hànhtrên thị trường 24

CHƯƠNG 3 KÉT QUÀ THựC HỆN ĐÈ ÁN 24

3.1 Ket quả xâydựng phương pháp định tính, định lượng Febuxostat trong chế

phẩm bằng HPLC đầu dò PDA (HPLC_PDA) 24

3.1.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện 24

3.1.2 Lựa chọn pha động 25

3.1.3 Lựa chọntỷ lệ pha động 26

3.1.4 Lựa chọn tốc độ dòng 27

3.1.5 Lựa chọn thê tíchtiêm 28

3.1.6 Lựa chọn nliiệtđộ cột 29

3.1.7 Lựa chọn cột sắc ký 30

3.1.8 Phươngpháp định tính, định lượng Febuxostat trongchế phâm viên nén bang sac kýlòng hiệu năng cao đầu dò PDA (HPLC_PDA) 31

3.2 Thâm địnhphirơng pháp định tính, định lượng Febuxostat trong chế phẩm viên nén dược bang sắc ký lòng hiệu năng cao đau dò PDA (HPLCPDA) 33

3.2.1 Các chi tiêu thầmđịnh 33

3.2.2 Tính tương thíchhệ thống 34

3.2.3 Độ đặc hiệu 35

3.2.4 Tính tuyến tứih 38

3.2.5 Độ chính xác 40

3.2.6 Độ đúng 44

3.2.7 Klioảngxác định 46

3.2.8 Giới hạn phát hiện vàgiới hạn định lượng 46

3.3 Bàn luận 46

3.4 ứng dụng phươngpháp đê định tính, định lượng Febuxostat trongmột số chế phàmtrên thịtrường 47

CHƯƠNG 4 KÉT LUẬNVÀ KIẾN NGHỊ 50

4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50

DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẤT

CAD Charged aerosol detector Đầu dò bình xịt

ICH International Council for Hội nghị Quốc tế và Hài

Harmonisation of hòa hóa các Thủ tục đăng

for Pharmaceuticals for

cho người

Detector

Đầu dò khối phô

DANH MỤC CÁC BẢNG so LIỆU

Bang 1.1: Một số đặc tính các loại detector 6

Băng 1.2: Độ hấp thuuv cùa một số dungmôi trong sắcký pha đảo 7

Bang 1.3: Các chi tiêu thâm định phươngpháp phân tíchthuốc dạng nguyênliệu và thànhphàm 12

Bàng 3.1: Bàng kết quả khảo sát tỳ lệ dung môi 26

Bàng3.2: Ket quả khảo sát tốc độ dòng 27

Bang3.3: Ket quả kliảo sát thê tích tiêm 28

Bang3.4: Ket quả kliảo sát nhiệt độ cột 29

Bàng 3.5: Ket quã khảo sát cột sắc ký 30

Bàng3.6: Các chì tiêu thâm định 33

Bàng 3.7: Ket quà thâm định tứih tương thíchhệ thống 35

Bang3.8: Ket quà thâm định độ đặc hiệu 36

Bảng 3.9: Ket quả các dung dịch tuyến tínli 38

Bang 3.10: Ketquả phân tíchhồi quy (Regression) bằngExcel 365 38

Bang 3.11: Ketquả thâm định độ chínhxác mẫu thừ kiêm nghiệm viên 1 41

Băng 3.12: Ketquả thâm định độchínhxác trunggian 42

Bàng 3.13: So sánli hai phirơng sai (F-test) bằngphần mềm excel 365 43

Bang 3.14: Ketquã phântích t-testhai phương sai bang nhau 44

Bàng 3.15: Ket quả thâm định độ đúng 45

Bàng 3.16: Ketquả định lượng viên nén Feburic 80 mg 48

Bâng 3.17: Ketquả định lượngviên nén Febuxotid 80 mg 48

Bang 3.18: Ketquà phân tích thời gian lưu mẫu thửsovới mầu chuân 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Phô sắc ký của Febuxostat chuân 25

Hình 3.2: sắc kýđồ độ tinhklúết của mẫu chuân Febuxostat 25

Hình 3.3: Phô quétPDA của mẫu chuẩn Febuxostat 25

Hình 3.4: Phô 3D của Febuxostat chuân 25

Hình 3.5: sắc kỷđồ khảo sát pha động MeOH:H3PO4 (80:20) 27

Hình 3.6: sắcký đồ khảo sát pha động MeOH:H3PO4 (70:30) 27

Hình 3.7: sắc ký đồ pha động MeOH:H3PO4 (73:27) 27

Hình 3.8: sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 0,5ml/phút 28

Hình 3.9: sắc kýđồ khảo sát tốc độ dòng 1 ml/phút 28

Hình 3.10: sắc ký đồ kliảo sát tốc độ dòng 1.5 ml/phút 28

Hình 3.11: sắc ký đồ kết quà thế tíchtiêm 10 pl 29

Hình 3.12: sắc ký đồ kết quà thể tíchtiêm20 pl 29

Hình 3.13: sắc ký đồ kết quả thể tích tiêm 10 pl 29

Hình 3.14: sắc ký đồ kết quảkhảo sát nhiệt độ cột 25 °C 30

Hình 3.15: sắc ký đồ kết quả khảo sát nhiệt độ cột 30 °C 30

Hình 3.16: sắc ký đồ kết quả khảo sát nhiệt độ cột40 °C 30

Hình 3.17: sắc ký đồ khảo sát cột C8 31

Hình 3.18: sắc ký đồ khảo sát cột C18 (150 mm X 4,6 mm, 5um) 31

Hình 3.19: sắc ký đồ kliảo sát cột C18 (250 mm X 4,6mm, 5 pm) 31

Hình 3.20: Sacký đồ thâm định tính tương thích hệ thống 35

Hình 3.21: sắc ký đồ thâmđịnh độ đặc hiệu mẫu trắng 37

Hình 3.22: sắc ký đồ thâm định độ đặc hiệu mẫu placebo 37

Hình 3.23: sắc ký đồ thâm địnhđộ đặc hiệu mẫu chuẩn 37

Hình 3.24: : sắc kýđồ thâm định độ đặc hiệu mẫu thừ 37

Hình 3.25: sắc ký đồ thâmđịnh độ đặc hiệu mầu thừ thêm chuân 37

Hình 3.26: sắc ký đồ thâm định tính tuyến tính 38

Hình 3.27: Đồ thị biêu diễntirơngquan giữa nồngđộ và diệntích pic Febuxostat.38 Hình 3.28: sắc kỷđồ mẫu chuẩn Kiêm nghiệmviên 1 41

Hình 3.29: sắc ký đồ mẫu thử kiêmnghiệm viên 1 41

Hình 3.30: sắc ký đồ mầu chuân kiêm nghiệmviên 2 42

Hình 3.31: sắc ký đồ mẫu thừ kiêmnghiệm viên 2 42

Hình 3.32: sắc ký đồ mẫu chuânđộ đúng 45

Hình 3.33: sắc ký đồ mẫu placebo thêm 80% chuân 45

Hình 3.34: sắc ký đồ mẫu placebo thêm 100% chuân 46

Hình 3.35: sắc ký đồ mẫu placebo thêm 120% chuân 46

Hình 3.36: sắc ký đồ giới hạn phát lũện 46

Hình 3.37: sắc ký đồ giới hạn địnhhrợng 46

Hình 3.38: Sac ký đồ mầu chuân 49

Hình 3.39: sắc ký đồ mẫu Febuxotid 49

Hình 3.40: sắc ký đồ mẫu Feburic 49

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề án

Febuxostat là một thuốc hiện nay đang được sừ dụng kháphô biến ở Việt Nam cũng nhtr trên thế giới Thuốc được dùng với tác dụng giảm acid uric máu trong

trường hợp đã lang động urat, Febuxostat được FDA chấp thuận năm 2009 [1] Vì

mrớc là điều quan trọng Mặt khác bên cạnh những ưu diêmcũa thuốc trên gan, thận thì thuốc lại có nhữngnhược diêm trênmột số cơ quankhác như timmạch [2] Vì thế

đê hạn chế tác dụng phụ và tăng cường hiệu quả sử dụng thuốc thì việc có liệu trìnli

điều trị cho từng bệnh nhân là điều cần thiết, việc nghiên cứu định tính, địnli lượng Febuxostat trong chế phâmviên nén sẽ gópphần giải quyếtkhâu kiêm soát chất lượngthuốc vàcó được liệu trình điều trị hiệu quả nhất

dược điên Anh, Mỹ, ViệtNam Một số tác giàcó nghiên cứu định lượng Febuxostat

bằng phương pháp HPLC [3], [4], [5], quang phổ UV-VIS [6], LC-MS/MS [7], tuy nhiên, các phương pháp này sữ dụng dung môi đắt tiền hoặc khó áp dụng với điều

ký lòng hiệu năng cao đầu dò PDA (HPLC PDA)” không chi nham mục đích hoàn

hy vọng sẽ đưa ra giài pháp tiên tiến, góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe và manglại lợi ích thiếtthực cho cộng đong

1.2 Mục tiêu của đề án

Thâm địnhquy trình định tính, định lượng Febuxostat trong chế phàmviênnén

dựng

ứng dụng quy trình xây dựng được đê định tính, định lượngFebuxostat trongmột số chế phâm lưu hànhtrên thịtrường.

1.3 Phạm vi của đề án

1.3.1 Đối tượng

Hoạt chatFebuxostat trong chếphâmdược phẩm

1.3.2 Địa điểm thực hiện đề án

Công ty cô phân dược phẩm tilingương 25

1.3.3 Thòi gian thực hiện đề án

1.4 Cơ sở lý thuyết của đề án

1.4.1 Tong quan về Febuxostat

1.4.1.1 Công thức cấu tạo của Febuxostat

Tên quốc tế: axit 2-[3-cyano-4-(2-metyỉpropoxy)phenyĩ]-4-metyỉ-l,3-thia:ioỉe-

5-carboxylic

Công thức phân từ: CioHiữN^OìS.

Phân từ lượng: 316,4 g/moì [8]

1.4.1.2 Tính chất lý hóa

Nó gần như khônghòa tan trong điều kiện acid, ít tan trong điều kiện trung tính và

xuyên qua màng te bào mạnh mẽ [10],

1.4.1.3 Dược động học của Febuxostat

Hấp thu: Febuxostat được hấp thu hiệu quả qua đường uống (ít nhất 84%) và

[10], [11]

Phân bố: ơ trạng thái chưa chuyên hóa Febuxostat liên kết với protein huyết

tương đạt xấpxi 99,2% (chù yếu là Albumin), ờtrạng thái chuyên hóa có hoạt tính tỳ

Chuyên hóa sinh học: Febuxostat đirợc chuyên hóa nhờ hệ enzyme uridin

cytochrom P450 [12], [13],

Thải Trừ: Febuxostat đirợc thảitrừbằng cả haicon đường phân (45%) và nước

tiểu (49%) [12],

1.4.1.4 Cơ chế tác dụng

Purin chuyênhóa thành acid uricnhờ enzyme xanthm oxidase (XO),Febuxostat

írc chế XO, hr đó giảm aciduric máu [12]

1.4.1.7 Liều dùng cho người lớn

ngày Tuynliiên, trongmột số tnrờng hợp, bác sĩcó thê điều chinhliều lượng này lên

và phàn ứngcủahọ vớithuốc [10].Nên sửdụngít nhất 6 thángđê dự phòng cơn gout tái phát Hiệu quả an toàn của Febuxostat chưa thiết lập cho trẻ em dưới 18 tuôi [12]

1.4.1.8 Tác dụng phụ

Những bất thường chức năng gan , tiêu chảy , buồn nôn , đau đầu , ban và phù

nề, các phản ứng phụnày hầu hết là nliẹ tới trungbình [10], [16]

1.4.1.9 Một số che phâm chứa Febuxostat trên thị trường

Febuxostat 40-80: Viên nén bao phim chứa 40mg, 80mg Febuxostat, nhà sản

Febuxat: Viên nén bao phim chứa 40mg Febuxostat,nlià sànxuất Côngty Cô phần DượcphàmGia Nguyền

Febuzex 40-80: Viên nén bao phim chứa 40mg, 80mg Febuxostat, nhà sảnxuất

Ajanta Pharma Limited ( Ản Độ)

Theofeb: 40-80:Viên nén baophimchứa 40mg 80mg Febuxostat, nhà săn xuất Theon Pharmaceuticals Limite ( Ân Độ)

Febuxotid 40-80: Viên nén bao phún chứa 40mg, 80mg Febuxostat, nhà xàn

xuất Công ty Cô phần Dượcphẩm An Thiên

Feburic: Viên nén bao phim chứa 80mg Febuxostat, nlià sàn xuất công ty

1.4.2 Tong quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.2.1 Định nghĩa sac ký lỏng hiệu năng cao

bố tùy thuộc vào loạipha tĩnh sừ dụng HPLC có hai loại là HPLC pha thuận và pha

đâo Với HPLC pha thuận thì pha tĩnhphân cực, pha động kliông phân cực, đối với

1.4.2.2 Nguyên tac sac ký lỏng hiệu năng cao

Các chat phântích có thê tách khỏi nhau trong hỗn hợp do mỗi chất có cấu tráckhác nliau, tính chất khác nhau do đó ái lực của nó với pha tĩnh dưới tác động của

pha động khác nhau Với các chất cùng nhóm có cấu tróc kliá tương đồng hoặc đồng

phân đốiquang cầntác độngvào hệtách gồm pha tĩnhvàphađộng đê cóthêthuđược

1.4.2.3 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký

Quá trình phàn tách trong phương pháp HPLC là do quá trình vận chuyên và

phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau Klúphađộng di chuyên với mộttốcđộ nliất

địnli sẽ đây các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra khòi cột Tuỳ theo bàn chất pha động,pha tĩnh, chất tanmà quá trinh lừa giải tách được các chất ra khóicột Klii

ra khòi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic Tín hiệu của cả quá trìnli sac ký cho chúng ta sắc ký đồ Một sắc ký đồ có một hay nlứều pic phụ thuộc

1.4.2.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Bơm HPLC dùngđê hútpha động từ bình chứa và đây chúng chúngqua cột sắc

Bơm đăng dòng: Chì lấy được một loại dung môi không ựr động pha trộnđirợc

dung môi

Bơm nliị phân: Có thê lấy được đồng thời 2 loại dung môi đầu và có thê chạy

chạy chươngtrình hóa dung môi [24]

Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bìnli chứa dung môi thường bang thuỷ tinh, đôi khi bang thép kliông gi Dung

tlưrờng chi cần một bình dung môi, trong phương pháp gradient cần phải có nhiềubình [20]

Bộ phận tiêm mẫu

đối vớitiêm tự động [20]

Cột sắc ký

Trong HPLC, pha tĩnh là các hạt nhò hình cầu hoặc nguyên khối Những hạt

có một số thông số quan trọng, chăng hạn như: Kích thước hạt, loại pha tĩnh, độ xốp

Bộ phận phát hiện (Detector)

một cách chính xác và đáng tin cậytrongcácđiềukiện nhất định Mộtsốđặc tínhcủa

các loại detector được tóm tắttrong bảngsau:

Bàng 1.1: Một số đặc tính các loại detector

UV/UV-Vis Tning bình Cao

Phát hiện được các chấtcókhảnănghấpthụ

chủ yêuvào chât phân tích

DAD, PDA Trung bình Cao

Phát hiện được các chầtcó khả năng hầp thụ

chủ yếu vào chất phân tích Phổ sừ dụngđể

khẳng định định tính

Phát hiện các chầt dựa vàotỳ lệkhổilượng

và điện tíchcủa ion mẹ độnhạy phụ thuộcvào điện tíchionmẹtạo thành Tỳ lệ này sử dụng để khẳng định định tính

tữ hóa vàpháthiện tín hiệu điệncủa các hạttạothành từ bộtíchđiện Phát hiện các chất

ELSD

bình

Chat phân tích lứa giải ra sẽ được nguyên

từ hóavàpháthiện ánhsáng tánxạ của các

hạt tạo thành Phát hiệncác chất không hấp

thụUV

Đầu dò UV-Vis có thê phân tích các chất hấp thụ tia UV-Vis, chăng hạn như

hơn dẫn đến phân tích định lượng chính xác hơn [20] Độ hấp thu uv cùa một số

dung môi trong sac ký pha đào được tóm tắt ờ bảng sau:

Bâng 1.2: Độ hấp thu uv củamột số dung môi trong sắc ký pha đào

Đầu dò UV-Vis có thê hoạt động với bước sóng cố định hoặc thay đôi Hầu hết

các đầu dò uv cho HPLC hiện nay đều sử dụng các birớc sóng thay đôi với mảng đi-

ốt (DAD/PDA) có thê thu thập thông tin trên một loạt các bước sóng từ 190 nm đến

1.4.2.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Thòi gian lưu ÍR và thê tích lưu V r

tR là thời gian cần đê một chất di chuyên từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký tới detectorvà cho pic trên sac ký đồ

Thời gian hm thực C r của một chat: C r = tR- to

to là thời gian chết (thời gian không hru ghì)

cột sắc ký, tới detectorvà cho pic trên sắc kỷđồ

V r = tR X Fc

Hệ số phân bố K

thê hiện tốc độ di chuyêncủa chất tan qua pha tĩnh

Cs và C m là nồng độ chất tan ờ pha tĩnh và pha động tương ứng K phụ thuộc

vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ

^ƠRB ~ tRA) 1.18(^5 — tRA) VỸ /ư — 1\ / k'B \

Ư - - - - - - I I I I

Rs phụ thuộc vào: Hệ số chọn lọc a, hệ số dung lượng k'B

Yêu cầu: Rs > 1, giá trị tốitru Rs= 1,5 [25]

Hệ số đuôi (TF) hay hệ so đối xứng (AS)

2aTrong đó: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ờ 1/20 chiều cao của pic

tnrớc tại vị trí 1/20chiều cao pic [26]

Yêu cầu AS nam trong khoảng 0,8-1,5 [25]

Số đĩa lý thuyết N

N = 16 hay N = 5,54

Trong đó:

W1/2: là chiều rộng đo ờ 1/2 chiều caopic

Số đĩa lýthuyết cho biết hiệu lực tách của cột sắcký số đĩa lý thuyết cànglớn hiệu lực tách cùa cột càng cao, đinh pic càng nhọn, hẹp, không giãn rộng [25] [27]

1.4.2.6 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp có nhiều

khác nhau nliư: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đôi ion

táchphải xảy ra nlianli và lặp lại tốt, cỡhạtphảiđồng nhất Phatĩnh thường được che

tạo trên nen silica (S1O2), nền oxyd nhòm (AI2O3), nền hợp chat cao phân từ

được sửdụng nhiều nhất [20]

Lựa chọn pha động cho HPLC

môi theotỷ lệ nhấtđịnli

Yêu cầu : Phải trơ đốivới pha tĩnh, phài hòa tanđược chat mẫu, ôn định theo

cực như : nước , methanol, acetonitril hay hỗnhợp cùa chúng [20]

Chọn hệ đệm

Trong sac ký tạo cặp ion, sắc ký trao đôiion, sac kỷ hấpphụ mà chất tan có tính

sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệulực tách Thông thường với các chất tan

là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acidnhưng cũng có những trường hợp ngoại lệ , cònsac kýtạo cặp ion thì pHtùy tìmgtrường hợp [20]

Tốc độ dòng

Sau klũ có pha động , pha tĩnh ,pH thích hợp thì cần phảilựa chọn tốc độ dòng

cho pha độngđêquá trìnli tách tốt hơn

Trong quá trình sắc kỹ các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng riêng

Định lượng và xác định tạp chất

Trong sắc ký chất muốn phân tích được táchriêngra khỏi hỗn hợp vàđược định

lượng dựa vào chiều cao hay diện tích pic so với chất chuân Một số phương pháp

Phương pháp chuân ngoại: Cả hai mẫu thừ và chuân đều được tiến hànhsắc

ký trong cùngmộtđiều kiện Sau đó so sánh tiực tạrc tiếp chiều caohay diệntíchpic

từ đường chuân tuyến tính Công thức tính theo cách chuân hoá 1 diêm:

„ C s

cx = sx -^

Trong đó: Cs, Cx là nồngđộ mẫu chuẩnvà mẫu thử

Ss, Sx là diện tíchpic mẫu chuânvà mâu thừ

Phương pháp chuãn nội: là phương pháp cho thêm nil ừng lượng giống nhaucùa chất chuân thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mâuthử vào cả mẫu

chuân và mâu thử ròi tiên hành săc ký Chât chuân thứ hai gọi là chuânnội

Phương pháp thêm chuân: Dùngtrong HPLC khi có ảnhhường cùa chat hấp

chuân

Phương pháp chuân hóa diện tích pic:

thảnhphần [25]

1.4.3 Thâm định phương pháp phân tích

Thâm địnhphương pháp phân tích nhầm chứng minh quy trình đó có phù hợp

quan trọng, can thiết trong nghiên cứu phát triênthuốc mới, là dữ liệu bắt buộc phải

có kill lập hồ sơ đăng ký thuốc, là bước khởi đầu cho các nghiên cứu liên quan tới

nong độ thuốc trongcơthê như dược độnghọc, sinhkhã dụng, tương đương sinh học

của thuốc

Thâm định quy trình phân tích liên quan đến 3 loại quy trình sau đây:

Địnli tínli

Địnli lượng

được đánli giá kliácnhau [20]

Bàng 1.3: Các chi tiêu thâm định phươngpháp phàn tíchthuốc dạng nguyên liệu và

Dấu+ nhằm chi các chi tiêu này cầnphải đánh giá

không cần phảixem xét

(2)một quy trìnliphântích kém đặc hiệu cóthêđược bô trợ bang một hay nliiều

(3)có thê cần trongmột số trường hợp

chính xác, khoãng xác định, tính tương thíchhệ thống Nội dung thâmđịnh:

1.4.3.1 Tính tương thích hệ thong

đánli giá tính thích hợp cùa toàn hệ thống phân tích đirợc cấu thànli bời các yếu tố

biệt phụ thuộc vào loại quy trình được thâm định Các thông số này đặc biệt quan

Đánh giá kết quả: Thực hiện tiêmlặp lại 6 lần chất chuân, tính RSD (%).RSD cùa diện tích pic giữa 6 lần tiêm lặp lại kliông lớn hơn 2,0 %

Hệ số đối xứng củapic phải từ 0,8 đen 1,5 [28]

1.4.3.2 Độ đặc hiệu

mầu chuẩn,mẫu thừ

Đánh giá kết quả: Chuẩn bị mầu trắng (dung môi pha động), dung dịch mâu

Thời gian hm cùapic febuxostat trên sắc kýđồ cùa dung dịch thừ tương đương

febuxostat

Sắc kýđồ cũa dung dịch thừ thêm chuẩn cho pic có thời gian lưu tươngđương với pic febuxostat trên sắc ký đo của dung dịch chuân và diện tích tăng so với khi

chưa thêm [28].

I.4.3.3 Tính tuyến tính và khoảng nồng độ

Là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ đã biết (x)của chấtphân tích trong một khoảng nồng độ xác định Tính tuyến tính được biêu thị bang phươngtrìnhhồi quy: ỷ =ax + b và hệ sốtương quan tuyến tính R2 Đường hồi

<1

Đánh giá kết quả: Thực hiện trực tiếp trên mâu chuẩn bằng cách pha loãng

đối với thâm định phương pháp địnli lượng) cùa nồngđộ thừ

Phương pháp thêm chuân vào chế phâm: Trongtrường hợp khôngcó đầy đủ

che phẩm

Đánh giá kết quà:

Đối với quy trình định lượng: Tỷ lệthuhồi 98 - 102%ờ mỗi mức nồng độ, RSD

1.4.3.5 Độ chính xác

Là mức độ chụm giữacác kết quà riêng biệt khi lặp lại qui trinh phân tíchnhiêu

lần trên cùng một mẫu thù đồng nhất, được biêu thị bằng giá trị độ lệchchuẩn tương

đối RSD (%) Độ chínilxác có 3 mức:

Độ lặp lại: là độ chụm của kết quả khi lặp lại qui trìnhphân tích nhiều lần bời

Độ chính xác trung gian: Là độ chụm của kết quâ khi lặp lại qui trình phân

trìnhphân tích Đó là ngày phân tích, kiêmnghiệmviên, thiết bị

Độ tái lặp: Độ tái lặp đượcxác định bằng cáchso sánh kết quả giữacác phòng

1.4.4 Một số phương pháp định tính, định lượng Febuxostat

Định lượng Febuxostat bang HPLC

Năm 2019 Kamel và cộng sự côngbố nghiên cứu định lượng Febuxostat trong

nội (axit 2-naphthoic) Chất nôi phía trên được phân tích ờ bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt là 320và 380 nm Cột Luna C18 (Phenomenex, úc) ờ 40 °C với pha

độnglàaxit axetic băng (0,032%) trong acetonitril:nước (60:40, v:v), thêtích tiêm 10

Năm 2020 D Han và cộng sự đã nghiên cứu định hrợng đồng thời Febuxostat

và diclofenac trong mầu huyết thanh chuột bằng phương pháp hplc đầu dò huỳnh

quang Hệ thống Shimadzu HPLC-FL (Shimadzu Co, Kyoto, Nhật Bản) được trang

bị máy bơm (LC-20AT), bộ lấy mẫuhr động (SIL-20AC),lò cột (CTO-20A) và máy

Phenomenex, Torrance, CA, USA) được sử dụng đê phân tách sắc kỷ ờ 40 °C Pha

động nhị phânbao gồmdung dịch đệmkali phosphat(pH 6,6; 10mM) và acetonitril

và tông thời gian chạy lần lượt là 20 pL và20 phút Bước sóng kíchthích và phát xạ

huỳnhquang đốivới FEBđược đặt là 320 nm và380 nm, cácbước sóng đối với DIC

Năm 2021 Magdy và cộng sự công bố nghiên cứu định lượng đồng thời

tương người Việc phân tách sac ký được thực hiện bằng phương pháp lira giải đăng dòng trên cột Hypersil BDS C18 ờ 40 °C Pha động bao gồm acetonitril: đệm kali

pL đirợc sừdụng Thời gian phân tích<10 phút [4]

montelukast và febuxostat bang phương pháp hplc đầu dò huỳnh quang trong mẫu

giãi dòngcấp thànhphần của pha động (acetonitrilmước, 60:40, v:v, axit axetic băng

0,032 %)trẽn cộtc18 Tốc độ dòng thay đôi trong quá trình phân tích, đặc biệt từ 0,5

và địnhlượng các chất phân tích được thực hiện bằng máy dò huỳnh quang ờ bước sóng hấp thụ 320 nmvà 350 nm và ờ bước sóngphát xạ lần lượt là 380 nm và 400

nm tirơng ứngvớiFebuxostat và Montelukast [5]

Định lượng Febuxostat trong chế phâm viên nén bằng phương pháp đo

quang

Năm 2017 M Kaur cùng cộng sự công bố bài nghiên cứu xây dựng và thâm

định độ ôn định mới cho thấy phươngphápđoquang phô uv đê định lượngfebuxostat

dung dịch đệm Phosphat pH 6.8, siêu âmrồi đem đo quang, dung dịchđem đo quang

(Ân Độ) Xây dựng đồ thị biêudiễn sự phụ thuộc tuyến tínli giữa nồngđộ và độ hấpthu của Febuxostat trong dãy nồng độ 1 - 10 pg/ml Căn cứ vào đồ thị và độhấp thu

MS/MS

Điều kiên sắc ký: Cột Hypersil Gold-C18 (2,1 mm X 100 mm, 1,9 pm)

(acetonitril chứa 0,1% acid formic) Với chirơng trinhchạynhưsau: 0-0,5 phút(10%

Thê tích tiêm: 10 pL

Nhiệt độ cột: 40 °C

Điều kiện khối phô: Khí rèm và khí va chạm được đặt riêng ờmức 20 L/phút

và -4500 eV Khí nguồn ion 1 và Khínguồn ion 2 được đặt riêng ờ mức 50 L/phút

ờ m/z 315,3 —► m/z 271,3 đối với Febuxostat và m/z 324,3 —> m/z 280,3 đổi với IS

(Febuxostat-dg), trong giao diện ESI ion âmtương ứng [7],

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG ĐÈ ÁN

2.1 Dung môi hóa chất, trang thiết bị nghiên cứu

ương cung cấp CKS: C0219328.02

Mầu thữ: Viên nén Febuxogoutchíra 80mg Febuxostat, nhà sản xuất Công Ty

Methanol hãng Fisher

Mâu placebo(thànhphần công thức cho 1 viên nén bao phim Febuxostat 80 mg)

6 Colloidal silicondioxide

11 Màu vàng tartrazin lake

Máy quang phổ Shimadzu 1800 UV-Vis.

Cân phân tích AND GR 202 Japan

2.2 Nhiệm vụ và phương pháp thực hiện

2.2.1 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng Febuxostat trong chế phâm

viên nén bang sac ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PDA (HPLCPDA)

Lựa chọn điều kiện sac ký: Bướcsóng phát hiện, thành phần và ti lệphađộng,

Xây dựng quy trình định tính, định lượng Febuxostat trong chế phàm viên nén bang phương pháp sac ký lỏng hiệu năng cao đầu dò PDA (HPLCPDA):

Sau khi đã chọn được điều kiện sac ký tiếnhành xây dựngquy trình định tính,

Pha dung dịch thử và dung dịch chuẩn sao cho cùng nồng độ, sau đó tiếnhànhsac ký dung dịch chuânvà dungdịchthừ ghi nhận sac ký đồ

Định tính: Thời gian hru của chất thừ trên sắc ký đồ phải tương ứng với thời

gian hru cùa chất chuân đối chiếu trênsắc ký đồ

Định lượng: Hàm lượng Febuxostat so với lượng ghi trên nhãn được tinh theo

Trong đó:

H%: Hàm lượng phan trăm Febuxostat sovới lượng ghi trên nhãn

HLt: Hàmlượng chất thừ đo được

Cc: Nông độ chât chuân

st: Diện tíchpic chấtthừ

Đối với phươngpháp định tính, địnhlượngFebuxostattrongchếphàmviênnén

dược bằng sắc ký lòng hiệu năng cao đầu dò PDA (HPLCPDA) cần thâm định với các tiêu chí sau: độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, tínhtương thích

Tiến hành: Pha dung dịch chuân theo phương pháp đã xây dựng.Tiêm 6 lần

thời gianlưu, diện tích và hệ sổ bất đối củapic tạo bời Febuxostat

2.2.2.2 Độ đặc hiệu

Mục đích: Chứng minh sựcó mặt của chất kliác haydung môi pha động kliông

ảnh hường đến việc địnhtính, địnli lượng Febuxostat

Tiến hành:

Mầuplacebo: Cânmâu placebo tương ứng hàm lượngtádược so với kliối lượng

đãxây dựng

Yêu cầu:

với dung dịch chuẩn(RSD < 2 %)

Febuxostat

Sắc ký đồ cũa dung dịch thừ thêm chuẩn cho pic có thời gian lưu tương đương

với pic Febuxostat trên sắc ký đồ của dung dịch chuân và diện tích tăng so với khi

khoảng 60 % - 140 %nồngđộ định lượng trong phương pháp đã xây dựng Tiếnhành

Yêu cầu: Hệ số tương quan hồi quy R > 0,999

2.2.2.4 Độ chính xác

Nguyên tắc: Độ chính xác bao gồmđộ lặp lại và độchính xác trunggian trong

nghiệm viênkhác nhau tiến hành phân tích trên 2 hệ thốngHPLC kliác nhau, vào 2

quả: thời gian hm, diện tích và hệ sổ bấtđối cùapic tạo bờiFebuxostat

Dùngphần mem excel phântích thống kêtheo phương pháp t-test, phương phápđạt độ chính xác kill và chi kill

F-test: p > 0,05

t-test: p > 0,05

2.2.2.5 Độ đúng

Thực hiện phương pháp thêm chuân vào mẫu placebo đê được các mẫu thừ tự

hành sắc ký theophươngpháp mô tả , ghi nhận sắc ký đồ, tính ti lệ phục hồi,RSD %

Tiến hành:

Mức nồng độ 80 %: Cân khoảng 229,3 mg placebo và 32 mg Febuxostat vào

siêu âm 10 phút Đê nguội tiếp tục thêm methanol vừa đủ đen vạch và lắc đều Lọc

Mức nồng độ 100 %: Cânkhoảng 229,3 mg placebo và 40 mgFebuxostat vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 mlmethanol, sau đó lắc đêhoà tan bang máy

siêu âm 10 phút Đẽ nguội tiếp tục thêm methanol vìra đủ đến vạch và lắc đều Lọc

bò 10 ml dịch lọc đầu sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này cho vào bình định

mức 50ml, thêmpha động vìra đủ đến vạch, lắc đều Lọc dung dịch mẫu đã pha được

Mức nồng độ 120 %: Cânkhoảng 229,3 mgplacebo và 48 mg Febuxostat vào

bình định mức 100 ml, thêmkhoảng 70 mlmethanol, sau đó lac đêhoà tan bang máy siêu âm 10 phút Đê nguội tiếp tục thêm methanol vừa đù đen vạch và lắc đều Lọc

bò 10 ml dịch lọc đầu sau đó hút chính xác 5,0 ml dịch lọc này cho vào bình định

Yêu cầu:

2.2.2.6 Khoảng xác định

Sau khi đã xác định độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, độ đặc hiệu thì khoảng

2.2.3 ứng dụng phương pháp đã xây dựng đế định tính, định lượng Febuxostat

trong một so che phàm viên nén dược lưu hành trên thị trường

80đê xác định hàm lượng Febuxostattrong mỗi sảnphẩm này

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ THựC HIỆN ĐÈ ÁN

3.1 Ket quả xây dựng phương pháp định tính, định lượng Febuxostat trong chế

Qua nghiêncứu tính chất hóa lý cũa Febuxostat, kết hợp với các tài liệu tham khảo vàđiềukiện sẵncó của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiêu sắc ký HPLC

sóng phát hiện, lựa chọn pha động, tốc độ dòng, lựachọn thê tích tiêm, nhiệtđộ cột

3.1.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Triển khai mẫu chuân Febuxostattrên hệ thốngHPLC trang bị đầu dò PDA với

dải bước sóng pháthiệnhr 200 - 400 nm Dựa vào phô sac ký (hình 3.1) chọn bước

làmbước sóng phát hiện

Hình 3.1: Phô sắc ký của Febuxostat

chu ân

Febuxostat

tính tốiưu nhất

3.1.2 Lựa chọn pha động

Trong phương pháp HPLC pha động hay dùng nhất là methanol, acetonitril,nước cùng với một hệ đệm hay hỗn hợp củachúng Các nghiên cứu trước đây đã dùng

rằng bản chấtphân cực như các pha động trên, so sánh giá tiền thấyrang methanol

tôi chọn dung môi; methanol và H3PO4, sau khi chọn pha động, tiến hànhpha dung dịch H3PO4 đê có pH phù hợp hơn với cột sắcký (pH ônđịnh là 2-8) và tiếnhành lựa

3.1.3 Lựa chọn tỷ lệ pha động

Điều kiện sắc ký khảo sát:

Lựa chọn thê tích tiêm mẫu: Khi thê tích tiêm không qui định trong chuyên

[30],

Lựa chọn nhiệt độ cột khảo sát: Phần lớn quá trình tách diên ra ở nliiệt độ

hoặc thay đôi thành phần pha động [30] Cùng với tham khảo các nghiên círu trướcđây chúng tôi chọn điềukiện sắc ký klião sát như sau:

Tiến hành: Mầu chuân: Cân chính xác khoảng 20 mg Febuxostat chuân vào

định mức đến vạch bang methanol Hút chính xác 5,0 ml dung dịch này cho vào bình

định mức 50 ml, thêm pha động vìra đủ đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45

pm Tiếnhành sắc ký

Ket quả:

Tý lệ MeOH:H3PO4 _Thờigian lưu _Hệ sô kéo đuôi

73:27

13,77511,425

1,131,11

PDA PDA

Hình3.7: sắc ký đồ pha động MeOH:H3PO4 (73:27)

Nhận xét: Dựatrênkết ờ bàng 3.1 hệdungmôi pha động MeOH:H3PO4 (80:20)

có thời gian lưu ngăn nhât (6,0591) và hệ sô kéo đuôi cao nhât (1,17), hệ dung mỏi MeOH:H3PO4 73:27 có hệ số kéo đuôi đẹp hon hai tỷ lệ dung môi còn lại, thời gian

Kết Luận: Chọn hệ dungmôimethanol:H3PO4 0,05% (73:27, v:v) làm hệ dung môipha động đê nghiên cứu

3.1.4 Lựa chọn tốc độ dòng

bâo việc phân tách tốt và địnli lượng Febuxostat đồng thời rút ngan được thời gian phân tích

Hình 3.8: Sắc ký đồ khảo sát tốc độ Hình 3.9: sắc ký đồ khảo sát tốcđộ

dòng 0,5 ml/phút dòng 1 ml/phút

Nhận xét: Theo kết quã phân tích băng 3.2 với tốc độ dòng 0,5 ml/phút thời

gian lưu khá dài klioảng 20 phút, với 1,5 ml/phút thời gian hni có ngắn hơn (6,945

1,0 ml/phút cho pic gọn, kliá cân đối (hệ số kéo đuôi 1,11), thời gian hru thích hợp

nhất (11,425 phút)

Ket luận: Chọn tốcđộ dòng là 1,0ml/phút đê tiến hànli sắc ký

3.1.5 Lựa chọn thê tích tiêm

Thể tích tiêmmầu Thờigian lưu Hệ số kéo đuôi Diện tíchpic

Hình 3.11: Sãc ký đô kêt quàthê tích tiêm

Ket luận: Chọn thê tíchtiêm20 pL tiến hành sắcký

3.1.6 Lựa chọn nhiệt độ cột

đôi 25 °C; 30 °C; 40 °C nham chọn được nhiệt độ cột thích hợp đâm bảo việc phân

Ket quả:

Nhiệt độ cột Thời gianlưu Hệ sô kéo đuôi Diệntích Pic