Xây dựng và thẩm Định quy trình Định lượng capecitabine trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

Bảng 1.1: Kehoạch thực hiện nội dung công việc chủ yếu cùa đềánXác định được các điều kiện sắc ký phù hợp nhưpha tĩnh,bước sóng phát hiện, thành phần và ti lệpha động, tốc độ dòng và thê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TẤT THÀNH

NGUYEN TA I THANH

ĐÈ ÁN THẠC Sĩ KIỂM NGHIỆM THƯÓC VÀ Độc CHẤT

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH - 2024

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TẤT THÀNH

NGUYEN TAT THANH

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUÓC VÀ ĐỘC CHÁT

ĐÈ ÁN THẠC Sĩ KIẺM NGHIỆM THƯỔC VÀ Độc CHẤT

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH - 2024

Đầu tiên tôixin gửi đến Quý Thầy/Cô khoa DượcvàViện Đào Tạo Sau Đại Họctrường đạihọcNguyềnTất Thành trong suốt 2 nămqua đã nhiệt tình giảng dạy kiến thứccũng nliư là kỹ năng, thái độ cho tôi vàcácbạn học viên.

Tôi xin gửi lời cảmơn chânthành đến TS Võ Hong Tiling - Trườngbộ môn

Hóa Sinh - Độc chất, trường Đại Học Nguyên Tất Thành đã trực tiếp giúp đờ và

hướng dần tận tình tôi hoànthành đề án Và các thầy cô thuộc bộ môn Hóa sinh

-Độc chấttrườngĐạihọcNguyễnTất Thành và viện đào tạo sau đại họcđã tạo điều

kiện giúp đờ tôi trong suốtthời gianhọc tập tạitrường

Bêncạnh đó tôixin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đen gia đình, đồng nghiệp đãluôn đồng hành, ùng hộ đê tôi có thê hoàn thành đề án này

Do kiến thức bàn thân cònhạn chế nên nội dung bài nghiên cứu klió tránhkhỏi những thiêu sót Tôi rât mongnhận được sựgóp ý, chi dạy thêm từ quý ThâyCô

Lời cuối cùng, tôi xin chúc tất cảQuý thay côthậtnhiềusức khoè

Tôi xin chân thành cảm ơn

Tôi Trương Thị Thu Thảoxin cam đoan nội dung để án này được ghi nhận, thực hiện một cách tiling thực Đe ánnày không có bất kỳ số liệu, văn bản, tài liệu đã được

TnrờngĐạihọc Nguyễn Tất Thành hay Trườngđại học kliác chấpnhậnđê cấp vănbằngđại học, sauđại học Đe ánnày không bao gồmcác giải pháp đã được thực hiện và báo

cáo tại bất kỳ cơ quan, đơnvị, địa phương nham giải quyết vấn đềtương ựr vớimục tiêu

đề án đề ra

Học viên

Trương Thị Thu Thào

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẢT iv

DANH MỤC BÀNG V DANH MỤC HÌNH vi

CHƯƠNG 1 GIỚITHIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề án 1

1.2 Mục tiêu của đề án 2

1.2.1 Mục tiêu chung 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Phạm vi cùa đeán 2

1.3.1 Đỏi ttrợng nghiên cứu 2

1.3.2 Địa điểm 2

1.3.3 Thời gian 2

1.4 Cơsờ lý thuyết cùa đề án 3

1.4.1 Nghiêncứu định lượng Capecitabine 6

1.5 Tông quan về phươngpháp sắc ký lòng hiệu năngcao (HPLC) 11

1.6 Tông quan vềthâm định quy trìnhphântích 12

1.6.1 Kiêm tratính phùhợp của hệthống 13

1.6.2 Độ đặc hiệu 13

1.6.3 Tính tuyến tính 14

1.6.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 14

1.6.5 Độ đúng 16

1.6.6 Độ chính xác 17

CHƯƠNG 2 NỘIDUNG ĐÈ ÁN 18

2.1 Dung môi hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Dung môi hóa chất 18

2.1.3 Trang thiếtbị dùng nghiên cứu 19

2.2 Nhiệm VỊ1 và giải pháp thực hiện 19

2.2.1 Xây dựngđiều kiện sac ký 19

2.2.2 Xây dựng quy trình xừ lýmẫu 21

2.2.3 Thâm địnhphươngpháp phân tích 22

2.2.4 Phân tích thống kê 26

CHƯƠNG 3 KÉTQUA VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích TI 3.1.1 Ket quả khảo sát điều kiện sắc ký 27

3.1.2 Ket quả khảo sát điều kiện xửlý mẫu 34

3.1.3 Các thôngsố sắc ký được chọn chođịnh lượng viên nén capecitabine 36

3.2 Thâm định phirơng pháp phân tích 36

3.2.1 Tính phùhợp cùa hệthống 36

3.2.2 Đánh giá độ đặc hiệu 37

3.2.3 Tính tuyến tính 39

3.2.4 Độ đúng 41

3.2.5 Độ chính xác 43

3.2.6 Giới hạn địnli hrợng và giới hạn phát hiện 45

3.3 Áp dụng phirơng pháp 45

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 47

4.1 Kết luận 47

5.1 Đe nghị 48

Tài liệu thamkhảo 49

DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẤT

TỪ VIẾT

High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

USP United States Phannacopoeia Dược điên Mỹ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Ke hoạchthực hiện nội dung công việc chù yếu củađề án 3

Bảng 1.2: So sánh quy trìnhđịnh lượng Capecitabine theo dược điên Anh, Mỹvà Châu Âu [19][20][21] 8

Bàng 1.3: So sánh các quy trình địnli lượng viên nén Capecitabine bang phương pháp sắc ký lòng 9

Bảng 3.4: Tông hợp các thông so sac ký khảo sátthànhphan và tỷ lệ dung môi 31

Bâng 3.5: Thông so sac ký kliảo sáttốc độ dòng 32

Bảng 3.6: Thông so sac ký khảo sátthê tích tiêm mẫu CAP 20pg/mL 34

Bảng 3.7: Thông số sắc ký khảo sát hệ dung môi hòa tan mầu CAP 20pg/mL 35

Bàng 3.8: Thông số sắc ký khảo sátthời gian siêu âmmẫu thừ CAP 20pg/mL 36

Bảng 3.9: Các thông số xácđịnh tính phù hợp của hệ thống 37

Bảng 3.10: Thông số sắc ký đánh giá độ đặc hiệu 39

Bảng 3.11: Ket quả xác địnhphương trình hồi quy vàhệ số tuyến tính 40

Bảng 3.12: Ket quà xác định độ đúng củaphương pháp 43

Bàng 3.13: Ket quả xác định độ lặp lại 44

Bảng 3.14: Ket quả thâm địnliđộ chínhxáctiling gian 45

Bảng 3.15: Ket quả định lượng mẫu thừ CAP nghiên cứu 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Capecitabine [3] 4

Hìnli 1.2: Cơ che chuyênhóa cùa Capecitabin [9] 5

Hình 1.3: cấu trúc cơ bản của hệ thống HPLC 11

Hình 2.4: Viên nén Xeloda 500mg 18

Hình 2.5: Chất chuân Capecitabine 18

Hình 3.6: Phồ hấp thu uv cùa dung dịch chuẩn CAP 27

Hìnli 3.7: sắc ký đồ hệ phađộng đệmphosphat: methanol : acetonitriltỷlệ (65:25:10) [12] 30

Hình 3.8: sắc ký đồ với hệ pha động acetonitril: đệm phosphat 0,0IM tỳ lệ (60:40) [18] .30

Hình 3.9: Sac ký đồ với hệ pha động methanol : mrớc acid tỳ lệ 50: 50 (a), tỳ lệ 40:60 (b), tỳ lệ 30: 70 (c) 30

Hình 3.10: sắc ký đồ hệ pha động methanol: mrớc tỳ lệ 65:35 (a), 60;40 (b), 55:45 (c),50:50 (d), 45:55 (e) 31

Hình3.11: số đĩa lý thuyết(N) theo thểtích tiêm mẫu CAP 20ug/mL 33

Hình3.12: Hệ sổ kéo đuôi (Tf)theo thể tíchtiêmmẫu CAP 20pg/mL 33

Hình3.13: Anh hường của thời gian siêu âm mẫu thử CAP 20pg/mL 35

Hình 3.14: sắc ký đồ mẫu trang 38

Hình3.15: sắc ký đồ mẫu thừ CAP 20 pg/mL 38

Hình3.16: sắc ký đồ mẫu chuẩn CAP 20 ug/mL 38

Hình3.17: sắc ký đồ mẫu thừ CAP 20 Lig/mL đãbị phânhủy trong môi trường acid 38

Hìnli 3.18: sắc ký đồ mẫu thử CAP 20 ug/mL đã bị phân hủy trong môi tnrờng kiểm.

39

Hình3.19: sắc ký đồ mẫu thừ CAP 20 pg/mL đãbị phânhủy bời tác nhân oxyhóa

39

Hình 3.20: sắc ký đo mầu thử CAP 20 ug/mL đã bị phânhủy bời nhiệtđộ 39

Hình3.21: sắc ký đồ mẫu thừ CAP 20 pg/mL đã bị phânhủy bời bứcxạ tìrngoại 39

Hình 3.22: sắc ký đồ của dung dịchmầu chuân CAP cónồng độ từ 5 đến 30 pg/mL.40 Hình 3.23: Tương quan giữa nồng độ và diện tíchpeakcủa Capecitabine 41

Hình3.24: sắc ký đồ mẫu thử thêmchuẩn 80% 42

Hình 3.25: sắc ký đồ mẫu thừ thêm chuẩn100% 42

Hình 3.26: sắc ký đồ mẫu thừ thêmchuẩn 120% 42

CHƯƠNG 1 GIỚI TIHỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề án

Ung thư tiếp tỊic là vấn đề toàn cầu Theo số liệu thống kê cũa GLOBOCAN nãm

2020, tỷ lệmắc và tử vong do ung thư trên toàn cầu đang gia tăng Ước tínhcó 182.563

ca mắc mới và 122.690 ca tữ vong do ung thư được báo cáotại ViệtNam Sau bệnh tim

mạch, ungthir đượcxếp hạng là nguyên nhân gây tử vong phô biếnthứ hai

Ngoài ra thuốc điều trị ung thrr là các thuốc gây độc te bào và có giới hạn trị liệu

hẹp Do đó việc kiêm soát liều lượng của thuốc làhết sức canthiết

Hiện nay, trẽnthế giới đã có công bố về phương phápđịnhlượng Capecitabine trong

chế phẩm viên nén bằng phương pháp RP-HPLCvới các điều kiện kliác nhau đồngthờidược điên của Mỹ, Anh vàChâu Âu cũng ban hành các quy trìnhhướng dẫn định lượng

Capecitabine nliưng vẫn chưa có chuyên luận riêng cho hoạt chất này Dược điên Việt Nam V chưa có quy trình hướng dầnđịnlilượng hay chuyên luận riêngcho Capecitabine

và ờ nước ta cũngchưa có bấtkìnghiên cứu nào về hoạt chất này được thực hiện

Trong khi đó Capecitabine là một trong những thuốc điều trị ung thư dùng đường

uống ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các phác đồ điều trị ung thư đơn thành phan hoặc phốihợpvới các thuốc khác

Chínhvi nhữnglí do trên, tôi đã lựa chọn thựchiện đe tài “Xây dựng và thâm định

quy trình định lượng Capecitabine trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC)” nhăm tìmra một quy trìnhđịnh lượng nhanh chóng, đơn giản, chínhxácvà phù hợp với điều kiệnphòng thí nghiệm cùa Khoa Dược- trường Đạihọc Nguyễn

Tất Thành cũngnhưcác phòng thí nghiệmvàkiêm nghiệm hóa lý khác

- Xây dựng điều kiện sắc ký đê phân tích hoạtchất Capecitabine trong viên nén.

- Xây dựng điều kiện xử lýmẫu viên nén chứahoạt chat Capecitabine

- Thâm địnhphương pháp phân tích đã xâydựng đạt yêu cầu theo hướng dẫn thông

hr số 32/2018/TT-BYT về quyđịnli việc đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làmthuốc

1.3 Phạm vi của đề án

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Sản phẩm viên nénchứahoạtchấtCapecitabine 500mg

Mầunghiên cứu: Viên nén Xeloda500mg chứa Capecitabine, dạngbào che viên nén

bao film do công ty Productos Roche S.A.de c.v, Mexico cung cấp

Chất đối chiếu: Capecitabine đượccung cấp bời Sigma Aldrich

1.3.2 Địa điểm

Đe án đượcthực hiện tại Khoa dược - Trường Đại HọcNguyền Tất Thành Địa chi

300a Nguyền Tất Thành Phường 13 Quận4 Tp Hồ Chí Minh

1.3.3 Thòi gian

Bảng 1.1: Kehoạch thực hiện nội dung công việc chủ yếu cùa đềán

Xác định được các điều kiện sắc ký

phù hợp nhưpha tĩnh,bước sóng phát hiện, thành phần và ti lệpha động, tốc

độ dòng và thê tíchtiêm mẫu đê phân

tích hoạt chất Capecitabine trong viên nén

phù hợp và đạt yêu cầu theo hướng

dẫn cùa thông tư số

32/2018/TT-BYT về quy định việc đăng ký hruhành thuốc, nguyên liệulàm thuốc

1/7/2024 đến 19/7/2024

4 Phân tích số

liệu, báo cáo

tông kêt

Hoàn thành báo cáo tôngkết 20/7/2024 đến 5/8/2024

1.4 Cơ sở lý thuyết của đề án

1.4.1 Capecitabine

Tên khoa học: Pentyl 0X0-1H-pyrimidin-4-yl]aminomethanoate

[l-(3,4-dihydroxy-5-methyltetrahydrofuran-2-yl)-5-fluoro-2-Công thức phân tử: C15H22FN3O6

Khối lượng phân hr: 359.35 g/mol

Độtan: Tương đối ít tan trong nước (26mg/mL ờ 20°C) [3].

Côngthức cấu tạo:

o

Hình 1.1: Côngthức cấu tạo của Capecitabine [3]

Capecitabine (CAP) là một carbamate fluoropyrimidine có hoạt tính chốngung thư

và thuộc nhóm thuốc chống chuyên hóa Nó là một tác nhân hóa trị liệu dùng đường

uống được sửdụng phô biến nhất trong điều trị các kliối u ran, chủ yếu là các kliối u ờ

đườngtiêu hóa, đầu, cổ, vú và đặc biệtlà ung thư đạitrựctràng di căn [4],

Sảnphâm chuyên hóa cùa Capecitabine là 5- Fluorouracil (5-FU) là mộtchất được

sửdụng rộng rãitrong điềutrị nhiều loại ung thư như ungthư vú, đại trực tràng, dạ dày, tuyến tụy, gan và não Tuy nhiên với thời gian bán hủy ngắn, độc tính tế bào cao và sinh khả dụng thấp [5] Capecitabineđirợc thiết kế đặc biệt đê khắc phục nliững nliược diêm

của 5-FU có thê được vận chuyên nguyên vẹn qua niêm mạc ruột nên nó có thê được

vận chuyên có chọn lọc 5-FU đến các mô kliối u thông qua chuyên hóa enzyme, mi tiênbên trong tế bào khối u Do đó, Capecitabine là một tiền chất dùng đường uống giúp

giảm độc tính toàn thân cùa thuốc [6]

Dược lực học: Cho đến khi được chuyên đôi thành 5-FU bời các enzyme có trong

mô khối u ờnồngđộ caohơn so với các môxung quanh hoặc huyết tương, capecitabinehầu như không có tác dụng dược lý [7]

Dược động học: Hệ thống tiêu hóa được thiết kế đê hấp thụ capecitabine dễ dàng.Nồng độ đinli 5-FU đạt được sau hai giờ, trong khi nồng độ đinh huyết tương củacapecitabine đạt được sau klioàng 1,5 giờ [8] Khối u, niêm mạc một, huyết tươngvàgan là một trongnhữngmô mà capecitabinehoặc chất chuyên hóa cũa nó được tìm thấy

và xử lý Capecitabme và chất chuyên hóa của nó chù yếu được đào thải qua nước tiêu

và có thời gian bán thãi là 45 đen 60 phút [7], Capecitabine được thủy phân thành uorocytidine (5'-DFCR) bời carboxylesteraesờgan, sauđóđược chuyênthành5'-deoxy-

5-fluorouridine (5'-DFUR) bời cytidine (Cyd) deaminase trong gan và mô khối u, cuối cùng được thủy phân thành hoạt chat 5-FU bời thymidine phosphorylase (TP) trong khối

u Tại đây 5-fluorouracilức chế quá trìnli sinh tông hợp DNA và ngăn chặn quá trìnhtăng sinh cùa kliối u [9],

Hình 1.2: Cơchế chuyênhóa của Capecitabine [9]

Capecitabine do Roche phát triên và được Cục Quàn lý Thực phâm và Dược phàm Hoa Kỳ (FDA) phê duyệt lan đau tiên vào tháng 9 năm 1998 đê điều trị ung thư vú và

ung thir đại trực tràng di căn và năm 2010 viên nén của Capecitabine là Xeloda® được

đira ra thị hường [10]

Mộtsố sảnphâm trên thị trường có chứahoạt chất Capecitabine:

- Viên nén bao film Naprocap-500 do Miracalus sân xuất

- Viên nén bao film Pecabine 500mg do Laboratorios Normon sản xuất

- Viên nén bao filmXelocapec 500mg do Shine Pharma sảnxuất

- Viên nén bao film Capetex 500mg do Excel Charis sàn xuất

1.4.2 Nghiên cứu định lượng Capecitabine

a Tình hình nghiên cứu trongnước

Cho đến nay chưa có nghiên cứu liên quan đến định lượng Capecitabine bằngphươngpháp sacký lòng hiệu năng cao (HPLC) được công bố ờtrong nước

b Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Hiện nay, cónhiêu phương pháp đê định lượng Capecitabinetrongchếphàm nhưsắc

kýlòng(LC), quang phô hap thu tìĩ ngoạikhả kiến(UV-Vis), chuẩn độ điện thế, sắc ký

lớp mòng hiệu năng cao (HPTLC) Tuy nhiên, theo hướng dẫn của dược điên Anh, Mỹ

và Châu Âu cùng hầu hết các nghiên cứu của các nhà khoa học trước đó đều sừ dụng phương pháp sắc ký lòng hiệu năng cao đê tiến hành định lượng Capecitabine Cụ thê

Bhatia và cộng sự (2017) đã định lượng được Capecitabine trong viên nén bằng

phương pháp RP-HPLC Pha tĩnh là cột Inertsil ODS C18 (250 X 4,6 nm X 5 pm),pha

động0,1% acid acetic, metanol, acetonitril (35:60:5), rửa giải đăngdòng, phát hiện bằng

đầu dò uv bước sóng 304 nm, khoảng tuyến tính 50-150 pg/mL [11]

Radha và cộng sự (2017) cùa mình cũng sữ dụng phương pháp RP-HPLC đê định

lượng Capecitabinenhưng với cột Altiman C18 với kích thước ngắn hơn 150 X 4,6 nm

X 5 pm, lira giãi đăng dòng bằng hệ dung môi acetonitril, methanol, đệm phosphat pH

4,6 (10:25:65), đau dò uv bước sóng 234 nm và klioàng tuyếntínhđược thiết lậptrong

khoảng 25-125 pg/mL [12]

Vijayavà cộng sự (2018) đãphát triên đồng thời phương pháp uv và RP-HPLC đê định lượng Capecitabine một cách đơn giản, chọn lọc, nhanh chóng và chính xác số

lượng lớn Capecitabine trong chephàm Sừ dụng cộtEclipse C18 (250 X 4,6 nm X 5 pm)

lảm pha tĩnh, hệ dung môi acetonitril, acid orthophosplưic 0,1% (50:50) làm phađộng,

chương trình đăng dòng, phát hiện bằng đầu dò uv bước sóng 242 nm Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượnglần lượt là 0,312 và 0,021 pg/mL [13]

Patel và cộng sự (2019)đã công bổ quy trình định lượng Capecitabinebằng phương

pháp RP-HPLC với các điều kiện nhưsau: Phatĩnh là cột Hypersil BDS C18 (250 X 4,6

nm X pm), pha động gom nước, methanol, acetonitril (40:10:50), rửa giài đăng dòng

và phát hiệnbang đầu dò uv bước sóng 270 nm, khoảng tuyến tính cùa Capecitabineđược thiết lậptrong khoảng 50-150 pg/mL [14]

Pal và cộng sự (2020) đã xây dựng phương pháp định lượng Capecitabine bang phương pháp RP-HPLC với việc sử dụng cột Waters ODS C18 (250 X 4,6 nm X 5 pm),

lira giải đăng dòng bằng pha động đệm phosphat, acetonitril (45:65),pH được duy trì ờ

5,2 Capecitabine được phát hiện bằng đầu dò uv ờ bước sóng 243 nm trong khoảng

nong độ tìr 0-35 pg/mL [15]

Tirumalasetty và cộng sự (2021) đã sừ dụng phương pháp RP-HPLC với cột Inertsil

ODS C18 (250 X 4,6 nm X 5 gm), lira giải đăng dòng vớihệ dung môiacetonitril, nước

(50:50), sử dụng đầu dò PDA, bước sóng 220 nm đêđịnh lượng Capecitabine [16]

Katare và cộng sự (2022) đã phát triên phương pháp RP-HPLC đê định lượng

Capecitabine trong viên nén với các điều kiện sắc kỷ nliư sau: cột C18 (150 X 4,6 nm X3,5 pm), pha động gồm acid hexan sulfonic 0,25%, acetonitril (40:60), lira giải đăng dòng, pháthiệnCapecitabine ờ bước sóng 232 nm bang đầu dò uv trong khoảng nồng

độ tìr 50-750 pg/mL[17]

Gần đây nhất, Sagar và cộng sự (2023) đã đưaraquy trìnli định lượng Capecitabine

bang sac ký lỏng với cácđiều kiện sắc ký đãđược tối ưu hóa bang thiết ke Box-Behnken.Ket quả sựphân tách đạtđược trêncộtC18 (250 X 4,6nm X 5 pm) với chương trình rửagiải đăng dòng bang pha động gồm acetonitril, đệm phosphat 0,01M (60:40), pH 3,11, phát hiện bangđầu dò PDA ở bướng sóng 310 nm, khoảngnồng độ 2-64 pg/mL [18].Bâng 1.2: Sosánh quy trình định lượng Capecitabine theo dược điênAnh, Mỹ và Châu

Bàng 1.3: So sánhcác quy trình định lượng viên nén Capecitabine bằng phương pháp sắc kýlòng

Khoa

"8 tuyến tính (pg/

mL)

LOD (pg/

mL)

LOQ (Mg/ mL) Kích thước

Nhiệt dọ

(°C)

Tốc độ dòng (II1L/

phút)

Bước sóng phát hiện

Thề tích tiêm mẫu

(pL)

Thời gian sắc ký (Phút)

Bhatia MS và

cộng sự

(2017) [11]

Inertsil ODS CIS, 250 X

4,6 nm, 5 pin 40

0,1% acid

aqcetic, metanol, acetonitril

Nước, methanol,

acetonitril (40:10:50)

1 UV270

nm 20 8

Đẳng

dòng 50-150 0,523 0,527Pal N và cs

(2020)[15]

Symmetry C18, 250 x 4,6 nm, 5 pm

Nhiệt độ phòng

N và cs

(2021) [16]

Inertsil ODS

C18, 250x 4,6 nm 5 pm

Katare và cs

(2022)[17]

C18, 150x 4,6 nm, 3,5

pm

Acid hexan

sulfonic 0,25%, acetonitril

(40:60)

1 UV232

mn 10 8 2,5 Đẳng

dòng 50-750 0,4 2,9

Panda Sagar

s và cs

(2023)[18]

C18, 250 X 4,6 nm 5 (.1111

Acetonitril, đệm phosphat 0,0IM

(18: 80:2)

1,1 UV230 nm 10

Đẳng

dòng 20-120 0,6 2,0Sreevatsav và

cộng sự

(2015)[23]

Hypersil BDSC8, 250

X 5 run 5 pm

Đệm phosphat, acetonitril

(80:20)

1,2 uvnm240 20 15 4,0 Đẳng

dòng Pallavi K và

cộng sự

(2016)[24]

Eclipse XDB Cl8, 250 X 4,6 run, 5

pm, 2-100

Metanol, acetonitril nước (30: 30: 40) 1 UV304

(2020) [26]

Quails BDS

C18, 250 X 4,6 nun 5pm

Đệm phosphat, acetonitril

(50:50)

1 uv 245

nm 20 5,0 Đẳng

dòng 60-120

1.5 Tông quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [1]

Phương pháp sắc ký lòng hiệu năng cao (HPLC - High Performance LiquidChromatography) là một kỹ thuật phân tích hóa học được sử dụngđê tách, nhận diệnvàđịnli lượng các hợp chất trong một mẫu lóng Đây là một côngcụ quan trọng trong hóa

phân tích, dược phâm, hóa sinh, và nhiều lĩnlivực kliác

a Nguyên lý hoạt động

Chia mẫu: Mầu lòng được đưa vào hệ thống HPLC và đi qua một cột sắc ký chứapha tĩnh (stationary phase) Pha tĩnhthường là một chất rắn hoặc gel phũ lên một chất

mang (vídụ, silica hoặc polymer)

Tách hợp chat: Klii mầu đi qua cột, cáchợp chất trong mẫu tươngtác khácnhauvới phatĩnli, dẫn đến việc táchbiệt cáchợp chat ra khỏi nhau Các hợp chatcó thê tươngtác

với phatĩnh khác nhau về mặt lực lượng hấp phụ hoặc phân cực

Phát hiện: Các hợp chất tách ra từ cột được phát hiện bang các phương pháp nlnr

quang phô UV-Vis, phát quang, hoặc đo dẫn điện Dữ liệu thu được từthiết bị phát hiện

sẽ được chuyênđôi thànhđồ thị hoặc biêu đồ, cho thấy thời gianhru (retention time) và

diện tíchpeak cùacác hợp chất

b Cấu trúc cơ bản của hệ thống HPLC

Hình 1.3: cấu trác cơ bân của hệ thống HPLC

Bơm: Đưa dung môi (pha động) và mầu vào hệ thống với áp suất cao.

Cột sắc ký: Nơi diễnra quá trìnhtách các hợp chất Cột chứa pha tĩnh và có nhiều

loại khác nhau tùy theo mục đíchphân tích

Bộphận tiêm mẫu: Nơi mẫu được đưa vào dòng pha di động

Bộ phân pháthiện: Đo và ghi lại các hợp chat kill chúng đi qua hệ thống Có nhiều loại detektor khác nhau, bao gồm UV-Vis, Fluorescence, và RefractiveIndex

Máytứili và phan mềm: Xử lý dữliệu thu được

1.6 Tông quan vê thâm định quy trình phân tích

Quá trình thử nghiệmxác địnhcác đặc diêm hiệu suất của phương pháp đê chứng minh rang kỹ thuật đáp ứng các yêu cầu phân tích mong muốn được gọi là thâm địnhtrìnhphân tích Xác nhận quy trinhphân tích đê đảm bảo tínhphù hợp của quy trình và

độ chínhxác củakết quả phântích [2]

Tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp kiêm nghiệm cùa dược chất được thực

hiệntheo DĐVN hay nhóm Dược điểntham chiếunhư: BP, USP, JP, IP (DĐQT), EP

Neu áp dụng theo các nhóm Dược điên này cần nêu rõ: Phương pháp nào/ Phụ lục nào/Dược điên nào/ Năm xuất bànhoặc lần xuấtbản

Đối với quy trình chưa có trong các Dược điên tham chiếu Theo hướng dần cùa thông tư số 32/2018/TT-BYT về việc quy địnhviệc đăng ký lưu hành thuốc và nguyên

liệu làm thuốc Thâm định quy trình định lượngvới HPLC cần kiêm tra, đánh giá các

chi tiêu sau:

1 Kiêm tra tính phù hợp của hệ thống

1.6.1 Kiêm tra tính phù họp của hệ thống

Kiêm tra tính phù hợp cùa một hệthống là mộtbiĩớc quantrọng trong nhiều quytrình phân tích Kiêmtra tính phù hợp của hệ thống bao gom việc xác định xem toàn bộ

hệ thốngphân tích, bao gồm các thành phần như công cụ, quy trinh phân tích và mẫu

thừ, có phù họphay không

Tiến hành sắc ký bằng cách tiêm sáu mẫu chuân vào thiết bị HPLC Khi các giá

trịRSD (%) của thời gian lira,diệntíchđinh, hệ số bất đối xứng đỉnh và số đĩa lýthuyếtđều nhò hơn 2,0%, hệ thống HPLC hoạt động ôn địnli và có khả năng lặp lạitốt

1.6.2 Độ đặc hiệu

Địnhlượng và thử tạp chất:

- Neu có tạp chat:

+ Địnhlượng: Thêm lượng tạp chất và/hoặc tá dược can thiết vào mẫu đầu tiên

cầnthử nghiệm Sau đó, so sánh kết quà xét nghiệm với mẫu không có bấtkỳtạp chất hoặc tá dược bô sung nào đê chứng minh rằng kết quâ xét nghiệm

không bị ảnh hườngbời sựhiện diện cùa chúng

+ Thử tạp chất: Đối vớinguyên liệu hoặc thành phẩm cuối cùng, thêm các chất theo tỷ lệ thích hợp và chứng minhrằng mỗi tạp chất được tách biệt khỏicác

tạp chat khác và/hoặc khỏi các thànhphantrong mẫu

- Neu không có tạp chấtnào có thê tiếp cận được:

+ Bangcách đốichiếu kết quả phântíchcủaphươngphápphân tích đã thiết lập

với kết quả phân tích của một phương pháp phân tích đã đượcxác nhận kliác,

chăng hạn như phươngpháp dược điênhoặc phương pháp phân tích đã được

xác nhận khác, trên các mẫu có chứa tạp chất hoặc sàn phâm phânhủy, người

tacóthêchứngminhtínhđặc hiệu Phân tích các mẫu được lira giữ trong điều kiện ứng suất thíchhợp, chăng hạn nhưánhsáng,nhiệtđộ, độâm và thủy phân

và oxy hóa axit/kiềm, nếu cần

+ Đê thê hiện tính đặc hiệu, cần cung cấp sắc ký đồ đại diện có chú thích cho

từng thành phanriênglẻ Nên sửdụng máy quang phô khối hoặc máy dòDAD

đê đánligiá độ tinh klúết của đinh Độ phân giải cùa hai thànli phần rừa giải

gần nhau nhất có thê được sử dụng đê thê hiện tính đặc hiệu, sắc ký đồ của

các mẫu thử, chuân và mầu trang Các thông số như số lượng đĩa lý thuyết, độphân giải và hệ số đối xứng đinh được sử dụng đê đánh giá tính phù hợpcùa

hệ thống sac ký

1.6.3 Tính tuyến tính

Việc phân tích mối tương quan tuyến tínhtrong phạm vi quy địnli Tức là phạm

vi nồng độ đảm bảo sựphụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích (x) và lượngđượcđo (y) là điều cầnthiết

Sừ dụng trựctiếp các mẫu chuân (bang cách pha loãng dung dịch chuân gốc) hoặccân các hỗn hợp đã pha sẵn cụ thê với các thành phần thuốc theo đúng quy trình quy định Thực hiện ít nhât năm nông độ Trong những tình huông khác, lý do biện minh phải được nêu rõ ràng Các phát hiện thừ nghiệm nên được đánh giá bằng các kỹ thuậtthống kê thích họp, chăng hạn như sử dụng phươngpháp bình phươngnhỏ nhất đẻ tínhtoán đường hồiquy dựa trênphươngtrình y = ax + b Hệ số tương quan (r) lý tường nliất nên nam trong khoảng từ 0,998 đến 1,002; nếukếtquả tìmđược namngoàiphạm vi này,

phải đưa ralời giải thích về việc chấp nhận kết quả đó

Sừ dụng "phân tích hồi quy", trắc nghiệm F đê xác định xem phương trình hồi

quy có phù họp haykhông và trắc nghiệm t đê xác định ỷ nghĩa cùa các hệ số trong

phtrơng trình hoi quy

1.6.4 Giói hạn phát hiện (LOD) và giói hạn định lượng (LOQ)

❖ Giới hạn phát hiện (LOD)

Nồng độ tối thiêu có thê có của một chat phân tích trong mẫu có thê xác định được

nhưng kliông phải lúc nào cũng đođược

Có thê xác định bằng một trong các phương pháp sau:

- Dựatrênquan sát: Nồng độ tối thiêucóthê đọc được phản ứng của chất phân tíchđược tim thấy bang cách phân tích mẫu có nồng độ chất phân tích đã biết (pha

loãng tuầntự) đê tính toán giới hạn pháthiện

- Dựa trêntỷ lệ phản ứng với nhiều: chiáp dụngcho các kỹ thuậtphântíchcó nhiêu

cơ bàn, nồng độ tối thiêu có thê phát hiện được cùa chất phân tích có thê được

xác định bang cách so sánh phản ứng (Signal-S) được đo trên mẫu có nồng độ

chất phân tíchthấp đã biết với phân ứngcùa mâu trắng (Noise-N) Người ta thừa nhận rằng nên sử dụng tỳ lệ phàn ứng với nhiêu S/N khoảng 3:1 đê xác định giới hạn phát hiện

- Xétđộ dốc và độ lệch chuân: Có thê sử dụng công thức sau đê có được giới hạn pháthiện:

s

Trong đó: ơlà độ lệch chuẩn của đáp ứng

s là độ dốc củađường chuân

s có thê được xác định dựa vào đườngchuân cùa chất phân tích

❖ Giói hạn định lượng (LOQ)

Lượng chấtphântích tối thiêu trong mẫu có thê định lượng chính xác và rõ ràng

Có thê xác định bằng một trong các phương pháp sau:

- Dựa trênquansát: Phân tích mâu có chứa nồng độ chất phântích đã biết cho phép

tính toán giới hạn định lượng hoặc nồng độ thấp nhất mà chất phân tích có thêđược đo với mức độ chính xác và độ tin cậy có thêchấp nhận được

- Dựa trêntỳlệ phản ứng với nhiều: Nồngđộ chất phân tích ít nhất có thê đo được

xác định bằng cách so sánh phản ứng cùa mẫu trắng (N) với phản ứng được đo

trênmầu thừ có nồng độ chấtphân tích thấp đã biết (S) Phương pháp này chi áp

dụng cho các quy trình phân tích có nhiễu đường cơ sờ Thôngthường, tỳ lệ S/N phản ứng với nhiễu là 10:1.

- Xét độdốc và độ lệch chuân: Một cáchđê tínli giới hạn định lượng như sau:

s

Trong đó: ơ là độ lệch chuân của đáp ứng

s là độ dốc cùa đườngchuân

s cóthê được xác địnli dựa vào đường chuân cùa chất phân tích

1.6.5 Độ đúng

Quy trình đề xuất được sử dụng trên cùng một mẫu thừ đong nliất trong cùng điều

kiện được xác định tnrớc, độ đúng của quy trìnliphân tích được xác định bời mức độkhớp giira các giá trị tìmđược với giá trị thực Điều quan trọnglà phải thiếtlập độ chínhxác trong phạm vi xác địnhcủa phương pháp phântích

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỳlệ thu hôivà RSD của tỳ lệ thu hồi

- Sừ dụng chất phântích có độ tinh khiết đãbiết

- So sánh kết quả củaphương pháp phân tích được đề xuất vớiphương pháp phântích có độ chứili xác đã được công bố

- Có thê suy ra nếu tính tuyến tính, tính đặc hiệu và độ chính xác đãđược xác định

Thành phẩm:

- Sừ dụngquy trìnhphân tích trên mẫuhr tạocó nồng độ đã biết

- Quy trình thêm chuân: Trongmầu thử có nồng độđã biết, thêm một lượngthànhphần đã biết, đàm bảo nồng độ đo được nằm trongphạmvi tuyến tính.

- Trong phạm vinồng độ được chi định của phương pháp phân tích, độ chính xác phải được tínli toán bang cách sử dụng tối thiêu phép thử trên ít nhất 3 mức

nồng độ riêngbiệt(ví dụ: 3 nồngđộ, mỗi nong độđược thực hiện theo bộ ba) Tỷ

lệ phục hồiphần trăm củachấtphân tích đã biết được thêm vào mẫu thừ hoặc sự

khác biệt giữa giá trị đo được trung binh và giá trị thực cùng với khoảng tin cậy

làhai cách đê mô tả độ chínhxác.Tiừkhiđược chiđịnh khác, tỷlệphục hồiphầntrăm sẽ nằm trongkhoảng tìĩ 98,0% đến 102,0%, vớiRSD nliỏ hơn 2%

- Kiêm tra và đối chiếu kết quả cùa phương pháp phân tích được đề xuất với quytrình phân tíchthông thường đã được côngbố

1.6.6 Độ chính xác

❖ Độ lặp lại.

Có thê được đánhgiá dựa trênkết quà của:

- Phải thực hiện tối thiêu chínlầnxác định trong phạmvinongđộ quy định của quy

trình (ví dụ: ba nồng độ, môinồngđộđược thực hiện ba lần)

- Cầnthực hiện tối thiêu thínghiệm sáu lan ờnồng độ thử nghiệm 100%

- Trừ khi có ghi chú khác, can có RSD ít nhấtlà 2%

❖ Độ chính xác trung gian:

Các điềukiện riêngbiệtcho từng quy trìnhphân tích được sừ dụng sẽ quyết định

độ chính xác tiling gian Ví dụ về các độ lệch phô biến cần lưu ý là (ngày phân tích,

người phân tích, thiết bị, V.V.) So sánh kết quà của các thử nghiệm được thực hiệntrong cùng một phòngthí nghiệmvào nliững ngày kliác nhau bằng cách sừdụngcác nhà phân tích và thiết bị khác nhau Các pháthiện được tạo ra không nên khácnhau

về mặt thống kê (một công cụ đánh giá có thê được sử dụng là thử nghiệm F với khoảng tin cậy 95%)

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG ĐÈ ÁN

2.1 Dung môi hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

- Sảnphâm viên nén chứa hoạt chấtCapecitabine 500 mg

- Mầunghiên cứu: Viên nén Xeloda 500mg chứa Capecitabine, dạng bào chế viên

nén bao film do công ty Productos Roche S.A.de c.v, Mexicocung cấp

- Chất chuân: Capecitabineđượccung cấp bời Sigma Aldrich

Hình 2.5: Chất chuẩn CapecitabineHình 2.4: Viên nénXeloda 500mg

2.1.2 Dung môi hóa chất

- Acetonitril, ethanol, methanol (dùng cho sắc ký cung cấp bời hãng Merck - Đírc)

và nuớc đạt tiêu chuân sừ dụng cho sắc ký tìr hệ thống lọc nuớc siêu sạch Pali (Mỹ)

- Các hóa chat khác đạt tiêuchuânphântích

- Chất chuân: Capecitabineđược cung cap bời Sigma Aldrich

2.1.3 Trang thiết bị dùng nghiên cứu

- Cân phân tích 105MSDU (Metier Toledo - Thụy Si)

- Hệ thống lọc dung môi Glassco (Ản dộ)

- Máysiêu âm SH 180 (Ehna -Đức)

- Hệthống lọcnuớc siêusạch Pali (Mỹ)

- Hệ thống sắc ký lòng SHIMADZU serial L214555; đầu dòPDA (Đức)

- Máy Quang phô tử ngoại -khả kiến (UV 1800- Shimadzu - Nhật)

2.2 Nhiệm vụ và giải pháp thực hiện

2.2.1 Xây dựng điều kiện sắc ký

Nguyêntắc củanghiên cứu là tiến hành cố định các thông sốkhác trong tô hợp các

yếu tố kliảo sát, tiến hành khảo sát đơn yếu tố

Chuân bị mẫu Capecetabine nồng độ 20 pg/mL

❖ Khảo sát bước sóng phát hiện

Mầuchuân Capecetabine nồngđộ 20 pg/mL, tiến hành sắc ký và ghi phô hap thu uv cùa Capecitabine trong vùng bước sóng 200 - 400 nm, xác địnhbước sóng hấp thu phù

hợp đê ghi nhận tín hiệu

❖ Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động

Tham kliảo cáchệ pha động đã được sử dụng:

- Đệmphosphat: methanol: acetonitril (65: 25: 10) [12]

- Acetoniltril: đệm phosphat 0,01 M (60: 40) [18]

- Methanol: nước acid (50: 50) [27]

Đánh giá các hệ số sắc ký, sau đó điều chinhtỳ lệ của từng hệ pha động

Đánh giá ảnh hường cùa dung môiđối với cácthông số sắc ký như hệso bấtđối xứng

và độ tinh kliiet của tín hiệu sắc ký cho capecitabine Tỳ lệ pha động phùhợp cần được

xác định sao cho đinh capecitabine đạtđược độtinli khiếtcao, phântách hoàn toàn khỏi

các đinh tạp (nếu có), số đĩa lý thuyết lớn hơn 3000, hệ số dung lượng K’ nằm trong khoảng từ 1 đen 5, và hệ số đối xứng nằm trong khoảng tìĩ 0,8 đến 1,5.

Ghi chép và phân tích kết quả, sánh các kết quà thu được ờ các tốc độ dòng khác

nhau Đánhgiá ảnh hường củatốc độ dòng đến các thông sổphântíchnhư thời gianhru,

độ phân giảivà diện tích peak Xác định tốc độ dòng tối tru dựa trên các thông số quantrọng (ví dụ: độ phân giãi cao, thời gian phân tích ngắn, V V.)

❖ Khảo sát thê tích tiêm mẫu

Đượckliảo sáttrên mầu Capecetabine có nồng độ 20 ug/mL với thê tích tiêm mầu từ

Tăng thê tíchtiêm lên20 pL: Lặp lại quá trình một lần nữavà ghi lại các thông số

Ghi chép và phân tíchkết quả, so sánh các kết quả thu được ờ các thê tích tiêmkhác

nhau Đánh giá ảnh hường cùa thê tích tiêm mẫu đến các thông số phân tích như thời

gian lưu, độphân giải, diện tích peak, và độ nhạy Xácđịnh thê tíchtiêm mầutối ưu dựa

trên các thông số quan trọng (vídụ: độ phângiải cao, độ nhạy tot,V.V.)

2.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

- Xác định được dung môi và thời gian chiết siêu âm trong viên nén chứa Capecitabine

- Phương pháp: Xử lý chiết táchhỗ trợbang sóng siêu âm Thay đôi loại dung môi

vàthời gian siêu âm

❖ Khảo sát lựa chọn dung môi

Dung môi cần khảo sát đó là ethanol 95%, methanol 100%, nước 100% và hệ phađộng đã được khảo sát

Cânmộtlượngbộtthuốc tương đương với 20 mg Capecitabine chuyênvào bình định mức 100 mL Thêm 50 mL dung môi cần khảo sát, siêu âm kliông gia nhiệt 20 phút Định mức đenvạch bang dung môi cần khảo sát, lọc và bò dịch lọc đầu, pha loãng đennôngđộ 20 pg/mL bang dụng môi cần khảo sát Dung dịch sau khipha loãng được lọcqua màng lọc PTFE/ Nilon kích thước lỗ lọc 0,45pm (Merck, Đức) thu được dung dịch

đê tiêmsắc ký

Đánh giá: Thông qua diện tíchpeak (S) và hệ số kéo đuôi (Tf) cùa Capecitabine

❖ Khảo sát thòi gian siêu âm

Chuân bị 7 mầu bang cách cân một lượng bộtthuốc tương với 20 mg Capecitabinechuyênvào bình định mức 100 mL Thêm 50 mL dung môi đã được lựa chọn

Tiến hành siêu âm các mẫu theo thứ ựĩtừ 0, 5, 10, 15, 20, 25 và 30phút (không gia

nhiệt) Định mức đến vạch bang dung môi đã được khảo sát, lọc và bò dịchlọc đầu Phaloãng đến nồngđộ 20 pg/mL bang dung môi cankhảo sát Dung dịch sau khi pha loãngđược lọc qua màng lọc PTFE/Nilon kích thước lô lọc 0,45pm (Merck, Đức) thu được

dung dịch đê tiêm sắc kỷ

Đánh giá: Thông qua diệntíchpeak (S)của Capecitabine

2.2.3 Thâm định phương pháp phân tích

Theo hướng dẫncùathôngtư số 32/2018/TT-BYT về việc quy định việc đăng ký hru hành thuốc, nguyênliệu làm thuốc

1 Kiêm tra tính tương thích hệthống

2 Đánhgiá độ đặc hiệu

3 Đánhgiá tính tuyến tính

4 Đánh giá độ đúng

5 Đánh giá độ chínhxác

2.2.3.1 Kiêm tra tính phù hợp của hệ thống

Sắcký lặp lại 06 lần cùng một dung dịch chuâncó nồng độ20 pg/mL

Klião sát thông số: Thời gian hru ír), diện tích peak (S), số đĩa lý thuyết (N), hệ số

kéo đuôi (Tf) vàđộ phân giải giữa các peak định lượng hoặc/và peak tạp (Rs)

Yêu cầu:

- RSD (%) của diện tích peak, thời gian lưu (ír)và số đĩa lý thuyết(N)< 2%

- Sổ đĩa lý thuyếtN > 3000

- Độ phân giảipeak (Rs) >2 cho các peakcầnđịnh lượng

- Hệ số kéo đuôi (Tf) nam trong khoảng ừr 0,8 đến 1,5

2.2.3.2 Đánh giá độ đặc hiệu

Chuân bị mẫu trắng, mẫu thử, mâu chuân, mẫuthừ thêm chuân và mẫu thử phân hủy Capecitabine có nồng độ 20 pg/mL trong các điều kiện khắc nghiệt khác nhau (trong HC1 2M,NaOH 2M, H2O2 3%, chiếu đèntử ngoại (254 nm) trong 8 giờ và đặt trong tùsấy 60°C trong 3 giờ)

❖ Chuan bị mẫu trang

Mâu trắng: Sử dụng dung dịch pha động giống như trong điều kiện sắc ký nhưng không thêmcapecitabine.

❖ Chuẩn bị mẫu chuẩn

Mầu chuân: Là dung dịch chuân capecitabine với nồng độ20 pg/mL

❖ Chuan bị mẫu thử

Mầu thử: Cân một lượngbột thuốc tương đương với 20 mg Capecitabine chuyênvàobình địnli mức 100 mL Thêm 50 mL dung môi cần khao sát, siêu âm không gia nhiệt

trong thời gianđã được khảo sát Định mức đếnvạch bằng dung môi cần khảo sát, lọc

và bò dịch lọc đầu, pha loãng đến nong độ 20 pg/mL bằng dụng môi đã khảo sát

❖ Chuân bị mẫu thử thêm chuân

Mấu thử thêm chuẩn: Là dung dịch mấu thừ cỏ nồng độ 20 pg/mL thêm 80% dung

dịch chuâncó nồng độ 20 pg/mL

❖ Chuẩn bị mẫu thử phân hủy

Mầu thử phân hủy trong điều kiệnkliacnghiệt: Là mẫu thử chứa Capecitabine đirợc

xử lý dưới các điềukiện khắcngliiệt đê đánli giáđộ ôn định và khâ năng phân hủy

- Phân hủy trong HC1 2M: Cân một lượng bột thuốc tương đương với 20 mg

Capecitabữie chuyênvào bình định mức 100 mL Làm âm bột thuốc bang dung dịch HC1 2M Đặt mẫu ờ điều kiện phòng trong 12 giờ Sau đó tiến hành pha

loãng vềnồng độ 20 pg/mL bang dung môi đã khảo sát

- Phân hùy trong NaOH 2M: Cân một lượng bột thuốc tương đương với 20 mg Capecitabine chuyênvào bình địnhmức 100 mL Làm âm bột thuốc bang dung dịch NaOH 2M Đặt mẫu ờ điều kiệnphòng trong 12 giờ Sau đó tiến hành pha

loãng vềnồng độ 20 pg/mL bằng dung môi đã khảo sát

- Phân hủy trong H2O2 3%: Cân một lượng bột thuốc tương đương với 20 mg Capecitabine chuyênvào bình định mức 100 mL Làm âm bột thuốc bang dung

dịch H2O2 3% Đặt mầu ờ điều kiện phòng trong 12 giờ Sau đó tiến hành pha

loãng vềnồng độ 20 pg/mL bằng dung môi đã khảo sát

- Chiếu đèntừngoại (254 mu) trong 8 giờ: Cân một lượng bột thuốc tương đương

với 20 mg Capecitabine chuyên vào bình định mức 100 mL Thêm 50 ml dung

môi Đặt dung dịch capecitabine dưới đèn tử ngoại (254 nm) trong thời giangiờ Đàm bão rang dung dịch được chiếu sáng đều và liên ựic Sau đó tiến hànhpha loãngvề nồng độ 20 pg/mL bằng dung môi đã khảo sát

- Đặt trong tủ sấy 60 °C trong 3 giờ: Cân một lượng bột thuốctương đươngvới 20

mg Capecitabine vào cốc, đặt cốc vào tù sấy ờ nhiệt độ 60 °C trong 3 giờ Sau đótiến hành pha loãng về nồng độ 20 pg/mL bang dung môi đã khảo sát

Tiến hành sắc ký, ghi lại và đánh giá các thông so sac ký và phô của các mầu So

sánh thời gianlưu, kiêm tra peak và độ phân giải

Yêu cầu:

- Săc kýđôcủa mâu trăng phảikhôngxuât hiện peak cân khảo sát

- Sắc ký đồ mẫuthử phải cópeak chính có thời gian lưu không xuất hiện trongmầu

trăng

- Phô uv cùapeak chat phân tích trong dung dịch thừ giống phô uv cũa peak chat

đối chiếu trong dung dịch chuân

- Thời gian lưu của mầu chuân Capecitabine phải tràng với mầu thừ và các mẫu

thừ trong các điều kiện khắc nghiệt

2.2.3.3 Đánh giá tính tuyến tính

Khảo sát tính tuyến tính của Capecitabine từ 5 - 30 pg/mL Pha dung dịch banđầu có nồngđộ 200 pg/mL Cân20 mg chấtchuân pha vào bìnhđịnh mức 100 ml(2000

ug/mL) Sau đó pha loãng về nồng độ200 ug/mL

Chuân bị các dung dịch chuẩn có nồng độ lan lượt là 5, 10, 15, 20, 25 và 30 pg/mL Tiến hành sac ký trên từng mầu chuân Mỗimẫu sac ký 3 lần Xâydựng phương

trình hồi quyvà vẽ biêuđồmô tã tương quangiữadiện tíchpeakvà nồngđộCapecitabinetrong mầu được xây dựng.

Sừ dụng “phân tích hồi quy”, trắc nghiệm t đê kiêm tra ý nghĩa các hệ số trong

phương trình hồi quy và trắcnghiệm F đê kiêm tra tính thíchhợp của phương trình hồiquy-

có nong độ 20 pg/mL vào mẫu thừ có nồng độ của Capecitabine 20 pg/mL Tien hành

sắc kýờ mỗi nồng độ trên với ba mẫu khácnhau Tiến hành sac ký vàđánh giá qua (%)

Độ lặp lại: Tiến hành sắc ký 6 mẫu thừ có nồngđộ 20 pg/mL , mỗimẫu 2 lần, tínhkết quả tiling bình với quy trìnhphântích vừaxây dựng.

Độ chínli xáctrung gian: Tiến hành tương tựnhưđộ lặp lại nhưng trong2ngàykhácnliau

Yêu cầu:

- RSD (%) < 2%

So sánh hàm lượng Capecitabine 2 ngày bang phân tích thống kê (ANOVA 1 yếu

tố), kếtquả kliác nliau không có ý nghĩa thống kê

2.2.4 Phân tích thống kê

Các phần mềm hỗ trợ phântíchkết quả và hình ảnh

MicrosoftExcel được áp dụng đêtínli toánthống kê (tiling bình,RSD (%)) Thiết kế

thí nghiệm,phân tích đánh giáANOVA, phầnmềm Chemstation - Shimadzu

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Ket quả khảo sát điều kiện sắc ký

❖ Khảo sát phô hấp thu và bước sóng phát hiện

Tiến hành ghi phô hấp thu của dung dịch chuân CAP 20 pg/rnL Từ bước sóng

200 den 400nm Bang cách xác định các cực đại hấp thu cùa Capecitabine Ket quả cho

thayCAP có 3 đinh hấp thụ lần lượt là 215 nm, 240 nmvà 305 nm (hình 3.5) Độ hấpthu lớnnhấtở bước sóng 215 nm, tuy nhiên ờ bước sóng này ảnh hưởng nhiều bời nền

mẫu, dung môi Bước sóng 240 nmđộ hấp thu bang 90% của bước sóng 215 nm Năm

2018 Patel DR vàcộng sự [25], năm 2015 Sreevatsav và cộng sự [23] cũng đã sừ dụng

bước sóng 240 nm là bước sóng hap thu phùhợp đê ghi nhận tín hiệu cùa CAP Do đó,bước sóng 240 nm được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

❖ Khảo sát thành phần và tỉ lệ pha động

Mục tiêu của nghiên cứu là tìmra điều kiện sắc ký đơn giãn, cải thiện thời gian

phân tích và đặc biệt là bão vệ môi trường, an toàn với kiêm nghiệm viên Dựa vào cấu tróc hóa học và tàiliệu thamkhảo đê tiến hành khảo sát

Điều kiện sắc ký ban đầu như sau: Cột pha đảo C18 (250 X 4,6 mm; 5 pm), thêtíchtiêm 10 pL, bước sóng pháthiện 240 nm, tốcđộ dòng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 40

°C, chương trình rửa giải đăng dòng

Khảo sát pha động làhôn hợp methanol, acetonitril, đệmphosphat và nước ờ các

tỷlệ khác nhau Tham khảo cáchệ pha động đã được sừ dụng:

- Đệmphosphat: methanol: acetonitril (65: 25: 10) [12]

- Acetoniltril: đệm phosphat 0,01 M (60: 40) [18]

- Methanol: nirớc acid (50: 50) [27]

Sau đó điều chinhtỳ lệ cùa từng hệ pha động

Tỷlệ pha động phù hợp được lựa chọn sao cho peak CAP đạt độ tinh kliiêt, tách

hoàn toànkhỏi cácpeaktạp (nếu có), sốđĩalý thuyết biêu kiến lớn hơn 3000, hệsố dung lượngK’ nam trong khoảng từ 1 đến 5 và có hệ số đốixứng nằm trong khoảng từ 0,8 -

1,5

Thông qua các thôngsố sắc ký và sắc ký đồcho thay:

Hệ pha động pha động (đệm phosphat: methanol: acetonitril) tỳ lệ (65: 25: 10)

cho thấy thời gian lưu tương đối lớn bang 40,496phút (hình 3.6) và hệ số dung lượng

K’ bang 16,09nằm ngoài khoang từ 1 đen 5 (bảng 3.4)

Hệ pha động (acetonitril: đệm phosphat) tỳ lệ (60: 40) có thời gian lưu là 3,512 phút(hình 3.7) tuy nhiên hệ số dung lượng K’ bằng0,632 nam ngoài khoảngtừ 1 đến 5

(bàng 3.4)

Đối với hệ phađộng methanol: nước acid ờ các tỳ lệ khác nhau (hình 3.8 a, b, c)

cho thấy thời gian lưu kliông quá dài nam trong khoảngnhò hơn 15 phút (từ 4,285phút

đến 12,822phút), peak nhọn,đạtđộ tinh khiết (peak purity ~ 100%), số đĩa lý thuyết (N) lớn hơn 3000 Hệ số dụng lượng K’ của hệ (methanol : nước acid) ờ tỷ lệ (50:50) và (40:60) nam trongkhoảng cho phép từ 1 đến 5và hệ (methanol: nước acid) Tuy nlứên

ở tỳ lệ (30:70) bang 5,26 nam ngoài khoảng cho phép (bảng 3.4)

Tiến hànli thay mrớc acid trong hệ pha động bang nước và khảo sát ờ các tỳ lệkhác nhau

Sac ký đồ và thông số sắc ký cùa hệ pha động methanol: nước tỳ lệ (55: 45) cho

thấy tínhiệu của CAP rất thấp, ngoài ra thời gian lưu là 26,44 phút tương đối lớn (hình3.9 e) Hệ sổ dụng lượng K’ bằng 18,36 nam ngoàiklioảngtìr 1 đến 5 (bảng 3.4)

Sac ký đồ và thông số sangký của hệ pha động (methanol: nước) tỷ lệ (65: 35),

60: 40), (50: 50) và (45: 55) cho thấy thời gian lưu từ 6,702 phút đến 16,808 phút là hợp

lý, peaknhọn,đạtđộtinh khiết (peak purity ~ 100%) (hình3.9 a, b, c, d), số đĩa lý thuyết (N) đều lớn hơn 3000, hệ số dung lượng K’ đều nằm trong khoảng cho phép từ 1 đến 5,

hệ số kéo đuôi (Tf) ~ 1,0nam trong khoảng từ 0,8 đến 1,2 (bảng 3.4)

Dựa vào các thông sô sãc ký và tài liệu tham kliảo như peak nhọn, đạt độ tinh

khiết, tách hoàn toàn với các peak tạp, thời gian hru không quá dài, số đĩa lý thuyết lớn hơn 3000, hệ số dung lượng K’ nam trong khoảngtìr 1 đến 5 và có hệ số đối xứng namtrong khoảng từ 0,8- 1,5 cho thấy những hệ pha độngcó thê lựa chọnđó là hệ methanol:nước acid tỷlệ (50: 50) và (40: 60) và hệ pha động methanol: nước (65: 35), (60: 40),(50: 50), (45: 55)

Tuy nhiên hệ pha động methanol: nước tỷ lệ (60: 40) với thời gian lưu là 8,67phút, hệ số kéo đuôi gần bang 1 so với cáchệ pha động khác, độ tinh kliiết (peakpurity)

bang 1 được lựa chọn cho cácnghiên cứu tiếp theo Nuớc là dungmôi thân thiện vớimôi truờng, phô biếnvà rẻ tiền, giúp giảm chi phí cho các phân tíchHPLC Ngoài ra, nướccòn là dung môi an toàn cho kiêmnghiệmviên, giảm thiêunguy cơảnh hườngđến sứckhỏe trong quá trìnhphântích