Trích dẫn bài viết Vietnam J Chem , 2020, 58(6E12), 178 183 Bài nghiên cứu 178 Xây dựng quy trình phân tích định lượng canthin 6 one và 9,10 dimethoxycathin 6 one bằng HPLC Đỗ Thị Ngọc Lan 1,2 , Nguyễ[.]
Trích dẫn viết: Vietnam J Chem., 2020, 58(6E12), 178-183 Bài nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích định lượng canthin-6-one 9,10-dimethoxycathin-6-one HPLC Đỗ Thị Ngọc Lan1,2, Nguyễn Quang Trung3, Nguyễn Tiến Đạt3* Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, 48 Hai Bà Trưng, Hoàn Kiếm, Hà Nội 10000, Việt Nam Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế, 138A Giảng Võ - Ba Đình - Hà Nội 10000, Việt Nam Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 10000, Việt Nam Đến Tòa soạn 15-6-2020; Chấp nhận đăng 20-12-2020 Abstract Cathin-6-one and 9,10-dimethoxycanthin-6-one are natural alkaloids that exhibits various biological activities such as anti-inflammation, antitumor, antibacterial, antifungal Canthin-6-one and 9,10-dimethoxycanthin-6-one were isolated from the roots of of Eurycoma longifolia Jack, which have been widely used in traditional medicine The chemical constituents including canthin-6-one and 9,10-dimethoxycanthin-6-one in Eurycoma longifolia Jack vary depending on the growing location, treatment conditions There are a number of products containing Eurycoma longifolia, while the material quality has not been well controlled A quantitative HPLC procedure was established for simultaneous dertermination of canthin-6-one and 9,10-dimethoxycanthin-6-one content in Eurycoma longifolia material The results show that the method has a linearity of R2 ≥ 0.9990, LODs of 2.75-3.44 μg/mL, LOQ of 8.3310.43 μg/mL with good precision and accuracy Keywords Canthin-6-one, 9,10-dimethoxycanthin-6-one, Eurycoma longifolia Jack, HPLC, quantification ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Bá bệnh có tên khoa học Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Thanh thất (Simaroubaceae) Bá bệnh đƣợc biết đến với tên gọi khác nhƣ bách bệnh, mật nhân, sâm Alipas, hậu phác.[1] Theo Đông y, phận nhƣ quả, vỏ thân vỏ rễ phơi hay sấy khô để làm thuốc Bá bệnh loại thảo dƣợc có vị đắng, tính ấm đƣợc dùng để chữa nhiều bệnh nhƣ vỏ dùng chữa ăn uống không tiêu, đau mỏi lƣng; dùng chữa lỵ; chữa ghẻ lở, ngứa; rễ chữa ngộ độc.[1] Nhiều hợp chất từ Bá bệnh đƣợc phân lập với thành phần vô phong phú đa dạng, gồm quassinoids, canthin-6-one alkaloids, β-carbolines, triterpenes khung tirucallane, dẫn xuất squalene, biphenylneolignans.[2-5] Trong đó, lớp chất quassinoid, alkaloid đóng vai trị định đến hoạt tính Bá bệnh Nhóm hợp chất canthin6-one alkaloids thể nhiều hoạt tính sinh học nhƣ chống ung thƣ, kháng khuẩn, kháng nấm, chống ký sinh trùng, kháng virus, kháng viêm,…[6] Trong đó, hợp chất canthin-6-one thể hoạt tính chống nấm;[6,7] chống sốt rét; ức chế sinh vật đơn bào;[3] gây độc tế bào ung thƣ phổi A549, ung thƣ vú ngƣời (MCF-7);[3,4,5] chống ung thƣ, chống thiếu máu.[8] Hợp chất 9,10-dimethoxycathin-6-one đƣợc xác định có hoạt tính kháng viêm;[3,4,9] chống ung thƣ, gây độc tế bào HT-1080 với giá trị IC50 = 5,0 μmol/L, thể hoạt tính mạnh chất đối chứng dƣơng 5-FU (IC50 = 9,2 μmol/L).[2,4] Theo nghiên cứu đƣợc cơng bố, Bá bệnh có hoạt tính đa dạng nhƣ kháng khuẩn, chống ký sinh trùng sốt rét, gây độc tế bào, kháng viêm, chống tiểu đƣờng, chống ung thƣ, chống co thắt, chống loãng xƣơng, tăng cƣờng chức sinh lý cho nam giới, kích thích thể tăng tiết hormon nam giới,[2-5] điều trị huyết áp cao,[3] có tác dụng bảo vệ gan,[4] chống đơng máu.[5] Chính hoạt tính sinh học q báu mà sản phẩm thực phẩm chức có chứa thành phần Bá bệnh nhận đƣợc quan tâm ngƣời tiêu dùng Tuy nhiên, nguồn gốc chất lƣợng sản phẩm nhƣ nguyên liệu Bá bệnh thị trƣờng cịn chƣa đƣợc kiểm sốt tốt Nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm thiết lập quy trình định lƣợng đồng thời hai hợp chất đặc trƣng đƣợc phân lập, tinh chế từ rễ Bá bệnh canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phục vụ thử nghiệm đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu sản phẩm từ dƣợc liệu Bá bệnh thị trƣờng 178 Nguyễn Tiến Đạt cộng TCHH, 58(6E12), 2020 Canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one Hình 1: Cấu trúc canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất, nguyên liệu Chất chuẩn canthin-6-one 9,10dimethoxycanthin-6-one đƣợc nhóm nghiên cứu phân lập tinh chế sắc ký điều chế từ rễ Bá bệnh, với độ đƣợc xác định hệ thống HPLC với lần lƣợt 99,1 % 99,4 % Mẫu thử: mẫu rễ Bá bệnh tự nhiên, mẫu cao chiết metanol Bá bệnh Dung môi: Metanol dùng cho HPLC (Scharlau, Tây Ban Nha), nƣớc đạt tiêu chuẩn HPLC (MilliQ Ultra Purification system, Merck-Millipore, USA) Hóa chất khác: Formic axit (Merck) 2.2 Thiết bị dụng cụ phân tích Hệ thống HPLC - DAD (Thermo Scientific Ultimate 3000), detetor DAD (Thermo Scientific), cột HPLC C18 Hypersil Gold - Thermo (2504,6 mm; µm), cột bảo vệ C18 Hypersil Gold - Thermo, cân phân tích xác 0.0001 g (Satorius, Đức), bể rung siêu âm (Daihan Scientific), máy ly tâm (LC-04R Centrifuge, Zenith Lab) dụng cụ thí nghiệm khác 2.3 Thực nghiệm 2.3.1 Điều kiện sắc ký Kỹ thuật HPLC đƣợc sử dụng với điều kiện sắc ký nhƣ sau: Cột sắc ký C18 Hypersil Gold (2504,6 mm; µm); pha động: gradient MeOH (0,1 % formic acid) - nƣớc (0,1 % formic acid) tỉ lệ 20:80 đến 100 % MeOH (0,1 % formic acid) 15 phút; detector DAD 260 nm; tốc độ dòng 1,5 mL/phút; thể tích tiêm µL; nhiệt độ cột 45 oC, nhiệt độ mẫu 15 oC 2.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn định lượng Dung dịch chuẩn gốc canthin-6-one 9,10dimethoxycanthin-6-one nồng độ 500 μg/mL đƣợc pha metanol Dãy dung dịch chuẩn canthin-6-one đƣợc khảo sát có nồng độ sau: 8, 40, 80, 120, 160 200 μg/mL Dãy dung dịch chuẩn 9,10dimethoxycanthin-6-one đƣợc khảo sát có nồng độ: 10, 40, 60, 80, 120, 160 200 μg/mL Phân tích đồng thời hai chuẩn theo điều kiện sắc ký thiết lập, lặp lại lần xác định phƣơng trình hồi quy tuyến tính dựa mối tƣơng quan nồng độ diện tích peak chất chuẩn Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng y = ax + b với yêu cầu hệ số tƣơng quan R2 > 0,99 Trong đó: y diện tích pic thu đƣợc tƣơng ứng vơi nồng độ chất chuẩn x (μg/mL) 2.3.3 Chuẩn bị mẫu Mẫu rễ Bá bệnh đƣợc cắt nhỏ nghiền thành dạng bột Cân lƣợng xác mẫu, chiết siêu âm với metanol, ly tâm 4000 vòng/phút phút, hút lấy dịch chiết chuyển vào bình định mức lặp lại quy trình chiết hai lần Định mức dịch chiết thu đƣợc để đƣợc mẫu có nồng độ 0,2 g/mL Mẫu cao chiết metanol Bá bệnh đƣợc cân xác khối lƣợng, chiết siêu âm với metanol, ly tâm 4000 vòng/phút phút, hút lấy dịch chiết chuyển vào bình định mức, định mức đến vạch metanol, lắc đều, thu đƣợc mẫu có nồng độ 10 mg/mL Các mẫu đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 µm cho vào vial 1,5 mL Tiến hành phân tích hệ thống HPLC theo điều kiện sắc ký thiết lập 2.3.4 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp Việc xác định LOD, LOQ đƣợc thực dựa đƣờng chuẩn Tiến hành phân tích lặp lại 06 lần dung dịch chứa đồng thời 02 chuẩn với nồng độ canthin-6-one µg/mL 9,10-dimethoxycanthin-6one 10 µg/mL, dựa vào hệ số góc đƣờng chuẩn để tính giá trị LOD, LOQ theo công thức: 3,3.SD a 10.SD LOQ = a LOD = (1) (2) đó: SD độ lệch chuẩn đƣợc tính theo cơng thức: ∑ SD = √ ; n số lần phân tích lặp lại của; 179 Xây dựng quy trình phân tích… TCHH, 58(6E12), 2020 nồng độ chuẩn i; xi giá trị nồng độ mẫu lần đo thứ i; xtb giá trị nồng độ trung bình n lần đo; a hệ số góc phƣơng trình hồi quy tuyến tính (y = a.x + b).[10] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Độ chọn lọc tính đặc hiệu 2.3.5 Xác định độ lặp lại phương pháp Thực phân tích lặp lại 06 lần dung dịch chuẩn canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one nồng độ 80 µg/mL, xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) diện tích pic chuẩn canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one tƣơng ứng với nồng độ khảo sát Giá trị RSD cho phép không vƣợt 5,3 %.[10] Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn chứa đồng thời chuẩn canthin-6-one 9,10dimethoxycanthin-6-one mẫu thử điều kiện sắc ký thiết lập Trên sắc ký đồ mẫu trắng, vị trí tƣơng ứng với thời gian lƣu canthin-6-one 9,10dimethoxycanthin-6-one không xuất pic nhƣ mẫu chuẩn Các pic hai chất chuẩn mẫu chuẩn mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp Nhƣ vậy, phƣơng pháp có độ chọn lọc tốt có độ đặc hiệu cao Hình 2: Sắc ký đồ UV 260 nm chất chuẩn 9,10-dimethoxycanthin-6-one (1) canthin-6-one (2) mẫu trắng (A), mẫu chuẩn 9,10-dimethoxycanthin-6-one (B), mẫu chuẩn canthin-6-one (C), mẫu chuẩn (D) mẫu thử (E) 3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn định lượng Phân tích dãy dung dịch chuẩn hai chuẩn canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one theo điều kiện sắc ký xây dựng lặp lại lần, xác định đƣợc phƣơng trình hồi quy tuyến tính dựa vào mối tƣơng quan nồng độ diện tích pic hai chuẩn bảng Kết xây dựng đƣờng chuẩn cho thấy tƣơng quan tuyến tính rõ rệt diện tích pic nồng độ canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6one khoảng khảo sát với hệ số tƣơng quan R2 ≥ 0,999 (hình 3) 180 Nguyễn Tiến Đạt cộng TCHH, 58(6E12), 2020 Bảng 1: Kết xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one Phƣơng trình đƣờng chuẩn* Hệ số tƣơng quan R2 Canthin-6-one y = 0,0706x + 0,0669 0,9990 9,10-dimethoxycanthin-6-one y = 0,0207x – 0,0447 0,9990 Chất chuẩn * y diện tích pic thu đƣợc tƣơng ứng với nồng độ chất chuẩn x (μg/mL) Nhƣ vậy, xác định đƣợc giới hạn phát giới hạn định lƣợng chất chuẩn canthin-6-one (LOD: 2,75 µg/mL, LOQ: 8,33 µg/mL) 9,10dimethoxycanthin-6-one (LOD: 3,44 µg/mL, LOQ: 10,43 µg/mL) Kết cho thấy phƣơng pháp có độ nhạy cao, đảm bảo yêu cầu thử nghiệm Area*min 3.4 Xác định độ lặp lại phương pháp 0 100 Các giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD < 5,3 % (bảng 3), giá trị RSD% tối đa chấp nhận 5,3 % khoảng nồng độ 100 ppm, nhƣ phƣơng pháp định lƣợng có độ lặp lại tốt, đáp ứng yêu cầu định lƣợng 200 C (µg/mL) Hình 3: Đƣờng chuẩn 9,10-dimethoxycanthin6-one Area*min 15 Bảng 3: Kết xác định độ lặp lại phƣơng pháp Lần S1 S2 1,6072 5,4795 1,5635 5,4354 1,5758 5,5684 1,6125 5,1245 1,5987 5,5823 1,6215 5,0254 5,431 1,597 ̅ 0,149 SD 0,022 2,7 RSD (%) 1,4 10 0 100 C (µg/mL) 200 Hình 4: Đƣờng chuẩn canthin-6-one 3.3 Kết xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng phương pháp (LOQ) đó: ̅ giá trị trung bình lần thí nghiệm, SD độ lệch chuẩn, RSD độ lệch chuẩn tƣơng đối, S diện tích pic thu đƣợc tƣơng ứng với nồng độ chất chuẩn, (1) - 9,10-dimethoxycanthin-6-one, (2) - canthin6-one Bảng 2: Giá trị LOD LOQ canthin-6-one (1) 9,10-dimethoxycanthin-6-one (2) Lần 1 SD LOD (µg/mL) LOQ (µg/mL) S1 0,1905 0,2058 0,1897 0,2469 0,2195 0,2195 0,022 3,44 10,43 S2 0,6793 0,5702 0,6302 0,6755 0,5615 0,6984 0,059 2,75 8,33 3.5 Kết xác định hàm lượng canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one số mẫu Bá bệnh Trong đó: SD độ lệch chuẩn, S diện tích pic thu đƣợc tƣơng ứng với nồng độ chất chuẩn, (1) - 9,10dimethoxycanthin-6-one, (2) - canthin-6-one Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one xây dựng với hai mẫu thử dạng rễ Bá bệnh tự nhiên mẫu cao chiết, cho kết sắc ký đồ mẫu thử xuất pic thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu chất chuẩn 9,10dimethoxycanthin-6-one (Rt = 8,9 min), canthin-6one (Rt = 10,05 min) (hình 5) có phổ UV trùng khớp với phổ UV chất chuẩn, pic chất 181 Xây dựng quy trình phân tích… TCHH, 58(6E12), 2020 canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one tách rõ ràng so với pic khác Hình 5: Sắc ký đồ UV 260 nm chất chuẩn 9,10-dimethoxycanthin-6-one (1) canthin-6-one (2) mẫu chuẩn (A), mẫu rễ Bá bệnh (B), mẫu cao chiết Bá bệnh (C) Bảng 4: Kết định lƣợng canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one hai mẫu thử Mẫu rễ Bá bệnh Hàm lƣợng canthin-6-one mẫu 0,236 mg/g mẫu khô Hàm lƣợng 9,10-dimethoxycanthin6-one mẫu 0,069 mg/g mẫu khô Mẫu cao chiết Bá bệnh 3,756 mg/g cao chiết 0,573 mg/g cao chiết STT Tên mẫu 2 KẾT LUẬN Đã nghiên cứu xây dựng hoàn thiện phƣơng pháp phân tích định lƣợng đồng thời canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one HPLC Phƣơng pháp có độ nhạy, độ ổn định, độ lặp tốt hoàn toàn đáp ứng yêu cầu phƣơng pháp phân tích Quy trình phân tích đƣợc đánh giá khả ứng dụng hiệu đánh giá hàm lƣợng canthin-6-one 9,10-dimethoxycanthin-6-one số mẫu Bá bệnh Lời cám ơn Nghiên cứu tài trợ Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (mã số đề tài GUST.STS.ĐT2017-HH01) TÀI LIỆU THAM KHẢO Do Tat Loi, Vietnamese Medicinal plants and Remedies Medicine Publisher House, Hanoi, pp 412-413, 2000 182 Hou Wen-bin, XiaoXue-feng, Guo Wei, Zhang Tiejun Advances in studies on chemistry, pharmacological effect, and pharmacokinetics of Eurycoma longifolia, Chinese Herbal Medicines, 2011, 3(3), 186-195 Bashir Mohammed Abubakar, Faezah Mohd Salleh, Alina Wagiran Chemical Composition of Eurycoma longifolia (Tongkat Ali) and the Quality Control of its Herbal Medicinal Products, Journal of Applied Sciences, 2017, 17(7), 324-338 T K Lim Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants, Springer, Vol 11, 250-276, 2016 Shaheed Ur Rehman, Kevin Choe, Hye Hyun Yoo Review on a Traditional Herbal Medicine, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): Its Traditional Uses, Chemistry, Evidence-Based Pharmacology and Toxicology, Molecules, 2016, 21(3), 331 Jiangkun Dai, Na Li, Junru Wang, Uwe Schneider Fruitful Decades for Canthin-6-ones from 1952 to 2015: Biosynthesis, Chemistry, and Biological Activities, Molecules, 2016, 21(4), 493 Bettarini F., Borgonovi G E., Fiorani T., Gagliardi I., Caprioli V., Massardo P., Chapya A., Nguyễn Tiến Đạt cộng TCHH, 58(6E12), 2020 Antiparasitic compounds from East African plants: Isolation and biological activity of anonaine, matricarianol, canthin-6-one and caryophyllene oxide, International Journal of Tropical Insect Science, 1993, 14(1), 93-99 Heron F Vieira Torquato, Antonio C Ribeiro-Filho, Marcus V Buri, Roberto T Araújo Júnior, Renata Pimenta, José Salvador R.de Oliveira,Valdir C Filho, Antonio Macho, Edgar J Paredes-Gamero, Domingos T de Oliveira Martins Canthin-6-one induces cell death, cell cycle arrest and differentiation in human myeloid leukemia cells, Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, 2017, 1861(4), 958-967 Dao Thi Thanh Hien, Tran Phi Long, Tran Phuong Thao, Jeong-Hyung Lee, Duong Thu Trang, Nguyen Thi Thu Minh, Pham Van Cuong, Do Thi Ngoc Lan, Nguyen Hai Dang, Nguyen Tien Dat Antiinflammatory effects of alkaloid enriched extract from roots of Eurycoma longifolia Jack, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2019, 9(1), 18-23 10 Tran Cao Son Method validation in chemical and microbiological analysis Science and Technology Publishing House, Hanoi, 2010 Liên hệ: Nguyễn Tiến Đạt Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 18, Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 10000, Việt Nam E-mail: ngtiend@imbc.vast.vn 183 ... 58(6E12), 2020 Bảng 1: Kết xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng canthin- 6- one 9,10- dimethoxycanthin -6- one Phƣơng trình đƣờng chuẩn* Hệ số tƣơng quan R2 Canthin- 6- one y = 0,0706x + 0, 066 9 0,9990 9,10- dimethoxycanthin -6- one. .. tính xây dựng đường chuẩn định lượng Phân tích dãy dung dịch chuẩn hai chuẩn canthin- 6- one 9,10- dimethoxycanthin -6- one theo điều kiện sắc ký xây dựng lặp lại lần, xác định đƣợc phƣơng trình hồi quy. .. 58(6E12), 2020 Canthin- 6- one 9,10- dimethoxycanthin -6- one Hình 1: Cấu trúc canthin- 6- one 9,10- dimethoxycanthin -6- one NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất, nguyên liệu Chất chuẩn canthin- 6- one