Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng 10 HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Văn Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10-HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - VĂN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS DƯƠNG HỒNG ANH Hà Nội, 2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân thành cảm ơn PGS.TS Dương Hồng Anh giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực luận văn Tơi xin trân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Môi trường Phát triển Bền vững – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện cung cấp trang thiết bị nghiên cứu, đặc biệt anh chị, bạn nhóm Điện di mao quản giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình nghiên cứu thực đề tài, luận văn thực khuôn khổ đề tài QG.18.05 Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy khoa Hóa học nói chung Bộ mơn Hóa Phân tích nói riêng dạy dỗ, bảo động viên thời gian học tập trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn học viên sinh viên Bộ mơn Hóa phân tích giúp đỡ tơi thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Văn Thị Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 SỮA ONG CHÚA 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm sữa ong chúa 1.1.2.Thành phần hóa học sữa ong chúa 1.1.3.Thu hoạch sữa ong chúa a Quy trình bắt cóc ong chúa b.Quy trình giả làm tổ ong chúa 1.1.4.Tác dụng sữa ong chúa 1.2.Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic (10-HDA) 1.2.1.Một số nghiên cứu 10-HDA 11 a.Hoạt tính sinh học 11 b.Phương pháp phân tích 10-HDA sữa ong chúa 13 c.So sánh phương pháp đề xuất phương pháp thích hợp 17 1.3.Giới thiệu phương pháp điện di mao quản 18 1.3.1.Dòng điện di thẩm thấu (EOF) 20 1.3.2.Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 21 1.3.3.Kỹ thuật bơm mẫu điện di mao quản 22 1.3.4.Các thông số đánh giá phương pháp điện di mao quản 23 1.3.5.Một số yếu tố ảnh hưởng tới trình tách chất điện di mao quản 24 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 26 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 26 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích CE 26 2.2.2 Khảo sát quy trình xử lí mẫu 27 2.3 Đánh giá phương pháp 28 2.4 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 30 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 30 2.3.2 Hóa Chất 31 2.4 Thông tin mẫu thực 32 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1.Khảo sát điều kiện tối ưu nhằm phân tích hàm lượng 10-HDA sữa ong chúa phương pháp CE-C4D 35 3.1.1 Khảo sát thành phần pH dung dịch đệm điện li 35 3.1.2 Khảo sát nồng độ pH dung dịch đệm điện li 37 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu 39 3.1.4 Khảo sát điện tách 41 3.2 Khảo sát tối ưu quy trình xử lí mẫu 42 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng giấy lọc quy trình ly tâm đến diện tích píc 10HDA 42 3.2.2 Khảo sát dung mơi hịa tan 45 3.2.3 Khảo sát tỉ lệ thành phần dung mơi hịa tan 47 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 49 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn, xác định hệ số tương quan 49 3.3.2 Đánh giá độ chụm 51 3.3.3 Độ (độ thu hồi) 52 3.3.4 So sánh với phương pháp tiêu chuẩn HPLC 54 3.3.5 Phân tích mẫu thực tế 55 KẾT LUẬN ……………………………57 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Quá trình phát triển ong chúa ong thợ Bảng 1.2 Thành phần sữa ong chúa tươi sữa ong chúa đông khô Bảng 1.3 Đề suất hàm lượng số quốc gia tổ chức 10,11 Bảng 2.1 Thông tin mẫu nghiên cứu .33,34 Bảng 3.1 Điều kiện thiết bị điện di mao quản 42 Bảng 3.2 Khảo sát diện tích pic trung bình 10-HDA với tỉ lệ dung mơi khác 48 Bảng 3.3 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ 10-HDA 50 Bảng 3.4 Kết so sánh giá trị a với giá trị phương trình đường 51 Bảng 3.5 Các thông số đánh giá phương pháp 52 Bảng 3.6 Giá trị độ lệch chuẩn 53 Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi 10-HDA 54 Bảng 3.8 Kết so sánh CE-C4D HPLC với số mẫu thực tế 55 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sự phát triển ấu trùng bên sữa ong chúa Hình 1.2: Sữa ong chúa Hình 1.3: Cơng thức hóa học 10-hydroxyl-trans-2-decenoic acid (10-HDA) Hình 1.4: Sơ đồ hệ điện di mao quản đơn giản 19 Hình 1.5: Hệ điện di mao quản kênh 19 Hình 1.6: Bộ ghi tín hiệu 19 Hình 1.7: Lớp điện kép tốc độ di chuyển ion 21 Hình 1.8: Cấu tạo detector đo độ dẫn khơng tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 22 Hình 1.9: Các kĩ thuật bơm mẫu điện di mao quản 23 Hình 3.1: Điện di đồ lựa chọn thành phần đệm (tại pH 9) phân tích 10-HDA (20 mg/L) 36 Hình 3.2 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 20 mM Tris/Ace pH ÷ 37 Hình 3.3 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 50 mM Tris/Ace pH ÷ 38 Hình 3.4 Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 100 mM Tris/Ace pH ÷ 38 Hình 3.5 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu tới tín hiệu 10HDA 40 Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng tách tới tín hiệu 10-HDA 41 Hình 3.7 Biểu đồ thể ảnh hưởng giấy lọc quy trình ly tâm đến việc phân tích 10-HDA (mẫu 1) 43 Hình 3.8 Điện di đồ phân tích 10-HDA với ly tâm 1500 rpm 15 phút, lọc PTFE, nilon xenlulozo axetat 44 Hình 3.9 Điện di đồ phân tích 10-HDA với khơng ly tâm, lọc PTFE, nilon xenlulozo axetat 44 Hình 3.10 Biểu đồ thể diện tích pic trung bình 10-HDA với dung mơi hịa tan 46 Hình 3.11 Điện di đồ phân tích 10-HDA với dung môi chiết khác (mẫu 1) 46 Hình 3.12 Điện di đồ phân tích 10-HAD với tỉ lệ dung môi chiết khác (mẫu 4) 48 Hình 3.13 Đường chuẩn 10-HDA 50 Hình 3.14 Điện di đồ phân tích 10-HDA mẫu chuẩn, mẫu thực mẫu thêm chuẩn 53 Hình 3.15 Điện di đồ phân tích 10-HDA số mẫu sản phẩm sữa ong chúa; mẫu 1: sữa ong chúa tươi, mẫu 3: sữa ong chúa/ấu trùng đông khô dạng bột, mẫu 5: sữa ong chúa đông khô dạng gel , mẫu 7: mật ong sữa chúa 55 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ 10-HAD Axit 10-Hydroxy-2-decenoic C4D Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện CE Phương pháp điện di mao quản CHES Axit N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic CZE Điện di mao quản vùng EOF Dịng điện di thẩm thấu GC-MS Sắc kí khí – detector khối phổ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao IDL Giới hạn phát thiết bị IFE Điện di mao quản điểm đẳng điện IQL Giới hạn định lượng thiết bị ITP Điện di mao quản gel Leff Chiều dài hiệu dụng mao quản Ltot Tổng chiều dài mao quản MDL Giới hạn phát phương pháp MQL Giới hạn định lượng phương pháp MECC Điện di mao quản kiểu mixcelle MES Axít 2-(N-morpholino) ethanesulfonic MOPS Axít 3-(N-morpholino) propanesulfonic RJ Sữa ong chúa Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane UV – Vis Quang phổ hấp thụ phân tử %RSD % độ lệch chuẩn tương đối %SD % độ lệch chuẩn MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, ngành sản xuất thực phẩm chức sản phẩm làm đẹp ngày phát triển toàn giới đặc biệt Việt Nam giúp trì sức khỏe, cải thiện nét đẹp người Các sản phẩm làm đẹp dinh dưỡng tập trung chủ yếu vào sản phẩm tự nhiên có sẵn sữa ong chúa, đơng trùng hạ thảo, sâm… Trong dân gian, Sữa ong chúa (RJ) biết đến với nhiều tác dụng cải thiện trí nhớ, tăng lượng, giảm lo lắng căng thẳng, kháng viêm, chống ung thư, đặc biệt có khả chống oxi hóa, ngăn ngừa lão hóa Nhiều năm trở lại đây, sữa ong chúa sử dụng chế độ ăn kiêng, làm đẹp trở thành sản phẩm thương mại ưa dùng Với thành phần hóa học đa dạng phong phú, giàu protein, chứa nhiều axit amin thiết yếu, axit béo cần thiết axit pantothenic (B-5) pyridoxin (B-6) … sữa ong chúa có nhiều tác dụng tốt với người lứa tuổi Trong tất sản phẩm làm từ ong phấn hoa, keo ong, mật ong, … điểm khác biệt sữa ong chúa sản phẩm khác sữa ong chúa có thành phần axit 10-Hydroxy-2-decenoic (10-HDA) Do diện 10HDA sử dụng làm dấu chuẩn (“marker”) để phân biệt sữa ong chúa với sản phẩm khác Và hàm lượng 10-HDA sử dụng thông số cho chất lượng sữa ong chúa Theo quy định Bộ Nông nghiệp (MOA) Trung Quốc, hàm lượng 10-HDA không thấp 1,4% sữa ong chúa nguyên chất dạng kem 4,2% dạng đơng khơ Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định tác dụng chống ngăn ung thư, kháng viêm chống oxi hóa,… 10-HDA [9] Với tác dụng sữa ong chúa đặc biệt 10-HDA dẫn đến nhập số lượng lớn sữa ong chúa năm nhiều quốc gia Nhu cầu sử dụng tăng cao dẫn đến xuất mặt hàng giả, hàng chất lượng Vì vậy, nghiên cứu thành phần sữa ong chúa sản xuất, đánh giá chất lượng sản phẩm thương mại cần thiết Kết hình 3.12 bảng 3.2 cho thấy tỉ lệ dung môi metanol hỗn hợp tăng đến 30% tỉ lệ nước giảm xuống diện tích pic 10-HDA có xu hướng tăng Nhưng tiếp tục tăng thể tích metanol đến 50% diện tích pic 10HDA lại có xu hướng giảm Và tiếp tục tăng thể tích metanol ta thu diện tích pic tiếp tục giảm giảm chậm gần không đổi Đặc biệt, tỉ lệ 30% metanol 70% nước ta nhận kết hòa tan tốt nhất, với đường ổn định tín hiệu có độ lặp lại cao tỉ lệ hịa tan mẫu khác Do đó, tỉ lệ dung môi metanol với nước 30 : 70 lựa chọn điều kiện tối ưu cho việc hòa tan mẫu sữa ong chúa, trước ly tâm, lọc để phân tích 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn, xác định hệ số tương quan Xây dựng đường chuẩn Các dung dịch dùng để dựng đường chuẩn pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc Các dung dịch có nồng độ biến thiên khoảng pm – 100 ppm Mỗi dung dịch đo lặp lại hệ điện di lần, diện tích pic trung bình thu số liệu để dựng đường chuẩn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Các điều kiện đo sở điều kiện tối ưu nêu bảng diện tích pic trung bình chất thu bảng 3.3 49 Bảng 3.3 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ 10-HAD STT Nồng độ (ppm) Diện tích pic (V.s) 0.002036 0.004789 10 0.01011 20 0.018728 30 0.02806 50 0.047078 100 0.096311 Từ kết thu sử dụng phần mềm excel để xử lí số liệu thu đường chuẩn thể hình 3.10 y = 0.001x - 0.0002 R² = 0.9997 Đường chuẩn 10-HDA Diện tích pic (V.s) 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 20 40 60 Nồng độ 10-HDA 80 Hình 3.13 Đường chuẩn 10-HDA 50 100 120 Giới hạn phát thiết bị (IDL), giới hạn phát (MDL) giới hạn định lượng (MQL) phương pháp Dựa vào cách tính mục 2.3, thu nồng độ nhỏ đo tín hiệu nguyên tố tín hiệu S/N Giá trị MDL sữa ong chúa tươi xác định sở chiều cao pic gấp lần nhiễu hệ số quy đổi với gam mẫu hòa tan vào 50 mL nước deion MQL tính từ giá trị giới hạn định lượng thiết bị quy đổi tương ứng hòa tan 1,0 g mẫu vào 50 mL nước deion 𝑀𝑄𝐿 = 𝐼𝑄𝐿 × 50 1000 × 𝑚 Trong đó: MQL: giới hạn định lượng phương pháp (mg/g) IQL: giới hạn định lượng thiết bị (mg/L) m: khối lượng mẫu (g) Bảng 3.4 Các thông số đánh giá phương pháp 10-HDA Khoảng Hệ số đường tương Phương trình đường MDL MQL chuẩn quan chuẩn (mg/g) (mg/g) (mg/L) (R2) - 100 0,9997 y = 0.001x - 0.0002 0,039 0,13 3.3.2 Đánh giá độ chụm Để đánh giá độ chụm phương pháp, tiến hành khảo sát độ lặp lại độ tái lặp 10-HDA mẫu thực Độ chụm đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic thời gian lưu tín hiệu 10-HDA phân tích 51 lặp lại với lần bơm độc lập độ lặp lại với ngày liên tiếp với độ tái lặp, mẫu chuẩn nồng độ 20 mg/L nước deion Kết thu sau: Bảng 3.5 Giá trị độ lệch chuẩn Độ lặp lại Độ tái lặp (n=7) (8 ngày) RSD % diện 10-HDA RSD % thời gian tích pic di chuyển 2,24 0,26 RSD % diện tích pic 8,48 RSD % thời gian di chuyển 3,18 Từ bảng trên, nhận thấy tiến hành đo lặp lại lần 10-HDA RSD diện tích pic với thời gian di chuyển tốt (RSD < 3%) Ngoài ra, tiến hành độ tái lặp, RSD tốt với diện tích pic thời gian di chuyển (RSD < 9%) Chứng tỏ phương pháp có độ chụm tốt đáng tin cậy 3.3.3 Độ (độ thu hồi) Độ phương phá đánh giá qua hiệu suất thu hồi phương pháp phân tích, bao gồm xử lý đo mẫu phân tích, thơng qua phương pháp thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn nồng độ 20 mg/L cách thêm chuẩn trực tiếp vào mẫu thực trước xử lý mẫu, xử lý mẫu tương tự xử lý mẫu thực, sau tiến hành phân tích thiết bị điện di mao quản kênh vận hành tay Kết thu bảng 3.7: 52 Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi 10-HDA Hiệu suất thu hồi Dạng mẫu 10-HDA (%) Dạng sữa ong chúa tươi (mẫu 1) 105,77 Dạng bột (mẫu 3) 99,89 Dạng gel (mẫu 4) 97,23 Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 97-106 Hình 3.14 Điện di đồ phân tích 10-HDA mẫu chuẩn, mẫu thực mẫu thêm chuẩn Các điều kiện điện: di tách -17 kV; thời gian bơm mẫu 30 s; mao quản silica nóng chảy I.D = 50 µm, Ltot = 60 cm, Leff = 48 cm, đệm Tris/Ace 20 mM pH 8,5 53 Như vậy, hiệu suất thu hồi phương pháp sau khảo sát với loại khác sữa ong chúa tươi, dạng bột khô dạng gel cô đặc Điều chứng tỏ phương pháp có độ cao, quy trình phân tích phù hợp cho việc xác định hàm lượng 10-HDA mẫu sữa ong chúa 3.3.4 So sánh với phương pháp tiêu chuẩn HPLC Việc phân tích đối chứng số mẫu thực tế thực với 5/7 mẫu thực tế có phát 10-HDA ( gồm: hai mẫu sữa ong chúa tươi, mẫu dạng bột, ba mẫu dạng gel mẫu mật ong) phương pháp tiêu chuẩn Sắc kí lỏng Hiệu cao (HPLC-DAD) Trung tâm CETASD Các kết đối chứng nêu bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết so sánh CE-C4D HPLC với số mẫu thực tế Hàm lượng 10-HDA (mg/g) Loại mẫu Mã mẫu CE (n=3) HPLC Độ chênh lệch (%) Sữa ong chúa Mẫu 21,38 ± 0,89 21,52 tươi Mẫu 9,14 ± 0,27 - Mẫu 13,20 ± 0,30 13,77 Viên nang sữa Mẫu 0,54 ± 0,01 - ong chúa đông Mẫu < 0,13