Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất, Đánh giá chất lượng cao chiết và hoạt tính sinh học của Đảng sâm (codonopsis javanica (blume) hook f )

Nham chứng minh giá trị cây Đảng sâm, tìm ra quy trình chiết xuất có hàm lượng hoạt chất cao,nhómnghiên cứu tiến hànhthực hiện đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất, đánh giá

NGUYEN TAT THANH

NGHIÊN CỨU XÂY DựNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT,

(CODONOPSIS JA VANICA (BLUME) HOOK.F.)

ĐÈ ÁN THẠC Sĩ KIẺM NGHIỆM THUÓC VÀ Độc CHẤT

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH-2024

NGUYEN TAT THANH

VÕ KIỀU TUYỂT QƯỲNH

NGHIÊN CỨU XẲY DựNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT,

(CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.)

MÀ SỔ: 8720210

ĐÊ ÁN THẠC Sĩ KIẺM NGHIỆM THƯÓC VÀ Độc CHẤT

TS DS THÁI THỊ CẢM

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH-2024

Tôi gửi lờicảmơn đen gia đình, bạnbè và các thànli viên trong lớp đã luônhỗ

trợ, động viêntôi trongquá trình học tập và thực hiện đề án

Xin chân thành cảm ơn./

Ngtrời thực hiện

Lòi cam đoan

Tôi Võ Kiều Tuyết Quỳnh xin cam đoan nội dung đề án này được ghi nhận,

thực hiệnmột cách trung thực Đeán này không có bat kỳ số liệu,văn bản, tàiliệu đãđược TrườngĐại học Nguyễn Tất Thành hay Trường đại học khác chấpnliậnđê cấp văn bang đại học, sauđại học Đe án này kliông baogồm các giãipháp đã được thựchiệnvà báo cáo tại bất kỳ cơ quan, đơn vị, địa phirơng nham giải quyết vấn đề tương

ựr vớimục tiêu đềánđề ra

Người thực hiện

£ TBip quip upip OBQ Vfĩ

£ gq^WOT

3 ỊệA onpj ỊBOỊ UBpd ZVI 3 TUBS SuBQ uno ỊỎS no J IVI 3 UB op uno ỊOẤnpỊ ẤỊ ỌS 03 VI 3 :ub op uoip oiipi UBĨỖ Topi £'£ I 3 UB op UOTIJ onip IIIOTP Big £‘£'1 3 nno uoĩpSu Sujonj TOQ Ị-£ĩ 3 neap uno TAniuqj •£] Ị UB op Brio oip lio nop onjAj Vó’I Ị UB op Bno Sunpo nop onpq T3T Ị UB op uno non anjAi 31 Ị UB op uno l?pp dựo pujl I I

I nậlHl I0IO • I ĐN0HH3

X quip onuT ifUBQ XT op JOS oniu TỊUBQ ĨTTA Snuq ofiUT quBQ TA nonj Ấp BA ỊBỊ IOTA nip oniu qUBQ ĨT UBOp LUBO Top T UjO LUBO pop

□117 □Aw

1.4.6.1 Tác dụng điều hoà miễn dịch 7

1.4.6.2 Tác dụng chống oxy hoá 8

1.4.6.3 Tác dụng khángkhuẩn 8

1.4.6.4 Hoạt động chống ung thư 9

1.4.6.5 Hoạt tính kháng nấm 10

1.4.6.6 Tác dụng hạ đtrờng huyết 11

1.4.7 Công dụng 11

1.4.8 Tinh hình nghiên cứu trongnước và nước ngoài 11

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG NGHIÊNcứu ĐỀ ÁN 13

2.1 Thiếtbị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 13

2.2 Nhiệm vụ và giải pháp thực hiện 13

2.2.1 Mục tiêu 1: Xây dựng quy trình chiết xuất cao Đàng sâm và định lượng hàmlượng của polyphenol, flavonoid, saponin toàn phần có trongcao chiết 13

2.2.2 Mục tiêu 2: Đánh giáchất lượngcao chiết theo tiêu chuẩn DĐVNV 17

2.2.3 Mục tiêu 3: Xác định hoạt tính chống oxy hoá các cao chiết bang DPPH và khả năng ức chế peroxy hóa lipidte bào 18

2.2.4 Mục tiêu 4: Đánhgiá hoạt tính độc tế bào m vitro của các cao chiết bang thừ nghiệmSRB 20

CHƯƠNG 3 KÉTQUA THựC HIỆNĐÈ ÁN 23

3.1 Ket quả và bàn luận 23

3.1.1 Đặc diêm của Đãng sâm 23

3.1.2 Vi phẫu cuống lá Đảng sâm 23

3.1.3 Vi phẫu rễ Đảng sâm 24

3.1.4 Đặc diêmsoi bột rễ Đảng sâm 25

3.1.5 Kết quả đo độ âmbột rễ Đàng sâm 26

3.1.6 Ket quả chiết xuất cao Đảng sâm 26

Ket quả chiết cao Đãng sâm bang phương pháp ngâm 26

Ket quả chiết cao Đãng sâmbang phương pháp hồi hru 27

3.1.7 Ket quà địnhlượnghàm lượng flavonoid và polyphenoltoàn phần 28

3.1.8 Ket quả định lượng saponin toàn phan 31

3.1.9 Ketquà đánh giá chất lượng caochiết theo tiêu chuân Dược điên ViệtNam V 32

3.1.10 Ket quà thừ hoạt tính chống oxy hoá bang phươngpháp DPPH 35

3.1.11 Hoạt tính ức cheperoxy hoálipid tế bào 38

3.1.12 Ket quả thử nghiệm hoạt tính gây độc te bào in vitro của các cao chiết bàng thử nghiệm SRB 41

3.2 Tính ứng dụng và phát triên củađê án 43

CHƯƠNG 4 KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 45

Tài liệu thamkhảo X

Danh mục chữ viết tắt và ký hiệu

Chữ viết

ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase

BHT Butylated hydroxytoluene

Chat chong oxy hoá Butylatedhydroxytoluen

DMSO Dimethyl sulfoxide

HBV-DNA

HepatitisB virus-DNA DNA-virus viêm gan B

HCC Hepatocellularcarcinoma Ungthư biêu mô tế bào gan

HepG2 Te bào ung thư gan ờ người

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

Te bào ung thư vúờ người

MDA Malonyl dialdehyd

OGTT Oral glucose tolerance test

Nghiệm pháp dung nạp glucoseđườnguống

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Giá trị IC50 trình bày hoạt tính gây độc tế bào cùa chiếtxuất c javanica

và DOX chổng lại dòng tế bào HepG2 và MCF-7 10

Bảng 2 2 Quy trình xây dựng đường chuân acid gallic 16

Bảng 3.3 Ket quã đo độâm bột dirợc liệu Đãng sâm 26

Bảng 3 4 Ket quả chiết caoĐãng sâm 27

Bảng 3 5 Mậtđộ quang của acid gallic với các nồng độ kliác nhau 28

Bàng 3.6 Hàm hrợng polyphenoltôngcủa các mẫu cao chiết Đãngsâm 29

Bảng 3 7 Mậtđộ quang của quercetin với các nồng độ khác nhau 29

Bâng 3.8 Hàm lượng flavonoid toàn phần của các mẫu cao Đảng sâm 30

Bảng 3.9 Mật đô quang dãy chuân acid oleanolic đo ờbước sóng 560 nm 31

Bảng 3 10 Hàm lượng saponin toànphần trongcao chiết Đàng sâm 32

Bảng 3 11 Ket quả mất khối lượng do làm khô cao chiết Đãng sâm bang phtrơng pháp đun hồihru 34

Bảng 3.12 Ket quà mất khối lượng do làm khô cao chiết Đảng sâm bằng phương pháp ngâm 34

Bảng 3 13 Khà năng chống oxy hoá bang phương pháp DPPH củaAcid ascorbic35 Bàng 3 14 Hoạt tính chống oxy hoá của caochiết DI 36

Bảng 3.15 Hoạt tính chống oxy hoá của cao chiếtD2 37

Bảng 3 16 Hoạt tính ức chế peroxyhoálipid te bào cùatrolox 38

Bâng 3 17 Hoạt tính írc chế peroxyhoá lipid tế bào cùa cao chiết DI 39

Bảng 3.18 Hoạt tính ức che peroxyhoá lipid tế bào cùa cao chiết D2 40

Bàng 3.19 Phần trăm gâyđộc tế bào cùa các caochiết Đảngsâm bang phtrơng pháp SRB 43

Danh mục sơ đồ

Sơđo 1 Sơ đồ chiết xuấttheo phươngpháp 1 14

Sơđồ 2 Sơđồchiết xuấttheo phươngpháp 2 15

Sơđồ 3 Quy trinh thực hiện thử tác dụng chống oxy hoá bang DPPH 19

Danh mục hình

Hình 1.1 Hình cây Đảng sâm 3

Hình 1.2 Hình lá cây Đảngsâm 3

Hình 1.3 Hình hoa cây Đảng sâm 4

Hình 1 4 Hình ảnh các bộ phận cây Đảng sâm 4

Hình 1 5 Cấu trúc hoá học và một số tương tác của a-spinasterol 5

Hình 1 6 Cấutrúc hoá học của acidarachidic (2) vàacid6-hydroxyoctadecanoic (3) .5

Hình 1 7 Cấutrúc cùa lobetyolin 5

Hình 1 8 Cấu trúchoá học của lobetyolin và các chất liên quan 6

Hình 1 9 Cấu trác hoá học cùa codojavanosides AC (1-3) 6

Hình 1 10 Cấu trác cùa 1,7-octanediol l-O-a-L-arabinopyranosyl-(l—>6)- P-D - glucopyranoside (1); 1,6-octanediol 1-O-ơ-L-arabinopyranosyl-( 1—>6)-p-D -glucopyranoside (2); (2 E)-tetradec-2-en-4,6-diyne-l,8,9,14-tetrol 8- O-p-D-glucopyranoside (3) 7

Hình 1.11 Hoạt tính gây độc te bào 9

Hình 1 12 Cao chiếtn-butanol ức chế mycelia của nấm 10

Hình 3.13 Hình rễĐảng sâm 23

Hình 3 14 Hình vi phẫucuống lá Đảng sâm 23

Hình 3.15 Hình vi phẫu rễ Đảng sâm 24

Hình 3.16 Hìnhsoi bột rễ Đãng sâm 25

Hình 3.17 Hình anh cao Đảng sâm thu được bang phươngpháp ngâm 26

Hình 3 18 Hình ảnh cao Đảng sâmthu được bang phương pháp đun hồi hm 27

Hình 3 19 Biêu đồ mật độ quang cùa acid galic 28

Hình 3 20 Biêu đồ mật độ quang của quercetin 30

Hình 3 21 Biêu đồmật độ quang của acid oleanolic 31

Hình 3.22 Hình ảnh cao chiết Đảng sâm 33

Hình 3.23 Hình ảnh kiêm tra độ đồngnhất của cao chiết Đảngsâm dưới vật kính lOx

33

Hình 3.24 Biêu đồ thê hiện hoạt tínhchống oxy hoá của acid ascorbic 36

Hình 3.25 Biêu đồ thê hiện hoạt tínli chống oxy hoá cùa cao chiết DI 36

Hình3.26 Biêu đồ thê hiện hoạt tínhchống oxy hoá của cao chiết D2 37

Hình 3.27 Biêuđồ thê hiện giá trị IC50 của cao chiết Đãng sâm và acid ascorbic 37

Hình3.28 Biêuđồ thê hiện hoạt tính ức chếperoxy hoá lipid tế bàocủa Trolox 39

Hình 3.29 Biêu đồ thê hiện hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid tế bào củacao chiếtDI .39

Hình 3.30 Biêu đồ thê hiện hoạt tính ức chế peroxy hoá lipid tế bào củacao chiếtD2 .40

Hình 3.31.Biêu đồ thê hiện phầntrăm gây độc tế bào HepG2 cùa cao chiếtĐàng sâm .41

Hình 3.32 Biêu đồthê hiệnphầntrăm gây độc tế bào NCI H460 cùa cao chiết Đảng sâm 42 Hình 3.33 Biêu đồthê hiện phầntrăm gây độctếbào MCF-7 cùa cao chiết Đảng sâm

42

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề án

Việt Nam là một quốc gia có truyền thống sử dụng các vị thuốc tìr thiênnhiênlâu đời Do có điều kiện kill hậu và thô nhưỡng thuận lợi nên rất thích hợp cho các loài thực vật hay động vật làm thuốc sinh sống và phát triên Cùng với đó việc sử dụng các thuốc điều trị bệnh có nguồn gốc hoá học mang lại rất nhiều tác dụng phụ,tác dụng không mong muốn Điều này sẽ được giảm đi rất nhiều khi sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên Trên thế giới xu hướng điều trịbệnh hiện nay là

sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ thực vật hay độngvật

Đàngsâm(Codonopsis javanica) là loàidược liệu quý hiếm.Loài này chứa rất nhiều hoạt chất có khả năng điều trị bệnli và có giá trị kinh tế cao Đãng sâm mang lại rất nhiều tác dụng có lợi cho cơ thê như: tác dụng chống oxy hoá, tác dụng chống lại tế bào ung thư, tác dụng khángkliuân, hạ đường huyết, giúp điều hoà miễn dịch.Đãng sâm có công dụng điều trị tỳ vị suy kém, phế khí hư nhược, kém ăn, đại tiệnlòng, mệtmòi, kliát nước, ốm lâu ngày cơ thê suy nhược, kill huyết hư Việc nghiên cứu về tác dụng dược lý cùa loài cây này cũng đang được đây mạnh Nham chứng

minh giá trị cây Đảng sâm, tìm ra quy trình chiết xuất có hàm lượng hoạt chất cao,nhómnghiên cứu tiến hànhthực hiện đề tài:

Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất, đánh giá chất lượng cao chiết

và hoạt tính sinh học của Đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) đêtiến hành nghiêncíru

1.2 Mục tiêu của đề án

1.2.1 Mục tiêu chung của đề án

Xây dựng được quy trình chiết xuất cao Đàng sâm Đánh giá chất lượng cao chiết Đãng sâm và thử hoạt tính sinh chống oxy hoá của cao chiết Đãng sâm ViệtNam Đánh giá hoạt tính gây độc te bào

1.2.2 Mục tiêu cụ thê của đề án

cùa poĩyphenoỉ, flavonoid, saponin toàn phần có trong cao chiết.

Mục tiêu 2/ Đánh giả chất ỉượìig cao chiết rễ Đãng sâm theo Dược điên Việt Nam V

tê bảo: ung thư phôi, ung thư gan và ung thư vú.

1.3 Phạm vi của đề án

1.3.1 Đoi tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cái trong đề án là: Rễ Đàng sâm thu hái ờ Tinh KonTurn

vào tháng2/2024 (Codonopsis javanica (Blume) Hook.F, Campanulaceae)

1.3.2 Địa điềm thực hiện đề án

Đe án nghiên ciru được thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP HCM

1.3.3 Thời gian thực hiện đề án:

Đe ánđược thực hiện trongthờigian 4 tháng tìr tháng3/2024 đến tháng 7/2024

1.4 Cơ sở lý thuyết của đề án

Đe án xây dựng trên các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước Đe tài đượclựachọn nhằm tìm kiếm những quy trình chiết tối tru cho cây Đãng sâm ViệtNam và

đánh giá các tác dụng sinh học của loài cây Đảng sâmnày

1.4.1 Tên gọi của Đãng sâm

Tên Việt Nam: Đãng sâm, Sâm leo, Đùigà

Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook F., thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae) [1]

Đàng sâm là một loài dược liệu quý được liệtvào danli lục đò cây thuốc ViệtNam [2].

1.4.4 Đặc điêni hình thái

Câythảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn dài khoảng 2-3 m Thân màu lụcnhạt hoặc hơi tím, phân nhánhnhiều

Lá mọc đối, ít khi so le, hìnhtim ờ gốc, nhọn ờ đau, mềm mòng, màu xanli lá

mạ, dài 3-6 cm, rộng 2,5-4,5 cm, mépnguyên lượn sónghoặc hơi klúa răng cưa [1]

Rễ hìnhtrụ dài, đường kính có thê đạt 1,5-2 cm, phân nhánh,đầu rễ phình to,

có nhiều vết sẹo lồi [1]

Hoa mọc riêng lẻ ờ nách lá, tràng hình chuông, màu trắng hoặc hơi vàng, có

vân tím ờ họng Quà nang, hình cầu có 5 cạnh mờ, khichúi màu tím hoặc tím đò, hạt

nhiều Toàn cây và củ có nhựa mủ màu trang [1]

Hìnli 1.3 Hình hoa cây Đãng sàm

1.4.5 Thành phần hóa học

Ket quả địnhtínli các nlióm chất hữu cơ trong rề củĐảng sâm cho thaycó sựhiện diện cùa: tinhdầu, triteipenoid, alkaloid, tannin, saponin và đường khử Tuy vậy,

các hợp chất này có sự thê hiện trong mâu với mức độ khác nhau [3]

Nguyễn Thị Thăng Long vàcộng sự (2020), bang cácphươngpháp sac kýkết

hợp với các phương phápphô,đã phân lập và nhận dạng cấu trúc 3 chất lần đầu tiênđirợc phân lập từ loài Codonopsis javanica: Chất (1) a-spinasterol, chất (2) acid

arachidic và chất (3) acid 6-hydroxyoctadecanoic tìrphân đoạn chiết n-hexan của rề

Đảng sâm Việt Nam(Codonopsis javanica. (Blume) Hook.f.) [4].

Hoàng Đức Nghĩa và cộng sự (2020), từ cao chiết n-butanol trên cột sắc ký

silicagel, dung môi rừa giải là hỗn hợp etyl axetat (E)/metanol (M): E/M = 98/2; E/M

= 97/3; E/M = 96/4; E/M = 95/5; E/M = 90/10; E/M = 88/10; E/M = 85/10; E/M = 80/10 thu được 6 phân đoạn kí hiệu là PD1-6 Quá trình sắc ký cột được theo dõibằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi triên khai là E/M/W = 8/1/0.5 Phânđoạn PD5 được tinhchế lại trêncột silica gel lần thứ 2, sử dụng dung môi lira giãi là

hỗn hợp E/M = 90/10, thu được một hợp chat ran dạng bột trang kết tinh phân đoạnthu được tinh thê (1) Hợp chất phân lập (1) được xác định cấu trúc bằng phô khối

ESI-MS/MS vàđược xác định là lobetyolin[5]

1

lobetyolin: R = /3-Glc

lobetyolinin: R = ^-Glc (6-*1 )-^Glc lobetyol: R=H

Phan Nguyền Hữu Toànvà cộng sự(2020),tiến hành xác địnli ờ rễ Codonopsis

3H13O-m/z 185.1094

sesquiterpenoid mới, được đặttênlà codojavanosides AC (1-3)và9 hợp chấtđã biết:

(37?, 6E, 10S)-2,6,10-trimethyl-3-hydroxydodeca-6,ll-diene-2,10-diol (4), (E)-2-

hexenylơy?-D-glucopyranoside (5), oct-l-en-3-ol ơ-«-L-arabinopyranosyl-( 1"—>6')-

ơ-^-D-glucopyranoside (6), (Z)-3-hexenyl ơ-«-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-/?-D- glucopyranoside (7), tangshenoside I (8) và II (9). tangshenoside V (10) và VI (11)

corchoionoside c (12) [6].

Nông Thị Anil Thư và cộng sự (2023), hr chiết xuất methanol của rễ cây c

javanica (Blume) Hook.f & Thomson., đã phân lập đtrợc hai octanediol glycoside

mới là: l,7-octanedioll-ơ-ỡt-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-/?-D-glucopyranoside (1) và 1,6-octanediol l-ơ-a-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-/?-D-glucopyranoside (2), một

polyacetylene glucoside mới (2£)-tetradec-2-en-4,6-diyne-l,8,9,14-tetrol 8-Ơ-/TD- glucopyranoside (3)và tám hợp chất đã biết, (£)-2-hexenyl ơ-a-L-arabinopyranosyl-(1—>6)-/?-D-glucopyranoside (4), (£)-2-hexenyl ơ-/?-D-glucopyranoside (5), (Z)-3-

hexenyl ơ-a-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-/?-D-glucopyranoside (6), (Z)-3-hexenyl ơ-/?-D-glucopyranoside (7), cordifolioidyne B (8), l-(l-/?-D-glucopyranosyl)-l H-

indole-3-carbaldehyde (9), tangshenoside II (10),và (65, 95)-roseoside (11) Các cấu trúc được xác định bằng phântích quang phố NMR1Dvà2D,HR-ESI-MS [7]

-glucopyranoside(1); 1.6-octanediol 1-ơ-a- L -arabinopyranosyl-(l—»6)-/?-D -glucopyranoside(2);

(2 £)-tetradec-2-en-4,6-diyne-l,8,9,14-teưol 8- ơ-/?-D-glucopyranoside(3)

I.4.6.I Tác dụng điều hoà miễn dịch

Lanfang Wu và cộng sự (2021), tiến hành sừ dụng phương pháp chiết nước

nóng, đượctách vàtinh che bang cột DEAE-cellulose và cột Sepharose CL-6B cấu

trúc của thành phần tinh khiết đirợc đặc trưng sơ bộ bằng sắc ký khí khối phô (GC- MS), sắc ký thâm thấu gel hiệu năng cao (HPGPC) và quang phô hồng ngoại (IR)

Bang cách kiêm tra mức độ quá mẫn loại muộn (DTH) ờ chuột và chi số thanh thài

hạtcarbon, hoạt động điều hòamiên dịch đã được làm rõ Ketquảcho thấy tỷlệ chiết

polysaccharides cùa c.javanica (CJP) là 24,9 ± 0,5% Sau khi tinh chế, thu được

thành phầnpolysacarid tinh chế (CJP-2) CJP-2 chù yếu bao gồm mannose, glucose

và galactose và trọng lượng phân từ cùa nó là 790 Da Kết quả điều hòa miên dịch

cho thấy ờ nồng độ CJP thấp và tiling bình tăng đáng kê mức độ DTH ờ chuột (P <

0,05) CJP có thê cải thiện chi số thanh thải của chuộtvà tăng ctrờng chức năng loại

bòhạtcarbon.Nghiên cứu đã cho thấy rang C.javanica làmột nguồn polysaccharides

dồi dào và chứa loại chất cókhả năngđiềuhòamiền dịchmới [8]

Tác dụng chống oxy hóa củachiết xuất cũng được thê hiện qua giá trị IC50- Giá trị IC50 của chiết xuất của Đãng sâm và acid ascorbic (đối chứng dương) lan lượt là

46,8 ± 6,8 mg/ml và 10,8±0,1 mg/ml [9]

I.4.6.3 Tác dụng kỉiáng khuân

KetquâMIC (Minimalinhibitory concentration) cho thấy ờnong độ200 pg/ml chiết xuất Đảng sâm cóthê ức chế hoàn toànsự phát triên củaE coìi Tuy nhiên, 20

pg/ml chiếtxuất khôngkìm hãm sự phát triên của E coỉi Trong khi chiết xuất đượcpha loãng đê đạt được nồng độ thấp hơn 150 pg/ml và 100 pg/ml Chiết xuất ở nồng

độ 150 pg/ml cókhả năng ức chế hoàn toàn sự phát triên cùaE coỉi Còn ờ nồng độ

130 pg/ml, chiết xuất không hoàn toàn kiềmche sự phát triên của vi khuân Những

dữ liệu này xác nhận rằng giá trị MIC của chiết xuất chống lạiE coỉi là 150 pg/ml

[9]

Dịch chiếtĐảng sâm thê hiện tính kháng khuântrên chùngp aeruginosa, s.

đó, chiết xuất cùa Đãng sâm có hiệu quả chống lại cà bốn chùng vi khuẩn được thừ

nghiệm Nó đặc biệt cho thấyhoạtđộng mạnh nhất chống lại B cereus vìgiá trị MIC

là 90 pg/ml, thấp nhất trong tất cả các nồng độ thừ nghiệm [9]

Thi Huong Trinhvà cộng sự (2021), sau klũ sàng lọc mộtsốhợpchấthoạt tính

sinh học quan trọng cùa rề và tiến hành địnli lượng hai hợp chất hoạt tính sinh học

quan trọng nhít polysacarid và polyphenol Ket quả cho thấy sinh kliối cùa

polysacarid (16,98%), polyphenol (1,876 mg GAE/g DW) và giá trị nồng độ ức chế nửa tối đa(IC50)đượcxácđịnh bời 2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl là2,44 mg/ml [10]

1.4.6.4 Hoạt động chống ung thư

Toan Phan và cộng sự(2020), tiếnhành đánh giá tác dụnggâyđộc tế bào cùa cáchợp chấtphân lậpđược từ Đãng sâm đối với ba dòng tế bàoung thư ờ người, bao

gồm te bào A549, tế bào HepG2 và tế bào MCF7 Ket quã cho thấy các hợp chất codojavanosides A-C (1)và (2);(3 R ,6 E ,10 5)-2,6,10 -trimethyl-3-hydroxydodeca- 6,1 l-diene-2,10-diol (4); và tangshenoside VI (11) có biêu hiện độc tính tế bào yếuđối với dòng te bàoA549,với cảmứng Tỳ lệ chếttế bào dao động từ40,8-66,4 % ờnồng độ 100 pM [6]

Chiếtxuất rề Đăng sâm thê hiện độc tính te bào ờ mức 100 pg/ml, tương ứng với khả năngcủa DOX ờ nồngđộ 6,25 pg/ml chốnglạicác te bào HepG2 trong Hình

1.5 Tương tự chiết xuất cũng chống lại các tế bào MCF-7 ờ 100 pg/ml, tương ứng với khả năng của DOX ờ nồng độ 12,5 pg/ml Trong khi đó, DMSO ờ mức 1,0%

tương ứng với nồng độ được sừdụng đê hòa tan chiết xuất ờmức 100 pg/ml khôngthê hiện hoạt động gâyđộc tế bào nào đối với cả te bào HepG2 vàMCF-7 [9]

C.ịavamcachổng lại tế bào ung thư biểu mô tế bào gan ờ người Tế bào HepG2 và tế bào

Giá trị IC50 chứng minh hoạt động gâyđộc tế bào cùa chiết xuất từ Đảng sâm chống lại các tế bào HepG2 và MCF-7 là không đáng kê Chiết xuất Đảng sâm đặc

biệt thê hiện độc tínhtebào yếuhơn khoãng 15 lầnso với DOX đổi với te bàoHepG2

và 9,5 lần đối với tế bào MCF-7 Nghiên cứu đã cho thấy độc tính tế bào của chiết

xuất rề Đảng sâmchống lại các tế bào HepG2 và MCF-7 [9]

Bàng 1.1 Giá trị IC50trình bày hoạt tính gây độc tế bào của chiết xuất c javanica

và DOX chống lại dòng tế bàoHepG2 và MCF-7

Hoạt tính kháng sinlicủa cao chiết n-butanol cùa Đàng sâmtrên nấm s roifsij

và F oxysporum tại nồng độ 1 mg/ml Tại thời điêm 1 ngày sau klii nuôi cấy, cao chiết n-butanol ức chế 35-56% sự phát triên của nấm s. roifsii. Trên đĩa petri quan

sát được nấm s roựsiỉ phát triên rất nhò cho thấy cao n-butanoltừ Đãngsâm có hiệu

quả ức che đángkê; sau 2 ngàynuôi cay, lie chế 13-49% nấm s rolfsii. Đối với nấm

F oxysporum, hoạt tính của cao chiếtn-butanol thê hiện hoạt tínhkháng nấm không

đángkê; hiệu quả ức chế 18-37% đối vớimycelia cùaF oxysporum sau 1 ngày và

6-24% sau 3 ngàynuôi cấy[5]

.4: tiấĩii s rolfsii; B: ỉiấin F oxysporiim

1.4.6.6 Tác dụng hạ đường huyết

Kun-Ning Chen và cộngsự(2013),đã thực hiệnphân tíchthốngkê mức insulinlúc đói tăng đáng kê sau 8 tuần cho ăn bằng đường fructose (2,6 ±0,45 pg/L) so với

chuột đối chứng (1,5 ± 0,27 pg/L) (p < 0,01) Mức tăng đạt tối đa (3,89± 0,43./2 <

0,001) khi cho ăn fructose liên tục vào tuần 12 Tăng insulin máu đã được xác nhậnsau 8 tuần cho ăn bang fructose, nliư được biêu thị bằng giá trị insulinvàIAUC cao hơn theo OGTT Nồng độ insulin tăng cao đã giảm xuống đáng kê sau khi điều trị bằng chiết xuất c javanica ở Nhóm 3 (p < 0,05) so với mírc giảm ờ nhóm chi

dùng fructose Hơn nữa, nồng độ insulintăng cao (p <0,001) trong OGTT ờ tuần 12

cũng giảm cùng với giá trị IAUC giảm khí dùng C.javanica [11]

Đảng Sâm c javanica là loài dược liệu quý, tính bình, hơi ấm, quy vào haikinhPhế và Tỳ.Theo y học cô truyền, bộphận sử dụng chínhlà rễ cũ Công năng: Bô

tỳ, ích khi, sinh tân chi khát

Đảng sâm chủ trị: Tỳ vị suy kém, phế klú hư nliược, kém ăn, đại tiện lòng,người mệtmỏi, cơthê suynhược do ốmlâu ngày, khíhuyết hư

ỉ 4.8 Tình hình nghiên cứu trong nước và nước ngoài

LanfangWu vàcộng sự(2021), đã nghiên cứu tácdụng điều hoà miễndịch cùa

C.javanica vàthê hiện được tác dụng điều hào miễndịch [8]

Hiện nay các nghiên cứu về Đảng sâm (C.javanica) ờnước ngoài chưa tìmthấy

các nghiên cứu về thử hoạt tính gây độc trên các te bào ung thư

Rễ Đảngsâmthêhiệnđộc tính tế bào ờmức 100 pg/ml, tương ứng với khảnăngcùa Doxorubicin ờ nồng độ 6,25 pg/ml chống lại các te bào HepG2 Tương tự, chiết

xuất cũng chống lại các tế bào MCF-7 ờ 100 pg/ml, tương ứng với khả năng cùa

Doxorubicin ờ nồng độ 12,5 pg/ml [9]

Chiếtxuất rễ có tác dụng gây độc tế bào đáng kê chống lại HepG2 với giá trị

IC50 = 83,6 ± 2,7 pg/mLvàtế bào MCF-7 với IC50 = 95,3 ± 2,3 pg/mL

Toan Phanvà cộng sự (2020), tiến hành đánli giá tác dụng gây độc tế bào của cáchợp chấtphân lậpđirợc từ Đãng sâm đối với ba dòng tế bàoung thiĩờngirời, bao

gồm tế bào A549, tế bào HepG2 và tế bào MCF7 Ket quả cho thay các hợp chất có

biêu hiện độc tế bào yếu đối với dòng tế bào A549 Tỳ lệ chết tế bào dao động từ 40,8-66,4 % ờ nồng độ 100 pM [6]

CHƯƠNG 2 NỘI DƯNG NGHIÊN cứu ĐÈ ÁN

2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu

Thiết bị

2 Máy đo quang phồ Thermo Scientific PhầnLan

3 Máy côquay chân không Heidolph Đức

5 Cân phân tích 4 sổ lẻ Đức

6 Bếp đun cách thủy Tày Ban Nha

10 Cân điện từ Trung Quốc

Dụng cụ

13 Bìnhlẳnggạn 500 ml Trung Quổc

14 Đũa thuỷ tinh Tiung Quốc

15 Pipet paster 3ml Trung Quốc

Hoá chầt

17 DPPH (2,2-diphenyl-l picrylhydrazyl) Merck

2.2 Nhiệm vụ và giải pháp thực hiện

lượng hàm lượng cna polyphenol, flavonoid, saponin toàn phần có

trong cao chiết.

2.2.1.1 Xây dựng quy trình chiết xuất cao Đảng sâm

Nhiệm vụ: Xày dựng được quy trình chiết xuất cao Đàng sâm đạt hiệu suất chiết cao, có hàm hrợnghoạt chất cao

Giải pháp: Nguyên liệu khô, cân xác định khối hrợng, xay nhuyễn, xác định

hàm âm bộtdược liệu Tiến hànhchiết với 2 phương pháp

Phương pháp 1: Chiết bằng phương pháp ngâm với dung môi cồn 70% theo

tỳlệ khốilượng trênthê tích (kl/tt), lần 1 tỷ lệdược liệu với dungmôi (dl/dm) là 1/5,

lần 2 tỳ lệ dl/dm là 1/3 Ngâm trong 12 giờ Thu dịch chiết của 2 lan chiết Cô quay

ờ 60 °C thu được cao chiết DI [12]

Sơ đồ 1 Sơ đồ chiết xuất theo phương pháp 1

Phương pháp 2: Chiết bằng phương pháp đun hồi lưu ờ 60 °C trong 30 phút với dungmôi là cồn 70% Lan 1 chiết xuất với tỳlệ dl/dm là 1/5, lần 2 tỷlệ dl/dm là

1/3 Thu dịch chiết của 2 lần chiết Cô quay ờ 60 °C thu được cao D2 [13]

Sơ đồ 2 Sơ đồ chiết xuất theo phương pháp 2

Xác định hàm âm cho các cao thu được bang cân sấyâm hồngngoại

2.2.1.2 Định lượng flavonoid và polyphenol toàn phần của các cao chiết

Nhiệm vụ: Định lượng được hàm lượng polyphenol tông và hàm lượng flavonoid toàn phầncótrong cao chiết Đàng sâm đã chiết được ờ mụctiêu 1

Trongthành phần thuốc thừ Folin-Cocalteu có hỗn hợpphosphomolybdate và

phosphotungstate hoạt động theo cơ chế phản ứng oxy hoá-khử Klii có mặt dung

dịch Na2CƠ3 các phân từ polyphenol phân lytạo thành anion phenolate phàn ứng với hỗn hợp phosphomolybdate và phosphotungstate tạo nên hỗn hợp có màu xanh

dương Cường độ màu xanh dương của hỗnhợp có thê được đo lường thông qua độ

hấp thu bời máy trắc quang với bước sóng 758 nm Hàm hrợng polyphenol tông có

trong mầu ti lệthuận với cường độ màu

Tiến hành xây đường chuânacid gallic (Sigma) như

Lắc đều, để yên trong tối 2 giờ sau đó quét bước sóng 758 nm

với methanol hoặc dung môi tương ứng với cao clũết thành một thê tích xác định Sau đó lấy200 pl dung dịch đã pha loãng đê định lượng polyphenol trongmầu theo quy trình bảng 1 Xác định hàm lượng polyphenol trong các cao chiết Hàm lượng

polyphenol tống (mg GAE/g cao chiết) [14],

Định lượng flavonoid toàn phần

Hàm lượng flavonoid tông được xác định theo mô tả cùa Chang và cộng sự

(2002) có hiệu chỉnh, xây dựng đường chuẩn với quercetin (Sigam) Hút đồng lượng

1 ml dung dịch quercetin (hàm lượng 10-60 pg) và AlCh 2% (hãng chemisol), đê phàn ứng trong 10 phút Tiếnhành xác định độ hấp thụ bang máy đo quang phô UV-VisHeÂiosy (Unicam Limitted - Anh) ờbước sóng 415 nm Các mẫu cao chiếtđượctiếnhànhtươngtự với quercetin, thí nghiệm được lặp lại 3 lan Hàm lượng flavonoid

toàn phầncùa cáccao chiết được biêu diễn theo miligam đtrơng lượng quercetin trên

gam cao chiết [15].

2.2.1.3 Định lượng saponin toàn phần trong cao chiết Đảng sâm bang

phương pháp vanillin - sulfuric

Nhiệm vụ: Xác định được hàm hrợng saponin toànphan chiếtđược trong cao

chiết tìĩ rễ Đàng sâm

Giảipháp:

Xử lý mầu: Cânchínlixác khoảng 0,5 g mỗi mầu thừ nghiệm Pha loãng trong

bình định mức 50 ml bằng dung môi đếnvạch thu được dịch mẫu trong thừ nghiệm

định lượng saponin

Hàm lượng saponin tông được xác định theo phương pháp vanillin - sulfuric,được mô tả bời Anhvà cộng sự (2018) [16], có hiệu chinh nliư sau: 0,25 mL mẫu

trộnđều với 0,25 mL dungdịch vanillin 8% (w/v) vàcuối cùng bô sung 2,5 mL dung

dịch acid sulfuric 72% (w/v) và trộn đều trong đá Sau đó, hỗn hợp được làmấm ờ

60 °C trong 15 phút và làm mát lại trong nước khoáng 5 phút Ket quã được đo ờbước sóng 560 mn băng máy đo quang phô UV-Vis Hàm lượng saponin toàn phân

được tínlidựa trên đường chuân oleanolic acid

Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức sau:

m

Trong đó: X (%) là hàm lượng saponin có trong mầu

c (pg/ml) là hàm lượng saponin cùa mẫu suy ra từ đường chuân

V: Độ pha loãngmẫu

p: Độ tinh khiết chuẩn (98%)

m: khối lượng mẫukhô tuyệtđối

2.2.2 Mực tiên 2: Đánh giá chất lượng cao chiết theo tiêu chuân DĐVN V

Nhiệm vụ: Tiến hành kiêm tra các chi tiêu của cao chiếttheo Dược điên ViệtNamV

Giảipháp:

Thử nghiệm độ tan

Cao lỏng phải tanhoàntoàn trong dung môi đã sử dụng điều chế cao Lấy một

hrợng cao chiếtvừa đủ, thêm tìĩ từ dung môi đã chiết xuất cao Lắc nliẹ, đê yên vàiphút Dung dịch thu được phải trong suốt, không đục, khônglang cặn

Thử nghiệm độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc

Cao chiết phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị

đặc trưng cùa dược liệu sử dụng Ngoài ra, cao chiết còn phải đồng nliất, không có vángmốc, không có cặn bã dirợc liệu và vật lạ

đậy lên cao chiết cho độ dày cùa lớp cao chiết khoảng 0,05 mm Quan sát dưới kínhhiên vi, cao chiết phải đạt các yêu cầu quy định Neu không đạt,phải thừlại lần hai

Thủ nghiệm mất khối lưọng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác)

Cao đặc không quá 20% Caokhô không quá 5%

bang cân sấy âm hồng ngoại Cân nhanh khoảng 2,000 g cao chiết vào Đĩa nhôm.Dùng máy sấy ầm, sấy ờ 100 °C đến 105 °C cho đen kill hiênthịkết quả Thực hiệnlặp lại 3 lần, lấykết quà trang bình

DPPH và khả năng ức che peroxy hóa lipid te bào

2.2.3.1 Hoạt tính chống oxy hoá các cao chiết bang phưong pháp DPPH

Nhiệm vụ: Đánh giá hoạt tính chống oxy hoá cùa cao chiết Đãng sâm bang

phương pháp DPPH

Giảipháp:

Nguyên tấc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc ựr do sẽ làm giảm màu của gốc ựr do l,l-diphenyl-2- picrylhydrazyl

(DPPH) (Sigma) Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có

hấp thu cực đại tại X = 515 nm [17], [18]

Cách tiến hành: Cho 0,5 ml mẫu thử ờ các nồng độ khảo sát được cho phàn ứngvới đồng lượngdung dịch DPPH 0,8 mM pha trong methanol Hôn hợp sau khiphađược đê ờnhiệt độ phòng30 phút Đo quang ở bước sóng X = 517 nm

Tinh toán kết quà

Công thức tính %hoạt tínli chống oxy hóa (HTCO):

ODc: Mậtđộ quang của chứng

ODt: Mật độ quang của mẫu thừ

Các số liệu kết quả thừ nghiệm được biêu thị bằng trị số trungbình cùa 3 lan

đo kliác nhau.Acid ascorbic (Merck, Đức) được sử dụng làm chứngdiĩơng

Sơ đồ 3 Quy trình thực hiện thừ tác dụngchống oxy hoá bằng DPPH

2.2.3.2 Thử nghiệm ức chế peroxy hóa lipid tế bào

Nhiệm vụ: Đánli giá khả năng ức che peroxy hóa lipid tế bào của cao chiết

Đãng sâm

Giảipháp:

Chuột nhắt trắng đực (chùng Swiss albino), 6 tuần tuồi, có trọng lượng trang

bình 25 ± 2 g, được cung cấp bờiViện Vac xin và Sinliphâm Y te- TP Nha Trang Chuột được nuôi bằng thực phâm viên (được cung cấp bời Viện vắc xin và SinhphâmY tế -TP Nha Trang), nước uốngđầy đũ và được đê ônđịnli (trong điều kiệnnhiệtđộ phòng 28 ± 2 °C, độ âm tương đối 60 -70%, ánh sáng đàm bảo 12 giờ tối/12

giờ sáng) ít nliất một Plan tnrớc khithừ nghiệm

Nguyen tấc: Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu

qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sàn phàm của quá trình

peroxy hóa lipid màng tế bào MDA có khả năngphản ứng với acid thiobarbituric đê

tạothànhphức hợp trimethin(màu hồng) có đỉnh hap thu cực đại ờ À = 532 mn [19], [20]

với dịchđồngthê não và thêm đệm phosphat vừa đủ2 ml u hỗn hợp phàn ứng trong

15 phút và dừng phản ứng bang acid tricloacetic (Merck) Sau khi ly tâm lấy dịchtrong cho phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric (Sigma) trong 15 phút Tien

hànhđoquang ờ bước sóng À = 532 nm

Tính toán kết quâ

Công thức tính % hoạt tínhchống oxy hóa (HTCO):

ODc: Mậtđộ quang cùa chứng dung môi (DMSO)

ODt: Mật độ quang cũa mâu thừ

Các số liệu kết quả thừ nghiệm được biêu thị bằng trị so tiling bìnhcùa 3 lần

đokliácnliau Trolox (Calbiochem Ltd Co.), đồngphâncủavitaminE được sử dụng

làmchất đối chiếu

2.2.4 Mục tiêu 4: Đánh giá hoạt tính độc te bào ill vitro cùa các cao chiết

bằng thừ nghiệni SRB

Nhiệm vụ: Đánh giá khả năng gây độc của cao chiết Đàng sâm trên các dòng

tế bào ung thư gan(HepG2), tế bào ung thư vú (MCF-7) vàtế bào ung thư’ phôi (NCI

H460)

Giải pháp:

Nguyên tắc

Thừ nghiệm SRB (Sulforhodamine B) là một phương pháp so màu đơn giản

và nhạy đê xác định độc tínhtế bào cùa một chat SRB là một thuốcnhuộm tích điện

âm sẽ liên kết tĩnh điện đượcvới các phầntích điện dương củaprotein Lượng thuốc

nhuộm liên kếtsẽ phàn ánhlượng proteintông cùa tế bào [21], [22]

Trong thừ nghiệm, tế bào được cố định, lira và nhuộm với SRB Sau đó SRB

liên kết với protein tế bào đirợc hòa tantạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật

độ quang đo được cùadung dịch tirơng quan với lượng protein tông hay số lượng tếbào Sựthay đôi lượng tế bào so với mầu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất

nghiên círu

Nuôi cấy tế bào

Dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư phổi (NCI H460), ung thư gan (Hep G2) doATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trongmôi trường E’MEM (MCF-

7, NCI H460, và Hep G2) hoặc RPMI (Jurkat) có bổ sung L-glutamine (2 mM),

HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 pg/ml), penicillin G (100 Ul/ml), streptomycin (100 pg/ml), 10% (v/v) huyết thanhbào thai bò FBS vàủ ở 37 °C, 5%

CƠ2

Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bang phương pháp SRB

Te bào đơn được cay trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tếbào/giếng (đối với dòngtếbào Hep G2 và MCF-7); 7,5.103 tếbào/giếng (đối với dòng

NCI H460) Sau 24 giờ nuôicấy,quầnthê tế bào đượcù với chất khảosát ờ các nồng

độ trong 48 giờ Sau đó, protein tông từ tế bào thử nghiệm được cố định bang dung dịch Trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộmvớidungdịchSulforhodamine

B 0,2% (Sigma) Ketquả đirợc đọc bằng máy ELISA reader ờ hai bước sóng 492 nm

và 620 mn Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả đirợc trình bày dưới dạng

giá trị tiling bình ± độ lệch chuân

Xừ lý kết quá

Sau khi có giá trị mật độ quang ờ bước sóng 492 nm và 620 nm (kýhiệu làOD492 và ODố2o);

- Tính giá trị OD = OD492 -ODố2o(1)

- Tính OD492 (hoặc ODó2o) = ODtb - ODbiank(2)

- Tínhti lệ (%) gây độc te bào theo công thức:

%I = 1 X100%