COLI SINH ESBL --- 43 KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CẮN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG TLC --- 44 PHÂN LẬP HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG E.. Năm 2006, Nalisha và cộng sự ti
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 12 năm
Tháng 12/2018, Phòng thí nghiệm Vi Sinh 01 - Cơ sở 3, Trường Đại học Mở - TP Hồ Chí Minh và Phòng 19 - Phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học đã phối hợp tổ chức Hội thảo khoa học quốc tế về Tổng hợp hóa học và ứng dụng vật liệu nano trong y sinh.
01 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP HCM
Chủng vi sinh vật nghiên cứu
Chủng vi khuẩn nội sinh cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum
Et thonn) Bacillus sp RD26 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh,
Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Chủng vi khuẩn E coli sinh ESBL 128a được cung cấp bởi Bộ môn Xét nghiệm, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
- Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA)
- Các muối khoáng: CaCO3, MgSO4
- Các dung môi: n-hexan, ethyl axetat, chlorofrome, dichloromethane, methanol, DMSO
- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất
- Silica gel dạng hạt dường kính 0,04 – 0,06 mm
- Sắc ký bản mỏng có tráng sẵn TLC silica gel F254.
Thiết bị và dụng cụ
- Máy ly tâm lạnh - Tủ ấm - Cây cột sắc ký
- Máy vortex - Tủ sấy - Kẹp treo cột, giá sắc
- Máy đo pH - Nồi hấp - Lọ bi
- Máy chụp hình - Đĩa petri - Cốc thủy tinh, ống nhỏ giọt
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
- Kính hiển vi - Máy cô quay - Máy cô quay thu hồi dung môi
- Tủ lạnh - Ống đong - Bình cô quay
- Cân điện tử - Ống nghiệm - Giấy lọc
- Tủ cấy - Becher - Phễu, bếp điện hồng ngoại
- Các loại micropipette và các đầu típ tương ứng (100 - 1000 𝜇L, 20 – 200 𝜇L)
- Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, que cấy trang
Dựa vào mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm
Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26
Thu nhận cao chiết từ các hệ dung môi khác nhau (HE, Cl, DI, EA, Me, W)
Xác định hoạt tính kháng khuẩn từ các cao chiết thô
Xác định nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC)
Khảo sát các phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào
Dịch ngoại bào Dịch nội bào
Thu nhận phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính sinh học kháng E coli sinh ESBL bằng phương pháp sắc ký cột cao chiết
Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng E coli sinh ESBL
Khảo sát khả năng kháng E coli sinh ESBL của cao chiết từ các hệ dung môi khác nhau
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp RD26
Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp RD26
Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch ngoại bào Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chủng Bacillus sp
RD26 thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Kumar và cs., 2009)
Môi trường NB và môi trường MHA thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121 o C /
20 phút Môi trường MHA được đổ đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 mL
1.3.2.2.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn E coli sinh ESBL
Chủng vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24h ở 37 o C
Chọn một khuẩn lạc đơn, cấy vào 9,9 mL nước muối NaCl 0,85% và lắc đều bằng máy vortex Đo độ đục của dịch vi khuẩn ở bước sóng 610 nm và điều chỉnh sao cho đạt mật độ tế bào khoảng 10^8 tế bào/mL, tương ứng với độ đục của ống McFarland 0,5 Dịch vi khuẩn E coli sinh ESBL đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút.
1.3.2.2.3 Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm
Vi khuẩn được hoạt hóa bằng cách lấy một ít sinh khối từ môi trường thạch nghiêng NA vào bình erlen chứa 20 mL môi trường NB Nuôi cấy lắc ở 37 o C / 24 giờ, tốc độ lắc 200 vòng / phút (Chen và cs., 2007) Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ phút ở 4 o C trong 10 phút thu dịch nổi Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Tiếp theo, lấy dịch nổi đã ly tâm đem lọc qua màng lọc 0.2 𝜇𝑚 (Shrivastava và cs., 2013)
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
Pha loãng vi khuẩn thử nghiệm với nước muối sinh lý 0,85% và so độ đục với ống McFarland 0,5 sẽ có nồng độ vi khuẩn tương đương là 1 – 2x10 8 CFU/ mL Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Tiến hành trải dịch cho tới khi thấy mặt thạch khô, mỗi lần xoay hộp 60 o Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ vô trùng
Dựng micropipet hỳt 100 àL dịch lọc vi khuẩn thử nghiệm bơm vào mỗi giếng Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch Ủ 24h/ 37 o C, đọc kết quả vòng kháng
Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện lần lượt từng dịch chiết được tách từ các dung môi khác nhau (Bexfield A và cs, 2008)
Vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn
Hình 2.1 Kết quả kháng khuẩn của vi khuẩn thử nghiệm
Xác định khả năng kháng E coli sinh ESBL từ dịch nội bào Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
1.3.2.3.1 Thu nhận sinh khối Bacillus sp RD26 bằng phương pháp sóng siêu âm
Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 10000 vòng/ phút, trong 10 phút ở 4 o C
Rửa tế bào bằng cách phân tán lại trong 3 mL NaCl 0,9%
Vortex kĩ, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
Chỉnh OD600 = 1 bằng đệm phosphat 0,1M pH = 7 (xác định tỉ lệ thích hợp giữa huyền dịch vi khuẩn và dung dịch đệm)
Bổ sung DTT đến nồng độ 10 mM để giảm quá trình hợp chất của chủng
Bacillus sp RD26 bị oxy hóa, ủ đá để mẫu đạt nhiệt độ 0-5 o C
Tán siêu âm 6 lần duy trì nhiệt độ không đổi, mỗi lần tán 30 giây Đầu dò có kích thước dài 9 cm, với chu kì 50% Trước các lần tán siêu âm, mẫu phải đạt nhiệt độ 0-5 o C Lấy khoảng 10 μL nhuộm đơn và quan sát trên kính hiển vi để theo dõi hiệu quả phá vỡ tế bào Mẫu sau khi tán siêu âm có thể giữ đông ở -20 o C
Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4 o C trong 10 phút Thu dịch nổi (dịch phá vỡ tế bào chứa enzyme) (Nguyễn Đức Lượng, 2011)
Thí nghiệm được tiến hành như mục 1.3.2.1.1, 1.3.2.1.2, 1.3.2.1.4
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0
Nuôi cấy và thu nhận cao chiết Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp RD26 bằng phương pháp lên men trên môi trường tối ưu
Công thức môi trường tối ưu trong quá trình lên men chủng Bacillus sp RD26 đã được kế thừa từ nghiên cứu trước “Xác định các điều kiện ảnh hưởng và tối ưu hóa khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc từ chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được phân lập từ cây Diệp hạ châu đắng” (Dương Nhật Linh và cs., 2018)
Hoạt hóa giống: Chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được hoạt hóa bằng cách lấy một ít sinh khối từ thạch nghiêng trên môi trường NA vào bình erlen chứa 20 mL môi trường NB, nuôi lắc ở 35 o C/36h, pH =7, tốc độ lắc 200 vòng/phút
Nhân giống: điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 có mật độ tế bào khoảng
10 8 tế bào/mL Bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn Bacillus sp RD26 sau khi hoạt hóa vào 100 mL môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng Bacillus sp RD26 (pepton:
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
7,36 g/L, glucose: 15 g/L, CaCO3: 0,72 g/L, MgSO4: 0,6 g/L) trong bình erlen 100 mL với tỷ lệ 1/20 theo thể tích dùng nuôi lắc ở 35 o C/36h, tốc độ lắc 200 vòng/phút (Shrivastava và cs., 2013)
Lên men: bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn giống cấp 2 vào môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng vi khuẩn ở 30 o C/36h, pH=7.
Thu nhận cao chiết Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
Quy trình điều chế cao phân đoạn
Cao phân đoạn được tiến hành điều chế từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng cách sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau như HE, Cl, DI, EA, Me, W với tỉ lệ 1:1 Quy trình điều chế cao phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2.2
Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao phân đoạn dịch vi khuẩn
Sau thời gian lên men tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 10 phút thu dịch nổi Thu 100 mL dịch khuẩn tiến hành chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi:
HE, Cl, DI, EA, Me, W với tỉ lệ 1:1 Sau đó thu dung môi kèm với các thành phần kháng khuẩn có trong đó Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi
Dịch khuẩn sau khi lọc
Thu nhận cao chiết HE, Cl,
SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU
Tiến hành cô quay dịch chiết và dung môi ta thu được cao chiết thô Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Thử khả năng kháng E coli sinh ESBL từ cao chiết Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa kirby-bauer
Cao chiết thô sau khi được thu nhận ở mục 3.3.2 được hòa tan trong DMSO 1% đạt nồng độ gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm tối ưu Thí nghiệm được thực hiện như mục 1.3.2.1.4
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibatory Concentration) của cao chiết với vi khuẩn E coli sinh ESBL
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết chủng Bacillus sp RD26 được xác định bằng phương pháp pha loãng (Wiegand và cs., 2008)
Nhằm xác định sự kìm hãm sự tăng trưởng của vi khuẩn thử nghiệm khi được ủ chung với cao chiết chủng Bacillus sp RD26, khảo sát trong 16 - 20 giờ (Wiegand và cs., 2008)
Phiến Microwell 96 giếng được ngâm cồn 70% trong 2 giờ để diệt khuẩn, sấy khô và chiếu UV trong 2 giờ
Cao chiết chủng Bacillus sp RD26, dịch vi khuẩn thử nghiệm
Môi trường MHB đã được hấp vô trùng ở 121 o C/20 phút để tiến hành tăng sinh các vi khuẩn thử nghiệm
