Sàng lọc và đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất từ chủng Bacillus sp. RD26 đối với vi khuẩn E. coli sinh β-Lactamase phổ rộng ESBL

VI KHUẨN Bacillus

Bacillus có khả năng sinh các chất chuyển hóa sơ cấp như nucleotide xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid, … Dưới điều kiện sống thiếu dinh dưỡng Bacillus còn có khả năng sinh các loại kháng sinh peptid như surfactin vừa có tính kháng khuẩn, vừa có tính diện hoạt mạnh, hay subtilin có hoạt tính kháng khuẩn và kháng khối u. SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 14 Năm 2006, Nalisha và cộng sự tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích điều tra đặc điểm của hợp chất hoạt tính sinh học được sản xuất bởi Bacillus subtilis chống lại Sclerotium rolfsii - loại nấm gây bệnh trên thực vật.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỢP CHẤT TỪ BACILLUS

Theo nghiên cứu của Arun và cộng sự đã phân lập các chủng vi khuẩn và vi nấm từ Terminalia arjuna, Azadirachta indica và Catharanthus roseus, trong đó chủng vi khuẩn NRL2 có hoạt tính kháng cao đối với chủng Staphylococcus aureus và dịch chiết thô từ chủng vi khuẩn này cũng có khả năng kháng MRSA (Arun và cs., 2015). Một nhóm nghiên cứu đã tiến hành đánh giá sàng lọc và phát hiện 1 chủng xạ khuẩn Micromonospora sp G006, phân lập từ mẫu trầm tích tại Vịnh Hạ Long, có khả năng sản sinh hoạt chất chloramphenicol (G016-1) - một hoạt chất đang được sử dụng làm thuốc kháng sinh, là tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất kháng sinh chloramphenicol (Phạm Văn Cường, 2015).

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT

Chủng vi khuẩn 045 – 203 - 4 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với 6 chủng vi khuẩn gây bệnh cho người và sinh vật biển, đó là Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus và Streptococcus faecalis. SVTH: ĐỊNH THỊ THÚY KIỀU 18 Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực như eter dầu hỏa hoặc hexan, eter etyl, cloroform, etyl acetat, butanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan dung môi thì đổi sang dung môi có tính phân cực hơn. Lưu ý: sự chiết lỏng-lỏng cần thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều sự thay đổi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh). Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào một hệ thống gồm có hai pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỷ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của hợp chất và của cả hai pha. Trong đó pha động là chất lỏng được xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic.

Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần tách.

VẬT LIỆU

- Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, que cấy trang.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bố trí thí nghiệm

Vi khuẩn được hoạt hóa bằng cách lấy một ít sinh khối từ môi trường thạch nghiêng NA vào bình erlen chứa 20 mL môi trường NB. RD26 đã được kế thừa từ nghiên cứu trước “Xác định các điều kiện ảnh hưởng và tối ưu hóa khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. Cao phân đoạn được tiến hành điều chế từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bằng cách sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau như HE, Cl, DI, EA, Me, W với tỉ lệ 1:1.

Xác định giếng đục đầu tiên trong dãy 12 giếng, từ đó suy ra được nồng độ tối thiểu của cao chiết vi khuẩn có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh. Từ cao chiết có hoạt tính mạnh nhất tiến hành sắc ký cột pha thường, kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để chia ra nhiều phân đoạn nhỏ có hệ dung môi rửa giải khác nhau. Trong quá trình chạy sắc ký luôn sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) giải ly bằng hệ dung môi Cl: Me với tỷ lệ thích hợp để kiểm tra và thăm dò các chất có trong cao thô và các phân đoạn, gôm các phân đoạn có các vết giống nhau lại chung một phân đoạn.

Sử dụng sắc ký cột pha thường, kết hợp với sắc ký bản mỏng (TLC) để phân lập các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn nhỏ có hoạt tính kháng E.

DỊCH NUÔI CẤY VÀ TỪ SINH KHỐI CHỦNG BACILLUS SP

Kết quả này tương tự với nghiên cứu từ công trình trước “Xác định các điều kiện ảnh hưởng và tối ưu hóa khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. Từ kết quả ở bảng 3.1 chúng tôi sẽ sử dụng dịch ngoại bào để thực hiện những thử nghiệm tiếp theo.

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC CAO CHIẾT THÔ THU ĐƯỢC

Từ kết quả bảng số liệu 3.2 và biểu đồ so sánh về khối lượng cao chiết và hiệu suất thu hồi được bằng các dung môi khác nhau nhận thấy rằng: Dung môi EA cho lượng cao chiết cao nhất (5,31 g) và hiệu suất chiết là 5,31% so với các dung môi khác. Chứng tỏ dung môi EA có khả năng chiết được nhiều hợp chất có trong dịch vi khuẩn Bacillus sp. Các cao chiết này sẽ được tính trên khối lượng nguyên liệu sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan. Ghi chú: DC: Đối chứng, Me: Methanol, C: Clorofrom, Di: Diclorometan, EA: Etyl acetat, HE: Hexan. Cao chiết bằng Cl không tạo vòng kháng (0± 00d) so với các loại cao chiết bằng dung môi khác.

Trong nghiên cứu của Tabben và cs (2010), đã thu hồi được hợp chất S07-2 tại các lần tách chiết khác nhau, cho thấy nước phù hợp nhất để thu hồi được hợp chất S07-2 có hiệu quả kháng P.

MIC) CỦA CAO CHIẾT VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH E. COLI SINH ESBL

Do đú dịch chiết từ nước cho khả năng ức chế vi khuẩn tốt nhất. Trong nghiên cứu tương tự của Kaushik và cs (2008), đã thử nghiệm in vitro cho hoạt động kháng khuẩn của cao chiết với E. RD26 với 6 loại dung môi thử nghiệm đều có kết quả tương tự như kết quả nghiên cứu của Kaushik và cs (2008) kháng với các vi khuẩn gây bệnh.

Do đú cao chiết dung mụi EA không được lựa chọn để tiến hành sắc kí cột. Tuy nhiờn W cú nhiệt độ bay hơi cao (100oC) sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng cao chiết, và thời gian thực hiện đề tài. Do đó chúng tôi quyết định sử dụng cao chiết từ dung môi Me để tiếp tục thực hiện những thí nghiệm tiếp theo của đề tài.

PHÁP SẮC KÍ LỚP MỎNG (TLC)

Hệ số Rf của các chất tan trong cao chiết chủng vi khuẩn với các hệ dung môi trên có giá trị tương đồng ở hệ khảo sát. Như vậy, những chất kháng khuẩn chủ yếu được chiết tách từ những dung môi phân cực mạnh. Các bản cho hình dạng, Rf và màu sắc khác nhau nên trong cao chiết có các chất khác nhau.

SẮC KÝ CỘT

Kết quả hình 3.6 cho thấy sắc ký cột cao phân đoạn B thu được 7 phân đoạn nhỏ. Qua kiểm tra phân đoạn bằng TLC, ta nhận thấy phân đoạn thu được từ hệ Cl: Me (85: 15) cú xuất hiện cỏc vết đẹp, rừ ràng thớch hợp cho việc khảo sỏt cỏc chất. Tiến hành khảo sát phân đoạn này qua sắc ký cột phân đoạn lần 2, để kiểm tra và thu nhận các chất riêng biệt từ phân đoạn trên.

Kết quả hình 3.8 cho thấy sắc ký cột cao phân đoạn D thu được 20 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn 1 đến phân đoạn 10, các vết tương đương nhau nên gộp thành một phân đoạn, phân đoạn 11 đến 15 gộp lại một phân đoạn, phân đoạn 16 đến 20 gộp thành một phân đoạn. Qua hình 3.9 thấy các vết đều có hình dạng, hệ số di chuyển, màu sắc và kích thước tương đồng nên được gộp lại thành 1.

Từ các phân đoạn chấm TLC ta thấy phân đoạn C và D có xuất hiện các vết đậm màu, hệ số di chuyển giữa các vết trong phân đoạn C và D tương đồng nhau.

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG E. COLI SINH ESBL TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG

Do đó, cao phân đoạn C và D được sử dụng để tiếp tục sắc kí cột làm tinh chất. Các phân đoạn trung gian của các cao phân đoạn A, B, C, D, E đều có khả năng kháng vi khuẩn thử nghiệm. Từ kết quả mục 6 và 7, cao chiết phân đoạn C và D xuất hiện hợp chất có khả năng kháng E.