KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MRSA TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS SP.. Phần lớn các hợp chất này được tổng hợp bởi vi khuẩn nội sinh giúp thực vật có khả năng kháng lại
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Từ tháng 2 năm 2019 đến tháng 5 năm 2019
+ PTN Công nghệ Vi Sinh - cơ sở 3,Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, Tỉnh Bình Dương
+ Phòng 19, Phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, số 01 Mạc Đỉnh Chi, Quận 1, TP Hồ Chí Minh.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu
Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp RD26 phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng ( Phyllanthus amarus schum et thonn) được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ
Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA - Staphylococcus aureus kháng methicillin) được cung cấp bởi công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa
- Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA), Mueller Hinton Agar (MHA)
- Cồn 96 o , 70 o , NaCl, HCl, NaOH, H2SO4 10%
- Nguồn dinh dưỡng: glucose, pepton
- Các muối khoáng: CaCO 3 , MgSO 4
- Các dung môi : n - hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl axetate, methanol và nước
- Nước muối sinh lý 0,85%, nước cất
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 18
- Các loại micropipette và các đầu típ tương ứng ( 100 - 1000 𝜇L, 20 - 200 𝜇L)
- Các loại dung môi: n - hexane, ethyl acetate, methanol, dichloromethane, chloroform và nước
- Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, qua cấy trang.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa vào mục tiêu của nghiên cứu chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau:
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 19
Sơ đồ 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby -
Khảo sát phân đoạn cắn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Thu cao chiết chủng Bacillus sp RD26
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn (MBC) bằng phương pháp pha loãng
Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26
Thu dịch nội bào Thu dịch ngoại bào
Chiết dịch vi khuẩn Bacillus sp RD26 với các hệ dung môi n-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước
Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng MRSA
Thu nhận phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính sinh học kháng MRSA bằng phương pháp sắc ký cột cao chiết Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào
Nuôi cấy và thu dịch
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 20
3.3.2 Hoạt hóa chủng Bacillus sp RD26
Kế thừa từ nghiên cứu “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Bacillus sp RD26 để nâng cao hoạt tính kháng vi khuẩn MRSA bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm” (Dương Nhật Linh và cs., 2018) trước đó đã xác định công thức môi trường tối ưu hóa để lên men chủng Bacillus sp RD26 (pepton: 7,36 g/L, glucose: 15 g/L,
Chủng vi khuẩn Bacillus sp RD26 được hoạt hóa bằng cách lấy một ít sinh khối từ thạch nghiêng trên môi trường NA vào bình erlen chứa 20 mL môi trường NB, nuôi lắc ở 35°C/ 36 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút
Nhân giống: Điều chỉnh dịch khuẩn đạt giá trị OD610 có mật độ tế bào khoảng 10 8 tế bào/ mL Bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn Bacillus sp RD26 sau khi hoạt hóa vào
100 mL môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng Bacillus sp RD26 trong bình erlen
100 mL với tỷ lệ 1/20 theo thể tích dùng nuôi lắc ở 35°C/ 36 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/ phút (Shrivastava và cs., 2013)
Lên men: Bổ sung 10% thể tích dịch khuẩn giống cấp 2 vào môi trường tối ưu hóa tương ứng với chủng vi khuẩn ở 30°C/ 36 giờ, pH = 7
3.3.3 Khảo sát khả năng kháng MRSA từ dịch ngoại bào hay nội bào chủng Bacillus sp RD26
Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA của dịch nuôi cấy và sinh khối chủng Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Kumar A và cs., 2009)
3.3.3.1 Chuẩn bị dịch ngoại bào vi khuẩn
Chủng vi khuẩn sau khi được lên men, tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/phút ở 4 o C trong 10 phút thu dịch nổi Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Ogidi và cs., 2015)
3.3.3.2 Chuẩn bị dịch nội bào
• Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 10000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4 o C
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 21
• Rửa tế bào bằng cách phân tán lại trong 3 mL NaCl 0,9% Vortex kĩ, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C
• Chỉnh OD600 = 1 bằng đệm phosphat 0,1M pH 7 (xác định tỉ lệ thích hợp giữa huyền dịch vi khuẩn và dung dịch đệm)
• Bổ sung DTT đến nồng độ 10mM để giảm quá trình hợp chất của chủng
Bacillus sp RD26 bị oxy hóa, ủ đá để mẫu đạt nhiệt độ 0 - 5 o C
• Tán siêu âm 6 lần duy trì nhiệt độ không đổi, mỗi lần tán 30 giây Đầu dò có kích thước dài 9 cm, với chu kì 50% Trước các lần tán siêu âm, mẫu phải đạt nhiệt độ 0 - 5 o C Lấy khoảng 10 μL nhuộm đơn và quan sát trên kính hiển vi để theo dõi hiệu quả phá vỡ tế bào Mẫu sau khi tán siêu âm có thể giữ đông ở -20 o C
• Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4 o C trong 10 phút Thu dịch nổi (dịch phá vỡ tế bào chứa enzyme) (Nguyễn Đức Lượng, 2003)
- Mục đích: Nhằm xác định khả năng kháng MRSA từ cao chiết chủng
• Môi trường tối ưu và môi trường MHA thử nghiệm được hấp vô trùng ở
• Môi trường MHA được đổ đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn MRSA
• Chủng vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37°C
• Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy vào nước muối NaCl 0,85% với thể tích 9,9 mL, dùng máy vortex lắc đều ống
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 22
• Đem dịch vi khuẩn đo OD ở bước sóng 610 nm, điều chỉnh sao cho có mật độ tế bào tương đương khoảng 10 8 tế bào/mL, tương ứng với độ đục trong ống McFarland 0,5
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn thử nghiệm như mục 2.3.3.1 và 2.3.3.2
• Pha loãng vi khuẩn thử nghiệm với nước muối sinh lý 0,85% và so độ đục với ống McFarland 0,5 sẽ có nồng độ vi khuẩn tương đương là 1 - 2 x
• Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Tiến hành trải dịch cho tới khi thấy mặt thạch khô, mỗi lần xoay hộp 60 o
• Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ vô trùng
• Dựng micropipet hỳt 100 àL dịch chiết bơm vào mỗi giếng (Trong đú cú một giếng không bơm dịch chiết mà bơm dung môi DMSO làm giếng đối chứng)
• Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch
• Ủ 24 giờ/37 o C, đọc kết quả vòng kháng
• Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, thực hiện lần lượt từng cao chiết được tách từ các dung môi khác nhau (Bexfield A và cs, 2008)
Cao chiết chủng Bacillus sp RD26 có khả năng kháng vi khuẩn thử nghiệm khi xung quanh lỗ xuất hiện vòng vô khuẩn (vòng trong không có sự hiện diện của vi khuẩn) Thí nghiệm được lặp lặp 3 lần, kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic Plus 3.0 (Bexfield A và cs, 2008)
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 23
Hình 3.1 Kết quả vòng kháng khuẩn 3.3.4 Thu nhận cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26 từ các hệ dung môi khác nhau
3.3.4.1 Thu cao chiết chủng Bacillus sp RD26
Hoạt hóa chủng như mục 3.1
Sau thời gian lên men tiến hành ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 10 phút thu dịch nổi Thu 100 mL dịch khuẩn tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi:
He, Clo, Di, Et, Me và W với tỉ lệ 1:1 Sau đó thu dung môi kèm với các thành phần kháng khuẩn có trong đó
Tiến hành cô quay dịch chiết và dung môi ta thu được cao chiết thô Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Quy trình điều chế cao phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2
Sơ đồ 2 Quy trình điều chế cao chiết vi khuẩn
3.3.4.2 Thử khả năng kháng MRSA từ cao chiết Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby - Bauer
Cao chiết thô sau khi được thu nhận ở mục 3.3.2 được hòa tan vào DMSO với tỉ lệ 10 mL DMSO 1% và 1 mg cao chiết.
Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.3.3.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0.
3.3.4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp pha loãng
- Mục đích: Nhằm xác định sự kìm hãm sự tăng trưởng của vi khuẩn thử nghiệm khi được ủ chung với cao chiết chủng Bacillus sp RD26, khảo sát trong 16 - 20 giờ (Wiegand và cs., 2008).
• Phiến Microwell 96 giếng được ngâm cồn 70% trong 2 giờ để diệt khuẩn, sấy khô và chiếu UV trong 2 giờ.
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 24
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 25
• Cao chiết chủng Bacillus sp RD26, dịch vi khuẩn thử nghiệm
• Môi trường MHB đã được hấp vô trùng ở 121 o C/20 phút để tiến hành tăng sinh các vi khuẩn thử nghiệm
• Cao chiết vi khuẩn được hòa tan trong DMSO 1% đạt nồng độ gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm tối ưu Pha loãng trong môi trường MHB để có được dãy nồng độ theo cấp số nhân, đồng thời nồng độ của DMSO nhỏ hơn hoặc bằng 1% Từ đó dãy nồng độ này có thể tiến hành thử nghiệm tác động kháng khuẩn
• Dịch khuẩn thử nghiệm sau khi đã tăng sinh trong 18 giờ - 24 giờ, đo OD ở bước sóng 610 nm đạt giá trị khoảng 0,08 - 0,1 thì tương đương với mật độ vi khuẩn là 1 - 2 x 10 8 CFU/ mL Pha loãng dịch khuẩn với MHB sao cho nồng độ đạt được 10 3 CFU/ mL
• Hỳt 100 àL dịch khuẩn thử nghiệm cho vào giếng Microwell trộn chung với 100 àL cao chiết Lặp lại 3 lần Giếng đối chứng thay cao chiết bằng
• Ủ 37 o C, bắt đầu đọc kết quả sau 18 - 20 giờ
- Kết quả: Đọc kết quả dựa trên sự sinh trưởng của vi khuẩn thử nghiệm (Wiegand và cs., 2008)
3.3.5 Khảo sát phân đoạn cắn của cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên tấm silica gel 60F254 (0,25 mm) (Merck, Đức) (Olfa Tabbene và cs, 2009)
Cao chiết sau khi thu được hòa tan với dung môi thích hợp, cao chiết dung môi nào hòa tan với dung môi đó
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 26
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MRSA TỪ DỊCH NGOẠI BÀO HAY NỘI BÀO CỦA CHỦNG BACILLUS SP RD26
Dịch ngoại bào và nội bào của chủng Bacillus sp RD26 sau khi qua xử lý, tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng kháng MRSA bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.2
Bảng 3.1 Kết quả thử khả năng kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Mã chủng Đường kính vòng kháng khuẩn MRSA (mm)
Dịch ngoại bào Dịch nội bào
Dựa vào kết quả bảng 3.2 cho thấy dịch nuôi cấy chủng Bacillus sp RD26 tạo vòng kháng vi khuẩn kháng thuốc với đường kính 29,67 ± 0,67 mm, còn sinh khối vi khuẩn không kháng với MRSA Kết quả này tương tự với công trình nghiên cứu trước
“Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Bacillus sp RD26 để nâng cao hoạt tính kháng vi khuẩn MRSA bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm” (Dương Nhật Linh và cs., 2018), chủng Bacillus sp RD26 kháng MRSA cao nhất là 31,67± 0,67 mm
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 34
Hình 3.3 Kết quả thử khả năng kháng MRSA bằng khuếch tán giếng thạch từ dịch nuôi cấy chủng Bacillus sp RD26
THU NHẬN CAO CHIẾT BACILLUS SP RD26 TỪ CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU
4.2.1 Thu cao chiết chủng Bacillus sp RD26 Độ phân cực của các dung môi khác nhau sẽ ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các chất khác nhau Để xác định được dung môi thích hợp cho việc tách chiết hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Bacillus sp RD26, chúng tôi nuôi vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường lên men tối ưu và đem lọc lấy dịch vi khuẩn thử nghiệm Dịch vi khuẩn thử nghiệm được chiết bằng phương pháp chiết lỏng lỏng với 6 loại dung theo tỉ lệ 1:1: n-hexane, chloroform , dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước
Tiến hành cô quay thu lấy cao chiết Kết quả cao thu được với từng loại dung môi được trình bày trong bảng 3.2 và biểu đồ 3.1
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 35
Bảng 3.2 Kết quả khối lượng và hiệu suất thu hồi của cao chiết thu được với
Số gam cao thu được sau cô quay
Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan (a, b,c,d,e:thể hiện mức độ khác nhau qua thống kê)
Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của dung môi đến khối lượng cao chiết
He Clo Di Et Me W g
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 36
Từ kết quả bảng 3.2 và biểu đồ 3.1, so sánh về khối lượng dung môi thu được với các dung môi khác nhau nhận ra rằng: dung môi cho lượng cao chiết cao nhất là Et (m
= 5,15g, H = 5,15%), dung môi cho lượng cao chiết thấp nhất là Di ( m = 1,21g, H 1,21%) Chứng tỏ dung môi Et có khả năng chiết được nhiều hợp chất có trong dịch vi khuẩn Bacillus sp RD26
4.2.2 Khảo sát khả năng kháng MRSA từ cao chiết Bacillus sp RD26 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby - Bauer
Từ 6 loại cao chiết Bacillus sp RD26 của 6 loại dung môi khác nhau được tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA bằng cách đo đường kính vòng vô trùng Kết quả được trình bày ở hình 3.4 và bảng 3.3
Hình 3.4 Kết quả cao chiết Bacillus sp RD26 kháng MRSA
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 37
Bảng 3.3 Kết quả vòng kháng MRSA của 6 loại cao chiết thu được
Cao chiết Vòng kháng khuẩn (mm)
Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử Duncan (a, b: thể hiện mức độ khác nhau qua thống kê)
Cao chiết thu được từ chủng Bacillus sp RD26 từ 6 loại dung môi đều có khả năng kháng MRSA Cao chiết dung môi Me có vòng kháng khuẩn MRSA mạnh nhất (18,67± 0,57 mm), tiếp đến là cao chiết với W (15,33± 2,52mm) và Di (15,33± 0,57 mm), Et (14 ± 3,00 mm), He (13,33 ± 2,52 mm),Clo có hoạt tính thấp nhất (11,67 mm) Theo Jeyanthi và cộng sự (2016), thử khả năng kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin của hợp chất được cô lập từ chủng Halophilic Bacillus amyloliquefaciens
MHB1, kết quả kháng MRSA của cao hợp chất phenolic (17,66 ± 0,57 mm) ( dịch khuẩn ban đầu kháng MRSA có vòng ức chế là 8,33 ± 1,15 mm) Kết quả nghiên cứu có kết quả cao chiết Me (18,67 ± 0,57 mm) lớn hơn với kết quả nghiên cứu của Jeyanthi và cộng sự (2016) Như vậy, dung môi Me phù hợp với dịch vi khuẩn để tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo
4.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết Bacillus sp RD26 kháng MRSA bằng phương pháp pha loãng trong môi trường dinh dưỡng
Từ kết quả thí nghiệm thử khả năng kháng MRSA từ cao chiết chủng Bacillus sp RD26 từ 6 loại dung môi bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, nhận thấy rằng
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 38 cao chiết chủng Bacillus sp RD26 có khả năng kháng MRSA Do đó, tiến hành thực hiện phương pháp MIC để kiểm tra lại khả năng kiềm hãm sự phát triển của MRSA của
6 cao chiết chủng Bacillus sp RD26 Kết quả thể hiện trong bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả MIC của 6 loại cao chiết từ chủng Bacillus sp RD26 kháng
Từ kết quả bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy cao chiết chủng Bacillus sp RD26 được tách từ các dung môi n - hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl axetate, methanol và nước đều có khả năng ức chế sự phát triển của MRSA
Tuy nhiên, không có sự khác biệt về khả năng kháng của từng loại cao chiết đối với vi khuẩn thử nghiệm Kết quả MIC cho thấy cao chiết He, W và Di là 512 μg/mL, cao chiết Et và Clo là 256 μg/mL, cao chiết Me là 128 μg/mL Trong nghiên cứu tương tự của Kaushik và cs (2008), đã thử nghiệm in vitro cho hoạt động kháng khuẩn của cao chiết từ vi tảo qua các dung môi: n - hexane, ethyl acetate, dichloromethane, và methanol với vi khuẩn gram dương S.aureus và 4 loại vi khuẩn gram âm (E coli,
P.aeruginosa, S typhi, and K pneumonia) Trong đó MIC của cao chiết methanol với
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 39 vi khuẩn S.aureus là 128 μg/mL, MIC của cao chiết dichloromethane là 512 μg/mL với
S aureus, MIC của 2 loại cao chiết n - hexane và ethyl acetate đều > 512 μg/mL với các vi khuẩn thử nghiệm Chalasani và cộng sự (2015) đã tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu của hợp chất được tinh chế từ Bacillus sp kháng MRSA khoảng 0.3–
Hiệu suất thu hồi cao chiết của dung môi Et cao nhất 5,31% nhưng khả năng kháng MRSA (14 ± 3,00 mm) thấp hơn các cao chiết của các dung môi Me, Di và W, nồng độ ức chế tối thiểu MIC (256 μg/L) cao hơn cao chiết dung môi Me (128 μg/mL) và bằng với cao chiết Clo (256 μg/L) Cao chiết với dung môi Me tuy có hiệu suất thu hồi thấp ( 2,19%) nhưng khả năng kháng MRSA cao nhất trong 6 loại cao chiết ( 18,67 ± 0,57 mm), nồng độ ức chế tới thiểu cũng thấp nhất (128 μg/mL) Vì vậy chọn cao chiết vi khuẩn với dung môi methanol để tiến hành thực hiện sắc ký cột thu nhận phân đoạn chứa chất có hoạt tính kháng MRSA.
KHẢO SÁT PHÂN ĐOẠN CẮN CỦA CAO CHIẾT TỪ CHỦNG BACILLUS SP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC)
BACILLUS SP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC)
Cao chiết chủng Bacillus sp RD26 thu được từ mục 3.2.1, tiến hành thực hiện phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), giải ly với hệ dung môi chloroform: methanol (65:35) Đọc kết quả dưới tia UV với bước sóng 254 nm hoặc phun dung dịch H2SO4
10% trong EtOH, tiếp theo làm nóng trên bếp điện 1 - 2 phút, 105°C Kết quả thể hiện ở hình 3.5, bảng 3.5 và 3.6
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 40
Hình 3.5 Sắc ký bản mỏng cao (TLC) chiết chủng Bacillus sp RD26 thông qua các dung môi nướng trên bếp điện
Ghi chú: (a):Clo, (d): W, (c): Me, (e):Et, (f): He, (g):Di
Bảng 3.5 Kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC) Dung môi
Số vết Hình dạng vết R f (cm)
He 1 Tròn, kéo dài, có tâm đen ở giữa 0,52
Et 1 Tròn, kéo dài, có tâm đen ở giữa 0,66
*Khi R f = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi R f = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi (Nguyễn Mạnh Cường, 2011)
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 41
Dựa vào kết quả hình 3.8 và bảng 3.5 - 3.6, các chất trong cao chiết hiện lên trên bản sắc ký lớp mỏng của các cao chiết dung môi có vết tương đối khác nhau Nhưng giá trị R f lại tương đương nhau
Cao chiết với 6 loại dung môi trên đều hiện vết trên bảng mỏng TLC Gía trị Rf cho thấy rằng các chất trong các cao chiết đều di chuyển được trong hệ dung môi giải ly chloroform : methanol tỉ lệ (65:35) Nên hệ dung môi chloroform : methanol phù hợp để tiến hành sắc ký cột cao chiết thu nhận phân đoạn các hợp chất có khả năng kháng MRSA.
SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT
Từ kết quả kháng MRSA, MIC và TLC trên, cao chiết methanol được chọn là cao chiết để tiến hành sắc ký cột thu nhận phân đoạn chứa chất có hoạt tính kháng MRSA Sắc ký cột cao chiết methanol với các hệ dung môi sau:
- Hệ dung môi chloroform : methanol với các tỉ lệ: (92 : 8), (95 : 5), (85 : 15) và (70 : 30)
- Hệ dung môi chloroform : methanol : nước với các tỉ lệ: (65 : 35 : 5) và (60:40:1) Để kiểm tra và thăm dò các chất trong từng phân đoạn thu được, tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng (TLC), thu được kết qua như sau:
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 42
Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (95:5)
Qua kết quả TLC từ phân đoạn hệ dung môi chloroform : methanol (95 : 5) thấy có xuất hiện các vết đậm nhạt và màu sắc khác nhau Dựa vào hình dạng các vết trên TLC, phân đoạn 1 tách riêng, tiến hành gôm các phân đoạn: 2, 4, 6 và 7; phân đoạn 3 và 5
Hình 3.7 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (92 : 8)
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 43
Qua kết quả TLC từ phân đoạn hệ dung môi chloroform : methanol (92 : 8) thấy có xuất hiện các vết đậm nhạt và màu sắc khác nhau Dựa vào hình dạng vết trên TLC, tiến hành gôm các phân đoạn từ 1 đến 4, từ 5 đến 7
Hình 3.8 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn khảo sát thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (85:15)
Qua kiểm tra phân đoạn bằng TLC, ta nhận thấy phân đoạn thu được từ hệ chloroform : methanol (85:15) có xuất hiện các vết đẹp, rõ ràng thích hợp cho việc khảo sát các chất Tiến hành khảo sát phân đoạn này qua sắc ký cột phân đoạn lần 2, để kiểm tra và thu nhận các chất riêng biệt từ phân đoạn trên
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 44
Hình 3.9 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol (70:30)
Qua kết quả TLC từ phân đoạn hệ dung môi chloroform : methanol (70:30) thấy có xuất hiện các vết đậm nhạt và màu sắc khác nhau Phân đoạn 1 đến phân đoạn 10, các vết tương đương nhau nên gôm thành một phân đoạn, phân đoạn 11 đến 15 gôm lại một phân đoạn, phân đoạn 16 đến 20 gôm thành một phân đoạn Sau đó, tiến hành sắc ký cột để tách các chất có trong từng phân đoạn trên
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 45
Hình 3.10 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol : nước (65:35:5)
Qua kết quả phân đoạn TLC, phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol : nước (65:35:5) từ phân đoạn 1 đến phân đoạn 6 các vết giống nhau
Hình 3.11 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol : nước (60:40:10)
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 46
Qua kết quả phân đoạn TLC, phân đoạn thu được từ hệ dung môi chloroform : methanol : nước (60 : 40 : 1) từ phân đoạn 1 và 2 vết TLC giống nhau, phân đoạn 3 đến phân đoạn 6 vết TLC giống nhau
4.5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG MRSA TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN
THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG BACILLUS SP RD26 NỘI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY –
Tiến hành thu nhận phân đoạn của các hệ dung môi chloroform: methanol từ sắc ký cột cao chiết trên Dựa vào hình dạng vết TLC, chọn các phân đoạn có vết TLC khác nhau của từng hệ dung môi, từ đó thử khả năng kháng MRSA của từng phân đoạn Kết quả như sau:
- Cao phân đoạn A: phân đoạn 1 và 6 có vòng kháng MRSA lần lượt là 27,5 mm và 7 mm
- Cao phân đoạn B: phân đoạn 1, 5 và 7 có vòng kháng MRSA lần lượt là 8 mm, 15 mm và 9 mm
- Cao phân đoạn C: phân đoạn 11, 25 và 20 có vòng kháng MRSA lần lượt là
- Cao phân đoạn D: phân đoạn 1, 5, 10, 15, 18, 19 và 20 có vòng kháng MRSA lần lượt là 7 mm, 7 mm, 8 mm, 10 mm, 12 mm, 10 mm, 11 mm
- Cao phân đoạn E và F: các phân đoạn 1, 4 và 6 đều không có khả năng kháng MRSA
Hình 3.12 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1 và 6 trong hệ dung môi chloroform: methanol (95:5)
Hình 3.13 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 5 và 7 trong hệ dung môi chloroform: methanol (92:8)
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 47
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 48
Hình 3.14 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 11, 15 và 19 trong hệ dung môi chloroform: methanol (85:15)
Hình 3.15 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 5, 10, 15, 20, 25 và
29 trong hệ dung môi chloroform: methanol (70:30)
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 49
Hình 3.16 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 4 và 6 trong hệ dung môi chloroform: methanol : nước (63 : 35 : 5)
Hình 3.17 Khả năng kháng MRSA của các phân đoạn 1, 4 và 6 trong hệ dung môi chloroform: methanol : nước (60 : 40 : 1)
Cao chiết hệ dung môi chloroform : methanol tỉ lệ (95 : 5) và (92 : 8) có phân đoạn 1 kháng MRSA cao nhất (27,5 mm và 18 mm) nhưng trên sắc ký lớp mỏng TLC
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 50 vết của phân đoạn này không rõ nên không chọn để tiếp tục phân lập và tinh sạch hợp chất Trong khi đó, các phân đoạn thử nghiệm của cao chiết hệ dung môi chloroform : methanol tỉ lệ (85 : 15) và (70 : 30) đều có khả năng kháng MRSA và vết TLC rõ ràng, các vết của các phân đoạn có hình dạng khác nhau nên được chọn tiếp tục sắc ký cột cao chiết với hệ dung môi chloroform : methanol phù hợp để tiến hành tinh sạch chất có hoạt tính kháng khuẩn
4.6 PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT THU ĐƯỢC
Dựa vào kết quả TLC và kết quả kháng MRSA của các phân đoạn thu được, tiếp tục tiến hành phân lập và tinh chế hợp chất thu được bằng phương pháp sắc ký cột Kết quả như sau:
- Sắc ký cột cao chiết C thu được cao C4-2h Tiếp tục sắc ký cột cao C4-2h với hệ dung môi choloroform : methanol tỉ lệ (8 : 2) thu nhận được phân đoạn L3.1 và K3.4
- Sắc ký cột cao chiết D thu được cao D5-g Tiếp tục sắc ký cột cao D5-g với hệ dung môi choloroform : methanol tỉ lệ (70 : 30) thu nhận được phân đoạn K2.1, K2.7, K2.4, K2-1 và L2
Hình 3.18 Sắc ký lớp mỏng (TLC) các phân đoạn thu nhận từ cao C4-2h và
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 51
Từ kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC) trên, chọn phân đoạn L3.1 và K2.4 để tiến hành sắc ký pha đảo với pha động là nước và methanol
Với mỗi lần thu được phân đoạn, đều tiến hành thử hoạt tính kháng MRSA Từ đó chọn ra phân đoạn phù hợp để tiến hành các bước phân lập và tinh chế hợp chất
4.7 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP
CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG MRSA
Sắc ký pha đảo thu được chất BR01 dưới dạng bột màu trắng Hấp thu UV cho vết màu đen ở λ = 254 nm
Phổ 1 H-NMR của BR01 (DMSO-d 6 , 500 MHz, δ ppm) (Bảng 1) cho các tín hiệu cộng hưởng: 2 proton imino ở δ H 10,78 (1H, s, 3-NH) và 10,98 (1H, s, 1-NH); 2 proton ghép cặp ortho ở δ H 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5) và 7,37 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6)
Phổ 13 C-NMR của BR01 (DMSO-d 6 , 125 MHz, δ ppm) (Bảng 1) cho các tín hiệu của 4 carbon, gồm 2 carbon carbonyl của 2 nhóm amide ở δ C 151,5 (C-2) và 164,3 (C- 4); 1 carbon olefin mang nitrogen ở δ C 142,1 (C-6) và 1 carbon olefin ở δ C 100,2 (C-5) giúp xác nhận BR01 mang dị tố và có khung sườn là pyrimidine-2,4-dion (Ton et al.,
Dựa trên dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR và so sánh với tài liệu (Ton et al., 2016), cấu trúc của BR01 được xác định là pyrimidine-2,4-dion
Hình 3.22 Cấu trúc hoá học của BR01
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 52
Bảng 3.6.Dữ liệu phổ 1 H (500 Hz) và 13 C (125 Hz) của BR01 và chất pyrimidine-2,4- dion đo trong DMSO-d 6
Pyrimidine là các dị vòng rất quan trọng về mặt sinh học và đại diện cho các thành viên phổ biến nhất của họ diazine với uracil và thymine là thành phần của axit ribonucleic (RNA), axit deoxyribonucleic (DNA) và cả cytosine (Sharma và cs., 2014) Pyrimidine là hợp chất có hoạt chất sinh học mạnh như kháng khuẩn, ức chế thần kinh trung ương, giảm đau, chống co giật, chống ung thư, chống viêm, chống oxy hóa , tác nhân chống HIV, diệt cỏ (Patil, 2018)
Ngoài ra, các dẫn xuất của pyrimidine có đặc tính tương tự như thuốc kháng sinh : dẫn xuất bacimethrin (5-hydroxymethyl-2-methoxypyrimidin-4-amin) có hiệu quả đối với một số bệnh nhiễm trùng do tụ cầu khuẩn staphylococcal gây ra, dẫn xuất cytosine có hoạt tính chống vi khuẩn mycobacteria cũng như một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Patil, 2018)
SVTH: Nguyễn Thị Lành Trang 53
Cieplik và cộng sự (2011) đã phân lập được 14 dẫn xuất pyrimidine mới (6a-6l ), tất cả đều có khả năng kháng trên một chủng vi nấm và tám chủng vi khuẩn: Candida albicans, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus Vulgaris, Seratia marcesceus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Staphylococcus cholermidis và Staphylococcus aureus
