Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết quả bình bát annona glabra l trong Điều kiện in vitro

TH ABTS+ ueehialie ~ 6 - safonie | quang màu xanh và đặc trơn hảo thụ ở bước sóng 7% Một gốc tự do có khả năng nhận các DPPH |11-diphenyl-2-pieryhydrazyl | phân từ hydro tir ese chat

‘TRUONG DAI HOC SU PHAM NH PHO HO CHi MINH AO TAO

HA DOAN HUY TAM

KHAO SAT HOAT TINH KHANG OXY HOA CUA CAO CHIET QUA BINH BAT (ANNONA GLABRA L.) TRONG DIEU KIEN

‘TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THANH PHO HO CHi MINH

HA DOAN HUY TAM

KHAO SAT HOAT TINH KHANG OXY HOA CUA CAO CHIET QUA BINH BAT (ANNONA GLABRA L.) TRONG DIEU KIEN

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

TÓT NGHIỆP BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA KHOÁ LỊ

Ho và tên: HÀ ĐOÀN HUY TÂM

mũ sinh viên: 46.01.301.109 nơi sinh: Tp Hồ Chi Minh

“Chương trình đảo tạo: Sư phạm Sinh học;

"Người hướng dẫn: Thể Nguyễn Thị Hằng

‘Co quan công tác: Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh

Điện thoại: 0985280851 Email: hangnL@hemue củu vn Tôi đã bảo vệ khoá luận tốt nghiệp với đề tải: Khảo sắt hoạt tính kháng oxy hóa của

cao chỉ tả bình bát (Annona glabra L.) trong di u kign in vitro,

tại Hội đồng chấm khoá luận ngảy 7 tháng 5 năm 2024

“ôi đã sửa chữa và hoàn chính khoá luận tất nghiệp đúng với các góp ý, yêu cầu của

Hội đồng và uỷ viên nhận xét, gồm các ý chính như sau:

-Mộts hình thức: lỗi chính

~ Trích đẫn tả liệu tham khảo

- Sửa lại thử tự mục tiêu cho phủ hợp ví

Nay tôi xin báo cáo đã hoàn thành sữa chữa khoá luận như trên và dé nghị Hội đồng

chấm khoá luận, người hướng dẫn khoa học xác nhận

Thành phố Hỗ Chi Minh, ngày 16 tháng Š năm 2024

Hà Đoàn Huy Tâm

“Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng

Xác nhận

của người hướng dẫn khoa học

Em xin chân thành cảm ơn ThŠ Nguyễn Thị Hằng - người đã tận tình

giúp đỡ vũ hưởng dẫn em trong quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thiện

đề tài khoá luận tắt nghiệp này:

Em sin chân thành cảm ơn Trường, Phòng Đảo tạo, các thầy cô trong Khoa

Í Hà 'Minh đã tạo điều kiện thuận

Sinh học - Trường Đại học Su phạm Thành phí

lợi cho tôi hoàn thành khoá luận

Em xin chin thành cảm ơn quỷ THẦy/Cô, cúc nhân viên, anh chỉ, các bạn sinh

viên thuộc phòng thí nghiệm Di truyền - Tiền hoá, Vi sinh - Sinh hoá, phòng Sinh học

tang tâm, phòng Giải phẫu Sinh lệ người = động vật phòng Thực vật học thuộc khoa hoá chat vd dung cw cho dé tài khoá luận tất nghiệp của em Tới cu cùng, em xin bày tỏ lòng bit øm và cảm kích đối với gia dink, ban be

đã bên cạnh không ngừng động viên, ủng hộ trong suốt quãng thời gian học tập,

"nghiên cứu và hoàn thành khoá lui

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 02 thắng 05 mãm 2024

SINH VIÊN THỰC HIỆN KHOÁ LUẬN

HA DOAN HUY TAM

II MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Ill BOL TUNG NGHIEN CU

1V NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU,

V PHAM VI NGHIEN CUU

VI NOI DUNG NGHIEN COU

Chương 1 TONG QUAN

1.1 TÔNG QUAN VỀ BÌNH BAT

1.1.1 Vị trí phân loại

1.1.2, Đặc điểm

1.1.3 Công dụng bình bát

1.1.4 Các nghiên cứu liên quan đến bình bát

1.1.4.1 Nehién cứu ti Việt Nam

1-1.42 Nghiên cứu ở nước ngoài

12 TÔNG QUAN VỀ GÓC TỰ DO,

1221 Nguồn gốc của gốc tự do rong cơ thể

12

IN VITRO

3.1 Phương pháp khảo sắt năng lực khử 1.3.2 Phương pháp khảo sắt năng lực khử sit 1.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự do (DPPH)

1.3.4, Phương pháp khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do ABT

Chương 2, ĐÔI TƯỢNG VẢ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2 THIET BI, DUNG CU VA HOA CHAT

2.3.1 Phương pháp thu và xử lí mẫu

2.3.2, Phương pháp thu nhận cao chiết

3.33 Phương phấp Khảo sát khả năng kháng oxy hoá invito 3.33.1 Phương pháp xác định năng lực khử 3.33.2, Phương pháp bắt gốc tự do DPPH

2.3.4 Phương pháp định lượng hợp chất hữu cơ 2.34.1 Định lượng acid aseorbie bằng phương pháp chuẳn độ iod 3.3442, Định lượng polysaecharide

2.3.5, Phương pháp xử lí số liệu

2.4 QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM

Chương 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KET QUÁ NGHIÊN CỨU

3.1.1, Thu nhận cao chiết

3.12 Kết quả khảo sắt khả năng kháng oxy hoá 3.121 Năng lực khử

3.122, Bắt gốc tr do DPPH

3.14 Kết quả định lượng một số chất hữu cơ 3.L3.1 Kết quả định lượng acid ascorbic

34 THẢO LUẬN

KẾT LUẬN, KIÊN NGHỊ L.KẾT LUẬN

1 KIÊN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC.

KiM —[ ida a Dik giả

lonbis (3 Một gộc tự: oo ben có khả năng TH

ABTS+ ueehialie ~ 6 - safonie | quang màu xanh và đặc trơn hảo thụ ở bước sóng 7% Một gốc tự do có khả năng nhận các

DPPH |11-diphenyl-2-pieryhydrazyl | phân từ hydro tir ese chat khang oxy The biochemical “half “maximal | 46 nude các mà gi đồhiệu quả

C50 | effective concentration (trong thi | No"E bấy độc tự do PB“ Ử [By gốc DPPH dt 50% ‘3

oD Optical Density Gide maa quae ROS | Reacitiv c bác sốc oxygen hoạt độn

Bang 3.2, Giá trị OD của thí nghiệm năng lực khử 30 Bang 3.3 Tí lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH của cao chiết 3 Bang 3.4 Phương trình tương quan giữa nồng độ và phần trăm bắt gốc ur do DPPH

của cao chiết 35 Bảng 35, Giá tị BC dự đoán của các loại cao chết 35 Bing 3.6, Him lugng acid ascorbic e6 rong cao chide 36 Bảng 3.7, Hằm lượng plysacchaide cổ trong cao chết m Bảng 38 So sinh năng lực khử của cao chiết với acid ascorbic 38

Ti lệ phần trăm ức chế một số vĩ khuẩn của họ Annonacea

Qué trinh peroxide hod lipid mang tế bào

Cơ chế tác động của chất kháng oxy hoá

Cơ chế kháng oxy hoá của acid aseorbi

Cơ chế kháng oxy hoá của polysaccharide

“Cấu trú của một số nhóm flavonoid

Sơ đồ phản ứng năng lực khử

Sơ đồ phản ứng giữa chất chống oxy hoá với DPPH

Vi thu miu

“Thịt bình bất sau khi ích hạt được ngâm với ethanol và nước cắt

Qui trình phương pháp xác định năng lực khử

Cứ trình phương pháp bất gbe te do DPPH

Sơ đồ phản ứng của acid asorbic với iod

CQui tình chuẳn 46 acid ascorbic bing iod

CQui trình định lượng polysaecbaride

Sơ đồ bồ trí thí nghiệm

Đường chuẩn năng lực khử acid ascorbic

Đồ thị phương trình tương quan của cao chiết và acid ascorbic

Đường tương quan tuyến tính giữa giá tị OD và nông độ của chất chuẳn

37

1.LÝ DO CHỌN ĐÈ TÀI

Binh bát (Annona glabra L.) là loài cây hoang dại, thích nghĩ với khí hậu nhiệt

đới Âm và cận nhiệc Cây mọc phổ biến ở các vùng dim lầy nước ngọt và nước lợ, dọc theo ạch và sông [II

ân gian dùng dịch lá tươi, bột được nghiễn từ hạt để trừ chấy rận trên người

và gia súc Thịt quả bình bát được dùng làm thức uồng do có vị ngọt, chua nhẹ Trong

đông y, bình bát được dùng để điều trị nhiều bệnh khác nhau: tiêu chảy, kiết lị, mÈ

day, lao phổi, tiểu đường, thiểu máu, đau nhức, lở loét, Một số bài thuốc dụng

bình bất có thể kể đến như: võ cây bình bát thái móng phơi khô, nấu với nước đến khiu tg có tác dung giúp người bệnh ổn định đường huyết, giảm đường và chữa

giun sán, kiết l: cùi của trái bình bát nghiễn với mật ong tạo thành hỗn hợp đặc sệt,

sử dụng hỗn hợp này làm mặt nạ đắp lên da trong khoảng 30 phút sau đó rửa lại với

nước có ác dụng lâm đẹp d [2]

Một số công trình trong và ngoài nước [3,4,5,6,7] được công bổ đã ghi nhận

bình bất có nhiều hoạt tính inh học khác nhau: hạt bình bất có khả năng gây độc tẾ đến các loài cây cùng họ (măng cầu xiêm, na ) cũng đã chúng minh iém ning sit

Co chiết nước, cao chiết cthanol từ thịt Và hạt

IV NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

Đề tài thực hiện các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể như sau:

1 Nghiên cứu và

quả bình bắt

ng hợp các công tình cỏ liên quan đến để tí,

2 Thực hiện các nội dung chính:

~ Khảo sát khả năng kháng oxy hoá ¿n viro của cao chiết thông qua phương

pháp năng lục khử và bắt gốc tư do DPPH;

- Định lượng acid ascorbic và polysaccharide 6 trong các

3 Viết báo cáo khoá luận tốt nghiệp

Y PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đề tài nh khảo sát khả năng oxy h6a in vitro cia cao nước và cao ethanol chiết xuất từ hạt và thịt quả bình bát thu tại Thành phố Hỏ Chí Minh Hai hợp chất hữu cơ được định lượng từ các cao chiết Ia acid ascorbic va polysaccharide Kha năng kháng oxy hod in vitro duge khảo sát dựa trên hai phương pháp là năng lực khử và bắt sốc tự do DPPH,

VI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1.1 TONG QUAN VE BINH BAT

1-1-1 Vịtrí phân loại

“Thực vật

“Thực vét hat kin— Magnoliophyta

Hãi lá mim ~ Magnoliopsida

Mie lan ~ Magnoliales

Ming cầu ~ Annonaceae

Măng cầu ~ Annona

Binh bat — Annona glabra L,

ình bát, nê, na biển (Trung tâm Dữ liệu Thực vật Việt Nam,

số màu xanh, đầi 7 10 em, không có gai, khi chín quả có mầu vàng

1.1.3 Công dụng bình bát

Các bộ phận khác nhau của bình bát gm thân, quả, ạt, lá và rễ cây đều được ứng dụng để làm dược liệu

Trong đông y, bình bát có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm; hỗ trợ hệ bài tiết

nhuận trùng, li tu; giáp thanh nhiệt iải độc: an thần, chống trằm cảm, Vị thuốc

bình bát được dùng trong điều trị mề đay mẫn ngứa, trị bệnh lao phối, hỗ trợ cải thiện

sác bệnh xương khớp và điều tị tiễu đường [2]

Các công trình nghiên cứu [11.12] cho thấy bình bát có tác dụng khíng nắm ức chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn như trực khuẩn lị và vi khuẩn gây viêm

ethyl acetate cit a binh bat 6 higu qui chéng li Pseudomonas aeruginosa nis vio

khả năng tương tác với thanh té bao vi khudn [11] Chiết xuất từ hạt bình bát được

ghỉ nhận có khả năng ức chế nhiễu loài vị khuẩn (hình 1.) [12]

Hình 1.1 Tig phin tram ức chế một số vi khuẩn của họ Annonacea

Bên cạnh đó, chiết xuất từ hạt, vỏ thân và rễ bình bát cũng được ghi nhận có

khả năng gây độc tẾ ào tế bảo ung thư phối ung thư kết máu [3.567]

1.1.4 Các nghiên cứu liên quan đến bình bát

1.1.4.1 Nghiên cứu tại Việt Nam

'Năm 2015, tác giả Nguyễn Thị Thu Hid én hành phân lập thành

phần hóa học của cao methanol tử quả bình bát khô Đề tài đã công bố được một số

va cộng sự đã

hợp chắt có khả năng gây độc tế bào ung thư máu ở người Đặc biệt, hợp chắteariide

D2 thể hiện hoạt tính gây độc đáng kể trên dong té bao HL — 60 [3],

Nam 2019, tác giả Huỳnh Thanh Duy và cộng sự đã tiến hành khảo sát thành phần hoá học và khả năng kháng oxy hoá của các phân đoạn cao chiết lá gì từ cây tình bát quả cho thấy lágiàbình bát khi ly tích với các đúng môi khác nhau đều xuthiện các hợp chấtcó khả năng kháng oxy hoá như ñavonoid,alkalsd,saponi, Bên cạnh đó, kế quả thí nghiệm với các gốc tự do DPPH, H:O; và năng lục khử cũng

ahi nhận các cao chiết đều có khả năng khán oxy hoá cao [4]

“Cũng năm 2019, ác giả Lưu Phong Dũ và cộng sự đã thực hiện khảo sát một số hợp chất có khả năng kháng oxy hoá, kháng khuẩn và kháng nắm của cao chiết từ lá khả năng khử gốc tự do DPPH và HO Theo đó, cao methanol có khả năng kháng quả còn cho thấy khả năng kháng hai dòng vi khuẩn Ö subtilis, E coli’ va khả năng

ức chế dòng nắm Candida albicans của các loại cao chiết là khá tốt [13] 1.1.4.2 Nghiên cửu ở nước ngoài

Nam 1998, tic gid Teresa Gallardo và cộng sự đã tiến hành đề tài nghiên cứu

v các hợp chất acetosenin có trong hạt bình bát Đây là nhóm hợp chất có tính chất gây chất của tế bào Đề tài đã công bố 12 hợp chất acetogenin đã được tìm thấy trong ình bất là rất lớn [7]

Năm 2008, Bruce Cochrane vi cộng sự đã tiến hành đánh giá h su qua

chống ung thư của chiết xuất ethanollá, hạt, thịt quả bình bất đối với các đồng t bio

thư nhạy cảm với thuốc (CEM) và dòng tế bảo ung thư đa kháng thuốc (CEM/VLB)

nhưng không thể hiện đối với tế bào Iympho binh thường Cao ethanol từ hạt được

ghi nhận là có khả năng gây chết tế bào ung thư cao hơn so với cao ethanol từ thịt

quả và lá, Cơ chế chính của khả năng khẳng ung thư được giả thích là do sự tăng

biểu hiệu của gene mã hoá cho các chất ức chế protein kinase, dẫn đến ức chế quá

trình phân chia tế bào gây sự chết theo chương trình [5]

Năm 2018, Yin Liu và cộng sự trong công bổ đề ti "ír uimo miochondia- mediated anticancer and antiprolifeative effects of Annona glabra leaf extract

mn iia Id binh bat ¢6 khả

against human leukemia cell di chimg minh cao chi

năng kháng oxy hoá cao thông qua ba phương pháp ERAP, bắt gốc tự do DPPH và

thư máu khi được ủ với cao chiết ở ndng độ 80 và 100 ug/ml, lần lượt là 10,7% và

22,4% [6]

Từ những công bố trên, đề tài nhận thấy lá bình bát thể hiện hoạt tính sinh hoc

tốt ở khả năng kháng oxy hoá, gây độc tế bào ung thư, kháng nắm, kháng vi khuẩn Hạt bình bất thể hiện khả năng gây độc tổ bảo ung thư cao với nhỉ hợp chất aeetogenin đã được tìm thấy Tuy nhiên, quả bình bát vồn được sử dụng rộng rãi trong

thực phẩm lại chưa được quan tâm nghiên cứu

12.TÔNG QUAN VỀ GÓC TỰ DO

1.2.1 Nguén gắc của gắc tự do trong cơ thể

Gốc tư do, hay còn được gọi là free radieal, là những nguyên tử hay phân tử không cân bằng về điện do bị mắt clecon ở lớp ngoài cùng Sự mắt cần bằng này

khiến cấu trúc của chúng không ổn định Vì vậy các gốc tự do thường có xu hướng

tạo ra chuỗi các gốc tự do khác [I4]

Các gốc tự do được tạo ra thông qua các quá tình sinh hoá trong cơ thể Trong

chuỗi truyền elecron của quá tình hô bắp tẾ bào, oxysen là chất nhận điện từ cuối đình tạo thành các gốc tự do như gốc hydroxyl (*OH-), sốc superoxids (.O:) và sốc niưic oxide (+NO-) Các gốc tự do cũng có thể được tạ ra trong dạ dầy và ruột nhờ,

.quá trình tiêu hoá thức ăn Nồng độ các gốc tự do trong tế bào sẽ được được gia tăng

nếu gặp phải các tác động như: chất phóng xạ, tia UV, 6 nh môi trường, Ngoài

tự đo được sinh ra nhiều hơn

1.3.2, Tác hại của gốc tự do

Các gốc tự do khác nhau sẽ có tác động khác nhau đến thành phần của tế bào

Vi dw gốc superoxide gay mit én dinh céu trúc màng sinh chất và giải phóng acid

c hydroxyl COKD tấn công gây tốn thương mảng tế ào, kích thích sự phân béo,

tách cấu trúc xoắn kép của DNA [ HiỊ

Hình L.1 mồ tả gu tình proxide bo lớp pid ở màng tế bảo Theo đó, phân

ww khi tiếp xúc với gốc oxy hoá mạnh là hydroxyl đã

từ ipid chưa bảo hoà bạn đầu

bị mắt điện tử và trở thành một gốc tự do lipid mới (lipid radical) Gốc này có khả

(d peroxyl có tác động

năng kết hợp với O¿ tạo thành gốc tự o lipid peroxyl Gốc li

„ nó lấy điện tử từ một phân tử lipjd chưa bão hoà khác

tương tự với hydroxyl band

trên màng ế bào để tở thành Hpid peroxide Phân tử id vừa bị nất điện ừ tẾp tục

n tử Quá trình này lặp

trở thành gốc tự do mới và đi tìm phân tử lipid khác để lấy di

đi lập lại khiến các phân từ lipid trên màng tế bào chuyển dẫn thành dang lipid peroxide, gay t6n thuong mảng tế bào

nhiễu các gốc tự đo dẫn đến stress oxy hoá trong té bio [16] Stress oxy hoá có thể

sây ra một số bệnh í như: xơ vữa động mạch, ung thư, xơ gan, Tinh trang bệnh lý

6 thể tế triển nhanh hơn và năng hơn nêu người bệnh mang nhiễu yêu tổ nguy cơ

(ô nhiễm, rượu bia )

12.3 Phân loại các gốc tự đõ cá

gốc tự do chứa nitrogen ~ RNS; trong đó nhóm gốc tự do ROS phổ biển hơn và có

bốc tự do được thành hai nhóm chính: gốc tự do chúa oxygen - ROS va

vai tr quan trọng hơn [7]

Một số gốc tự do phố biển có thể kể đến như:

- Superoxide (O;); đây là gốc tự do ROS phé biến nhất, được hình thành chủ yếu ở tỉ thể Gốc này có thể tổn tại dưới dạng hydroperoxy] (HO:) ở mỗi trường có

pH thấp, giúp xuyên qua lớp phospholipid kép của màng tế bào đễ dàng hơn

- Hydroxyl (OH): đây là gốc tự do có khả năng phản ứng mạnh mẽ nhất rong

số các gốc tự do nhóm ROS Nó có thể phản ứng với phân tử vô cơ lẫn hữu cơ (bao gồm DNA, protein, lipid, carbohydrate) dn dén gây tổn thương nghiêm trong cho bào

- Hydrogen peroxide (H:02): g6c tự đo được hình thành từ phản ứng phân huy được xúc tác bởi enzyme superoxide effutase H:O› có thể gây tôn hại cho tế bào ở

‘enzyme san xuất n

= Ozone (O¿): chất oxy hoá mạnh được tạo ra nhờ vào sự oxy hoá nước được tg lượng nhu glyceraldehhyde-3-phosphate dehydrogenase xúc tác bởi kháng thể, đồng vai trd quan trong trong quá trình viêm Ozone có thể hình thành các gốc tự do bằng cách oxy hoá các đại phân tử sinh học

~ Peroxyniite (OONO): được hình thành từ phản ứng giữa các gốc tự do O; và

NO, Đây là gốc tự đo nhóm RNS có độc tính cao, nó có thể phan ứng trực p với CO; để peroxyniuite (ONOO) ONOO có thể oxy hod lipid, oxy hoá lượng dư

‘methionine va tyrosine cia protein, oxy hod DNA

1.2.4 Họp chắt kháng oxy hoá

“Trong tự nhiên, nhiều hợp chất có trong các loài thực vật được ghi nhận là có

khả năng làm giảm te động của ác gốc tự do, các hợp chắt này được gọi là hợp chất

kháng oxy hoá Chất kháng oxy hoá là những hợp chất hữu cơ có lượng điện tử dư

thứ tự do bằng cách chơ bớt điệ từ (hình 1.3) NR

tự do đạt rạng thái bên vũng, không tắn công đến các phân tử khác

chúng có thể trung hoà c;

vậy mà cá

của tế bảo và cơ thể

wath „người ta đã có thể xác định thành phần, hồ u lượng các hợp chất 6 trong sinh

ật và phân lập chung ch các mục đích khác nhau

1.2.4.1 Acid ascorbic

Acid ascorbic (vitamin C) là hợp chất hữu cơ khing oxy hoá mạnh, có nhiều

trong các loại rau (bông cải xanh, tiêu, khoai tây, cà chua) và quả (cam, quýt, chanh)

Acid aseotbie nhạy cảm với ánh sng, đễ bị mắt hoạt tính khi tiếp xúc nên cần được bảo quản trong điều kiện tránh sáng [18]

Trong ế bảo, đi à một chất khử mạnh và có thể làm vô hiệu hoá gốc tự do, tham gia bảo vệ màng lipid và protein khỏi tổn thương oxy hóa bằng cách chuyển điện tử cho các gốc tự do và làm giảm khả năng oxy hoá của chúng (hình l.4)

Polysaccharide (C¿HizO,), là đại phân tử hữu cơ cực kì phổ biến ở các loài thực

vật, tham gia vào cấu tạo của thành tế bào thục vật Trong những năm gần đây,

polysaccharide và các dẫn xuất của chúng đã được quan tâm nghiên cứu về khả năng trung hoà các gốc tự do

Cie polysaccharide tự nhiên có tương thích sinh học tốt, đã được sử dụng rộng trong các ứng dụng y học và được phẩm nhờ vào tít chất chống oxy hóa vượt trội của chúng Cơ chế chống oxy hóa của polysaecharide chủ yếu bao gồm việc điều chỉnh các con đường truyền tin hi „ kích hoạt enzyme, và loại bổ các gốc tự do

(hình 1.5) Hiệu quả chống oxy hóa của polysaccharide phy thuộc nhiều vào tính tan

u trúc vòng đường, trọng lượng phân tử, các thành phan protein [20]

Flavonoid la ce chit phenolic doe ô lập tử ác loài thực vật có mạch, với hơn

000 hợp chất đã được bit đến Chúng hoạt động trong cơ thể thục vật với nhiều vai côn trùng

iii pata aco

Hình Ló Cầu trúc của một số nhém flavonoid Cấu trúc của fiavonoid (hình 1.6) có nhiễu đặc điểm giáp chúng thực hiện khả

năng kháng oxy hoá: nhờ nhóm hydroxyl trên vòng B và liên kết đôi 2,3 được liên

kết với chức năng đ‹oxo mà flavonoid có khả năng cho điện tử từ nhóm hydroxyl

này, từ đó làm giảm các gốc tự do như hydroxyl, peroxyl, và peroxynitrite "Ngoài 3 nhóm hợp chất hữu cơ nêu trên, trong tự nhiên vẫn còn rắt nhiều các

hợp chất hữu cơ khác có khả năng kháng oxy hoá như: alkaloid, saponin,

14 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT KHẢ NẴNG KHÁNG OXY HOÁ

IN VITRO

13.1 Phương pháp khảo sắt năng lực khi:

Đây là phương pháp khảo sắt khả năng kháng oxy hoá được đ xuất bởi tác giá Oyaizu M nim 1986

Nguyên tắc của phương pháp này được thực hiện đựa trên việc các chất chống

‘oxy hoá có khả năng khử Fe" trong [ferricyanide}* thanh Feˆ* trong [ferroeyanide]“ (heo sơ đồ hình 1.7) Phức hợp này khi tác dụng với FeCH: sẽ tạo thành dung địch

Fe" cùng cao, chứng tô hàm lượng các chất chống oxy hóa có rong mẫu cao Hàm

lượng phức ch màu xanh được thể hiện gián tip thông qua chỉ số OD do ở bước

- Phương pháp rẻ tiễn, dễ làm và độ tin cậy cao;

= Đo độ hấp thụ ở bước sóng cao giúp hạn chế ảnh hưởng từ phản ứng;

- Sữ dụng thiết bị don gin

Han ché [21]

- Phuong pháp không thể thực hiện trén cae tim microplate;

= Néu miu 6 mite 49 protein cao quá tình kết tủa vi axit trichloroacetic ©6

thể gặp khó khăn

Phương pháp khả năng khử Fe** (viết tắt là FRAP) được phát triển bởi Iris

Benzie va J Stain nim 1996

Nguyên tắc: các chất chống oxy hoá có khả năng khử phe Fe" - TPTZ

hành phức Fc?' - TPTZ màu xanh ở pH thấp

{6 -tripyridyl -s - triazine) mau

chống oxy hoá có trong mẫu

Cường độ màu xanh dai điện cho hàm lượng ede ct

khảo sắt Bước sóng đo OD sử dụng cho phương pháp này là 593 nm với dung dịch BHT (Butylated Hydroxy! Toluene) duge ding lim chất chuẩn [21]

Khi phân ứng xay ra, mau của DPPH có hiện tượng chuyển từ màu tím sang

màu vàng Sự giảm màu của DPPH phản ánh khả năng bắt gốc tự do của chất chống

oxy hoá Đo độ hắp thụ của DPPH tai bude sng 517 nm giúp xác định hiệu quả Kháng oxy hoá thông qua sự giảm giá trí OD của mẫu so với chứng âm [21]

Ưu điểm [21]:

- Bon giản, rẻ tiền và nhanh cl ong;

~ Có thể định lượng chất chống oxy hóa trong các hệ thống sinh học phức tap;

- Thời gian khử gốc tự do là 30 phút, cho phép DPPH phản ứng hiệu quả, ngay

cả với các chất ching oxy hóa yên:

- Hiệu quảcho các hợp chất không ôn định nhiệt

- Độ nhạy coi

- Cóthi sảng lọc nhiễu mẫu một cách kịp thời;

- Thường thể hiện có mối tương quan tí

flavonoid) với hệ số hồi quy R > 08

Hạn chế [21]

với các hợp chất sinh học (phenol,

~ Phân tử gốc tự do DPPH tan trong dung môi hữu cơ (dạng lipophilic);

- DPPH có xu hướng phản ứng với các gốc tự do khác có mặt trong các mẫu đượ kiếm tr;

~ DPPH nhạy với các base Lewis

Khitiếp xúc với ánh sáng, hp thụ của DPPH có xu hướng giảm, diễu nảy đồi

hỏi quá trình thí nghiệm cần trong bóng tôi;

~ Không thể hiện được khả năng kháng oxy ho tốt đối với một số cốc tự do như O11, NO, O:

1.3.4 Phương pháp khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do ABTS*

Năm 1993, Miler và Riee-Evanslà những người đầu tiên báo cáo phương pháp thử ABTS', côn được biết đến với tên gọi TEAC Phương pháp này sau đỏ đã được cải tiến bởi Re và đồng nghiệp vào năm 1999 [21]

Nguyên tắc: 2,2° - azinonbis (3 - ethylbenzothiazoline - 6 - sulfonic acid)

(ABTS*) la mét géc tyr do bén, có khả năng phát quang màu xanh và đặc trưng ở độ

hip thụ ở bước sóng 734 am Chất chống oxy hoá có khả năng trung hòa gốc tự do

này và làm giảm độ hắp thụ của dung địch Do đó, khi đo độ bắp thụ ở bước sóng

T34 nm và đem sơ sảnh với chất chuẫn Trolox (6 - hydroyl 25.7 tetramethyl -

- carboxylic acid) s@ xác định được hoạt tính của chất chống oxy có trong mẫu [10]

Ưu điểm [21]

tudo ABTS* tan trong cả dụng môi hữu cơ và nước;

~ Có thể được sử dụng để xác định khả năng chồng oxy hóa của nhiều hợp chat, như carotenoid, phenolic và huyết tương;

= Phan tir ABTS* bén và ôn định trong hơn so với DPPHI, có thể dùng được

khi bảo quản ai ngày trong bóng tối ở nhiệt độ phòng

Hạn chế [21]

- Gốc tự do ABTS" khong tin ia rong tự nhiên mà cằn phải được tạo ra bằng phương pháp ha học, Do đó, một

hg thong in vive;

ti ligu cho ring ABTS*khdng thé đại diện cho

= Théi gian tao ra ABTS* tuomg d lâu, mắt khoảng 12 - 16 giờ:

~ Không thể hiện được khả năng kháng oxy hoá tốt đối với một số gốc tự do như

OH, NO,

“Chương 3 DOL TUQNG VA PHUONG PHAP NGHIEN COU

3.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu trong đề tải là cao nước và cao etbanol được chiết xuất

từ quả bình bất được thu nhận tại huyện Bình Chánh, thành phổ Hồ Chí Minh

“Cây bình bất được định danh bởi Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Tâm, bộ môn Phân loại thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HOÁ CHÁT

2.2.1 Thiét bi, dung cw

'Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài được trình bày tại

bảng 2.1 dusi diy

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị, dụng cụ

“Tên thiết bị, dụng cụ Hãng sản xuất

THIẾT BỊ

1 [Qungpỏkế ‘Amersham Biosciences

2 Bê ôn nhiệt 'Memmert

3 | May chung edt nude Cold Parmer

4 | May iam HETTICH

2 | Binh tam gide Bomex

3 | Burette 25mlL Eisco Scientific

4 | ipetman 100 - 10004 Seitogex

5 Pipetman 20 - 200L AS ONE

3⁄42 Hố chất

3.2.2.1 Cao chiết

Dung mơi đăng để thu nhận cao chiết ừ thị và hạt bình bất là nước cất và

ethanol 96; tỉ lệ I g bột được liệu : 10 mL dung mơi

Mẫu cao chiết ding trong các thí nghiệm dược pha lọng bing dung dịch cimethl sulfoside (DMSO) 2,59

22.22 Thí nghiệm năng lực khử

“Thí nghiệm sử dụng các hố chất gồm: dung dịch dém phosphate pH = 6: dụng địch Ks[Fo(CN)e] 1%; dung dich acid trichloroacetic (TCA) 10%: dung dich FeCls (0,1%; dụng địch acid ascorbie (Merek) nồng độ 1000 g/mL, Cách pha:

- Dung dich dgm phosphate pH = 6,6: 1,0842 g NaH:PO¿2H:O được bổ sung vừa đủ với 30 ml nước cất tạo dung dich A Lay 1,434 g Na›HPO 12H:O pha với

nước cất đến khi đạt thé tich 20 mL tao dung dich B Trich 25 mL dung dich A pha

‘i 15 mL dung dich B 18i bd sung nước cất đến tổng thể tích 8Ư mL;

= Dung dich Ko[Fe(CN)e) 1%: 0.5 g KalFe(CN), khan được bổ sung nước cắt đến khi ạt th tch $0 mL

- Dung dich TCA 10%: 5 g TCA được bổ sung vita di v6i 50 mL nude et

- Dung dich FeCl 0.1%: 0.0166 g FeCl: được pha vừa đủ với I0 mL, nước cất;

- Dang dịch acid aseotbie 1000 g/mL; 0.005 g ad asorbie pha trong 5 ml, nước cấtthu được dung dịch acid aseorbie cĩ nơng độ 1000 mg/mÏ sử dụng làm dung

100 pgimL (bảng 22)

Bảng 2.2 Các nằng độ acid ascorbie sử dụng trong năng lực khử:

Nong d9 acid ascorbie | ‘Thé teh stock (WL) | Thể tích nước cất (HL) 20pgimL 20 980

40 p/m 40 960

60 pg/mL 60 | 940

Cách pha

Đung dịch DPPH 0,08 mM: 0.0033 g DPPH (ThermoScien ) duge bé sung,

- Dụng dich acid ascorbie 16,0 pg/mL: 0,002 g acid aseorbie duge bd sung vừa

44120 mL nước cắt tạo dung dịch stock có nông độ 16,0 g/ml Rút 160 0l dung dich stock pha với 840 pL nude eft

3.3.3.4 Thí nghiệm định lượng acid ascorbie

Hoá chất được sử dụng trong thí nghiệm gồm: dung dich HC1 2%: dung địch hỗ tỉnh bột 1ö: dung địch iod 0.01 N

Cách pha

Dung dich HCI 2⁄%: pha 2 mL, dung địch HCI 36% với 34 mí nước cắt

- Dạng dịch hỗ tỉnh bột 1⁄6: 0.2 g tinh bgt duge pha véi 15 mL nude et ri dun

nóng để làm tan tỉnh bột Sau khi tính bột tan hoàn toàn thì bỏ sung nước cắt đến khi

đạt hề tích 20 mL

- Dung địch iod 0,01 N: cho 1,6 g KĨ pha với 50 ml, nước cắt tạo dung địch KĨ Hod tan 1,27 g tỉnh thể iod với dung địch KĨ vừa tạo Sau khi iod tan hoàn toàn thì

bổ sung nước cắt đến khi đạt 100 mi,, bảo quản ở điều kiện tính sáng

3.2.2.5 Thí nghiệm định lượng polysaccharide

Hoá chất được dùng rong thí nghiệm gồm: dung dịch glucose 100 iLiml: dung

dich phenol 5%: dung dich H;SO; đậm đặc,

~ Dung dich phenol 5%: 0,5 g phenol được bổ sung vừa đủ với 10 mLħ nước cắt,

30 mL, nước cắt để dùng làm dung dich stock Dung dich stock này được pha loãng xuống các nồng độ: 20, 40, 60, 80, 100 g/mL (bảng

Bang 2.3, Các nồng độ D - glucose sit dyng trong định lượng polysaecharide

Nong dé acid ascorbic “Thể tích stock (HL) Thé tích nước cất (wL)

CQuả bình bát được thu hái tự nhiên vào tháng 9 - 10/2023 Quả được chọn có

màu vàng (chín), không bị sâu, không bị thổ ữa Quả được thụ hái trên nhiều cây tại khu vục xã An Phú Tây, huyện Bình Chánh, Tp Hỗ Chí Minh (hình 2.1)