Do đó, bảo ung thư, Phùng Anh Tải [13] “đã chứng mình nước sắc tổ hợp ba loại dược liệu trên có khả năng gây độc tế bảo ung thư gan Hep-G2 với giá trị ICạn là 0,661 + 0.137: các dược X
Trang 1
TRUONG DAI HOC SU PHANCTHANT PHO HO Citi MINH
NGUYEN HUY HOANG
ĐỊNH LƯỢNG MỘT SÓ HỢP CHÁT THỨ CAP
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ TRONG DIEU KIEN IN VITRO
CUA TO HOP BA LOAI DUQC LIEU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DAL HOC NGANH SU PHAM SINH HỌC
THANH PHO HO CHi MINH - 2024
Trang 2
TRUONG DAI HOC SU PHANCTHANT PHO HO Citi MINH
NGUYEN HUY HOANG
ĐỊNH LƯỢNG MỘT SÓ HỢP CHÁT THỨ CAP
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ TRONG DIEU KIEN IN VITRO
CUA TO HOP BA LOAI DUQC LIEU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGANH SU PHAM SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DÁN KHOÁ LUẬN Th§ Nguyễn Thị Hing THÀNH PHÓ HỖ CHÍ MINH - 2024
Trang 3Độc lập - Ty do - Hạnh phúc
BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA KHOẢ LUẬN TÓT NGHIỆP
Ho và lên: Nguyễn Huy Hoàng
Sinh viên khoá: 46 "Mã số sinh viên: 46 01.301.038 Ngày sinh: 1601/2009 Nơi sinh: Bình Dương
“Chương trình đào tạo: Sư phạm Sinh học
"Người hướng dẫn: Thể, Nguyễn Thị Hằng
Cơ quan công tác: Trường Dại học Sư phạm Thành phố Hỗ
Điện thoại: 0985280851 Email: hangntŒ hemue củu vn
Tôi đã bảo về kho lun ốt nghiệp với đỀ tú: Định lượng một thứ cấp
có khả năng kháng oxy hoá trong điều kiện šø vizo cũa tổ hợp bai
= Một số lỗi hình thúc: lỗ chính tà, ỗi khoảng trắng
- Thay đối su trúc nội dung Chương 3 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN,
"Nay tôi xin báo cáo đã hoàn thành sữa chữa khoá luận như rên và đề nghị Hội đồng chấm khoả luận, người hướng dẫn khoa học xác nhận
của người hướng dẫn khoa học
‘ThS Nguyén Thj Hing ‘ThS DS Thinh Tri
Trang 4Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn cổ Ngụ hg - người đã định
"hưởng, hướng dẫn và tận tình giáp đỡ tôi trong quả trình hoc tap, nghién citu va hoàn thành đễ tài khoá luận
Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Si phạm Thanh pho Ho Chi Minh
va ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điêu kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa hận này
Toi xin chan think cảm ơn các cá nhân thuộc phòng thí nghiệm Di truyén - Tién hod, khoa Sinh học, trường Đại học Sự phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình cho đề tài khoá luận của tôi:
Tôi vấn chân thành cảm ơn các quý Thy/Có, các nhân viên, anh chị, các bạn xinh viên thuộc phòng thí nghiệm Vĩ sinh - Sinh hoá, phòng Sink học trung tâm, phòng, Sinh học, trường Đại học St phạm Thành phố Hỗ Chí Minh đã giúp đồ, hỗ trợ các
tiế bị và đụng cụ cho để tà
Thành phổ Hồ Chi Minh, ngày 02 tháng 05 năm 2024
VIÊN THỰC HIỆN KHOÁ LUẬN
⁄
Nguyễn Huy Hoàng
Trang 53 ĐÔI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
4, NHIEM VU CUA DE TAL
5 PHAM VI NGHIEN CUU
6 NOI DUNG CUA DE TAL
Churomg 1 TONG QUAN
1.1 Tổng quan về gốc tự do và cơ chế khẩng oxy hoá cũ tế bào 11-1, Tổng quan về gắc tự do
1.1.2 Cơ chế kháng oxy hoá của tế bảo
1.2 Tổng quan về chất khing oxy hoổ tự nhiên
Trang 61.5.3 Phương pháp khảo sát năng lực khử lan đẳng (CUPRAC) 1.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng bắt gắc ne do DPPH (DPPH) 1.4.3 Phương pháp khảo sát hiệu quả trừng hoà gắc tự do ABTS+ (TEAC) Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU,
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2 Đồi tượng nghiên cứu
3.4.5.2 Phương pháp bắt gốc tự do DPPH
2.5 Phương pháp xử lí số liệu
Chương 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu
BLL ất quả xác định khả năng kháng oxy hoá
311-.1 Nẵng lực Khử của cao nước
3.1.1.2, Két qua bit ede te do DPPH
3.11.2.1 Két quả bắt gốc tự do DPPH cia ascorbie acid 31.1.22 Kết quả bắt gốc tư do DPPH của cao nước 3.1.2 Kết quả định tính, định lượng các họp chất thứ cắp 3.1.21 Két qua dn tn
3.1.2.2, Két quả định lượng.
Trang 7KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
“TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Trang 8
OD | Optical Density Mật độ quang DPPH [22-dipheny-l-pierylhydragl | Mộtgốe tự do e6 Kha nding hap
thụ các phân từ hydrogen ECu Half maximal effective | Nong độ của hợp châUchất mà concentration tại đồ có giá trị kháng oxy hoá
là 50%
mẹ CEig hoặc | khối lượng cafe tong cao | Đơn vị định lượng alkaloid
mg CE/mL _ | chiết hoặc l mL nước sắc nồng | dựa vào đường chuẩn caffein
độ 100%6; đơn vị mg
mỹ QE/g hoặc | khỏi lượng quecerin tong 1 g | Đơn vị định lượng flavonoid mgQE/mL | cao chiết hoặc 1 mL nước si |dựa vào đường chuẩn nồng độ 100%; đơn vịmg —— |quereein
mg GAE/g— [khối lượng galie acid trong L ø| Đơn vị định lượng polyphenol hoặc mg — | cao chiết hoặc 1 mL nước sắc | dựa vào đường chuẩn gallic GAE/mL | ning 49 100%; don vimg |acd
‘mg GEghoge | Khoi hong D-glucose tong 1g|Don vị đđịh lượng mgGE/mL |cao chiết hoặc 1 mL_ nước sic | polysaccharide dya vào đường nỗng độ 10016; đơn vị mg chuẩn D-glusose
Trang 9Trang Hình 1.1 Gốc tự do và một số bệnh liên quan 3 Hình L2 Quá tình tự oxy hoá của monosaccharide với sự tham gia của lon
kim loại 5 Hinh 1.3 Stress oxy hod vi hw qua 6 Hình L.4 Một số cơ chế kháng oxy hoá của tẾ ào 1 Hình 1.5 Các loại chất kháng oxy hoá s8 Hình Ló Sơ đồ thể hiện quá tình bắt hoạt gốc tự do của lkaloid 9 inh 1,7 So dd thể hiện quả nh bất hoạt sốc tự do bởi Ilavonoid 9
Hình 1.8 Phức Fe "-quecertin hoạt động như superoxide dimusta (SOD) lo
inh 1.9 Sơ đồ thể hiện quá trình bắt boạt sốc tự do bởi polyphenol " Hình 1.10 Sơ đồ thể hiện quá trình loại bô ion kim loại cia polyphenol " Hình 1.11 Eucoidan ngăn chặn sess oxy hóa bằng cách điều chỉnh hệ thẳng kháng oxy hóa
Hình 2,1 Bán chỉ liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và X4 đen sấy khô 20 Hinh 2.2 So dd bé tri thi nghiém 23 Hình 3.1 Đồ thị thể hiện sự trong quan gia DPPH (24) vi nồng d@ ascorbic acid
3 Hình 3.2 Dề thị thể hiện tương quan giữa DPPH (%) và nồng độ cao nước theo phương tỉnh logarithmie 3 Hình 33 Kết quả định tinh hop chit alkaloid trong tổ hợp dược liệu 35 Hình 34 Kết quả định tính hợp chất iavonoid trong tổ hợp được liệu 36 Hình 35 Kết quả định tính hợp chất polyphenoltrone tổ hợp dược liệu 37
Minh 3.6, Két qua dinh tính hợp chit polysacchride trong tổ hợp dược liệu 3
Trang 10chất chuẩn 39
Trang 11Bang 1.1 Mgt s6 gốc tự do phổ biến
Bảng 21 Danh mục các thiết bị, dung cụ sử đụng trong đ ti
Bang 2.2 'ác nồng độ cao nước khảo sát trong thử nghiệm năng lục khử
Bảng 23 Các nổng độ cao nước khảo sit tong thử nghiệm bit gốc DPPH
Bảng 3.1 Nang lye khir Fe của cao nước theo nỗng độ
Bảng 3.2 Tỉ lệ phần trăm bắt gốc tự do DPPH của cao nước theo nồng độ Bảng 3.3 Giá trị ICs của cao chiết nước tổ hợp được liệu
Bảng 3.4 Kết quả định tính các hợp chất ự nhiền từ nước sắc và cao nước
Bang 3.5 Hàm lượng các hợp chất thứ cắp trong tổ hợp dược liệu 40
Bảng 3.6 Kết quá định lượng một số hợp chất ự nhiên rong tổ hợp dược liệu và các dược liệu thành phần 42
Trang 12LÍ DO CHỌN ĐÈ TÀI
(Chit khéng oxy hoá là chất có khả năng ức chế quá trình oxy hoá Trong cơ thể,
chất kháng oxy hoá giúp ngăn chặn sự tấn công của gốc tự do đến các thành phần,
cơ quan của tế bào, chẳng hạn như DNA, protein, ty thể, [1] Từ đó, nó góp phần cải thiện nhiều tỉnh trạng sức khoẻ, bao gồm viêm nhiễm, ưng thư và bệnh tim mach LẺ] Ngoài ra, chất kháng oxy hoá có khả năng diều hoà thải độc thông qua đó làm giảm tác dụng phụ của thuốc và tác hi của bệnh tật Vì vây, số lượng các nghiên cứu
về kháng oxy hoá, hợp chất, chiết xuất kháng oxy hoá tăng đáng kể trong ba thập kỉ
“qua Có nhiều nguồn chất kháng oxy khác nhau bao gồm cả tự nhiên và tổng hợp
Trong đó, chất kháng oxy hoi tw nhiên có nguồn gốc từ thực vật chiếm phần lớn
Theo WHO, khoảng 80% người dân trên thể giới tin dùng các loại thảo được trong, điều trị và phòng ngửa các bệnh mãn tính [3] Chính vì vậy, tiện nay, các chiến lược sắng lọ các hợp chất từ tự nhiên có tính kháng oxy hoá đang diễn ra rất phố biển bởi các nhà khoa học trong và ngoài nước Từ đó, những cây thuốc, dược liệu của dân gian được quan tâm, chủ ý nhiều hơn
Một số công trình nghiên cứu vẻ Bán chỉ liên [4,5,6], Bạch hoa xả thiệt thảo [7.8], Xa den [9,10] cho thấy mỗi được iệ riêng lẻ đu thể hiện hoạttính kháng oxy hoá và chứa các chất kháng oxy tềm năng như flavonoid, phenolic,
carotenoid, Trong đông y, Bán chỉ liên, Bạch hoa xà thiệt tháo củng một số thảo
được khác được đng trong điều tr ung thư gan [11,12]; tương tự ở Xạ đen Do đó,
bảo ung thư, Phùng Anh Tải [13]
“đã chứng mình nước sắc tổ hợp ba loại dược liệu trên có khả năng gây độc tế bảo ung
thư gan Hep-G2 với giá trị ICạn là 0,661 + 0.137:
các dược
Xi các cơ sở đã tỉnh bày và mong muỗn chứng minh tổ hợp dược liệu gồm Bán chỉ lên, Bạch hoa xà thiệt thảo, Xa đen ngoài hoạt tính gây độc tẾ bào úng thư dụng phụ, tăng cường miễn dịch trong điều trị ung thư Vì vậy, để ải iến hành “Định
Trang 13lượng một số hợp chất thứ cắp có khả năng kháng oxy hoá trong điều kign in vũo cũa tổ hợp ba loại được liệu” để cung cấp thêm cúc cơ sở khoa học
2 MUC DICH NGHIEN COU
Phin ích khả năng kháng oxy hod in viiø của cao nước tổ hợp gm Bản chỉ liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và Xa den
3.ĐÔI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Để cung cắp những dẫn liệu cho việc sử dụng thuốc trong dân gan, đ tài khảo sát khả năng kháng oxy hoá của cao nước tô hợp được liệu gồm Bản chỉ liên, Bạch hoa xà thiệt thảo và Xa đen được phối trộn theo tỉệ 2
4 NHIỆM VỤ CUA DE TAL 5 về mặt khôi ượng
Đề tài tiến hành thực hiện các nhiệm vụ sau:
- Nhiệm vụ 1: Tổng thuật các cơ sở khoa học và các công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài;
- Nhiệm vụ 2: Thực hiện các nội dung chính g6
+ Nội đụng 1: Xác định khả năng kháng oxy hoá in vitro của cao nước; + Nội dung 2: Định tính và định lượng các hợp chất thứ cấp có t h kháng oxy hoá có trong nước sắc, cao nước
5 PHAM VINGHIEN COU
rong giới hạn nghiên cứu của đề ủi, cao nước và nước sắc tổ hợp dược liệu được định lượng một số hợp chất thứ clp Trong các hợp chất thứ cắp, những hợp chất này đã được chứng mình iểm năng khing oxy hoá
ĐỂ chứng mình khả năng kháng oxy ín iø của dược liệu, đỀ tải sử dụng 2
y) và bắt gốc tự do DPPHL pierylhydruzyl) Vì 2 phương pháp này được sử dụng phổ biỂn trong phương pháp: năng lực khứ sắt (reducing power as
(2.2-diphenyl-
thứ nghiệm kháng oxy hoá, có độ tin cậy cao, phủ hợp với điều kign phòngthí nghiệm
6 NỘI DUNG CỦA ĐÈ TÀI
Trang 14
1-1 Tổng quan về gốc tự do và cơ chế kháng oxy hod cia té bio Ltt Ting quan về gốc tự do
Gốc tự do (Eee radieal) là các phân tử hay nguyên tử bị mắt đi một hoặc nhiều electron lip ngodi cùng Chúng gồm hai nhóm phổ biến là các gốc oxygn hoạt động (ROS ~ Reactive Oxygen Species) và các gốc nitrogen hoạt động (RNS - Reactive Niưogen Species) II Khi ở nồng độ cao, gốc tự do có thé tin công làm tổn thương các phân tử DNA, proin,lipfd, cũng như các bảo quan, cầu trú tẾ bào như ty thể, mảng ế bào, [I4] Từ đó, gốc tự do góp phần gây ra hoặc làm rằm trọng thêm các bệnh như ung thư, đái tháo đường, các vẫn đề tim mạch, (hình 1.1) Một số ROS phổ biển ong tế bảo được thé him qua bang 1.1
ốc tự do và một số
Trang 15
Reactive Oxygen Species Non Free-Radical Species Hydroxyl radical HOt | Hydogenperoul | HO;
Hytopsovylndiel— | HOO, Ozone °Ẳ Lipid radical L idhydroperoxide | LOH Lipid perorylvadical | LOO* | Hypocnlorousacid | HOCL Peroxyl radical ROO* Peroxynitrite ONOO-
Lipid alkoxyl radical Lo* Dinitrogen trioxide NO; Nitrogen dioxide radical | NO3* Nitrous acid 1 HNO,
Nitric oxide radial | NO" Niuyl ehlonde NOC Thiyt radial RS Nitoxyl anion NO Protein radical Fr Nitroxyl cation: NO*
Trong co thé, gốc tự do là sản phẩm tắt yếu của của quá tình sinh hoá,
cụ thể là các phản ứng oxy hoá khử, nhiều nhất là quá trình hỗ bắp tế bảo Gốc tự do .được tạo ra thông qua tỉnh phân giải siucose với sự tham gia của các cnzyme trong bào quan khác như peroxisome, mierosome [l6] Ở cấp độ cơ thể, gốc tự do các nguy cơ Xơ gan, viêm gan, ung thư gan
Ngoài quá trình hô hấp t
khác như: quá trình tự oxy hoá đường monosaccharide với sự có mặt của ion
dào, ốc tự do còn được ạo ra từ một số con đường kăn loại Con đường này không cần sự tham gia cũaenyme [17], Theo ình L2, khi
có sự tham gia của lon kim loại (MP), monosaeehaide (đụng edioD sẽ tự oxy hod
thông qua nhiều giai đoạn và tạo thành nhiều gốc tự do như: HOz, 'OH,
Trang 16protein, Điều này làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein, tờ đó dẫn đến
một số bệnh mà điễn hình nhất là đái tháo đường [18]
Hình 1.2 Quá trình tự oxy hoá của monosaccharide với sự tham gia của
ion kảm loại [I7]
11.2 Co ché khang oxy hod cia é bio
Khi nông độ cốc tự do trong tẾ bào tăng cao vượt quá mức kiểm soát, nổ có thế
ay ra tinh trang stress oxy hoá, Sưess oxy hoá nghiêm trọng có thể gây tổn thương
tế bảo, là một trong những nguyên nhân dẫn đến nhiều loại bệnh, tật, thậm chí là tử vong (hình 1.4) [19]
Trang 17(GPx), thieredoxi (Tre Chất kháng oxy hoá ngoại sinh bao gồm các chất không
phải enzyme như: các vitamin A, C và E, [lavonoid, phenolie acid, coenzym Q10,
Trang 18ƒ-tạo gốc tự do theo nhiều cơ chế khác nhau Theo hình 1.4, một số cơ chế phân ứng
phổ biển của chất chống oxy hoá là: phản ứng trực tiếp với gốc tự do, qua đó tạo ra
sốc Ôn định hơn; úc chế các phản ứng oxy hoá tạo ra ốc tự đo; chất khẳng oxy hoá Không enzyme có thé host hos gene sin xuất các enzyme kháng oxy hoá, 20]
tốt trong lipid có thể loại bỏ gốc tự đo trong lớp phophotlipid kép, từ đó hình thành
sốc tự do của vitamin E Sau đó, vitamin C phản ứng với nhóm chroman để ti tạo
lại vitamin E từ gốc tự do của nó [21] Tuy nhiên, hiệu quả các chất chống oxy hoá
nhiên được quan tâm, chủ ý:
1.2 Téng quan về chất kháng oxy hoá tự nhiên
Hiện nay, một số hợp chất có khả năng khing oxy hoá đã được phân lập thể
hiện qua hình 1.5 Theo đó, trong các nhóm chất kháng oxy hoá, các nhà khoa học
Trang 19flavonoid, phenolic, cée vieanin, Vì những chất này có nhiễu trong thực vật, qui
trình phân lập và cách bảo quản đơn giản hơn so với các enzyme kháng oxy hoá
Pa REioo.dik, Li! tretnety (Teeepberelsnd c (Ascorbic Aad) E Tecstrenob)
Trang 201221 Đây cũng là cơ chế kháng oxy hoá của alkaloid Nếu trong tế bảo có các gốc tự đo ở điện tử trên nguyên tử nitrogen có khuynh hướng địch chuyển về liên kết trạng thiếu một proton (chẳng han nhu hydroxyl, thi proton H* cia alkaloid sẽ được chuyển cho gốc tự do để tạo thành gốc ổn định (hình 1.6) [23]
A KR OH
co" Co = Ao’ Alkaloid Tndol
THình L6 Sơ đồ thể hiện quá trình bắt hoạt gắc tự đo của lkalo (23) 1.2.2, Flavonoid
Flavonoid là những hợp chất có màu thuộc nhóm phenol, phổ biển ở thực vật Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 iphenylpropan (Cu-Cs.C) và thường có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl ~ OH) [22] Vi vay, flavonoid la mot hgp chất tiềm năng kháng oxy hoá thông qua quá trình nhường proton H* của nhóm hydroxyl
Có 2 cơ chế hoạt động kháng oxy hoá của các flavonoid: (a) loại bỏ trực tiếp các gốc tự do bằng cách nhường một electron hoặc nguyên tứ hydrogen; (b) ức chế
quá tình ình thành gốc tự do Theo cách thứ nhất, các fiavonoid phân ứng với gốc
tự do bằng cách nhường đi prolon H" của các nhóm ~ OH (hình L7)
Trang 21Theo cách thứ hai, khi có mặt của ion kim loại (Fe™) va gốc tự do (Ox), flavonoid (quecerin) có thể hoạt động như enzyme kháng oxy hoá để loại bỏ gốc tự
do (hình 1.8) Đồng thời, (lavonoid liên kết và tạo phức với các ion kim loại, từ đó
iéu fenton (1) [25] Ngoài
ra, một số nghiên cứu cho thấy, flavonoid có thể giảm hoạt động các enz loại bỏ mồi nguy tiềm tạo ra gốc tự do thông qua phan ng
sme hình
thành gốc tự do (xanthine oxidase) do c6 cu trie gin ging én có khả năng cạnh tranh [26] Vì vậy, những nhóm thực vật có chứa nhiều flavonoid sẽ là nguồn kháng oxy hoá tiềm năng ching han như các họ thuộc bộ Hoa môi (Lamiueeue,
'Verbenaceaeae, Qesneriaceae), họ Hoà Thảo (Gramineae), [27]
(1) H2O» + Fe™*(Cu*) > ‘OH + OH + Fe*(Cu™) Phan tmg Fenton
o cy
'Hình 1.8 Phức Fe°'-quecertin hoạt động nhw superoxide dimusta (SOD) [25]
Trong tự nhiên, phần lớn các flavonoid xuất biện đưới dạng liên kết với đường (glyeosiỏe) Số lượng và vị liên kết với phân từ đường sẽ ảnh hướng đến hoạt tính
(aglyeone) thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn nhưng nồng độ trong cơ thể thấp
[28]
1.2.3 Polyphenol
Polyphenol li ning hep chit thuộc nhóm phenol, đặc trưng bởi cầu tric ving benzene, có một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl (~ OH) Cae hyp chat polyphenol thường có trong hầu hết họ thực vật một số hợp chất polyphcnol phổ biển như tanin
(lá); lignin (vách tế bảo thực vật) [22].
Trang 22nên dễ đăng khử các gốc tr do (hydroxyl, peroxyl ) bằng con đường nhường nguyên từ hydrogen (đình L9)
do, ching hạn như Fe" Thông qua đó, sự hình thành của các gốc tự đo bị hạn chế
(hình 1.10) Một số công trình ngiền cửu [25] đã chứng mình một số hợp chất polyphenol còn tham gia vào quá trình điều hoà hoạt động gene mã hoá cho các enzyme kháng oxy hoá (SOD, GSH, GST) bing eich di chỉnh yếu tổ Nrf2
Trang 23hình thành gốc tự do [30]
Các liên kết giyeoside của polysaechaide có thể cho điện từ Từ đó, polysaccharide o6 thé phan ứng trực tiếp với gốc tự do đ tạo nên gốc bn vững trong
vai trò là chất khử Ngoài ra, một số polysaecharide như Fucoidan có khả năng ức
chế hoạt tính của enzyme oxy hoá (NADPH oxidase) và tăng cường hoạt động của ewyme kháng oxy hoá (SOD, CAT, ) thông qua con đường truyền tín hiệu (KeapI/Nr2/ARE) (hình 1.11) [311
oxy hoá tốt như: vitamin A, C, E, coenzyme Q10, kim loại selen [15] Trong phạm vỉ
nghiên cứu của để tải, bốn hợp chất alkaloid, flavonoid, polyphenol, polysaccharide
.đượ lựa chọn để định tính định lượng (nước sắc và cao nước) Từ đó làm cơ sở để giải thích cho khả năng kháng oxy hoá của tổ hợp được liệu 1.4 Tổng quan về các được iệu trong nghiên cứu của để tài 1.3.1 Bán chỉ liên
Bán chỉ liên là cây thân thảo, mọc bỏ, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae)
“Trong đông y, toàn cây (ừ rổ) Bán chỉ liên được sử dụng làm thuốc để tiêu viêm,
thanh nhiệt, điều tị áp-xe phối, nhiễm độc do rắn hoặc côn trùng cắn Đặc bit,
Trang 24điều trị ung thar (11)
Năm 2018, nhóm nghiên cứu của H1 Liu đã tiến hành định lượng các hợp chắt flavonoid, phenolic, carotenoid chlorophyll cia cc cao chit ethanol vi ethyl acetate
tủ Bán chỉ liên bằng phương pháp do mật độ quang Theo công trình, giá tr fiavonoid toàn phần là 70,77+0.78 mg QE/g và phenolic toàn phần là 25,72+0.52 mg GAE/e được định lượng từ cao ethanol; trong tw & cao ethyl acetate, cic gi ti ny tương ứng lần lượt là 12,17+0.66 mẹ QE/g và 12,7740.31 mg GAE/g Ngoai ra, công trình còn chứng mình khả năng chống viêm của 2 loại cao chiết này rên dòng
tế bào RAW 264.7 và cho kết quả khả quan [4] Năm 2021, Arzoo Pannu và Ramesh K Goyal di tiền hành định tính, định lượng
các hợp chất có trong cao chiét ethanol 75% của Bán chỉ liên Bằng phương pháp lần lượt là 1,03%; 1,37% và 2,33% Bên cạnh đó, giá tị flavonoid toàn phin và 12,090,057 mg GAE/g [5]
"Đặc biệt, nhóm nghiên cứu của T.T, Ma (2020) đã tiền hành khảo sát khả năng điều trị ung thư của tổ hợp Bán chỉ iên và Bạch hoa xã thiệt thảo Bằng phương pháp thủ nhận nước sắc kết hợp với sắc kí lồng hiệu năng cao, công trình đã xác định được tổng công 75 hop chất có trong tổ hợp này cũng như chứng minh khả năng ức chế
sự tăng sinh và xâm lấn của tế bảo ung thư vú [6]
1.3.2 Bach hoa xà thiệt thảo
Bach hoa xã thiệt thảo là cây thân (hảo sống hẳng năm, mọc bô, thuộc họ Cả phê (Rubiaceae) Toàn cây (trừ rễ) được dùng làm thuốc Trong một số bài thuốc
‘dong y, Bạch hoa xà thiệt thảo được sử dụng như một vị thuốc hỗ trợ tong điều tị các vẫn đề về viêm, nhiễm, đặc biệt trong điều trị ung thư [1]
"Năm 2020, Phan Kim Định và công sự đã nghiên cứu một số hoạt tính sinh học
ở cao chiết methanol của Bạch hoa xà thiệt thảo, Bằng phương pháp đo mật độ quang
Trang 25V8 flavonoid toin phin a 83,5841,38 mg GAE/g vi 398,5347,13 mg QE/e, Ngodi ra,
48 ti cm khio sit kha nang khing oxy hos cia cao methanol Bach hoa xa thit thio các kết quả này, nhóm tác giả đã cho thấy Bạch hoa xã tiệt thảo là nguồn chất kháng oxy hoá tiềm năng [7]
Năm 2022, công trình của Phan Thị Thu Hiển đã xác định được các nhóm hợp chitnhu lavonoid, tannin,chất béo, alkaloid coumarin, saponin từ cao chiết phân thiệt thảo, Bên cạnh đó, đề tải cũng tiễn hành khảo sát khả năng kháng oxy hoá bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH và hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT của các cao chiết dược liệu này Kết quả cho thấy cao
cao chloroform có hoạt tính gây độc tốt nhất với ECso là 81,I6 wg/mL Qua đây,
công trình đã mở ra các hưởng nghiên cứu tiếp theo về phân lập và khảo sắt tác dụng được lí của hoạt chất có trong cao chloroform vả cao ethyÏ acetate [8] 1.3.3 Xq den
Xã đen là cây thân gỗ, leo, thuộc họ Vòi voi (Boraginaceae) Thân, cành và lá của Xạ đen đều được sử dụng làm thuốc Trong đông , Xạ đen thường là chủ vỉ trong các bài thuốc về điều trì ung thư, đc biệt à viêm, ung thư gan [12]
Năm 2020, nhóm nghiên cứu của Bùi Thị Thanh Duyên đã tiến hành chiết xuất
mẫu lá Xa đen bằng cthanol 90⁄6 và tiến hành phân đoạn Hin luge véi n-hexane, cdhyl aeeate và n-butanol Để tải đã khảo sắt khả năng kháng oxy hoá của các loại (cao tổng) có giá trị ECau là 48,5 g/mL, cao ethyl acetate có tác dụng mạnh nhất trong các cao phân đoạn với ICa là 46.9 ngỷml, Ngoài ra, công tình còn tiền hành
G2, LU-I, MCF-7) Ở thử nghiệm nảy, e:
ethyl acetate cing 66 tác dụng gây độc tế bảo ung thư gan và phổi mạnh nhất
so với các phân đoạn khác với giá tị ICa; lẫn lượt là 33,7 pg/mL và 13,0 pg/mL,
Trang 26(Qua công trình này, nhóm tc giá đãđảnh giả cao chiết lá Xạ đen có tác dụng ức chế
1 bảo ung thư và kháng oxy hoá tốt I9]
ai Thị Thu Trang và cộng sự (2023) đã tiền hành khảo sắt hoạt tinh sinh hoe của cao chiét ethanol la Xa den dirge th hãi ti hai địa điểm là Hoà Bình và polyphenol và flavonoid cao hơn với giá trị lần lượt là 99,98 mg GAEig và 90,69 mg QE/e so với 50.95 mg GAE/g và 49.72 mg QE/g Ngoài ra, công tình còn tiến hành khảo sát hoại tỉnh kháng oxy hoá và kháng đái thảo đường in vitro cao hơn lá Xe đen tại Hoà Bình [10]
Dựa trên kết quả nghiên cứu bước đầu của Phùng Anh Tài (2021), Xạ đen được
phối trộn với Bán chỉ i n và Bạch hoa xả thiệt thảo; trong đó Xa đen đóng vai trò
trộn 5:2:2 thể
(Bacillus subtilis) va gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2 (ECs chủ vị Tổ hợp có lệ pÏ n hoạctính kháng oxy hoá, kháng khuẩn
0470 £ 0.014%) cao nhất Vì vậy, đỂ ải iếp tục nghiên cửu khả ning Khing oxy hoá và định tính, sinh học trong triệu, tăng cường miễn dịch, giảm tác dụng của thuốc, giảm tác hại của gốc tự do
1.4 Tổng quan về các phương pháp định lượng hợp chất thứ cắp
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định thành phần về
lượng các hợp phần của hợp chất đã cho hoặc hỗn hợp các chất Các phương pháp
nay được chia think hai nhóm là: phân tích hoá học (phân tích trọng lượng, phân tích
lên di ) [32] Trong điều kiện nghiên cứu của dé tai, phương pháp đo mật độ quang được sử dụng
thể ích ~ chuin độ) và phân tích ho Ii (se kí, đo mật độ quang
để xắc định hàm lượng các hợp chất thứ cắp sau:
“Alkaloid: Hầm lượng alkaloid được xác định thông qua phân ứng tạo mẫu vàng giữa các allaloid với bromocresol green Như đã tình bảy ở rên, các alialoid luôn
cổ tính bas Vì vậy, phúc hợp màu vàng này dễ dàng được chiết xuất bằng
chloroform trong môi tường pH 47 và được đo hấp thụ ở bướ
Trang 27hàm lượng caffein
Flavonoid: Ham lugng flavonoid được xác định bằng phương pháp so màu với AICh trong môi trường kiểm và được tính dựa trên phương trình đường chuẩn của quecerin
Polyphenol: Thi
phosphomolybdie, Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất polyphenol và tạ thành thử Folin-Ciocalteu có thành phẩn là phospho-wolfarm- sản phẩm có mảu xanh đương với độ hấp thu cực đại tại bước sỏng 725 nm Dựa vào cơ chế này, hàm lượng polyphenol được dựa vào phương tình đường chuẳn của galie acid
Polysaccharide: Ci liên kếtglyeoside trong polysaecharide sẽ bị phân huỷ bởi H;SO đậm đặc tạo thành cúc monosaccharide Tiếp theo, cúc đường đơn sẽ phản ứng
với phenol tạo thành dung địch có màu vàng-cam Dựa vào sự biến đổi màu nảy,
hàm lượng polysaccharide được xác định dựa vào chất chuẩn li D-glucose tai
bước sóng 490 nm,
1.5 Tổng quan các phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hod in vitro 1.5.1 Phương pháp khảo sắt năng lực Khit Fe (reducing power) Phương pháp này được M Oyaizu công bổ lần đầu vào năm 1986 [30] Về su
phương pháp này được cải tiến bởi Elmastas [33] va đã trở nên phổ biến vì được đánh giá là nhanh chóng, tiết kiểm và dễ dàng thực biện tại các điều kiện phỏng thí nghiệm khác nhau
Một số
khử của các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hoá [34] Vì vậy ở thử nghiệm này, tghiên cứu đủ chỉ rẳng khá năng nhường điện tử sẽ phin ảnh khả năng
K-[ES(CN).] được sử dụng làm chất oxy hoá (chất nhận eletron) và mẫu thử sẽ đóng K-[ES(CN)u] (EeŸ") sẽ bị khử thành K:[Ee(CN)v] (Fe) Sau đó, K-[Fe(CN),] sẽ tác xác định bằng phương pháp đo mật độ quang tại bước sóng 700 nm Khi này, màu dung dịch cảng đậm thì chỉ số OD cảng lớn chứng tỏ khả năng cho electron và khá
Trang 28định thông qua sản phẩm chuyển tip vì vậy dễ dẫn đến si số 1.5.2 Phương pháp khảo sắt năng lực khử sắt (PRAP) Phương pháp khảo sit năng lục khử sắt (FRAP) được công bố lần đầu vào năm
1985 bởi Wayner [L5], sau đó nó được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm đơn giản, nhanh chóng, không yêu cầu các thiết bị, dụng eụ chuyên dụng Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế lớn là hoạt động ở điều kiện pH 3.6 ~ môi trường pH acid phí thự tẾở cơ thể người và sản phẩm tạo ra ắt dễ kết tủa dẫn đến si số
Phương pháp FRAP sử dụng tripyridyltriazine (TPTZ) làm phối tử liên kết với
ion sắt để đảnh giá khả năng kháng oxy của mẫu thử Mức độ khử các
phức Fe'* + TPTZ thành phức hợp kim loại Fe" + TPTZ có màu xanh lam đậm sẽ
EeSO, hoặc BHT (Butylated Hydroxyl Toluene) (15]
15.3 Phương pháp khảo sắt năng lực kh on đồng (CUPRA) Phương pháp CUPRAC giúp xác định tổng khả năng kháng oxy hoá dựa trên việc khử lon Cu" thành Cụ" Phương pháp này được xây dụng và phát tiễn bởi Krishnaiah va céng sr vio du nig nim 2000 Với cúc tu điểm như ổn định, một tong những phương pháp tốt nhất trong nhóm phương phip SET (Single Electron Transfer) (35)
Trong phương pháp này, neocuproine (Ne; 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline) được sử dụng làm phối tử tạo thành phúc phối tử với đồng (Cu-Ne) Các nhóm
hydroxyl của chất chống oxy hóa sẽ khử phức hợp CuỶ*-neocuproine (màu xanh dương) thành phức hợp Cu-neocuproine (màu vàng-cam) Khi này, cường độ màu
thử và được xác định ở bước sóng 450 nm [15]
Trang 29Phương pháp khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH ra đời vào năm 1958 bởi Blois và được cải tiến, hoàn thiện quy trình bởi Brand — William và Bondet kin lượt vào năm 1995 và 1997 [36] Phương pháp DPPH là một trong những phương pháp khảo sát khả năng kháng oxy hoá được sử dụng phỏ biển với
các ưu điểm như đơn giản, dễ thực hiện trong điều kiện phỏng thí nghiệm, chỉ phí
thấp so với các phương pháp HAT (Hydrogen Atom Trandfas) khác
2 - điphenyl - 1 - picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím, có .độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm và được sử dụng làm chất oxy hoá Nó sẽ bị khử thành 2,2 - diphenyl ~ 1 pierylhydrazine (DPPH - H) có màu vàng bởi chất chống oxy hoá Dựa vào cơ chế này, giấ trị OD ở bước sông 517 nm cảng thấp so với chứng âm, chứng tô nồng độ DPPH tong dung dịch cảng ít và khả năng kháng oxy hồn của mẫu thứ cảng mạnh [37]
1.45 Phương pháp khảo sắt hiệu quả trung hoà Ốc ự do ABTS+ (TEAC) Phương pháp này được công bổ vào năm 1993 bởi Milervà cộng sự Nó nhanh
điều úệ cũng như xác định được nhiều loại chất chống oxy hoá khác nhau từ tổng bợp đến
chóng trở nên phổ biển nhờ tru điểm có thể hoạt động ở nhí pH khác nhau
tự nhiên Phương pháp TEAC được sử dụng để đo khả năng trung héa cation 2,2'-
azinobis(3-<thylbenzthiazoin-6-ulfoni) (ABTS*) cia cic chit chong oxy hóa và
được so sinh véi el chuẩn là Trolox Trong thử nghiệm TEAC, kali persulphate (K;S;O) là chất oxy hóa phổ biển nhất để tạo ra ABTS" (màu xanh lam) tie ABTS 4i cing với đó là sự thay đổi của dung địch từ mẫu xanh lam về dạng không màu Sự cảng thấp chứng tỏ khả năng trung hoà gốc tự do ABTS" cing như khả năng kháng
oxy hod của mẫu thử cảng nhiề [15]
Tựa trên các lí luận tổng quan vừa trình bày, đ tài tiến hành khảo sát hoạ tính kháng oxy hoá i vizø của đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp năng lực khử (reducing power) và bất gốc tự do DPPH Vì hai phương pháp này phổ biến,
Trang 30đại diện cho hai nhóm phương pháp thử nghiệm kháng oxy hoá tong điều kiện
in vitro fd SET va HAT
Trang 312.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
ĐỀ tải được tiến hành tron khoảng thời gian từ tháng 10/2023 đến 4/2024 tai phỏng thí nghiệm Dĩ tuyễn - Tiền hoá, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm,
'Thành phố Hỗ Chí Minh
-22 Đối trợng nại
Nước sắc và cao nước được thu nhận từ tỗ hợp dược liệu gồm: Bán chỉ liên
(Scutellaria barbata D.Don), Bach hoa xa thigt thio (Hedyotis diffusa Willd) va
Xa den (Ehret asperula Zoll, et Mot) phdi tin theo tie 2:2:5 vé mặt khối lượng,
Các dược liệu (hình 2.1) được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu trồng vả chế biển
cây được liệu Dược liệu Sài Gòn (35/2IBS đường Trần Đình Xu, quận I, thành phố Hồ Chi Minh); được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ phòng, khô ro, thoáng mắt tại phòng thí nghiệm Di muyền - Tiến hoá, Khoa Sinh học, ngày sau khihu nhận, cao nước được bảo quản diễu kiện nhiệt độ -20FC, khô ro
sn, Bach hoa xà thiệt thảo và Xạ đen sấy khô Ghi chí: (ø) Bán chỉ lên; (b) Bạch hoa xã tt thio; (e) Xe den
Trang 322.3 Thiét bj, dung ey vi hoá chất
STT "Tên thiết bị Hãng sản xuất
2 | Talanh Toshiba
3 | May iti 8 dng Hettich Zentrifugen
4 | Quang phd ké UV ‘Amersham Biosciences
5 | cin dign ue Ohaus
6 [Thấy Memmert
7 | Be én nhigt Memmert
8 | Pipetman 5000 pL SCI Logex
9 | Pipetman 1000 pl SCI Logex
10 | Pipetman 100 pL SCI Logex
- Flavonoid: NaOH 1%
~ Polyphenol: FeCl: 5% (duge pha trong ethanol 90%)
~ Polysaecharide: HsS0, dim đặc, thuốc thử Fehling (cách pha: Fehling A+ Fehling B với lệ l:l; Fehling A: 40 g CuSOx HO, bổ sung nước cắt vừa đủ nước cắt vừa đủ tạo thành 1000 mLẴ dung địch)
Trang 33* Hoá chất được sử dụng trong thử nghiệm định lượng các hợp chất tht ep + Alkaloid: dung dich Bromocresol green (BCG) (Ba Lan; cách pha: 68,9 mg Bromocresol green cing véi 3 ml NaOH 2N và 5 ml, nước cắt được đun nồng cho acetate pH = 4,7 (cách pha: 1.92 g CH:COOH va 3.2 g CH¡COONa, bổ sung nước cất vừa đủ tạo thành 200 ml, dung dich), chorolomm, chất chuẩn: cafein (Merck)
- Flavonoid: NaNO» 5%, AICI: 10%, NAOH IM, chất chun: quercetin (Merck)
- Polyphenol: NaxCOs 7%, Folin ~ Ciocalteu (Merck), chat chudn: gallic acid (Merck)
= Polysaccharide: phenol 5%, H:SO, dim đặc, chất chuẩn: D-glucose (nang Quốc)
* Hoá chất được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá
in vitro
- Năng lực khử: đệm phosphate pH = 6,6, Ka[Fe(CN)e] 1%, trichloroacetic acid (TCA) 0% (bảo quản trong điều kiện không c
(Sigma-Aldrich; duge sử dụng ngay, trắnh sáng)
- Bắt gốc tự do DPPH: DPPH (Siema-Aldich ; 67 mg DPPH được bỗ sung
FeCl: 0,1%, ascorbic acid inh si
vita đủ với methanol tuyệt đối tạo thành 170 mL dung dịch có nồng 46 0,1 mM; ngay, tránh sáng),
2.4 Phương pháp nghiên cứu
Dya vio kết quả nghiên cầu bước đầu của Phùng Anh Tài (2021), tổ hợp được liệu gồm Bán chỉ liên, Bạch hoa xa thiệt thảo và Xạ đen có tỉ lệ 2:2:5 về mặt khối lượng thể hiện hoạt tính sinh học Vì vậy, đề tải tiến hành (hực biện định tình, định lượng một số hợp chất thứ cắp (hình 2.2) trong nước sắc và cao nước; đồng thời
sinh học này nhằm ứng dụng thực tiễn
Trang 34== { and }
[Bini nt, ink tang |
: các hợp chất thứ cấp +Í Pohphengl
-{ Poach { Phương pháp Thirnghigm Ì năng lực khử
“Trong để ải, nước sắc được thu nhận theo tà liệu [38], quy trình được thực hiện như sau
= 18 g được liệu khô được ngâm ngập bằng nước cắt, sau 15 phút, loại bỏ nước ngâm;
- Bổ sung 300 mL nước cất; cô trong 1 giờ 30 phút ở nhiệt độ T0 — 80°C, thu nhận nước sắc lần 1;
~ Tổ hợp dược liệu được bỏ sung 200 mL nước cắt và tiếp tục cô trong I gid 30 phút ở nhiệt độ như trên, thụ nhận nước sắc lần 2;
- Nước sắc lần 1 và lần 2 được trộn chung và li tâm ở 3000 vòng/phút
Trang 35- Địh chiết 2 lần được trộn với nhau; dung môi được loại bỏ bằng cách ủ
trên bể ôn nhiệt ở 60°C cho đến khi khối lượng không đổi;
- Cao nước sau khi được thu nhận được cân để tỉnh hiệu suất thu cao và
“được bảo quản tránh sing ở nhiệt độ ~ 20C tại phòng thí nghiệm Sinh lí Thực vật
3.4.8 Phương pháp định tính các hợp chất hữu cơ
Phương pháp định tính một số hợp chất hữu cơ trong mẫu (nước sắc và cao
nước) được thực hiện theo tải liệu [22] và [39] Các nghiệm thức trong thí nghiệm
này được lặp lại 3 lẫn
* Altaloid: 2 mL mẫu được bổ sung 1 mL HCI 1,5%; 3 — 5 giọt thuốc thử Wagner Quan sit hiện tượng két tia xuất hiện trong dụng dịch Nếu alkaloid có hiện diện tong mẫu thì kết tủa nâu - đ sẽ xuất hiện
* Flavonoid: 2 mL mẫu được bỗ sung 3~ 5 giọt NaOH 1% Quan sát hiện tượng
biển đổi màu của dung dịch Nếu mẫu thử có fiavonid thì màu của dung dịch sẽ biến đổi sang màu vàng - cam = đồ,
*Polyphenol: 2 ml miu bé sung 3~ 5 giọt FeCl, 5% (pha trong ethanol 9010) 'Quan sát hiện tượng biển đồi màu của dung dịch Nếu mẫu thử có polyphenol thi mau của dụng dịch sẽ biến đổi sang màu xanh rêu
* Polysaccharide: 5 mL mẫu thử được bé sung thêm 25 ml H;SO; đun sôi hỗn
hợp 15 phúc sau đó để nguội và chuỗn độ bằng NaOH 10% cho đến khi pH=7:
Trang 36tia d6 gạch sẽ xuất hiện
2.4.4 Phương pháp định lượng các hợp chất hữu cơ:
Ning a nước sắc được thử nghiệm cỏ nông độ từ 001% đến 0,001% vì các nồng độ trên 0,01% không ghỉ nhận được giá trị OD (vượt ngưỡng của thiết bì Nông
Quy trình thực hiện ở nghiệm thức cafTein và mẫu được thực hiện tương tự nhau, diya trên nguyên tắc của tài liệu 39] Các bước thực hiện gồm: Ï ml mẫu hoặc caffein
k7);
và 4 mL chlorofom; các dịch chiết thu nhận được ở
“được bổ sung với 5 mL dung địch BCG và 5 ml dung địch đệm acetate (pH = lắc và chiết lần lượt với 1
bước trên được bổ sung với chloroform vita di: 10 mL; do độ hấp thụ ở bước sóng
470 nm
"Nông độ cakin được sử dụng để xây dụng đường chuẳn: 50, 100, 150, 200,
250 qug/mL Các nồng độ này được xác định bằng cách: 0.5 mL cafTein (nồng độ
100 pgímL) sẽ có nồng là 50 ngmL; tương tự cho các nồng độ còn lại (1; L5: 2; 2,5 mL ning độ 100 jyg/mL)
Hàm lượng alkaloid trong mẫu được tính bằng cách thay thể giá trị OD của mẫu vào phương trình đường chuân cafiin Đơn vị alkaloid: mg CE/g hode mg CE/mL
Để đình lượng được hàm lượng Ilavonoid toàn phần trong mẫu, phương trình đường chuẳn của queeedin được xây dựng dựa trên mối tương quan giữa x (nồng độ quecertin) và y (giá trị OD)
Quy trinh thực hiện ở nghiệm thức quecertin và mẫu được thực hiện tương tự nhau, dựa trên nguyên tắc của tải liệu [39] Các bước thực hiện gồm: I mL mau hose
Trang 37thêm 0.3 ml AICb 10%; sau 5 phút, bổ sung thêm 2 mL NaOH IM vi hn hep đo độ hấp thụ ở bước sơng 510 nm Các bước thí nghiệm được thực hiện tránh sáng Ning d quecerin được sử dụng để xây dựng đường chuẩn: 20, 40, 60, 80,
100 ng/mL Các nồng độ này được xác định bằng cách: pha 0,0010 g quecertin vừa
đủ trong 10 mL (nồng độ 100 ug/mL); sử dụng quecertin nồng độ 100 ¡ug/mL pha lọng thành các nồng độ cần sử dụng
Him Iugng flavonoid trong mẫu được tính bằng cách thay thé giá tị OD của mẫu vào phương trình đường chuẩn quecertin, Đơn vị flavonoid: mự QE/E hoặc
mg QE/mL
* Poliphenol
Để xác định được hàm lượng polyphenol toan phần trong mẫu, phương trình đường chuẩn của gall acid được xây dụng dưới dạng y = ax +b trong đĩ: x là nồng độ gallie acid và y là giá trị OD
(Quy trình thực hiện ở nghiệm thức galic acid và mẫu được thực hiện tương tự nhau, dựa trên nguyên tắc của tài liệu [39] Các bước thực hiện gồm: 1 ml mẫu hoặc
galic aeid được bỗ sung với 9 mL nước cắt và 1 mLẴ thuốc thử Folin Ciocalteu sau § phút, bổ sung thêm 10 ml Na;CO; 7⁄2; hẳn hợp dung dich được bổ sung bằng
nước cất vừa đủ 25 mL; sau 90 phút, hỗn hợp được đo độ hấp thụ ở bước sĩng 725
am Các bước thí nghiệm được thực hiện trắnh sáng
iy dựng đường chuẩn: 20, 40, 60, 80, Nơng độ gallie acid được sử dụng để x
100 pg/mL Cách xác định nồng độ trơng tự như ở nghiệm thức queccntin Hàm lượng polyphenol trong mẫu được tính bằng cách thay thể giá tị OD của mẫu vào phương trình đường chuẩn của øallie acid Đơn vị polyphenlol: mg GAE/g
hoặc mg GAEimnL
Trang 38Để xác định được hàm lượng polysaecharide trong mẫu, phương tỉnh đường chuẩn của D-glueose được xây dựng dưới dạng ý = ax + b trong đó: x là nồng độ D-glucose va y li gid tr] OD
“Quy trình thực hiện ở nghiệm thie D-glucose vai mẫu được thực hiện tương tự nhau, dựa trên nguyên tắc của tả liệu [40] Các bước thực hiện gồm: I mL mẫu hoặc D-glucose được bổ sung với 0,5 mL phenol 5%; bổ sung thêm 2,5 ml H:§O, đậm đặc và để nguội ở nhiệt độ phòng; đo độ hắp thụ ở bước sóng 490 am
"Nông độ D-glucose được sử dụng để xây dựng đường chuẩn: 20, 40, 60, 80, 100 e/mL Cách xác định nồng độ tương tự như ở ngh m hức quecertin
Hàm lượng polysaccharide trong mẫu được tính bằng cách thay thể giá trị OD
của mẫu vào phương trình đường chuẩn của D-glueose Đơn vị polysaccharide
mg GEíg hoặc my GE/ml
-.4.5 Phương pháp xác định khả năng kháng oxp hod in vitro 2⁄45.1 Phương pháp xác định năng lực khi:
Phương pháp được thực hiện dựa theo ti liệu [41], Nguyên tác: Phức Ee(CN),`
sẽ bị khử thành phức Fe(CN)¿" bởi chất kháng oxy hoá Sau đó, phúc Fe(CN)"
sẽ tác dụng với FeCl: tạo thành Fe[Fe(CN),} có màu xanh Màu của Fe[Fe(CN),} urge do mật độ quang ở bước sóng 700 nm Khi này, mẫu của dung dịch càng đậm thì giá OD càng cao, năng lực khử của chất khng oxy hoá càng cao
Quy trình được thực biện như sau: 1 mL cao nuée (nông độ 50, 100, 150, 200,
250, 300, 400, 600, 800, 1000 g/mL_: được pha theo bang 2.2) được bổ sung 2,5 mL
dụng dich dém phosphate 02M (pH = 66): bỗ sung thém 2.5 mL dung dich K;Fe(CN), 1% và ủ ở nhiệt độ 50°C trong 20 phút, hỗn hợp sau ủ được bổ sung
2,5 mL TCA 10% va li tim ở 3000 vòng/phút trong 10 phút; hỗn hợp sau li tâm được
ly 2.5 mL dung dich tn; bd sung 2,5 mL nue edt vi 0.5 mL dung dich FeCh 0.1%;
hỗn hợp được đo mật độ quang tại bước sóng 700 nm Chứng âm của thí nghiệm là
nước cất và DMSO 2.5%; chứng đương là aseorbie acid có nÖng độ 100 g/mL
các thí nghiệm được lập lại 3 lần
Trang 39chất kháng oxy hoá Dựa vào cơ chế này, giá trị OD ở bước sóng $17 nm cảng thập
so với chứng âm, chứng tỏ nồng độ DPPH trong dung dịch cảng ít và khả năng kháng oxy hoá của mẫu thử cảng mạnh
(Quy trình được thực hiện như sau (42): 1 mL mẫu thử (nồng độ 20, 40, 60, 80,
100, 130 pg/mL; được pha theo bảng 2.3) được bổ sung 2 ml dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM; hỗn hợp được ủ trong 30 phút ở điều kiện không có ánh sáng;
mm của thí nghiệm là nước cắt và DMSO
đo độ bắp thụ ở bước sống 517 nm Chimg
¡ chứng dương là ascorbic acid c6 nong độ 8,3 g/mL, — gid tr] ECs» được suy ra
từ phương tình đường chuẩn (vinh bày ở phụ lục): các thí nghiệm được lp hạ 3 lồn
Trang 40xác định theo công thức:
DPPH () =((OD ODạ)/OD,) x 100 Với
DPPH (2): 141g phan tim bắt gốc tự do DPPH
on:
trị mật độ quang của chứng âm
Da: Gi trì mật độ quang của cao chiết ở từng nỗng độ khảo sắt,
Tir DPPH (%), phương trình tương quan tuyến tính được xây dựng là
sắc kết quả về định lượng, giá trì phần tăm được xác định bằng
phần mềm Microsoft Exeel 365 Các số liệu khác như: giá trị trung bình, độ lệch