Cô lập một số hợp chất phenolic từ loài Địa y parmotrema tsavoense thu hái Ở tỉnh bình thuận

- SV Trương TẤn Phát — Khoa Hóa học — Đại học Sư phạm TPHCM “Thời gian thực biện: 12 tháng 1, Mue tiêu: Cô lập một số hợp chất phenolic trên cao ethyl acetate của loài địa y Parmotrema t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

‘TRUONG DAI HQC SU PHAM TP HO CHi MINH

BAO CAO TONG KET DE TAL

KHOA HQC VA CONG NGHE CAP TRUONG

CO LAP MOT SO HOP CHAT PHENOLIC

TU LOAI DIA Y PARMOTREMA TSAVOENSE THU HAI O TINH BINH THUAN

MA SO: CS 2015.19.17

Cơ quan chủ tri: Trường Đại học Sư phạm TpHCM

Chủ nhiệm đề tà: TS Dương Thúc Huy

THÀNH PHÓ HO CHÍ MINH, 12/2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

‘TRUONG DAI HQC SU PHAM TP HO CHi MINH

BAO CAO TONG KET DE TAL

KHOA HQC VA CONG NGHE CAP TRUONG

CO LAP MOT SO HOP CHAT PHENOLIC

TU LOAI DIA Y PARMOTREMA TSAVOENSE THU HAI O TINH BINH THUAN

MA SO: CS 2015.19.17

Xác nhận cũa cơ quan chủ trì để tài Chủ nhiệm đề tài

TS Dương Thúc Huy

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH, 12/2016

Trang

TOM TAT 3

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH " LOICAM ON 12

CHƯƠNG 2: TONG QUAN l§ 2.1 Định nghĩa và phân loại địa y' 15

2.2 Vai tò sinh thái của các hợp chất tự nhiên trong địa y 15

.3.3 Nghiên cứu hoá học về các hợp chất trong địa y 16

2.4 Nghin eta hos hoc eta mst sé lod địa y thuộc chỉ Parmotrema 16 2.5 Hoat tinh eta địa y và các hợp chất của địa ý 2

2.5.2 Hoat tinh digu tiết tăng trưởng đổi với thực vật bậc cao 2 2.5.3 Hot ính kháng is và chế enzyme vn et ce hop eit „ lay

2.5.4 Hoại tính kháng khuẩn và kháng nắm của các hợp chất địa y 24 2.5.5 Hoat tính gây độc tế bảo và kháng đột biển của các hợp chất a diay

CHUONG 3: THUC NGHIEM

DE TAI KHOA HQC VA CONG NGHỆ CAP TRUONG

“Tên đề tải: Cô Isp mét sé hgp chit phenolic ti loai dia y Parmotrema tsavoense thu hái ở tỉnh Bình Thuận

Mã số: CS2015,19.17

Chủ nhiệm để tải: Dương Thúc Huy Tel: 0919 011 884

E-mail: thuchuy84@ yahoo.com

Cơ quan chủ trì đề tải : Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện

- Trương Thị Huỳnh Hoa - Phòng phân tích trung tâm ~ Dại học Khoa học Tự nhiên TPHCM

- Hồ Huỳnh Thủy Dương ~ Bộ môn Di truyền ~ Khoa Sinh ~ Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM

- SV Trương TẤn Phát — Khoa Hóa học — Đại học Sư phạm TPHCM

“Thời gian thực biện: 12 tháng

1, Mue tiêu: Cô lập một số hợp chất phenolic trên cao ethyl acetate của loài địa y Parmotrema tsavoense va thit nghigm hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bảo ung thư của một số hợp chất cô lập được

2 Nội đụng chính

& Cổ lập, tỉnh chế các họp chất tự nhiên từ loài dia y Parmotrema tsavoense

* di ch cao ethyl acetate, các phn doan eta cao ethyl acetate

3 Tiển hảnh cô lập hợp chất trên các phân đoạn

ˆX Xác định cầu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được bằng các phương pháp phổ

tham khảo nghiệm: UV, IR, MS, NMR va so sánh với số liệu NMR trong tài liệu

b Thử nghiệm hoại tỉnh sinh học

3X Thử nghiệm hoại tính gây độc tẾ bảo ung thư, chủ y là 2 đồng Ế bảo ung thứ HepG2 NCI-H460.% Thử nghiệm những đồng tế bào ung thư khác hay các hoạt

3.1 K&L qui khoa ge:

Bột địa y phối kh, xay nhỏ cia Parmotrema tsavoense abi tích với

methanol theo phương pháp ngâm dằm, lọc thu được cao methanol thô và tủa P

“Thực hiện sắc kỉ cột trên cao methanol thu được các phân đoạn PI-P7, M Tiếp tục

tiển hành các phương pháp sắc ký khác nhau để cô lập được bảy hợp chất 1-7 Dựa

vào các kết quả phổ cộng hướng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, khối phổ phân chit 1-7 duge xác dinh, Dé là pammosdone A-E (1-8), vinaxanthone (6), methyl (©)-2-cihydroxy-6-methyl3.G-oxobut- en

chỉ

tính tế bào đối với bốn đồng tế bảo ung thư cổ tử cung HeLa, ứng thư phổi NCI-

ylbenzoate (7) TẤt cả các hợp

u là các hợp chất mới Ngoài ra, một số hợp chất cô lập được thử nghiệm độc

11460, ung thư vú MCE-7 và ung thư gan nhưng kết quả cho thấy chỉ có hợp chất 3

cổ hoạt tỉnh trung bình đối với các đông tế bảo ung thu

Kết quả được viết thành một bài báo công bổ trong nước: [1] Duong Thục Huy, Nguyen Kim Phi Phung A new monoaromatic

‘compound from the lichen Parmotrema tsavoense, Tap ehi Khoa hoc (Dai học Sư phạm TPHCM), đã chấp nhận đăng

3.2 Kết quả đảo tạo:

Hung din SV Trương Tấn Phát hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp năm 2015

Project Title: Isolation of some phenolic compounds from the lichen Parmotrema tsavoense growing in Binh Thuan province

Code number: C$2015.19.17

Coordinator: Dương Thúc Huy, PhD

Implementing Institution: Department of Chemistry - HCM University of Pedagogy

‘Cooperating Insttution(s)

~ Analysis center - HCM University of Science

- Department of Biology - HCM University of Science

Duration: from 10/2015 to 10/2016

1 Objectives:

Isolating some phenolic compounds from the ethyl acetate extract of the lichen Parmotrema tsavoense and evaluating the cytotoxicity on some cancer cell lines of some isolated compounds

2 Main contents:

4 Isolation on the lichen Parmotrema tsavoense

+ Preparing the ethyl acetate extract and its fractions

%* Isolating pure compounds from aforementioned fractions

% Determining the chemical structures by various spectroscopic method such as UV, IR, MS, and NMR as well as comparison of the date in the literatures +b, Evaluating the biological activity

* Evaluating the cytotoxicity on two cancer cell lines HepG2 and NCI-H460

extensive isolation methods, The chemi

by using ID-, 2D-NMR, mass spectrum as well as comparison with those in the structures of compounds were elucidated literatures These are parmosidone A-E (1-5), vianxanthone (6), methyl (E) dihydroxy-6-methyl (3-oxobut-l-en-I-y)benzoate (7) All isolated compounds 2á are new or novel compounds Some isolated compounds were evaluated for eytotoxici against the HeLa, NCI-H460, MCE-7, HepG2 cell lines but only compound 3 showed moderate activity t© cancer cell lines, These results were published in the Journal of Science (University of Pedagogy),

DANH MUC CAC CHU VIET TAT VA KY HIEU

Mii don (singlet)

Mũi đôi (doublet)

(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Tương quan 'H-C qua 01 nỗi

(Heteronuctear Single Quantum Coreluiion)

“Tương quan 'H-'!C qua 02, 03 nối

(Heteronuctear Multiple Bond Coherence) Khối phố sắc kílòng

(Liquid Chưomtaiography = Mass Spectroscopy) High Resolution - Electro Spray Toniztaiion — Mass Spectrometry

sass to charge ratio transfer

part per million

DANH MYC CAC BANG

'Hoạt tỉnh điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Hoại tính kháng virus và ức chế enzyme của virus

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nắm của các hợp chất địa y

Hoạt tính gây độc tế bảo và khẳng đột biển của các hợp chất

đy

Các loại cnzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y

Dữ liệu phỏ NMR của 1-2, 8 va protocetrarie acid

NMR cia 1, 3, 4 và furfurie acid

Sinh tổng hợp của các hợp chất từ địa y

“Các hợp chất cô lập từ địn y thuge chi Parmonrema

“CẤU trúc hoá học của các hợp chất 1-7

“Tương quan HMBC của các hợp chất I-, và 8

“Tương quan HMBC via NOESY của các hợp chất 3-4

DANH MUC PHY LUC PHO

Dữ liệu phỏ NMR và HR-ESEMS ciia 1

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH Một bài báo khoa học được chấp nhận đăng trên tạp chí chuyên ngành: [1] Duong Thue Huy Nguyen Kim Phi Phung A new monoaromatic compound

from the lichen Parmotrema tsavoense, Tap chi Khoa hoe (Đại học Sư phạm

“TPHCMD, đã chấp nhận đăng

Nhóm nghiên cứu trăn trọng cảm ơn Trường Đại học Sư phạm TpHCM đã tài trợ kinh phí để thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô chuyên gia rong hội đồng đã đồng góp các ý kiến nhận xét quý báu giúp hoàn thiện

1 Tên để tàữdự án:

“Cô lập một số hợp chất phenolie từ lồi diay Parmotrema tsavoense

“Chủ nhiệm đề tài/dự án: Dương Thúc Huy

“Thời gian thực hiện: 12 tháng

Kinh phí được duyệt 34 triệu đồng

Mục tiêu:

“Cô lập một số hợp chất phenolie của loài địa y Parmorrema tsavoense va thi

nghiệm độc tính tế bào trên một số hợp chắt cô lập được

3 Nội dung

3.1 Nội dung thực hiện giai đoạn 1 (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

‘SIT 'Công việc dự kiến 'Công việc đã thực hiện

1 cam (7-10 bap ch ak im in ei hi cic ci

Ti ohio ho Tah fy cs

2 | dng bo ng thr HeLa, ICE, vt | Thrmghigm | NCEII460 Tink tain IC (ne) host oh cos 3h chit

A gi hin i Kw Bo in

3 | tem uap chi ch Croatia won 08 Tà bán rong nước

“| ae Bio _t90 me sinh vin Ss Tab we 1 Khến hận ấtnghệp sain naniey 3⁄2 Nội dụng còn lại

Đã hoàn thành tắt cả các nội dung công việc dự kiến theo hợp đồng

“Trong khoảng 20 năm tr lại đây, những nghiên cứu hóa học và sinh học về địa y trên thế giới trở nên phổ biến Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự

sông sinh của tảo và nắm Địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây, trong những điều kiện khắc nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đối Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân

bồ phong phú và da dang

Ngay từ thời trung đại, nhiễu người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm

thuốc chữa bệnh Y học cổ truyền Trung Quốc từng sử dụng 71 loi diay cin 17 chi (© hig) với mục dich làm thuốc chữa bệnh Địa y thuge ho Parmeliaceae, Usneaceac, Clzdionaceue được sử dụng nhiều hơn hết, Một vài loại cao điều chế từ

địa y được sử dụng để trị các bệnh khác nhau như [obarid pulmonaia chữa các

bệnh về phổi, Xanuhoria pariemina chữa bệnh vàng da, chỉ Uønea đễ dưỡng tóc, Conaria idhàica (được gọi Ielsà moss) chữa nhiễm khuẩn và su chảy Ngoài

ng đụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỳ phẩm, xà phòng, nước hoa 29!

keo các tác gid Boustie et al (2007), Muller et al (2001), Huneck et al

1.000 hợp chất thử nghiệm các hoạt tính sinh bọc như kháng khuẩn, kháng virus,

(1999), từ xưa cho đến nay có khoảng la y đã được cô lập và

ng oxy hứa kháng ung thự, khing viêm, kháng enzyme

XXuÍt phát từ những ứng dụng ý học quý giávà kế thừa những nghiên cứu đã

có về chỉ Parmotrema trong nước cũng như nghiên cứu hóa học trên loài địa y

Parmotrema tsavoense (Huynh BLC, Duong etal), ching t6 ip tue nghién cứu

sô lập các hợp các hợp chất phenolie có nhiều hoạt inh sinh hoe

2.1 Định nghĩa và phân loại địa y

Địa y là một dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, nó là kết quả cộng sinh của nắm

(mycobiom) và một thành phẫn quang hợp (phoiobiou) thường là tảo (green alga)

hay vi Khuin lam (cyanobacterium) Hiện nay có khoảng 17.000 loài địa y đã được

tim thấy Thông thường địa y chia lim 3 dang (Choi eta 2008):

Xanthoria sp, Xanhoparmelia of lavicola, — Hypogymnia cf ubulosa, (Crustose lichen) lise lichen) (ructicose lichens) Hình 2.1 Ba dang chinh ciia dia y

“Thành phần tảo của địa y sản sinh cic carbohydrate bing quá trình quang

hợp, còn thành phần nắm sản sinh các bợp chất tự nhiên (để chấn sâu bọ và các loài động vật n c, , cng cắp nước và khoáng cÍ

từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện

khắc nghiệt, chủ yễu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đói, và có th hiện di ở khấp mọi nơi như trên đá, đắt, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tỉnh (Choi tai, 2008)

ĐỂ hiểu được bản chất của địn y và giải thích nguồn gốc của chứng, các nhà thực vật học đã thứ tổng hợp địa y từ tế bào tảo và nắm Mặc dù cả ha thành phần

được nuôi cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành địa y thật sự khó khăn

32 Vài trồ sinh th hợp chất tự nhiên trong đị

~ _ Bảo vệ đối với cây trồng bậc thấp và bậc cao

= Ce hop chit thơm hắp thụ ia UV, bảo vệ địa y chống lạ bức xạ cổ hi

= Cée carboxylic acid tir diay ltée chất tạo phức mạnh vả giáp cho địa lấy

được các khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi et al , 2008)

~ Giúp xua đuổi thú n thịt và côn trùng

3.3 Nghiên cứu hoá học vỀ các hợp chất trong địa y

nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (hình 3)

~ Nguẫn gắc acidiikinic:tephenylquinone và dẫn xuất của acid tewonie

~ NguÌn gốc acid merelonic: titepenoid

- Nguẫn gắc aceate-malonate: các acid đây dai va các acid phenol

(#)-Praesorediosie acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (11)

và chioroatranorin (12) được cô lập bởi David F et al, (1990) Lecanoric acid (14) va stictic acid (18) được cô lập tir Parmelia praesorediosa (NylL) bởi Ramesh P etal, (1994),

> Pamotrema lichexanthonicum

Depside atranorin (11), depsidone salavinic acid (16) và xanthone lichexanthone (40) được cô lập từ cao chloroform của loài dia y Pamorrema lichexanthonicum by Michelletin A C et al (2009)

> Parmotrema mellissii

Methyl orsellinate (5), ethyl orselliate (6), n-butyl orsellinate (7), methyl f- orsellinate (8), methyl haemtgiommate (9), ethyl chlorohaerntgiommate (10), 2-0-methyl-œ-aleetoronie acid (26), 2"-O-ethyl-a-alectoronie acid (27), dehydroaleetoronic acid (28), dehydrocollatolic acid (29), parmosidone A (30),

17

dia y Parmotrema mellissii thu hái ở thành phổ Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy (2012)

Nam 2011, Dương T, Huy ti đã cô lập được hợp chất gồm có mehyl/-

orselinate (8), methyl orsellinate (5), orselinie acid (4), methyl haemlgiommate

(9), atranorin (11), lecanoric acid (14), (+)-(12R)-usnic acid (39) Năm 2012, orcinol (3) gyrophoric acid (13), protocetraric acid (21), 9'-0-

methylprotocetraric acid (22), 2-[3-(2,6-dihydroxy-4-methylbenzyl}-2,4-dihydroxy- Duong T Huy et al

Orsellinie acid (4), methyl orselinate (8), atranorin (11) vA lecanoric acid

(14) được cô lip boi Javaprakasha G K et al (2000)

> Parmotrema subisidiosum

Depside atranorin (11) va hai depsidone salazinie acid (16) và consalazinie acid (17) duge 66 lập từ cao acetone béi O"Donovan D G et al (1980)

1

(2010)

Isoleeanorie acid (15) dược cô lập bởi Sakurai A et al (1987) Ethyl orsellinate (6) durge e6 Ip béi Santos L C et al (2004), Atranorin (11) và lecanorie acid (14) được cô lập bởi Honda N K et al Các acid béo

“m CHC Orcinol (3) 0

St osctnates ReMe Ethyl chlorobacmatommmate (10)

Ethyl ovselinate (6) RES

£-Bwyl ansllinns (7) R-rBu

Mranorin (11) RH Gyrophoric acid (13)

21

a of dit ‘on Ho H

)

Mình 2.3 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chỉ Parmotrema (tiép)

2.§ Hoạt tính của địa y và các hợp chất của địa y

Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoại tính sinh học và nhiễu loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên Tuy vay, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn,

sắc địa y phát iển rất châm Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc mui cấy địa

y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10 % địa y được nuôi

sấy thành công, ty nhiên chúng lạ chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp thành công 10 % rên khoảng 50 loài địa y ấy từ Việt Nam Tuy đạt thành công về

khác so với các hợp chất địa y tự nhiên

Khoảng gin 1.000 hop chit dia y đã được cô lập cho đến nay Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng được học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được

thing ké diy di cin Boustic (2007), Huncek (1999), Muller (2001) vé khang Khun, king viru, chdng oxy héa, khing ung thy, khing viém, khing enzyme 2.5.1 Hoạt tính đối v động vật

CCageraii acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia batimorensis va Xanthoparmelia cumberlvaia Kim hầm sự tầng trường của loài ốc Pallera variu

“Các hợp chất phenol đơn vồng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis

Atranorin, pulvinie acid dilactone, calycin, pariedi evernic acid, psoromie acid, physodie acid, 3-hydroxyphysodic acid, fumarprotocetraric acid, stictic acid, norstictic acl | salazinic acid, vulpinic 4 id, rhizocarpic acid va usnic acid làm giảm

sự tăng trưởng của ấu tring aa tap Spodoptera littoralis ahung khéng anh hung đến sự sống còn của chúng

2.5.2 Hoạt tính điề tiết tăng trường đối với thực vật bậc cao

Băng 2.1: Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Địa y hoặc các hợp chất của lay Hoạt tính Aci Darbiaiic, acid 40-| Ge ché sy ting trudng của cây rau diếp demethylbarbtgiic, acid diffractaic, acid

rcinolearboxylic, acid sell Bigochrome AA (acid secalonie A) | Gay de cho tage vit eid eves Giăm cức nũng độ chất điệp he tong W

‘Acid lseanorie Nguyên nhân gây bất thường cho sốc

cba ely Allium cepa Alum cepa

Lepidium stativum

2.5.3 Hoat tính kháng virus và ức chế enzyme virus của các hợp chit dia y Antagninone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus Hyperiin có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược cia virus HIV

có hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1 (virus bénh sinh due herpes don dang loai 1) dường như tăng theo số lượng nguyên từ Cl trong cấu trúc (Muller 2001) Depside imergrase) (Bouvie 2007) Neamad et al đề nghị hoạt tính này xuất phát từ đặc

điểm cầu trúc vòng 11//-dibenzo[b.e][1.#]dioxepin-l1-one của depsidone Depside

có hoạt tính khá yếu trong khi những -depsidone như vingie acid, gral iede sid và chloroparelli acid cùng cho những khả năng tương đương, cụ th với

giá trị ICay khoảng 3 ụM Các J-depsidone khác như physodie acid, norlobarie

acid, salatinie acid và parellie acid cũng có hoạt tính với giá trị ICạo khoảng vài wM Acid béo log -butrolaetone cũng có hoạt tính Kháng virls như protolicheet

ức chế sự nhân bản DNA của virus HIV với giá trị ICạy khoảng 24 wM (Bảng 22) (Muller 2001),

2.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nắm của các hợp chat dja y

Các hợp chất từ địa y cũng là những hợp chắt có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả Protoliehesterinie acid được thử nghiệm in vitro khing khuẩn Helicobacter pylori (acid này là thành phần tong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên phát triển của vi khuẩn hay nắm như aleetosarmentin, pannarin và chloropannarin,

đơn vòng, puvinie acid va din xuit, usnic acid và dẫn xuất (Bảng 23) (Muller

2001) Khả năng kháng nắm của các hợp chất địa y cũng được đánh giá dựa trên giá

tr MIC, thí đụ nhir ede hop chit paritin, fallacinal, emodin (Boustic 2007), Trong

‘eye kì mạnh trên khá nhiều đồng vi khuẩn

Bang 2.2: Hoat inh Khng virus va de ché enzyme cia virus

của các hợp chat dja y

Hop chất Virus va enzyme etia virus

Depsidone: virensic acid va din | Hệ enzyme đặc hiệu đình thể nguyên thực xuất tương tự khuẩn vào nhiễm sắc thé virus HIV

Butyrolactone acid: | Nhân bản cia HIV protolichesterinie acid

(£)-USnie ái vad depside khác | Virus Epstei Barr (EBV) Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro- | HIV, cytomegalovirus va các virus khác 1-O-methylemodin, Sứ:

dichloroemodin, hypericin 3.55 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đặt biển của các hợp chất địa y

Hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là usnie ad Thử

nghiệ kháng u (anttumour) của usnic acid được khám phá cách đây 3 thập niên, được thử nghiệm lần đầu đổi với hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis boi Kupchan và Kopperman (1975) Những nghiên cứu về mỗi liên hệ hoạt tính cấu

trúc cũng được khảo sát và kết qua da chi ra cing tinh thin déw (lipophilicity) có phân tử trong cấu trú của usnie acid đã làm tăng tỉnh thân đầu tự nhiền của nó Depside và depeldone cũng thể hiện độc tính tế bảo tương đổi Depsidone

lobaric acid va depside bacomyccie acid cũng có khả năng ức chế sự phát triển của

14 đồng tẾ bào ung thir véi giá trị ICo trong khoảng 12-65 g/ml (Boustie 2007)

Depsidone pannarin và depside sphaerophin cũng ức chế sự phát triển của tế bào

ng thư tuyỂn tiễn liệt DU-45 và ế bảo ưng thư da M14 với ICạ, ong khoảng 25-

30 pg/ml (Bang 2.4) (Boustie 2007)

nụ một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme tinh bày trong bảng

Bang 2.3 Hogt tinh khing khuin va khéng nim của các hợp chit ajay Hợp chất

Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis

Leishmania spp

Bacillus brevis

Drechslera rostriaia, Alternaria alternata

Vi khuẩn hiểu khí và vi khuẩn ky khí

Vi khuẩn Gram (+) và Gram ()

tính gây độc tế bào và kháng đột biển của các hợp chất địa y

Kháng ung tt pti Lewis, ung th bạch 8, ức chế phân bào, có hoạt tính

ie valid bao sừng hóa HaCat

“Có hoạt tính chồng lạ tế bảo ung thư bạch cầu K-562 và khối u rin Ehrlich

%6

Pannarin, Sphaerophorin Chloropannarin,

Naphthazarin

Scabrosin ester và dẫn xuất, Euplectin

Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic

Monoamino oxidase

‘Arginine decarboxylase Omnithine decarboxylase

3⁄1 Hoá chất

Dung môi dung tong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm hexane, ethyl aetti, acid acetic, cloroform, acetone, methanol digu fa héa chat cia hãng Chemsol-Vigt Nam va duge lim khan bằng Na:SO, nễ sử dụng lại

Thuốc thử để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dụng dịch acid sulfuric 20%, vanillin/H,SO,, đèn UV

~_ˆ Các thiết bị dùng để ly tríeh (lọ thủy tỉnh, becber, bình lóng)

= May cô quay chân không Buehi:111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bụih,

~_ Cậtoắc ký: cột cổ điễn

~ _ Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel Fas, Merck

- _ Các thiết bị ghỉ phổ: Phố 'H-NMR, 'C-NMR, 2D NMR được ghỉ trên máy cộng

hưởng từ bạt nhân Bruker ở tằn số 500 MHZ cho phổ 'H-NMR và 125 MHZ cho Nhiên thành phố Hồ Chí Minh Ngoài ra, thiết bị ghỉ phổ Varian Mercury-400 Plus NMR (400 MHz cho "H NMR va 100 MHz cho °C NMR) được sử dụng

4 ghi phd cia hgp chit 1, 2 và 6 tại Dại học Chulalongkorn, Bangkok, Thai Lan

3.3 Parmotrema tsavoense

Loài diay Parmorrema

Isavoense (Krog & Swinscow) Krog &

Swinscow thu hái trên đá trên núi Tà

tỉnh Bình Thuận (tháng 8/2012-

12/2012) Tên khoa học được xác định

bởi tiến sĩ Wetchasart Polyiam, Tổ

nghiên cứu dị y, Bộ moa Sin os,

28

Khoa Khoa hoe, Bai hoe Ramkhambaeng, Bangkok, Théi Lan, Mẫu ký hiệu số US- Đại học Khoa học Tự nhiên

34 Qua trình cô lập từ loài địa y Parmotrema tsavoense Bột khô địa y nghiền nhỏ (1,350 g) được ngầm dằm trong methanol va dich chỉ ô quay dưới áp suất thấp Trong quá trình methanol bay hơi, tủa trắng T (79.7

#) xuất hiện dẫn và được lọc riêng Phin dung địch lọc còn lại được tếp tục cô quay cao methanol thô, giải ly với hệ dung môi hexane -ethyl acetate (9:1) thủ được phân đoạn PI (9:9 g) Tiếp tục giái ly với cùng hệ dung môi nhưng tăng dẫn độ phân cực (8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6) thu được năm phân đoạn P2 (2.8 g), P3 (3.3 g), P4 (3.1 g), ethyl acetate-methanol v6i các tỉ lệ (9:1) và (0:10), thu được hai phân đoạn tương, ứng P7 (5.1 g) và M (80.1 g)

Ti tục thực hiện sắt cột trên phân đoạn P3 (3.3 g) giải ly với hệ dung môi hexane-ethyl acetate-acetic acid (9:1:0.02) để thu được các phân dogn P3.1 (0.1 g), P32 (0.8 g), và P3.3 (1.1 g) Thực hiện sắc kí cột trên phân đoạn P3.2, giải mỹ)

Phin doan PS (16.1 g) được thực hiện sắc kí cột siiea gel, giải ly với hệ dang môi hexane-ethyÌ aeetate-aeet acid (1002) thụ được bốn phân đoạn PS.1

ly với cùng hệ dung môi như phân đoạn PS thu được hai phân doạn PS.I (02 2)

và PS.1.2 (0.2 g) Tử phân đoạn PS.1.1 thực hiện sắc kí lớp móng điều chế thu được

hủ hợp chất 6 (79 mẹ) và 7 (39 mg) PS.L2 (02 g) được thực hiện sắc kí lớp (85:15:0.02) thu được hai hợp chất 3 (5.9 mg) và 4 (9.8 me) Phôn đoạn P6 (99 g) được thục hiện sắc kí gel (Sephadex LH-20), giả ly biing methanol (100%) to thu được 3 phân đoạn P6.t (3 g) P6.2 (25 2), va P63

3.5 Phương pháp thử nghiệm độc tinh té bio

>_ Quy trình khảo sắt hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB -_ Giải đông nguẫn tế bào ung thư báo quản trong nite long bào đến thế hệ thứ 4 (P4)

~ Nuôi tế bào trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70 - 80%

- Phủ tế bào vào các giếng trên đĩa 96 giống với mật độ tẾ bào/giếng

ban dau 1a 10* thigiéng (di v6i dòng tế bào HeLa và MCE-7) và 7,5.10` th/giểng

(đổi với đồng NCI-H460) theo thiết kế (5)

+ U637°C, 5% CO;, 24

~ Bổ sung mỗi trường chứa chất thử với nồng độ gấp đôi nồng độ muỗn thữ

(chú ý: không loại bỏ môi trường cũ đã có ở trong giế

- Ủở 37C, 5% CO,, 48 giờ

~ Cổ định tế bào trong giéng véi trichloroacetic acid (TCA) + Đối với những dòng tế bào bám dính: sử dụng dung dịch TCA 50% lạnh vào (cho vào từ từ không quá nhanh)

+ Đối với những đồng tế bảo lơ limg: sir dung dung dich TCA 80% lạnh

vào mỗi giếng

đĩa trên vào trong tủ lạnh (4°C), 1-3 giờ

+ - Loại bỏ chất lồng trong mỗi giếng

© _ Rửa nhẹ nhàng với nước (200u1/giếng) 5 lần

«- ĐỂ khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ

~ Nhuậm SRB:

++ Cho dung dich SRB 025 vào mỗi giếng

-+ Ủ ở nhiệt độ phòng, 5:20 phút

+ Loại bỏ dụng địch SRB

++ Rita ahg nhing bing dung dich acetic acid 1% (5 Lin

+ Để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng 12-24 giờ

- Đọc kết quả

+ Cho 20 0l Tribase I0mM vào mỗi giếng

+ Lắc trên máy lắc khoảng 10-15 phút cho đến khi SRB tan hodn toàn + Đo mật độ quang ở bước sóng 492m và 20nm:

(*JThiết kế khảo sát gầm:

- 1 mẫu chứng dương: té bio v6i camptothecin 6 ndng d6 0.01(ye/m)

~_1 mẫu chứng âm: tế bào với dung môi hòa tan chất thir (DMSO 0.25%)

= Ce miu cin thử nghiệm hoạt tính gây độc Trong trường hợp xác định

C50 thì mẫu thử nghiệm sẽ được pha loãng ở các nồng độ khác nhau

~ Thiết kể thử nghiệm của 1 mẫu gồm

-+2 giếng tổ bảo có môi trường nuôi cấy chứa chất thứ ở nằng độ khảo sắt

+ 2 giếng không có tế bào có môi trường nuôi cấy chứa chất thử ở nồng độ

ii chí 369mg) 398m) He dng mob A MAACOH 9 CAAIA.O

C- CA-AROH

Ð CA rom ssusno 7525002

CHUONG 4: NGHIEN COU - KET QUA

Tir oii dia y Parmonrema tsavoense, 8 clip được š hợp chất phenlic mối

Đó là Parmosidone A-E (5), vianxanthone (6), methyl (E)-2, -inydroxy-6-methyl-3- (3-oxobu-I-en-]-yl)benzoate (7)

“Cấu trú hoá học của các hợp chất 1-7 được biểu diễn trong hình 4.1

Hop chất 1 được cô lập ở dạng vô định hình, màu trắng Công thức phân từ được

xe dinh 1a CHO, thing qua khối phổ phân giải cao chế độ ghi nhận ion âm ta

"73.0578 [M-HỊ Phỏ 'H NMR cho thấy sự x aldehyde tại 5 10.61 (1H, s), một nhóm methine nhân thom 6 6.78 (1H, s), một nhóm 3H, s) Phố 'ÌC NMR và HSQC cua 1 (Bang 4.1) cho thấy sự hiện điện của 18 carbon bao gồm một nhóm formyl (ở 192.2), hai nhóm carbonyl (5 170.6 và 162.2), 12 carbon

li

nhân thơm, trong đó có 5 carbon mang oxygen cộng hưởng trong vùng 164—111 ppm,

3

111.6 ¢ 3), 116.7 (C-5), 164.1 (C-4) Tín hiệu proton nhan thơm (ở 6.78, H-5) cho tương quan với c¿ arbon tai 6 111.6 ( 164.1 (C-4) va v6i nhm methyl (C-9) va đồng thời các proton này (22.41, H 9), cũng có tương quan với các catbon tại 5116.7 (€5), 1125 (C-1), và 151.9 (C-6) Vì

hydroxy-6-methyl-2-0-aryl-L-carbonyl vong A của 1 duge xéc định là 3-formyl-4-

“rong vòng B, phổ HMBC của 1 cho thấy sự tương quan cia proton của nhóm

.oxymethylene tại ở4.49 (H,-8) với các carbon tại 6 117.5 (C-3), 143.8 (C-4), 162.2 (C-2) và của poton của nhóm methyl thứ hai tại (ở 2.62, c9) với các carbon tại ở

1156 (C-), 131.6 (C-5), 139.6 (C-6), 162.2 (C-2), va 170.6 (C-7) Hai tương quan

#củal 9! giúp xác định vị trí lân cận giữa nhóm methyl và nhóm carboxyl trên vòng methyl-l -carbonyl

“Trong quả tình xác định cắu trúc của 1, chúng tôi nhận thấy dữ liệu phổ của 1 có

sự tương đồng với dữ liệu phổ cia protocetrarc acid (Brandao L F G etal 2013)

‘Tuy nhiên, sự so sánh chỉ tiết dữ liệu phd "C NMR cia 1 va acid protocetraric cho thấy có sự khác nhau của những tin hiệu thude von B gi

(Ad = 10.3) mic đù chúng, được đo trong cùng dung môi DMSO-.V Sự thay đổi về dữ liệu phổ 'ÊC có thể xuất

chúng, cụ thể với các carbon C-2' (Ade = 47.8), C-5' (Ade = -10.3), và C

hít ừ sự thay đối vi í của các nhóm thé tn nhân thơ B, KẾt hợp tắt cả các dữ Hiộu

trí với nhóm hydroxymethylene Ngoài ra, từ sự phân về sự lân cận của nhóm methyl và nhóm carboxyl giúp xác định nhóm carboxyl cũng đã tráo đổi vị trí với vậy, 1 được đề nghị là một meia-epsidone, được đặt tên là parmosidone A, với công, thức được trình bay trong hình 4

42 Parmosidone B (2)

4 Chit bgt v6 din binh mau ting

# HR-ESI-MS (Phụ lục 6): m⁄ 385.0537 [M+Na|* (tính toán cho Cạ;H;,O„+Na, 385.0536)

Phd 'Hva "C-NMR (DMSO-d, 400 MHz va 100 MHz) (Phu lục 7 và 8): xem

Bing 4.1

Pho HSQC và HMBC (DMSO ,, 400 MH) (Phụ lục 9 và I0): xem Hình 42

Hợp chất 2 được cô lập dưới dạng bột vô định hình mảu trắng và công thức

phân từ của 2 được xác định lš C;HỊ,O, đựa trên mũ ion phân từ gi gi 5.0537 [M+Na|ˆ trong phổ HR-ESI-MS So sánh dữ liệu phé NMR ea 2 và 1 cho thấy có sự

tương đồng của cóc tín hiệu phố trên vòng B (Bản 4.1) nhưng 2 có sự biến mỗt của nhóm chúc aldehyde Sự thay thế của nhóm chức aldehyde bởi nhóm hydroxyl duge củng cổ bởi sự so sánh dữ liệu phỏ HR-ESI-MS của 2 chứa ít hơn dữ liệu phổ của 1 một nguyên tử carbon Khi so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất 1, carbon C-3 của 2 các cabon lân cận C.2/C-4 chuyển địch về củng từ trường cao hơn [C-2/C-: 6.54 với các carbon ở vùng từ trường ở 1324 (C-3), 150.7 (C-4), 163.3 (C-7) va 19.9 mình họa trong Hình 4.1 Đây là hợp chất mới và được đặt tên là parmosidone B 4.3 Parmosidone € (3)

+ Chit bot v6 dinh bin mau vàng

“ HR-ESE-MS (Phu Tue 11): m/z 575.1163 [M+Na]* (tinh

4 Pho 'H và ''C-NMR (DMSO-.,) (Phụ lục 12 và 13): xem Bảng 42,

4 Phd HSQC va HMBC (DMSO-d) (Phu lye 14, 15, và 16): xem Hình 4.3

# NOESY (DMSO-d) (Phu Iye 17): xem

Hợp chất 3 được cô lập dưới dạng chất bột 43 din hinh mau ving Công thúc phân từ của 3 được xác định là CnH.O,; j mũi ion phân từ giả mức 575.1163

1 So sánh dữ liệu phổ của 3 và 1 (Bảng 42) gip xác định 3 có chứa cấu trúc vòng Á

6

phổ 'H-NMR đồng thời với sự xuất hiện của một nhóm methyl ester (ð 171.1, 51.7), 6 ceatbon nhân thơm (6 158.3, 155.1, 134.1, 117.8, 109.9 và 1092) và hai carbon methyl

xác định cấu trúc vòng C của hợp chit 3 1k 2”,

methylene-1”-methoxyearbonyl Ngoài ra tn higu nhm hydroxymethylene (dy 4.49,

525, C-#) của 1 đã biến đổi thành nhim methylene (6 389, &: 21.2 C-8) cia

3 Su két ni eta ving C va ving B tai C3" va C-Š” được xác nhận bối tương quan

HMBC từ H;-§' tại ở 3.89 đến các carbon ở vùng từ trường 6 117.9 (C-3"), 144.3 (C-

158.3 (C-4”) trên vồng C Đặc điểm cấu trúc này của 3 khá tương đồng với cấu trúc của furtrie aeid, được cô lập từ địa y Pseudeverna furfuracea (Gungzinger, Tabachi

1985) So sánh dữ liệu phổ 'ÏC-NMR_ của 3 và furfuric acid, trong cùng dung môi

DMSO-ds, cho thay chúng có sự tương đồng nhưng có sự khác bit ở 6 catbon trên

nhân thơm B, carbon C-l' (Ad: = +5.5), C-2' (Ade = -8.6), C-3" (Ad = -4.2), C4"

chuyên dịch về vùng từ tường thấp của nhóm methyl tại đụ 2.59 (H79) của 3 khi so methylene tại ấy 3.89 (H8) chuyển dịch về vùng từ tường cao hơn trong 3 khi so

sánh với nhỏm thế tương tự tại đ; 3.97 của furfuric acid Những đừ kiện nảy chứng tỏ

nhân B cổ sự chuyển đổi giữa các nhóm thể giống như trong trường hợp của hợp cÌ

1 Ngoài ra tương quan NOESY gitta HE và H9” giúp xác nhận sự lân cận rong

chất meia-depsidone mới có cấu trúc minh họa trong Hình 4.1 và được đặt tên là

pamosidone C

4.4 Parmosidone D (4)

+ Chit b6t vé định hình mau tring

Hình 4.8: Một số tương quan HMBC va NOESY ciia 3 va 4

Hộp chất 4 được cô lập dưới dạng chất bột võ định hình màu trắng Phỏ HR-

phd"

NMR cia 4 va 3 (Bing 43) cho thiy sự tương đồng giữa chúng trong cấu trúc của

nhân thơm A và B và đồng thời trên nhân thơm C,

methyl trong 3 thay cho mt proton thom trong 4 Nhận định này được cing cổ bởi

một nhóm methylene so với hợp chất 3 Proton thom tai dy 6.11 duge xác định vị tr 3" bing ede trơng quan HMBC (Hình 43) đến các carbon tại ð 113/7 (C- 1), 1544 (C2"), 1583 (C4"), 164 (C5"), va 1700 (C-7"), Che tương quan NOESY quan trọng gita H-3" va 2”-OH va gita Hy-8 va HS" gitp khẳng định cấu

của nó lạ

được đặt tên là pammosidone D