BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM ĐĂNG NGUYÊN Mã sinh viên: 2091048 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT PHENOLIC TỪ HẠT NHỤC ĐẬU KHẤU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Nhục đậu khấu
1.1.1 Vị trí và phân loại
- Vị trí phân loại của chi Myristica theo hệ thống phân loại Takhatajan [42]
Phân lớp Ngọc Lan: Magnoliidae
1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây Nhục đậu khấu ( Myristica fragrans Houtt )
Nhục đậu khấu là một cây to, cao 8-10m Toàn thân nhãn Lá mọc so le, xanh tươi quanh năm, dai, phiến lá hình mác rộng, dài 5-15cm, rộng 3-7cm, mép nguyên, cuống lá dài 7-12mm Hoa khác gốc mọc thành xim ở kẽ lá, có dáng tán Màu hoa vàng trắng Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng, đường kính 5-8cm, khi chín nở theo chiều dọc thành 2 mảnh, trong có một hạt có vỏ dày cũng, bảo bọc bởi một áo hạt bị rách, màu hồng [1]
Hạt hình trứng hoặc hình bầu dục, dài 2 cm đến 3 cm, đường kính 1,5 cm đến 2,5 cm Mặt ngoài màu nâu tro hoặc vàng xám, có khi phủ phấn trắng, có rãnh dọc, mờ nhạt và nếp nhăn hình mạng lưới không đều Có rốn ở đầu tù (rốn ở vị trí rễ mầm) là một điểm lồi tròn, màu nhạt Hợp điểm lõm và tối, noãn nhân dọc nối hai đầu hạt Ngoài cùng là lớp vỏ hạt rồi đến lớp ngoại nhũ sát lớp vỏ hạt Cây mầm nằm trong một khoang rộng Chất cứng, mặt gãy có vân hoa đá màu vàng nâu, đầu tù Có thể thấy phôi nhăn, khô, nhiều dầu, mùi thơm nồng, vị cay [1]
1.1.3 Sinh học và hình thái
Cây Nhục đậu khấu không ra hoa cho đến khoảng 9 tuổi, nhưng một khi bắt đầu ra hoa, chúng sẽ tiếp tục ra hoa trong 75 năm nữa Cây cho 2 đến 3 vụ một năm Hạt Nhục đậu khấu cần 3 đến 6 tuần để khô trước khi sẵn sàng sử dụng [20]
Phân bố: Nhục đậu khấu có nguồn gốc ở vùng đảo Molucca ở Thái Bình Dương, được nhập trồng vào đất liền ở khắp vùng nhiệt đới Nam Á và Đông - Nam Á Ở Việt Nam cây chủ yếu được trồng ở các tỉnh phía Nam
- Nhục đậu khấu: là phần nhân phơi hay sấy khô
- Nhục ngọc quả: Là phần vỏ áo (vỏ giả màu hồng của hạt) của hạt Nhục đậu khấu đã được phơi hay sấy khô.
Một số nghiên cứu tác dụng sinh học và thành phần hóa học từ hạt Nhục đậu khấu
1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới
1.2.1.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học
Thành phần hóa học từ các bộ phận khác nhau của cây Nhục đậu khấu (Myristica fragrans Houtt) rất phong phú bao gồm: các hợp chất phenolic có khung lignan như diphenylpropanoid neolignan, diphenylpropanoid neolignan, benzofuranoid neolignan 2,3-dimethyl-1,4-diaryl-butane lignan, aryltetralin lignan và một số nhóm cấu trúc khác như diphenylalkan, phenylpropanoid, các axit béo và este của axit béo Trong đó, thành phần phenolic được xem là thành phần chính của hạt nhục đậu khấu Một số hợp chất phenolic được phân lập từ hạt nhục đậu khấu được thể hiện trong bảng dưới đây
Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong từ cây Nhục đậu khấu
STT Tên hợp chất Công thức hóa học TLTK
6 3-(4-Allyl-2,6- dimethoxy- phenyloxy)-2- methyl-5- methoxy-2,3- dihydrobenzofura n
(benzo[3′,4′]diox ol-1′-yl)-7- hydroxypropyl)be nzene-2,4-diol
1.2.1.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học của hạt Nhục đậu khấu a Tác dụng chống viêm và giảm đau
Nghiên cứu về tác dụng chống viêm và giảm đau của hạt Nhục đậu khấu đã cho kết quả sau: Dịch chiết cloroform của hạt Nhục đậu khấu ở các mức liều khác nhau 50, 100,
200 mg/kg thử nghiệm trên chuột đã chứng minh hoạt động ức chế chứng phù chân chuột do carragreenan gây ra Bên cạnh đó, dịch chiết xuất cloroform của hạt Nhục đậu khấu cũng có tác dụng giảm đau khá mạnh ở liều 50, 100, 200 mg/kg và đều thể hiện hoạt tính mạnh hơn 150 mg/kg axit acetylsalicylic [33] b Tác dụng chống oxy hóa
Nhiều nghiên cứu chỉ ra hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ của dịch chiết hạt Nhục đậu khấu, bao gồm khả năng bắt giữ gốc tự do, ức chế peroxy hóa lipid và tạo phức với ion sắt Dịch chiết aceton của hạt Nhục đậu khấu thể hiện hiệu quả chống oxy hóa cao nhất, với hoạt tính bắt giữ gốc DPPH, hoạt tính chelat ion kim loại và ức chế oxy hóa β-caroten đều trên 60% ở nồng độ 1 mg/ml Các tác dụng chống oxy hóa này có tiềm năng ngăn ngừa và làm chậm tiến triển của các bệnh liên quan đến viêm và tim mạch.
Nghiên cứu chiết xuất từ hạt nhục đậu khấu cho thấy dịch chiết aceton có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus, nấm Aspergillus niger và ba loài nấm khác Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của dịch chiết aceton cũng thể hiện trên các loài vi khuẩn và nấm khác, bao gồm Bacillus subtilis, Pseudomonas putida và Pseudomonas aeruginosa.
Bên cạnh đó, theo nghiên cứu hoạt tính kháng nấm in vitro và in vivo chống lại nấm gây bệnh thực vật Alternaria alternata, Magnaporthe grisea, Agrobacteria tumefaciens,
Burkholderia glumae, Colletotrichum coccodes và C gloeosporioides của ba lignan, bao gồm macelignan, axit meso-dihydroguaiaretic và nectandrin-B đều cho hoạt tính ở mức tốt Trong đó, nectandrin-B cho khả năng ức chế sự phát triển tốt nhất (IC50$ mgL -1 ) của tất cả các bệnh nấm gây ra bởi thực vật kể trên, trong khi macelignan và axit meso-dihydroguaiaretic cho khả năng ức chế ở mức trung bình hoặc không ức chế [20] d Tác dụng chống béo phì và điều trị tiểu đường
Bệnh tiểu đường và béo phì luôn là nỗi lo ngại cho con người trên thế giới trong đó bệnh béo phì là nguyên nhân thứ hai dẫn đến tử vong sau thuốc lá có liên quan đến bệnh tiểu đường type 2 Protein kinase kích hoạt AMP (AMPK) là mục tiêu điều trị tiềm năng để điều trị hội chứng chuyển hóa, bao gồm bệnh tiểu đường type 2 và béo phì Ba lignan tetrahydrofuran, bao gồm nectandrin B, tetrahydrofuroguaiacin B và nectandrin A ở nồng độ 5 àM tạo ra sự kớch thớch AMPK mạnh mẽ trong cỏc tế bào C2C12 đó biệt húa [32] Macelignan cải thiện đáng kể tình trạng kháng insulin và có tác dụng có lợi đối với chuyển hóa axit béo và glucose ở chuột mắc bệnh tiểu đường, tương tự như troglitazone là một thuốc điều trị đái tháo đường [17]
Ngoài ra, một số thí nghiệm in vivo trên chuột cho thấy tác dụng chống béo phì và điều trị tiểu đường của hạt Nhục đậu khấu Dịch chiết etanol của Nhục đậu khấu được chứng minh là làm giảm lượng đường trong máu vừa phải ở chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin (STZ) sau 3 đến 7 giờ sau điều trị [3] e Tác dụng chống ung thư
Ung thư luôn là nỗi quan tâm và là căn bệnh thế kỷ của nhân loại Những nghiên cứu về thuốc chống ung thư luôn được quan tâm nhiều trong suốt những thập kỷ qua Bốn lignan phân lập từ hạt Nhục đậu khấu ở Việt Nam bao gồm macelignan, axit meso- dihydroguaiaretic , nectandrin-B và fragransin A2 đã được nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro đối với nhiều loại khác nhau, bao gồm: các dòng tế bào ung thư H1299 (ung thư biểu mô phổi), H358 (ung thư phổi phế quản ở người), H460 (ung thư phổi tế bào lớn), Hela (ung thư cổ tử cung ở người), HepG2, KPL4, MCF-7, RD và MDCK (tế bào thận loạn sản đa nang) Kết quả là macelignan và axit meso- dihydroguaiaretic cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn so với nectandrin-B và fragransin A2 Hợp chất axit meso-dihydroguaiaretic thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với hầu hết các tế bào thử nghiệm H358, HepG2, RD, MCF-7, KPL4, tế bào ung thư H1299 và H460 cú giỏ trị IC50 nằm trong khoảng từ 10,1 đến 27,7 àM, so với đối chứng dương [taxol, IC50=4,9–6,6 àM] Macelignan cũng cho thấy khả năng gõy độc tế bào mạnh đối với cỏc tế bào ung thư H358 (IC50,2 àM) và Hela (IC50%,1 àM) [41] f Tác dụng bảo vệ gan
Hạt Nhục đậu khấu cho thấy hoạt động bảo vệ gan mạnh nhất so với 21 loại chất khác được kiểm tra khi dùng đường uống cho chuột bị tổn thương gan do lipopolysacarit (LPS) và D-galactosamine (D-GalN) [30].Trong nghiên cứu đó, cũng báo cáo hoạt động bảo vệ gan cực kỳ mạnh mẽ của myristicin, chất này ức chế rõ rệt sự tăng cường nồng độ TNF-α trong huyết thanh do LPS/D-GalN gây ra và sự phân mảnh DNA ở gan ở chuột [30] g Tác dụng sinh lý thần kinh
Hạt Nhục đậu khấu được ghi nhận là có nhiều tác dụng lên hệ thần kinh trung ương Một số thử nghiệm in vivo trên chuột được ghi nhận có thể kể đến như dịch chiết n- hexan cũng tạo ra tác dụng giống thuốc chống trầm cảm đáng kể ở chuột trong các thử nghiệm bơi cưỡng bức và treo đuôi [9] Trimyristin và dịch chiết n-hexan của hạt Nhục đậu khấu cho thấy hoạt động giải lo âu ở chuột khi được thử nghiệm trong mô hình mê cung và holoboard [40]
Ngoài ra, tác dụng của diphenylalkan là Malabaricon C trong điều trị bệnh Alzheimer còn được ghi nhận qua hoạt tính ức chế acetylcholinesterase (AChE) với giá trị IC50 là 44,0 àg/ml [7] Malabaricon C cũng cho thấy hoạt tớnh ức chế AChE (IC50=2,06 àg/ml) so với chất đối chứng dương, donepezil HCl (IC50=0,03 àg/ml) [37] h Tác dụng bảo vệ tim mạch
Tiểu cầu đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của rối loạn tim mạch và đột quỵ và việc ức chế chức năng tiểu cầu có lợi cho việc điều trị và phòng ngừa các bệnh này Theo một số nghiên cứu, lignan [(1S,2R)-2-(4-allyl-2,6-dimethoxyphenoxy)- 1-(3,4-dimethoxyphenyl) propan-1-ol acetat] được ưu tiên ức chế yếu tố kích hoạt tiểu cầu và huyết khối (PAF) gây ra sự kết tập tiểu cầu mà không ảnh hưởng đến tổn thương tiểu cầu theo cỏch phụ thuộc vào nồng độ với giỏ trị IC50 lần lượt là 3,2 và 3,4 àM [21] Trong một nghiên cứu in vivo được thử trên động vật, dịch chiết nước của hạt Nhục đậu khấu có tác dụng bảo vệ tim mạch chống lại chứng nhồi máu cơ tim (MI), chuột đực trưởng thành bị MI do isoproterenol gây ra được dùng dịch chiết nước của hạt Nhục đậu khấu (100 mg/kg) hàng ngày trong 30 ngày và kết quả cho thấy việc xử lý bằng dịch chiết nước của hạt Nhục đậu khấu đã bảo vệ chống lại tác dụng của isoproterenol đối với đường huyết, lipid huyết tương, cũng như những thay đổi về mô học của cơ tim, cho thấy vai trò bảo vệ tim mạch tiềm năng của hạt Nhục đậu khấu [25] Trong một nghiên cứu in vivo khác, chiết xuất từ quả Nhục đậu khấu có tác dụng hạ đường huyết ở thỏ [35], trong khi chiết xuất hạt Nhục đậu khấu cũng được ghi nhận có tác dụng chống cholesterol máu và chống xơ vữa động mạch đáng kể ở thỏ [39] i Độc tính
Sự hiện diện của hai thành phần phenylpropanoid chính là myristicin và elemicin trong hạt Nhục đậu khấu được cho là nguyên nhân chính gây ra ngộ độc [4], [11] Myristicin đã được ghi nhận là có tác dụng gây độc hại đối với hệ thần kinh (buồn ngủ, dị cảm, mê sảng, tê và hôn mê), đường tiêu hóa (nôn mửa và tắc ruột) và hệ tim mạch (hạ huyết áp và nhịp tim nhanh) [14], [36] Liều lượng tối thiểu (liều gây độc) của hạt Nhục đậu khấu có thể gây độc là 5g hạt nhục đậu khấu xay, chứa 1 đến 2 mg myristicin Ở liều lượng myristicin cao hơn có thể xảy ra tử vong [31]
1.2.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam về hạt Nhục đậu khấu
Các nghiên cứu ở Việt Nam về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Nhục đậu khấu còn tương đối hạn chế và chủ yếu được nghiên cứu ở nước ngoài
Bảng 1.2: Các hoạt chất hóa học trong hạt Nhục đậu khấu được xác định ở Việt Nam
STT Tên hợp chất Công thức hóa học Tài liệu tham khảo
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Hạt Nhục đậu khấu được sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ Trung Quốc, nhập khẩu bởi công ty TNHH Đông Dược Tân Lợi Nhục đậu khấu đạt các chỉ tiêu chất lượng của Dược điển Trung Quốc 2015 bộ 1, bộ 4 (Phụ lục 2)
Hình 2.1: Hình ảnh hạt Nhục đậu khấu
Hình 2.2: Hạt Nhục đậu khấu sau khi được phơi khô và xay
Nguyên liệu
Phân tích TLC được thực hiện bằng cách sử dụng bản mỏng silica gel GF 254 Phát hiện vết dưới bức xạ UV 254 nm và bằng cách phun tẩm với H2SO4 sau đó làm nóng bằng súng nhiệt
Việc tinh chế sử dụng sắc ký cột được thực hiện bằng hạt silica gel 60 Mesh Các dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi hữu cơ: n-hexan, CH2Cl2, Aceton, MeOH, EtOAc, cồn và nước
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
5 Ethyl acetat Trung Quốc TCNSX
2.2.2 Trang thiết bị nghiên cứu
- Thiết bị chiết ngấm kiệt dược liệu
- Máy cất quay chân không BUCHI Toledo AB204S (Thụy Sĩ)
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merch)
- Chất hấp phụ: silica gel (Merck)
- Cân kỹ thuật, cân phân tích
- Các dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm như: Cột sắc ký, bình gạn, bình nón, bộ sinh hàn hồi lưu, bình cầu, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet,…
Nội dung nghiên cứu
Chiết xuất dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn hạt Nhục đậu khấu
Phân lập một số thành phần từ phân đoạn ethyl acetat của hạt Nhục đậu khấu
Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp ngâm nóng ở 60 o C, 3 lần với dung môi EtOH 96% với tỉ lệ DM/DL lần lượt là 10:1, 8:1, 6:1, lọc và gộp dịch, cất thu hồi dung môi thu lấy cắn chiết Sau đó, phân tán cắn chiết vào nước rồi chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: CH2Cl2, EtOAc, nước các phân đoạn dịch chiết thu được đem cô lấy cắn
2.4.2 Phân lập hợp chất hóa học
Sử dụng phương pháp sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel để phân lập
Trước khi tiến hành phân lập, khảo sát phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn pha động Sử dung phương pháp sắc ký cột để phân lập các hợp chất sạch
- Chất nhồi cột: silica gel cỡ hạt (Merck)
Dung môi rửa giải (pha động) là hỗn hợp dung môi được pha theo tỷ lệ thích hợp dựa trên các dung môi phổ biến như n-hexan, dicloromethan, aceton, ethylacetat và methanol Tỷ lệ pha trộn này được xác định thông qua phương pháp sắc ký lớp mỏng.
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng chất đưa lên cột, rửa sạch, tráng cột bằng ethanol để khô, cố định trên giá theo phương thẳng đứng Cho lớp bông vào đáy cột
Nhồi cột bao gồm cân lượng silica gel phù hợp vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải, khuấy đều và ổn định hỗn dịch cho đến khi không còn bọt khí Đổ hỗn dịch này vào cột đã chuẩn bị Mở khóa cột, rót thêm dung môi và gõ quanh thành cột để đẩy bọt khí và ổn định cột Tiếp tục cho hệ dung môi chảy qua cột cho đến khi mực dung môi còn cách lớp silica gel khoảng 2-4 mm Sau đó, khóa cột và chuẩn bị mẫu để đưa lên cột.
- Nạp mẫu: Có 2 cách nạp mẫu
Để nạp mẫu khô, ta hòa tan mẫu trong dung môi trung gian trong cốc có mỏ Sau đó, thêm silicagel gấp đôi hoặc gấp rưỡi lượng mẫu vào cốc để hấp thu mẫu Chuyển hỗn hợp vào bình cầu và cất dưới áp lực giảm để loại bỏ dung môi, thu được silicagel khô chứa mẫu Nạp hết silicagel này vào cột và cho dung môi chạy cột vào.
+ Nạp mẫu ướt: Mẫu được hòa tan trong dung môi pha động dùng để chạy cột trước với lượng dung môi pha động tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột bằng pipet
- Tùy thuộc vào lượng chất, dạng chất và độ hòa tan mẫu trong hệ dung môi chạy cột mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng phương pháp khác nhau:
+ Nạp mẫu khô: Nếu lượng chất nhiều, chạy thô hoặc mẫu có một phần không tan trong dung môi chạy cột, thì phổ biến là tẩm chất với silica gel rồi làm khô bằng máy cất quay chân không, làm tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột
+ Nạp mẫu ướt: Nếu tách tinh khiết, lượng mẫu phân đoạn nhỏ, mẫu tan hoàn tan dung môi pha động dùng để chạy chạy cột thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan dung môi pha động với lượng tối thiều, rồi từ từ đưa lên cột bằng pipet
Quá trình rửa giải diễn ra bằng cách cho hệ dung môi rửa giải thích hợp vào cột đã nạp mẫu Sau đó, thêm một lớp bông lên trên để tránh lớp bề mặt bị xáo trộn khi dung môi được bổ sung Trong suốt quá trình rửa giải, cần liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô.
- Thu dịch: Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm với thể tích phù hợp Kiểm tra dịch thu được bằng sắc ký lớp mỏng để gộp các ống nghiệm có cùng sắc ký đồ Loại dung môi thu được và cho cắn vào các ống nghiệm để bảo quản và tiến hành các kỹ thuật phân tích sau đó
2.4.3 Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất được phân lập
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất cảm quan, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC, HSQC) và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trước đó.
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần và các dịch chiết phân đoạn
Lấy 2 kg hạt Nhục đậu khấu khô, xay nhỏ và chiết với ethanol 96% bằng phương pháp ngâm nóng ở 60 o C chiết 3 lần với tỷ lệ DM/DL lần lượt là 10:1, 8:1, 6:1 (v/v) trong thời gian 6 giờ Gộp cả 3 lần dịch chiết sau đó lọc dịch bằng lớp vải lọc, thu dịch chiết, tiến hành cô dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không thu được 110g cao chiết EtOH
Phân tán cao chiết EtOH trong một lượng nước tối thiểu, sau đó chiết phân bố với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần là CH2Cl2, EtOAc và nước Mỗi dung môi chiết nhiều lần cho đến khi lớp dung môi hữu cơ nhạt dần, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 52g cao chiết CH2Cl2, 15g cao chiết EtOAc, 25g cao chiết nước
Quy trình chiết được trình bày theo sơ đồ 3.1:
Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất cao phân đoạn hạt Nhục đậu khấu
Phân lập một số hợp chất trong phân đoạn ethyl acetat
Từ cắn chiết EtOAc (15g) được phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel Cắn EtOAc được trộn với khoảng 30g slica gel pha thường, cất dưới áp suất giảm và dùng chày cối làm mịn Cột sắc ký có đường kính 2,5 cm được làm sạch khô bằng ethanol, cố định thẳng đứng trên giá và lót một lớp bông dưới đáy cột Rửa giải với hệ dung môi pha động CH2Cl2:MeOH lần lượt với tỉ lệ là 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:1 (v/v) thu được 6 phân đoạn N1- N6
Hạt Nhục đậu khấu (2 kg)
- Ngâm nóng ở 60 o C với Ethanol 96%, chiết 3 lần
- Tỉ lệ DM/DL là 10:1, 8:1, 6:1 (v/v)
- Lọc, gộp dịch cô loại dung môi
- Phân tán cao chiết vào nước
- Chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần
Cao chiết phân đoạn CH 2 Cl 2 (52 g)
Cao chiết phân đoạn EtOAc (15 g) EtOAc
Phân đoạn N1 (850 mg) được tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi pha động là n-hexan:EtOAc với tỉ lệ 5:1 (v/v) thu được 3 phân đoạn từ N1.1-N1.3 Từ phân đoạn N1.3 (250 mg) tinh chế tiếp bằng chất hấp phụ silica gel pha thường với hệ dung môi pha động là CH2Cl2:Aceton:MeOH tỉ lệ 6:1:0.1 (v/v/v) thu được 3 phân đoạn từ N1.3.1-N1.3.3 Cuối cùng, từ phân đoạn N1.3.2 (83 mg) tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi pha động là n- hexan:EtOAc:MeOH tỉ lệ 5:1:0.1 (v/v/v) thu được hợp chất NĐK-09 (10 mg)
Phân đoạn N2 (1.2 g) được tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi pha động là CH2Cl2:Aceton với tỉ lệ 7:1 (v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ từ N2.1-N2.5 Từ phân đoạn N2.4 (200 mg)tinh chế tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi pha động CH2Cl2:EtOAc:MeOH với tỉ lệ 3:1:0.1 (v/v/v) thu được 3 phân đoạn từ N2.4.1-N2.4.3 Cuối cùng, từ phân đoạn N2.4.3 (80 mg) tinh chế sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi pha động là n-hexan:Aceton tỉ lệ 5:1 (v/v) thu được hợp chất NĐK-02 (15 mg)
Quá trình phân lập hợp chất NĐK-02 và NĐK-09 được biểu diễn theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập NĐK-02 và NĐK-09
NĐK-09 (10 mg) n-hexan:EtOAc:MeOH
Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập
Hợp chất NĐK-09 là chất rắn vô định hình màu trắng
Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-09 cho thấy các tín hiệu hấp thụ ở vùng trường thấp của năm proton vòng thơm là δ H [6,40 (2H, s, H-3',5'); 6,69 (1H, dd,
J 1=1,8Hz, J 2 =8,4Hz, H-6); 6,77 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2); 6,81 (1H, d, J=7,8 Hz, H-5)] (Xem hình 3.1 và bảng 3.1) Phân tích tín hiệu của cặp proton δ H 6,40 (2H, s, H-3',5') cho thấy sự hiện diện của vòng benzen thế ở 4 vị trí 1, 3, 4, 5 trong cấu trúc của NĐK-
09 Bên cạnh đó, phân tích hằng số tương tác của 3 proton thơm còn lại trên phổ cho thấy sự có mặt của hệ tương tác spin ABX tại δ H [6,69 (1H, dd, J 1=1,8Hz, J 2 =8,4Hz, H- 6); 6,77 (1H, d, J = 1,8Hz, H-2); 6,81 (1H, d, J = 7,8Hz, H-5)] Hai tín hiệu tại δ H [5,97 (1H, dd, J 1=9,6Hz, J 2 ,8Hz, H-8'); 5,10 (2H, m, H-9')] gợi ý cho sự xuất hiện của nhóm ethenyl Tín hiệu hấp thụ proton của ba nhóm methoxy tại δ H [3,80 (6H, s, H-2',6') và 3,86 (3H, s, H-3)], hai nhóm methylen tại δ H [2,72 (1H, dd, J 1=7,8Hz, J 2 ,2Hz, H- 7a); 3.11 (1H, dd, J 1=4,8Hz, J 2 2Hz, H-7b); 3.34 (2H, d, J = 6,6 Hz, H-7')], một nhóm oxymethin tại δ H 4,33 (1H, m, H-8) và một nhóm methyl tại δ H 1.20 (3H, d, J 6,0 Hz, H-9) đã được phát hiện.
Hình 3.1: Phổ giãn 1 H-NMR của hợp chất NĐK-09 Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-09 thu được 18 tín hiệu tín hiệu cacbon có độ dịch chuyển hóa học là δ C [134,5 (C-1); 112,3 (C-2); 146,2 (C-3); 143,9 (C-4); 114,0 (C-5); 122,2 (C-6); 42,9 (C-7); 80,0 (C-8); 19,6 (C-9); 135,5 (C-1'); 135,7 (C-2',6'); 105,7 (C-3', 5'); 131,1 (C-4'); 40,5 (C-7'); 137,3 (C-8'); 115,9 (C-9'); 56,1 (-OCH3); 55,9 (-OCH3)] (Xem hình 3.2, hình 3.3 và bảng 3.1) Phân tích các chuyển dịch hóa học của cacbon kết hợp với dữ liệu phổ 1 H-NMR cho phép xác định 2 mảnh cấu trúc trong hợp chất NĐK-09 Mảnh cấu trúc thứ nhất được xác định là 4-hydroxy-3- methoxyphenyl) 2-propanol với các tín hiệu có độ dịch chuyển tại δ C [134,5 (C-1); 112,3 (C-2); 146,2 (C-3); 143,9 (C-4); 114,0 (C-5); 122,2 (C-6); 42,9 (C-7); 80,0 (C-8); 19,6 (C-9)] Trong đó, vòng benzene thế 3 vị trí 1, 3, 4 cùng với một nhóm methylen, một nhóm oxymethin và một nhóm methyl được xác định thuộc về khung cấu trúc này Mảnh cấu trúc thứ 2 của NĐK-09 là 4-allyl-2,6-dimethoxyphenoxyl với các tín hiệu có độ dịch chuyển đặc trưng của vòng benzen thế 4 vị trí 1, 3, 4, 5 tại δ C [135,5 (C-1'); 135,7 (C- 2',6'); 105,7 (C-3', 5'); 131,1 (C-4')] và khung cấu trúc 2-propenyl tại δ C [40,5 (C-7'); 137,3 (C-8'); 115,9 (C-9')]
Hai mảnh cấu trúc của NĐK-09 được liên kết với nhau qua cầu ete giữa C-8 và C-1' trên cơ sở sự dịch chuyển về phía trường thấp của cacbon C-8 (δ C 80,0) và C-1' (δ C
Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp với so sánh tài liệu đối chiếu tham khảo, NĐK-09 được xác định là 2-(4-allyl-2,6-dimethoxylphenoxy)-1-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl) propan Cấu hình tuyệt đối tại cacbon bất đối C-8 của NĐK-09 được xác định là “R” dựa trên kết quả góc quay cực là [𝛼] 𝐷 23 -11,9 (c 0,2, CHCl3) Do đó, tên đầy đủ của hợp chất NĐK-09 là (-)-(8R) 2-(4-allyl-2,6-dimethoxylphenoxy)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) propan.
Hình 3.2: Phổ giãn 13 C-NMR của hợp chất NĐK-09
Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất NĐK-09
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất NĐK-09
Vị trí δ H a,c (ppm) (số proton, độ bội, J (Hz)) δ C a,b (ppm) TLTK a [18]
OCH3 55,9 55,8 a : đo trong CDCl3; b : 600 MHz; c : 500M Hz
Hợp chất NĐK-02 là chất rắn vô định hình màu trắng
Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-02 ở vùng trường cao xuất hiện 2 tín hiệu hấp thụ của proton ở δ H [1,37 (3H, dd, J 1 = 4,8Hz, J 2 = 6,6Hz, H-9); 1,83 (3H, t, J =5,4
Hz, H-9')] xác định cho sự có mặt của hai nhóm methyl Các tín hiệu hấp thụ ở vùng trường thấp cho thấy sự có mặt của 5 proton thơm tại δ H [7,01 (1H, br s, H-2); 6,82 (1H, m, H-5); 6,87 (1H, m, H-6); 6,85 (1H, m, H-2'); 6,80 (1H, m, H-6')] Bên cạnh đó, tín hiệu hấp thụ của hai proton olefin cũng được ghi nhận tại δ H [6.36 (1H,br d, J = 15,0 Hz, H-7'); 6,13 (1H, m, H-8')], cùng với giá trị của hằng số tương tác J = 15,0 Hz cho phép xác định được dạng đồng phân hình học của liên kết đôi là trans Ngoài ra, hai nhóm methoxy, một nhóm oxymethin và một nhóm methin đã được phát hiện với độ chuyển dịch hóa học lần lượt tương ứng là δ H [3,86 (3H, s, 5'-OCH3); 3,86 (3H, s, 3-OCH3), 5,07 (1H, m, H-7); 3,39 (1H, t, J = 6,6 Hz, H-8)] Các tín hiệu hấp thụ proton còn lại là δ H [6,85 (1H, H-2'), 6,80 (1H, H-6'), 3,39 (1H, H-8); 5,07 (1H, H-7)] cho thấy sự hiện diện của cấu trúc 2,3-dihydrobenzofuran và các nhóm thế ở vị trí C-1', C-3', C-4', C-5', C-7, C-8 [27] (Xem hình 3.4 và bảng 3.2)
phổ 13C-NMR của hợp chất NĐK-02 cho thấy 12 tín hiệu cacbon, ứng với các nguyên tử cacbon từ C-1 đến C-6 và C-1' đến C-6', ngoài ra còn có tín hiệu của một cacbon oxymethin tại C-7 (δ C 94,9), một cacbon methin tại C-8 (δ C 46,8) và một liên kết đôi tại C-7' (δ C 132,3).
123,9 (C-8'); hai nhóm methoxy tại δ C 56,5 (3-OCH3) và 56,7 (5'-OCH3); hai nhóm methyl tại δ C 18,1 (C-9) và 18,5 (C-9') (Xem hình 3.5, hình 3.6 và bảng 3.2)
Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-02
Hình 3.6: Phổ hai chiều HSQC của hợp chất NĐK-02
Phân tích phổ tương tác 2 chiều HMBC thu nhận được tương tác giữa H-2 (δ H
1 (δ C 134,8), C-3 (δ C 149,2), C-2 (δ C 111,0) chứng minh cho sự hiện diện của một vòng
1, 3, 4 - benzene thế Cấu trúc của vòng dihydrobenzofuran cũng được khẳng định dựa trên tương tác HMBC giữa H-7 (δ H 5,07) với C-3' (δ C 133,3), C-4' (δ C 147,8); H-2' (δ H
133,3) Tương tác HMBC ghi nhận được giữa H-2 (δ H 7,01), H-6 (δ H 6,87) với C-7 (δ C
Phổ 2D NMR cho thấy liên kết H-C-C tại C-7 trên vòng benzen với khung dihydrobenzofuran Liên kết olefin được xác định gắn vào vị trí C-1' trên vòng dihydrobenzofuran, liên kết này tương tác với proton H-2' và H-8' trên vòng dihydrobenzofuran.
Hình 3.7: Phổ hai chiều HMBC của hợp chất NĐK-02
Ngoài ra, tương tác giữa proton H-9' (δ H 1,86) với cacbon C-7' (δ C 132,3) và cacbon C-8' (δ C 123,9) của nhóm olefin cùng với tương tác giữa proton H-8' (δ H 6,13) với cacbon C-9' (δ C 18,5) và tương tác giữa proton H-7' (δ H 6,36) với cacbon C-9' (δ C
18,5) của nhóm methyl chứng tỏ vị trí của nhóm methyl gắn vào vị trí C-8' của nhóm olefin Tương tác giữa proton H-9 (δ H 1,37) với cacbon C-7 (δ C 94,9) và C-8 (δ C 46,8) của vòng furan và tương tác giữa proton H-7 (δ H 5,07) với cacbon C-9 (δ C 18,1) của nhóm methyl chứng tỏ vị trí của nhóm methyl C-9 gắn với C-8 trên vòng dihydrobenzenfuran Vị trí của các nhóm methoxy được xác định nhờ tương tác của proton δ H 3,86 với cacbon C-3 (δ C 149,2) và C-5' (δ C 145,3) Vị trí của nhóm thế -OH còn lại dựa vào độ dịch chuyển hóa học tại trường thấp C-4 (δ C 147,9) có vị trí nhóm thế vì vậy có thể xác định vị trí này là vị trí của nhóm -OH Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-7 và C-8 được xác định trên cơ sở so sánh chuyển dịch hóa học cacbon tại hai vị trí tương ứng của hai hợp chất (7S,8R)-4-Hydroxy-4',7-epoxy-8,3'-neolignan-7' [E]-ene (7S, 8R - 92,6 và 40,7 ppm) và (7S,8S)-3,4-Methylenedioxy-4',7-epoxy-8,3'-neolignan- 7' [E]-ene (7S, 8S - 92,7 và 45,3 ppm) [5] cho phép xác định cấu hình 7S, 8S - 94,9 và 46,8 ppm của NĐK-02 Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp với so sánh đối chiếu tài liệu tham khảo, hợp chất NĐK-02 được xác định là (+)-dehydrodiisoeugenol (Licarin A) [27]
Hình 3.8: Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC của hợp chất NĐK-02
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất NĐK-02
Vị trí δ H a,b (ppm)(số proton, độ bội, J (Hz)) δ C a,c
OMe 3,86 (s) 56,7 55,8 a : đo trong MeOD; b : 600 MHz; c : 500M Hz; d : đo trong CDCl3, 125 MHz
BÀN LUẬN
Về kết quả chiết xuất
Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng bằng EtOH 96% Phương pháp chiết này đơn giản, dễ thực hiện Dung môi EtOH là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, tương đối thân thiện với môt trường đồng thời có thể chiết xuất được nhiều hoạt chất trong dược liệu Cao tổng thu được tiếp tục được chiết phân bố thành các phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: CH2Cl2, EtOAc và nước để thu được các cao phân đoạn tương ứng.
Quá trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột, phương pháp này dễ thực hiện, chi phí thấp và phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn phân đoạn, khảo sát hệ dung môi rửa giải và theo dõi các chất trong quá trình phân lập.
Về kết quả phân lập
Trong quá trình thực hiện nghiên cứu, bằng vào kỹ thuật sắc ký cột với chất nhồi cột silica gel pha thường và kỹ thuật sắc kỹ lớp mỏng thu được 2 hợp chất đặt tên là NĐK-09 và NĐK-02 Thông qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân xác định được cấu trúc của hợp chất NĐK-09 là (-)-(8R) 2-(4-allyl-2,6-dimethoxylphenoxy)-1-(4- hydroxy-3-methoxyphenyl) propan và hợp chất NĐK-02 là Licarin A (Xem hình 4.1)
Hình 4.1: Cấu trúc hóa học của hai hợp chất phân lập được từ hạt Nhục đậu khấu
Hợp chất NĐK-09 tên danh pháp là 2-(4-allyl-2,6-dimethoxylphenoxy)-1-(4- hydroxy-3-methoxyphenyl) propan là một hợp chất thuộc nhóm phenolic NĐK-09 được tìm thấy nhiều ở hạt và quả của Nhục đậu khấu Hợp chất NĐK-09 được phân lập lần đầu tiên từ hạt Nhục đậu khấu vào năm 1973 [19] Hiện nay, trên thế giới chưa có báo cáo nào liên quan đến thử hoạt tính sinh học của hợp chất NĐK-09 và kết hợp với việc có nhiều báo cáo về tác dụng sinh học của nhóm phenolic, vì vậy đây là tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu tác dụng sinh học của hợp chất trong tương lai Một trong những tác dụng đặc trưng nhất của nhóm phenolic được nói đến là khả năng chống oxy hóa [15], [44], [24], đồng thời nghiên cứu về sàng lọc tác dụng kháng biofilm của hạt Nhục đậu khấu Do đó, việc nghiên cứu tác dụng sinh học của hợp chất NĐK-09 hứa hẹn mang lại nhiều thành công lớn trong tương lai
4.2.2 Về hợp chất NĐK-02 (Licarin A)
Licarin A là một hợp chất phenolic có hoạt tính dược lý đa dạng Nghiên cứu in vivo gần đây trên chuột cho thấy Licarin A có khả năng chống bệnh sán máng qua đường uống, với liều duy nhất 400 mg/kg có thể giảm một nửa lượng giun và trứng ký sinh, đồng thời làm giảm nhẹ tình trạng gan, lách to Những kết quả này cho thấy tiềm năng của Licarin A như một tác nhân chống sán mới.
Bên cạnh đó, một báo cáo gần đây về khả năng Licarin A trong vai trò một thuốc điều trị viêm mắt Theo như nghiên cứu in vitro ở tế bào gốc phôi người và in vivo ở chuột cho thấy Licarin A an toàn cho tế bào và CAM (Xét nghiệm màng chorioallantoic) ở nồng độ dưới 12,0 μM LCA làm giảm đáng kể tỷ lệ mạch máu trong CAM Độ an toàn trên võng mạc và hiệu quả chống viêm của tiêm Licarin A 6,0 μM trong dịch kính đã được xác nhận thông qua đánh giá lâm sàng, chức năng và mô bệnh học Người ta cũng thấy giảm đáng kể các cytokin gây viêm (yếu tố hoại tử khối u-α và interleukin-6) khi so sánh với động vật không được điều trị Điều này cho thấy Licarin A là một chất tiềm năng để làm thuốc trong điều trị bệnh viêm mắt [34]
Licarin A thể hiện tiềm năng đáng kể trong lĩnh vực hoạt tính sinh học Để làm sáng tỏ tác dụng kháng màng sinh học của hạt nhục đậu khấu, Licarin A được đánh giá là một hợp chất đầy triển vọng và cần được nghiên cứu sâu rộng hơn Các đặc tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống ung thư của Licarin A đã được ghi nhận, mang lại hứa hẹn đáng kể trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh nhiễm trùng, thoái hóa thần kinh và ung thư.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 Chiết xuất được dịch chiết ethanol toàn phần của hạt Nhục đậu khấu, sau đó chiết được các phân đoạn 52 g cao chiết CH2Cl2, 15 g cao chiết EtOAc, 25 g cao chiết nước Phân lập được 2 hợp chất phenolic từ phân đoạn EtOAc đó là NĐK-09 và NĐK-02
2 Xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất NĐK-09 là (-)-(8R) 2-(4-allyl-2,6- dimethoxylphenoxy)-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) propan và hợp chất NĐK-
Do thời gian có hạn, các kết quả nghiên cứu thu được còn khiêm tốn, bên cạnh đó tôi nhận thấy tiềm năng lớn về nghiên cứu tác dụng dược lý và sinh học của các hoạt chất thuộc nhóm phenolic từ hạt Nhục đậu khấu nhưng ở Việt Nam còn hạn chế Nên tôi xin có kiến nghị như sau:
+ Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao tổng, các cao phân đoạn và các hợp chất phân lập từ hạt Nhục đậu khấu
+ Tiếp tục phân lập các hợp chất trong phân đoạn EtOAc và các phân đoạn còn lại của hạt Nhục đậu khấu.
[1] Bộ Y Tế (2018), Dược điển Viêt Nam V, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, tr.123-125 [2] N Thị, Q Mai, T T Ngân, N Thị, T Phương (2021), “NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HẠT NHỤC ĐẬU KHẤU (Myristica fragrans Houtt.)”, Công trình nghiên cứu Khoa học Trường Đại học Dược Hải Phòng, tr 23-25
[3] Ahmad, R., Srivastava, S P., Maurya, R., Rajendran, S M., & nbsp, K R A and
A K S (2008), “Mild antihyperglycaemic activity in Eclipta alba, Berberis aristata, Betula utilis, Cedrus deodara, Myristica fragrans and Terminalia chebula’’, Indian Journal of Science and Technology, 1(5), pp.1–6
[4] B.Kasture (2002), “ANTICONVULSANT AND BEHAVIOURAL ACTIONS OF MYRISTICA FRAGRANS’’, Indian Journal of Pharmacology, (n.d.), pp.8–10 [5] Benevides, P J C., Sartorelli, P., & Kato, M J (1999), “Phenylpropanoids and neolignans from Piper regnellii”, Phytochemistry, 52(2), pp.339–343
[6] Chiu, S., Wang, T., Belski, M., & Abourashed, E A (2016), “HPLC-Guided Isolation, Purification and Characterization of Phenylpropanoid and Phenolic Constituents of Nutmeg Kernel (Myristica fragrans), Sage Journals, 11(4), pp.483–
[7] Cuong, D., Hung, T M., Han, H Y., Roh, H S., Seok, J H., Lee, J K., Jeong, J Y., Choi, J S., Kim, J A., & Min, B S (2014), “Potent Acetylcholinesterase Inhibitory Compounds from Myristica fragrans”, Sage Journals, 9(4), pp.499–502 [8] Cuong, T D., Hung, T M., Na, M., Ha, D T., Kim, J C., Lee, D., Ryoo, S., Lee, J H., Choi, J S., & Min, B S (2011), “Inhibitory effect on NO production of phenolic compounds from Myristica fragrans”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,
[9] Dhingra, D., & Sharma, A (2006), “Antidepressant-Like Activity of n-Hexane Extract of Nutmeg (Myristica fragrans) Seeds in Mice”, Journal of Medicinal Food, 9(1), pp.84–89
[10] Dzotam, J K., Simo, I K., Bitchagno, G., Celik, I., Sandjo, L P., Tane, P., & Kuete, V (2018), “In vitro antibacterial and antibiotic modifying activity of crude extract, fractions and 3’,4’,7-trihydroxyflavone from Myristica fragrans Houtt against MDR Gram-negative enteric bacteria”, BMC Complementary and Alternative Medicine, 18(1), pp.1–9
[11] Ehrenpreis, J E., DesLauriers, C., Lank, P., Armstrong, P K., & Leikin, J B (2014), “Nutmeg Poisonings: A Retrospective Review of 10 Years Experience from the Illinois Poison Center (2001-2011)”, Journal of Medical Toxicology Springer New York LLC, pp.21-23
[12] Francis, K S., Suresh, E., & Nair, M S (2014), “Chemical constituents from
Myristica fragrans fruit”, Natural Product Research, 28(20), pp.1664–1668
[13] Francis, S K., James, B., Varughese, S., & Nair, M S (2019), “Phytochemical investigation on Myristica fragrans stem bark’, Natural Product Research, 33(8), pp.1204–1208
[14] Grover, J K., Khandkar, S., Vats, V., Dhunnoo, Y., & Das, D (2002),
“Pharmacological studies on Myristica fragrans - Antidiarrheal, hypnotic, analgesic and hemodynamic (blood pressure) parameters”, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 24(10), pp.675–680
[15] Gupta, A D., Bansal, V K., Babu, V., & Maithil, N (2013), “Chemistry, antioxidant and antimicrobial potential of nutmeg (Myristica fragrans Houtt)”,
Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 11(1), pp.25–31
[16] Hada, S., Hattori, M., Tezuka, Y., Kikuchi, T., & Namba, T (1988), “New neolignans and lignans from the aril of Myristica fragrans”, Phytochemistry, 27(2), pp.563–568
[17] Han, K L., Choi, J S., Lee, J Y., Song, J., Joe, M K., Jung, M H., & Hwang, J
K (2008), “Therapeutic Potential of Peroxisome Proliferators–Activated Receptor- α/γ Dual Agonist With Alleviation of Endoplasmic Reticulum Stress for the Treatment of Diabetes”, Diabetes, 57(3), pp.737–745
[18] Hattori, M., Hada, S., Shu, Y.-Z., Kakiuchi, N., & Namba, T (1987), New Acyclic
Bis-phenylpropanoids from the Aril of Myristica fragrans1 Chem Pharm Bull (Vol
[19] Isogai, A., Suzuki, A., & Tamura, S (1973), “Structures of Dimeric Phenyl- propanoids from Myristica fragrans Houtt”, Agricultural and Biological Chemistry, 37(1), pp.193–194
[20] Jun, Y C., Gyung, J C., Seung, W S., Kyoung, S J., He, K L., Sun, O L., Nack,
D S., Kwang, Y C., & Kim, J C (2007), “Isolation and antifungal activity of lignans from Myristica fragrans against various plant pathogenic fungi”, Pest Management Science, 63(9), pp.935–940
[21] Kang, J W., Min, B S., & Lee, J H (2013), “Anti-platelet Activity of Erythro- (7S,8R)-7-acetoxy-3,4,3′,5′-tetramethoxy-8-O-4′-neolignan from Myristica fragrans”, Phytotherapy Research, 27(11), pp.1694–1699
[22] Kasahara, H., Miyazawa, M., & Kameoka, H (1995), “Absolute configuration of 8-O-4′-neolignans from Myristica fragrans”, Phytochemistry, 40(5), pp.1515–
[23] Kimura, Y., Ito, H., & Hatano, T (2010) Effects of Mace and Nutmeg on Human Cytochrome P450 3A4 and 2C9 Activity Biological and Pharmaceutical Bulletin,
[24] Kapoor, I P S., Singh, B., Singh, G., De Heluani, C S., De Lampasona, M P., & Catalan, C A N (2013), “Chemical Composition and Antioxidant Activity of Essential Oil and Oleoresins of Nutmeg (Myristica fragrans Houtt.) Fruits”,
International Journal of Food Properties, 16(5), pp.1059–1070
[25] Kareem, M A., Krushna, G S., Hussain, S A., & Devi, K L (2009), “Effect of Aqueous Extract of Nutmeg on Hyperglycaemia, Hyperlipidaemia and Cardiac Histology Associated with Isoproterenol-induced Myocardial Infarction in Rats”,
Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8(4), pp.337–344
[26] Kwon, H S., Cho, S J., Ha, T J., Harikishore, A., Yoon, H S., Park, K H., Kim,
I S., & Jang, D S (2014), “Lipoxygenase Inhibitory Effects of Dibenzylbutane Lignans from the Seeds of Myristica fragrans (Nutmeg)”, Bulletin of the Korean
[27] Li, F., & Yang, X.-W (2007), Three New Neolignans from the Aril of Myristica fragrans, pp.1994-1996
[28] Meguro, K., Tanaka, T., & Iida, T (1973), “Constituents of Myristica fragrans Houtt III The structures of licarin-A and -B”, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 21(10), pp.2215-2216
[29] Mengarda, A C., Silva, M P., Cirino, M E., Morais, T R., Conserva, G A A., Lago, J H G., & de Moraes, J (2021), “Licarin A, a neolignan isolated from Nectandra oppositifolia Nees & Mart (Lauraceae), exhibited moderate preclinical efficacy against Schistosoma mansoni infection”, Phytotherapy Research, 35(9), pp.5154–5162
[30] Morita, T., Jinno, K., Kawagishi, H., Arimoto, Y., Suganuma, H., Inakuma, T., & Sugiyama, K (2003), “Hepatoprotective Effect of Myristicin from Nutmeg (Myristica fragrans) on Lipopolysaccharide/d-Galactosamine-Induced Liver Injury”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(6), pp.1560-1565
[31] Naa, R (2015), “Toxicity of Nutmeg (Myristicin): A Review”, Article in International Journal on Advanced Science Engineering and Information Technology, 5(3), pp.997-1000
[32] Nguyen, P H., Le, T V T., Kang, H W., Chae, J., Kim, S K., Kwon, K i I., Seo,
D B., Lee, S J., & Oh, W K (2010), “AMP-activated protein kinase (AMPK) activators from Myristica fragrans (nutmeg) and their anti-obesity effect”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20(14), pp.4128–4131
[33] Olajide, O A., Ajayi, F F., Ekhelar, A I., Awe, S O., Makinde, J M., & Akinola Alada, A R (1999), Biological Effects of Myristica fragrans (Nutmeg) Extract, pp.501-503
[34] Paiva, M R B De, Vasconcelos-Santos, D V De, Coelho, M M., MacHado, R R., Lopes, N P., Silva-Cunha, A., & Fialho, S L (2021), “Licarin A as a Novel Drug for Inflammatory Eye Diseases”, Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 37(5), pp.290–300
[35] Ram, A., Lauria, P., Gupta, R., & Sharma, V N (1996), “Hypolipidaemic effect of Myristica fragrans fruit extract in rabbits”, Journal of Ethnopharmacology, 55(1), pp.49–53
[36] Sangalli, B C., & Chiang, W (2000), “Toxicology of Nutmeg Abuse”, Journal of
[37] Sathya, S., Amarasinghe, N R., Jayasinghe, L., Araya, H., & Fujimoto, Y (2020),
“Enzyme inhibitors from the aril of Myristica fragrans”, South African Journal of
[38] Shan, B., Cai, Y Z., Sun, M., & Corke, H (2005), “Antioxidant Capacity of 26 Spice Extracts and Characterization of Their Phenolic Constituents”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(20), pp.7749–7759
[39] Sharma, A., Mathur, R., & Dixit, V P (1995), “PREVENTION OF HYPERCHOLESTEROLEMIA AND ATHEROSCLEROSIS IN RABBITS AFTER SUPPLEMENTATION OF MYRISTICA FRAGRANS SEED EXTRACT”,
“Anxiogenic activity of Myristica fragrans seeds”, Pharmacology Biochemistry and Behavior, 71(1–2), pp.239–244
[41] Thuong, P T., Hung, T M., Khoi, N M., Nhung, H T M., Chinh, N T., Quy, N T., Jang, T S., & Na, M (2014), “Cytotoxic and anti-tumor activities of lignans from the seeds of Vietnamese nutmeg Myristica fragrans”, Archives of Pharmacal
[42] Takhtajan Armen (2009), Flowering plants, Springer, pp 918
[43] Woo, W S., Shin, K H., Wagner, H., & Lotter, H (1987), “The structure of macelignan from Myristica fragrans”, Phytochemistry, 26(5), pp.1542–1543 [44] Zhanga, C R., Jayashree, E., Kumar, P S., & Nair, M G (2015), “Antioxidant and Anti-inflammatory Compounds in Nutmeg (Myristica Fragrans) Pericarp as Determined by in vitro Assays”, Sage Journals, 10(8), pp.1399–1402
Phụ lục 1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-09 Phụ lục 2: Phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-09 Phụ lục 3: Phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-02 Phụ lục 4: Phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-02 Phụ lục 5: Phổ HSQC của hợp chất NĐK-02 Phụ lục 6: Phổ HMBC của hợp chất NĐK-02 Phụ lục 7: Phiếu kiểm nghiệm hạt Nhục đậu khấu
Phụ lục 1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-09
Phụ lục 2: Phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-09
Phụ lục 3: Phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-02
Phụ lục 4: Phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-02
Phụ lục 5: Phổ HSQC của hợp chất NĐK-02
Phụ lục 6: Phổ HMBC của hợp chất NĐK-02
Phụ lục 7: Phiếu kiểm nghiệm hạt Nhục đậu khấu