Gần đây, nhục đậu khấu đã cho thấy tiềm năng kháng biofilm của vi khuẩn trên thử nghiệm sàng lọc, do đó đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ hạt Nhục đậu khấu” đ
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Nhục đậu khấu
Vị trí phân loại của loài Myristica fragrans theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan [79]
Phân lớp Ngọc lan: Magnoliidae
Chi: Myristica Loài: Myristica fragrans Hiện nay, chi Myristica có khoảng 176 loài [65] được xác định trên toàn thế giới nhưng tập trung chủ yếu ở New Guinea với nhiều loài đặc hữu ở khu vực này [3], trong đó tại Việt Nam đến 2011 ghi nhận 4 loài là M fragrant Houtt.; M guatteriifolia A.DC.;
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố Nhục đậu khấu :
Nhục đậu khấu là một cây to, cao 8 – 10 m Toàn thân nhẵn, lá mọc so le, xanh tươi quanh năm, phiến lá hình mác rộng, dài 5 – 15 cm, rộng 3 – 7 cm, mép nguyên, cuống lá dài 7 – 12 mm Hoa khác gốc mọc thành xim ở kẽ lá, có dáng tán, hoa màu vàng trắng Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng, đường kính 5 – 8 cm, khi chín nở theo chiều dọc thành 2 mảnh, trong có một hạt có vỏ dày được bảo bọc bởi một áo hạt không kín, màu hồng [2] Hạt hình trứng hoặc hình bầu dục; dài 2 - 3 cm; đường kính 1,5 – 2,5 cm; mặt ngoài màu nâu tro hoặc vàng xám, có khi phủ phấn trắng, có rãnh dọc, mờ nhạt và nếp nhăn hình mạng lưới không đều Hạt có rốn ở đầu tù (rốn ở vị trí rễ mầm) là một điểm lồi tròn, màu nhạt; hợp điểm lõm và tối, noãn nhân dọc nối hai đầu hạt Ngoài cùng là lớp vỏ hạt rồi đến lớp ngoại nhũ sát lớp vỏ hạt Cây mầm nằm trong một khoang rộng, kết cấu cứng, mặt gãy có vân hoa đá màu vàng nâu, đầu tù; có thể thấy phôi nhăn, khô, nhiêu dầu, mùi thơm nồng, vị cay [1]
Cây nhục đậu khấu được trồng ở miền Nam Việt Nam, Campuchia, Indonesia, Malaysia, tây Ấn Độ, tỉnh Quảng Đông, miền nam Trung Quốc [2]
1.1.3 Bộ phận dùng: hạt, áo hạt, tinh dầu thường được sử dụng nhiều nhất [2], [8].
Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành phần hóa học của hạt Nhục đậu khấu
3 Hiện nay, các nghiên cứu về tính chất hoá học và tác dụng sinh học về hạt Nhục đậu khấu tại Việt Nam còn rất hạn chế, hầu hết các tài liệu đều được nghiên cứu ở nước ngoài
Hạt nhục đậu khấu cho thấy nhiều tiềm năng sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm nhờ vào sự đa dạng thành phần hoá học của nó, trong đó chủ yếu là: lignan, neolignan, diphenylalkan, flavonoid, terpen và một số thành phần khác:
Lignan là các hợp chất chủ yếu được phân lập từ hạt nhục đậu khấu với nhiều hoạt tính dược lý (chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tiểu cầu, kháng virus, …) Lignan là các dime của phenylpropanoid (C6 - C3) được liên kết bởi các nguyên tử C8 - C8’ ở nhánh bên; các dime tự nhiên có các liên kết khác với loại liên kết này được gọi là neolignan Cho đến nay, tổng cộng 21 lignan đã được xác định ở hạt nhục đậu khấu [28], [87] o Neolignan
Neolignan cũng là thành phần chính của hạt nhục đậu khấu, khoảng 44 hợp chất neolignan đã được phân lập từ hạt nhục đậu khấu, trong đó có hai neolignan mới được phân lập năm 2023 bởi Nguyễn Việt Phong và cộng sự [54]
Khoảng 38,6% là neolignan benzofuranoid; 59,1% là 8-O-4' neolignan (8-O-4' Diarylpropanoid) và 2,3% là neolignan diphennylpropanoid [28], [54], [62]
Có sáu diphenylalkan đã được xác định có trong hạt nhục đậu khấu [28] Trong số đó, malabaricon C được biết đến là hợp chất có hoạt tính oxy hoá khử mạnh và nhiều tác dụng sinh học [61] Gần đây, tetramethylhexestrol đã được phân lập từ hạt nhục đậu khấu [21]
Phenylpropanoid là một trong những thành phần chính (15 ‒ 20%) của tinh dầu hạt nhục đậu khấu, trong đó myristicin, elemicin, eugenol và safrol là các hợp chất sơ cấp được phân lập từ sớm [18], [34]; bốn dẫn xuất propanediol cũng được phân lập từ hạt Nhục đậu khấu năm 2009 [19]
Hydrocacbon terpen và các dẫn xuất của chúng là thành phần của tinh dầu và nhựa dầu chiết xuất từ hạt và quả nhục đậu khấu [18], [34] Một số hydrocacbon terpen: α- pinen, β-pinen, sabinen, camphen, terpinen-4-ol, limonen, dẫn xuất terpen khác cũng được báo cáo là thành phần chính của tinh dầu hạt nhục đậu khấu [34]
• Axit béo, este chất béo
Chất béo trong hạt nhục đậu khấu thường được gọi là trimyristin, bao gồm cả chất béo bão hoà và chất béo không bão hoà, và chiếm khoảng 28-34% trong thành phần của hạt, trong đó axit myristic là thành phần chủ yếu, rồi đến axit palmitic, axit lauric [46], [18], [38], năm axit béo: axit lauric, axit myristic, axit palmitic, axit stearic và axit pet- roselinic đã được phát hiện bằng GC–MS (phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ) [55]
Dịch chiết diclomethan của hạt cho thấy sự xuất hiện của các axit béo và este của axit béo như methyl pentadecanoic este, methyl 10-octadecenoic este, methyl 9- hexadecenoic este [6]
Steroid và saponin cũng có mặt trong hạt nhục đậu khấu tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu phân lập được các hợp chất thuộc nhóm này, trong đó steroid (β-sitosterol), saponin (daucosterol) đã được xác định [20], [21], [31]
Hơn nữa, campesterol và 5-avenasterol cũng được xác định có trong dầu hạt nhục đậu khấu và nghiên cứu còn chỉ ra việc chiết xuất nhanh dưới áp suất cao cho hàm lượng sterol cao hơn chiết soxhlet, và nhiệt độ càng cao thì hiệu suất càng lớn [56]
Ngoài ra, flavonoid (3',4',7 - trihydroxyflavon) đã được tìm thấy trong hạt của nhục đậu khấu [22], quercetin trong dịch chiết ethanol của hạt cũng được nghiên cứu tiềm năng chống viêm [17] Phổ MS/MS (phương pháp khối phổ nâng cao) cũng cho thấy sự hiện diện của catechin, apigenin và naringenin trong dịch chiết [81]
• Một số hợp chất khác
Một số thành phần khác cũng được báo cáo là có từ nhục đậu khấu như axit 3- methyl-5-pentyl-furylarylic từ hạt [40]
Hạt nhục đậu khấu được phát hiện có chứa axit amin bao gồm cả axit amin thiết yếu như leucin, lysin, phenylalanin, threonin, valin, isoleucin, histidin, methionin và axit amin không thiết yếu như axit glutamic, arginin, axit aspartic, tyrosin, glycin, serin, cystein [6]
Hơn nữa, Olaleye và cộng sự đã khảo sát các hợp chất tự nhiên từ dịch chiết nước của hạt nhục đậu khấu, và chỉ ra sự xuất hiện của alkaloid, anthraquinon, glycosid, phlobatanin, saponin và flavonoid mà không có sự xuất hiện của tanin [57]
Một số thành phần hoá học được tổng hợp trong bảng 1.1
Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong Myristica fragrans
STT Tên hợp chất Công thức hóa học TLTK
Axit béo và este axit béo
Một số hợp chất khác
Hạt nhục đậu khấu đã cho thấy nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng khi được sử dụng như một bài thuốc trong y học cổ truyển từ lâu Cho tới nay đã và đang có nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu sâu hơn về tác dụng sinh học và cơ chế hoạt động của những hợp chất phân lập được từ hạt nhục đậu khấu
1.2.2.1 Tác dụng kháng viêm và giảm đau:
Một số nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện của NO (nitric oxit) gây ra độc tính trên tế bào, xuất hiện trong phản ứng viêm và có thể gây tổn thương mô Quá trình sản xuất
NO là hiện tượng điển hình diễn ra trong đại thực bào bị hoạt hoá bởi LPS (lipopolysaccharid) [11], [84]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Nhục đậu khấu được sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ Trung Quốc, nhập khẩu bởi công ty TNHH Đông Dược Tân Lợi Nhục đậu khấu đạt các chỉ tiêu chất lượng của Dược điển Trung Quốc 2015 bộ 1, bộ 4 (Phụ lục 2) (Hình 2.1)
Hình 2.1: Hình ảnh hạt Nhục đậu khấu
Nguyên liệu
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
5 Ethyl acetat Trung Quốc DĐVN V
8 Axit sulfuric 10% Trung Quốc DĐVN V
• Cột sắc kí với đường kính 7 cm, 2,5 cm, 2 cm, 1,5 cm
• Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck), TLC Silica gel 60 RP-18 F₂₅₄s (Merck)
• Chất hấp phụ: silica gel
• Dụng cụ thủy tinh: Cốc có mỏ, pipet, phễu, buret, ống nghiệm, ống đong dung tích: 500 mL, 250 mL, 50 mL, 25 mL, 10 mL, bình cầu dung tích: 1 L, 500 mL,
100 mL, 50 mL, 25 mL, bình nón, đũa thuỷ tinh
• Quả bóp cao su, giá đỡ cột sắc ký, khay đựng ống nghiệm, micropipette, kẹp
• Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thụy Sĩ)
• Máy cất quay BUCHI Toledo AB204S (Thụy Sĩ)
• Máy siêu âm Elmasonic (Đức)
• Buồng soi đèn UV bước sóng 365nm/254nm
• Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam: Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ).
Nội dung nghiên cứu
• Chiết xuất cao chiết EtOH toàn phần và các cao chiết phân đoạn từ hạt nhục đậu khấu
• Phân lập một số hợp chất từ cao chiết phân đoạn của hạt nhục đậu khấu
• Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp ngâm nóng 60°C, chiết 3 lần với dung môi là EtOH 96%, tỉ lệ DM:DL lần lượt: 10:1; 8:1; 6:1 (v/v), lọc và gộp dịch cô rồi cất thu hồi dung môi lấy cắn chiết, thu được cao đặc EtOH Sau đó, cắn chiết được phân tán vào nước rồi chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: CH2Cl2 và EtOAc các phân đoạn dịch chiết thu được đem cô lấy cắn
2.4.2 Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của hợp chất hóa học:
Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường hoặc pha đảo kết hợp sắc ký lớp mỏng (TLC) Theo dõi các phân đoạn bằng TLC silicagel F254 và TLC silica gel 60 RP-18 F254S, phát hiện chất bằng đèn tử ngoại dưới bức xạ UV 254nm và dùng thuốc thử axit sulfuric 10%, sấy nóng để hiện màu.
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), kết hợp so sánh tài liệu tham khảo
• Hấp phụ bằng silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp
• Sắc ký cột pha thuận với pha tĩnh là silica gel có nhóm hydroxyl tự do có khả năng tạo liên kết hydro để tách các hợp chất có độ phân cực khác nhau: chất ít phân cực được ly giải ra trước, chất phân cực ly giải ra sau
Các bước tiến hành sắc ký cột:
• Lựa chọn pha tĩnh: Silica gel (Merck)
• Dung môi rửa giải (pha động): hệ dung môi được kết hợp từ n-hexan, diclomethan, aceton, ethyl acetat, methanol và nước theo tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát qua sắc ký lớp mỏng
• Chuẩn bị cột sắc ký: chọn cột có đường kính và chiều dài phù hợp lượng mẫu đưa lên cột, có khoá chắc chắn tránh rò cột, rửa và tráng cột bằng ethanol, để khô và cố định trên giá Lót một lượng bông vừa đủ vào cột tránh silica chảy ra trong quá trình chạy cột
• Đối với lượng chất nhiều, một phần không tan trong dung môi rửa giải
• Cho mẫu vào bình cầu, thêm một lượng dung môi trung gian vừa đủ hoà tan mẫu Thêm lượng silica gấp khoảng 1,5 – 2 lần lượng mẫu vào mẫu Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không, kết hợp làm tơi trong quá trình cô quay để mẫu được khô tơi
• Đối với mẫu hoà tan hoàn toàn trong dung môi rửa giải, chạy tách chất sạch
• Mẫu được hoà tan trong lượng dung môi rửa giải tối thiểu
• Nhồi cột: cho lượng silica vừa đủ với cột (tạo chiều dài pha tĩnh thích hợp) vào cốc có mỏ, thêm dung môi chạy cột vào, khuấy đều cho hết bọt khí Đổ hỗn hợp vào cột đã chuẩn bị, mở van, rót tiếp dung môi để cột hết bọt khí và ổn định Giữ lại một ít dung môi để cột không bị khô trước khi khoá cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột
1 Mẫu khô: Cho mẫu đã tẩm silica vào cột, tráng bình cầu bằng dung môi rửa giải rồi cho dịch vào cột
2 Mẫu ướt: cho mẫu được hoà tan trong lượng tối thiểu dung môi vào cột
Mở van khi nạp mẫu, có thể dùng quả bóp cao su gõ nhẹ vào thành cột để dàn đều chất, chờ cho lượng dung môi chảy gần hết, thêm bông vào để tránh dung môi thêm vào tiếp làm xáo trộn bề mặt
• Rửa giải: cho hệ dung môi đã chọn vào cột và bổ sung liên tục tránh làm khô cột
• Thu dịch: hứng dịch rửa giải vào các lọ/ống nghiệm với thể tích phù hợp phân đoạn
• Sử dụng sắc ký lớp mỏng TLC pha thuận và pha đảo để gộp phân đoạn và xác định chất sạch
2.4.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sử dụng bản mỏng để khảo sát hệ dung môi pha động phù hợp và theo dõi quá trình rửa giải
Nguyên tắc: hấp phụ bằng silica gel F254 hoặc silica gel RP-18 F254S, giải hấp phụ bằng hệ dung môi phù hợp
• Lựa chọn bản mỏng: pha thuận silica gel F254 (Merck), hoặc pha đảo RP-18 F254S
• Hoạt hoá bản mỏng trong tủ sấy khoảng 10 phút
• Đưa mẫu lên bản mỏng: hoà tan mẫu thử trong dung môi thích hợp, dùng mao quản để chấm dịch lên bản mỏng
• Chuẩn bị dung môi pha động: hệ dung môi thích hợp cho vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín để bão hoà dung môi 5-10 phút trước khi chạy
• Triển khai sắc ký: đặt bản mỏng vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín, để yên và quan sát Khi dung môi chạy gần mép bản mỏng thì lấy bản mỏng ra, chờ cho khô dung môi, có thể dùng máy sấy để sấy khô
• Sử dụng đèn UV 254nm để xác định vết, hiện màu bằng axit sulfuric 10%, dùng máy khò để sấy nóng từ từ quan sát vết
2.4.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử hợp chất:
Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, kết hợp so sánh các dữ liệu thực nghiệm của các tài liệu công bố trước đó để xác định cấu trúc phân tử hợp chất tinh chế được
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần và các dịch chiết phân đoạn
Hạt Nhục đậu khấu sau khi thu hái được rửa sạch, sấy khô sau đó xay nhỏ Lấy 2 kg dược liệu chiết với ethanol 96% bằng phương pháp chiết ngâm nóng 60°C, chiết 3 lần, tỉ lệ DM:DL lần lượt: 10:1, 8:1, 6:1 (v/v) trong thời gian 6 giờ với mỗi tỷ lệ, sau đó lọc dịch chiết thu được qua bông, thu và gộp dịch chiết tiến hành cô dưới áp suất giảm ở 50 o C cho đến khi thu được 110 g cao đặc ethanol toàn phần
Phân tán cao đặc thu được vào một lượng nước tối thiểu, sau đó chiết phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần là CH2Cl2, EtOAc, mỗi dung môi chiết 1500 mL/lần x 3 lần, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được
52 g cao chiết CH2Cl2, 15 g cao chiết EtOAc, và 25 g cao chiết nước.
Quy trình chiết Nhục đậu khấu được trình bày cụ thể trong sơ đồ 3.1:
Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất hạt Nhục đậu khấu
Hạt nhục đậu khấu (2,0 kg)
Ngâm nóng 60°C Ethanol 96%, Chiết 3 lần
Tỷ lệ DM:DL: 10:1; 8:1; 6:1 (v/v) Lọc, gộp dịch rồi cô loại dung môi
Phân tán cao chiết tổng vào nước Chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần
Cao chiết phân đoạn CH 2 Cl 2
Cao chiết phân đoạn EtOAc (15 g)
Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập hợp chất NĐK-1 và NĐK-2
Phân đoạn EtOAc (15 g) phân lập qua cột sắc ký pha thuận (7x64 cm) sử dụng pha tĩnh là silica gel, pha động là hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với tỷ lệ lần lượt 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:1 (v/v) x 500 mL/tỷ lệ thu được 5 phân đoạn (A-E)
Phân đoạn A (1,25 g) tiếp tục được phân lập qua cột sắc ký pha thuận (2x70 cm) sử dụng pha tĩnh là silica gel, pha động là n-hexan:EtOAc (5:1 v/v) thu được hợp chất 1 ký hiệu là NĐK-1 (10 mg)
Phân đoạn C (5,5 g) tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột pha thuận (2,5x70cm) sử dụng pha tĩnh là silica gel, pha động là hệ n-hexan:Aceton (1:1 v/v) thu được 5 phân đoạn C1-C5 Sử dụng cột sắc ký pha thuận (2x70 cm) và hệ dung môi n-hexan:EtOAc (3:2 v/v) để phân lập tiếp phân đoạn C2 (3,9 g) thu được 5 phân đoạn C2.1-C2.5 Từ phân đoạn C2.5 (330 mg) phân lập qua cột sắc ký pha thuận (1,5x70 cm) với hệ dung
20 môi n-hexan:Aceton:Methanol (2:1:0,1 v/v/v), thu được hợp chất 2 ký hiệu NĐK-2 (7 mg)
Hợp chất NĐK-1 là chất rắn vô định hình màu trắng
Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-1 cho thấy các tín hiệu hấp thụ ở vùng trường thấp của hai proton vòng thơm là δ H [6,37 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-6') và 6,41 (1H, br s, H-2')], cùng với giá trị của hằng số tương tác J = 1,2 Hz cho phép xác định được vị trí của hai proton trên vòng thơm ở vị trí meta Bên cạnh đó tín hiệu hấp thụ của ba proton ethenyl cũng được ghi nhận tại δ H [5,94 (1H, m, H-2) và 5,05 (2H, m, H-3)] Ngoài ra, một nhóm dioxymethylen, một nhóm methoxy và một nhóm methylen đã được phát hiện với độ dịch chuyển hóa học lần lượt tương ứng là δ H [5,89 (2H, s); 3,87 (3H, s) và 3,29 (2H, d, J = 6,6 Hz, H-1)]
Hình 3.1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-1
Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-1 thu được 9 tín hiệu cacbon có độ dịch chuyển hóa học là δ C [41,1 (C-1); 139,0 (C-2); 115,9 (C-3); 134,9 (C-1'); 109,6 (C-2'); 144,9 (C-3'); 136,0 (C-4'); 150,4 (C-5'); 103,6 (C-6')]; một cacbon dioxymethylen tại δ C
102,3; một cacbon methoxy tại δ C 57,3 (3'-OCH3)
Từ độ dịch chuyển hóa học tại trường thấp của nhân thơm tại δ C [136,0 (C-4') và 150,4 (C-5')] xác định được vị trí gắn của nhóm dioxymethylen tại vị trí 4' và 5' tạo thành vòng 1,3-benzodioxol
21 Ngoài ra, độ dịch chuyển hóa học cacbon tại δ C 144,9 (C-3') xác định được vị trí gắn nhóm methoxy Kết hợp với dữ liệu phổ 1 H-NMR cùng với phân tích dữ liệu phổ
13C-NMR, vị trí của nhóm methylen tại δ C 41,1 (C-1) được xác định gắn với carbon C- 1' tại δ C 134,9 và nhóm ethynyl tại δ C [139,0 (C-2) và 115,9 (C-3)]
Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp với so sánh tài liệu đối chiếu tham khảo, hợp chất NĐK-1 được xác định là Myristicin [90] (Xem hình 3.1, hình 3.2 và bảng 3.1)
Hình 3.2: Phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-1
Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất NĐK-1 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất NĐK-1
NĐK-1 Myristicin [90] δ H ab (độ bội, J (Hz)) δ C ac δ H de (độ bội, J (Hz)) δ C df
3'-OCH3 3,87 (3H, s) 57,3 3,91 (3H, s) 56,6 a : Methanol - d4; b : 600 MHz; c : 150 MHz; d : CDCl3; e : 500 MHz; f : 125 MHz; δ (ppm)
Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-2
Trên phổ 1 H-NMR của hợp chất NĐK-2 thu được tín hiệu hấp thụ của 5 proton thơm ở vùng trường thấp là δ H [7,61 (2H, m, H-4,8) và 7,46 (3H, m, H-5,6,7)] chứng tỏ sự xuất hiện của một vòng benzen thế ở 1 vị trí Một tín hiệu đơn tại δ H 6,06 (1H, s) được xác định là proton của nhóm oxymethin (H-2)
23 Bên cạnh đó, phổ 1 H-NMR cho thấy sự có mặt của một cấu tử đường glucose với tín hiệu của anomeric proton tại δ H 4,70 (1H, d, J = 7,2 Hz, H-1'), sáu proton carbinol tại δ H [3,27 – 3,47 (4H, m, H-2',3',4',5'); 3,96 (1H, dd, J 1 = 2,4 Hz, J 2 = 12,0 Hz, H-6'a) và 3,71 (1H, dd, J 1 = 6,6 Hz, J 2 = 12,0 Hz, H-6'b)] Với tín hiệu đặc trưng của proton anomeric có giá trị hằng số tương tác J = 7,2 Hz cho phép xác định cấu hình của đường tại C-1' là β
Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-2
Trên phổ 13 C-NMR của hợp chất NĐK-2 thu được 12 tín hiệu cacbon bao gồm: 6 tín hiệu cacbon ở trường thấp đặc trưng cho cấu trúc nhóm phenyl tại δ C [135,2 (C-3); 128,7 (C-4,8); 129,9 (C-5,7) và 130,7 (C-6)] và 6 tín hiệu cacbon trên phổ có độ dịch chuyển hoá học δ C [102,1 (C-1'); 74,7 (C-2'); 77,9 (C-3'); 71,5 (C-4'); 78,6 (C-5') và 62,8 (C-6')] đặc trưng cho cấu trúc của đường D – glucopyranosid Phân tích các chuyển dịch hóa học của cacbon kết hợp với dữ liệu phổ 1 H-NMR cho phép xác định nhóm cyanohydrin tại δ C [118,5 (C-1); 68,5 (C-2)]
Cấu hình tuyệt đối tại vị trí C-2 được xác định dựa trên cơ sở so sánh tín hiệu hấp thụ proton anomeric (H-1') do hiệu ứng không gian, tín hiệu hấp thụ proton và độ dịch chuyển hóa học cacbon tại C-2 của hai hợp chất prunasin [2R - δ H 4,69 (H-1'); δ H 6,04 (H-2); δ C 68,4 (C-2)] và sambunigrin [2S - δ H 4,26 (H-1'); δ H 5,91 (H-2); δ C 68,3 (C-2)] cho phép xác định cấu hình 2R của NĐK-2 Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp so sánh đối chiếu với tài liệu tham khảo, hợp chất NĐK-2 được xác định là prunasin [77]
Hình 3.6: Cấu trúc hóa học của NĐK-2 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1 H và 13 C -NMR của hợp chất NĐK-2
NĐK-2 Prunasin [77] Sambunigrin [77] δ H ab (độ bội, J
(Hz)) δ C ac δ H ad (độ bội, J
(Hz)) δ C ae δ H ad (độ bội, J
3,69 (1H, dd, 5,6; 12,0) a : Methanol - d4; b : 600 MHz; c : 150 MHz; d : 400 MHz; e : 100 MHz; δ (ppm)
Trong nghiên cứu này bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thuận kết hợp với sắc ký lớp mỏng đã phân lập được hợp chất NĐK-1, NĐK-2 Qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất và so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trong các tài liệu tham khảo có thể kết luận NĐK-1 là Myristicin và NĐK-
Hợp chất myristicin được phân lập từ hạt nhục đậu khấu lần đầu tiên vào năm 1903 bởi Wallace G.B [85], và đã có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học và tiềm năng ứng dụng Trong khi đó, prunasin đã được phân lập trước đây nhưng chủ yếu từ hạt, lá, và thân chi Prunus, đây là lần đầu tiên prunasin được phân lập từ hạt nhục đậu khấu
Hình 4.1: Cấu trúc hoá học của 2 hợp chất phân lập được từ hạt nhục đậu khấu 4.1 Myristicin:
Myristicin là một phenylpropanoid thực vật đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra các hoạt tính sinh học có lợi và tiềm năng ứng dụng trong điều trị
Myristicin cũng cho thấy khả năng kháng nấm khi thực hiện nghiên cứu trên hai loại nấm: Aspergillus flavus và Aspergillus ochraceus Kết quả cho thấy khả năng kháng hai loại nấm khá tương đồng giữa tinh dầu nhục đậu khấu thô, phân đoạn có hoạt tính được phân lập, myristicin được phân lập riêng và myristicin chuẩn đều ở nồng độ khoảng 0,1-0,3% bằng PFA (Xét nghiệm thực phẩm độc hại) Từ đây có thể xác định myristicin là chất kháng nấm chính trong tinh dầu của hạt nhục đậu khấu [82]
Hơn nữa, myristicin (phân lập từ Clausena anisum-olens Blanco) cũng cho thấy khả năng gây độc chống lại loài Lasioderma serricorne và Liposcelis bostrychophila
(LD50 lần lượt là 18,96 và 20,41 μg/mỗi cá thể) Tuy nhiên tinh dầu thô (kết hợp nhiều hoạt chất) cho thấy khả năng chống côn trùng mạnh hơn với LD50 lần lượt là 12,44 và 74,46 μg/1 con Từ đây có thể đưa ra đánh giá myristicin có khả năng gây độc cho Li bostrychophila [90]