trần thị khánh huyền nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ hạt nhục đậu khấu

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên cho em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Bùi Thị Thúy

Luyện đã dành thời gian, tâm huyết, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên em trong

suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, kỹ thuật viên của Bộ môn Kỹ thuật Hoá

dược và Chiết xuất Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực nghiệm

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu và các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên K74: Nguyễn Thị Lan Anh, Thiều Thị Minh Dung, Nguyễn Thị Thơm, em H1K1 Phạm Đăng Nguyên cùng thực hiện đề tài tại Bộ môn và các em sinh viên khoá 75 đã luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên em trong quá trình thực hiện đề tài

Và em cũng xin gửi lời cảm ơn thân thương đến gia đình, bạn Dương Thị Hoàng Anh, các bạn, các anh chị những người đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu, hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Dù em đã có nhiều cố gắng nhưng đề tài không tránh khỏi những thiếu sót Kính mong nhận được sự chia sẻ và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 108.06-2021.31

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Trần Thị Khánh Huyền

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2.4 Công dụng của hạt Nhục đậu khấu trong y học cổ truyền ……… 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu ……….14

2.2 Nguyên liệu ……… 14

2.2.1 Hóa chất ………14

2.2.2 Dụng cụ ……….14

2.2.3 Thiết bị ……… 15

2.3 Nội dung nghiên cứu ……… 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu ……… 15

2.4.1 Phương pháp chiết xuất ………15

2.4.2 Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của hợp chất hóa học ……… 16

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ……….18

3.1 Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần và các dịch chiết phân đoạn …… 18

3.2 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ………19

3.3.1 Hợp chất NĐK-1 ……….20

3.3.2 Hợp chất NĐK-2 ……….22

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ……… 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………28 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng anh Tiếng Việt

13NMR

C-Carbon 13 Nuclear magnetic

cho 50% đối tượng thử nghiệm EGFR Epidermal growth factor receptor Thụ thể của yếu tố tăng trưởng

biểu bì

MAPK Mitogen-activated protein kinase Protein kinase hoạt hoá bởi

mitogen

MS Mass Spectrometry Phương pháp khối phổ

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

diphenyl tetrazolium bromid

carbon

proton

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 Công dụng của hạt nhục đậu khấu trong y học cổ truyền 13

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gần đây, nguyên liệu sản xuất thuốc có nguồn gốc tự nhiên đang thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu cũng như người tiêu dùng, từ đó, nhiều nghiên cứu đã được triển khai để tìm hoạt chất tiềm năng trong nhiều loài thực vật Đặc biệt là sự đẩy mạnh nghiên cứu về những loài dược liệu có sẵn, đã được ứng dụng nhiều trong y học cổ truyền

Myristica fragrans (Houtt.) thuộc họ Myristicaceae thường được gọi là cây nhục

đậu khấu, đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới đẩy mạnh nghiên cứu về những hoạt tính sinh học tiềm năng [2] Toàn bộ các bộ phận của quả chín như vỏ, áo hạt, hạt nhục đậu khấu đều được biết đến với hương vị và mùi thơm và từ lâu đã được sử dụng như một vị thuốc dùng để kích thích tiêu hoá, điều trị sốt rét [2], dầu từ hạt và áo hạt nhục đậu khấu có thể làm nhẹ tình trạng bong gân, thấp khớp và tê liệt, cầm tiêu chảy, chống viêm, bảo vệ gan [15], [78]

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng hạt nhục đậu khấu chứa nhiều hợp chất khác như lignan, neolignan, diphenylalkan, phenylpropanoid và terpenoid, có nhiều hoạt tính sinh học có lợi [28] Một số tiềm năng ứng dụng như trong phòng và điều trị bệnh nhiễm khuẩn [58], bệnh mạn tính: cao huyết áp, đái tháo đường [53], [75] hay hỗ trợ trong điều trị ung thư [49], [60], tuy nhiên tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như tác dụng dược lý của nhục đậu khấu Gần đây, nhục đậu khấu đã cho thấy tiềm năng kháng biofilm của vi khuẩn trên thử nghiệm sàng lọc,

do đó đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ hạt Nhục đậu

khấu” được thực hiện nhằm tạo bước đầu để tìm ra hoạt chất có tác dụng kháng biofilm

với các mục tiêu cụ thể sau: - Chiết xuất dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn hạt Nhục đậu khấu - Phân lập một số hợp chất từ dịch chiết phân đoạn hạt Nhục đậu khấu - Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được

nhưng tập trung chủ yếu ở New Guinea với nhiều loài đặc hữu ở khu vực này [3], trong

đó tại Việt Nam đến 2011 ghi nhận 4 loài là M fragrant Houtt.; M guatteriifolia A.DC.;

M iners Blume; M yunnanensis Y.H Li [3]

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố Nhục đậu khấu:

Nhục đậu khấu là một cây to, cao 8 – 10 m Toàn thân nhẵn, lá mọc so le, xanh tươi quanh năm, phiến lá hình mác rộng, dài 5 – 15 cm, rộng 3 – 7 cm, mép nguyên, cuống lá dài 7 – 12 mm Hoa khác gốc mọc thành xim ở kẽ lá, có dáng tán, hoa màu vàng trắng Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng, đường kính 5 – 8 cm, khi chín nở theo chiều dọc thành 2 mảnh, trong có một hạt có vỏ dày được bảo bọc bởi một áo hạt không kín, màu hồng [2] Hạt hình trứng hoặc hình bầu dục; dài 2 - 3 cm; đường kính 1,5 – 2,5 cm; mặt ngoài màu nâu tro hoặc vàng xám, có khi phủ phấn trắng, có rãnh dọc, mờ nhạt và nếp nhăn hình mạng lưới không đều Hạt có rốn ở đầu tù (rốn ở vị trí rễ mầm) là một điểm lồi tròn, màu nhạt; hợp điểm lõm và tối, noãn nhân dọc nối hai đầu hạt Ngoài cùng là lớp vỏ hạt rồi đến lớp ngoại nhũ sát lớp vỏ hạt Cây mầm nằm trong một khoang rộng, kết cấu cứng, mặt gãy có vân hoa đá màu vàng nâu, đầu tù; có thể thấy phôi nhăn, khô, nhiêu dầu, mùi thơm nồng, vị cay [1]

Cây nhục đậu khấu được trồng ở miền Nam Việt Nam, Campuchia, Indonesia, Malaysia, tây Ấn Độ, tỉnh Quảng Đông, miền nam Trung Quốc [2]

1.1.3 Bộ phận dùng: hạt, áo hạt, tinh dầu thường được sử dụng nhiều nhất [2], [8]

1.2 Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành phần hóa học của hạt

Myristica fragrans Houtt

3

Hiện nay, các nghiên cứu về tính chất hoá học và tác dụng sinh học về hạt Nhục đậu khấu tại Việt Nam còn rất hạn chế, hầu hết các tài liệu đều được nghiên cứu ở nước ngoài

1.2.1 Thành phần hóa học:

Hạt nhục đậu khấu cho thấy nhiều tiềm năng sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm nhờ vào sự đa dạng thành phần hoá học của nó, trong đó chủ yếu là: lignan, neolignan, diphenylalkan, flavonoid, terpen và một số thành phần khác:

• Lignan

o Lignan

Lignan là các hợp chất chủ yếu được phân lập từ hạt nhục đậu khấu với nhiều hoạt tính dược lý (chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tiểu cầu, kháng virus, …) Lignan là các dime của phenylpropanoid (C6 - C3) được liên kết bởi các nguyên tử C8 - C8’ ở nhánh bên; các dime tự nhiên có các liên kết khác với loại liên kết này được gọi là neolignan Cho đến nay, tổng cộng 21 lignan đã được xác định ở hạt nhục đậu khấu [28], [87]

o Neolignan

Neolignan cũng là thành phần chính của hạt nhục đậu khấu, khoảng 44 hợp chất neolignan đã được phân lập từ hạt nhục đậu khấu, trong đó có hai neolignan mới được phân lập năm 2023 bởi Nguyễn Việt Phong và cộng sự [54]

Khoảng 38,6% là neolignan benzofuranoid; 59,1% là 8-O-4' neolignan (8-O-4' Diarylpropanoid) và 2,3% là neolignan diphennylpropanoid [28], [54], [62]

• Diphenylalkan

Có sáu diphenylalkan đã được xác định có trong hạt nhục đậu khấu [28] Trong số đó, malabaricon C được biết đến là hợp chất có hoạt tính oxy hoá khử mạnh và nhiều tác dụng sinh học [61] Gần đây, tetramethylhexestrol đã được phân lập từ hạt nhục đậu khấu [21]

• Phenylpropanoid

Phenylpropanoid là một trong những thành phần chính (15 ‒ 20%) của tinh dầu hạt nhục đậu khấu, trong đó myristicin, elemicin, eugenol và safrol là các hợp chất sơ cấp được phân lập từ sớm [18], [34]; bốn dẫn xuất propanediol cũng được phân lập từ hạt Nhục đậu khấu năm 2009 [19]

• Terpen và dẫn chất

Hydrocacbon terpen và các dẫn xuất của chúng là thành phần của tinh dầu và nhựa

dầu chiết xuất từ hạt và quả nhục đậu khấu [18], [34] Một số hydrocacbon terpen: pinen, β-pinen, sabinen, camphen, terpinen-4-ol, limonen, dẫn xuất terpen khác cũng

α-được báo cáo là thành phần chính của tinh dầu hạt nhục đậu khấu [34]

4

• Axit béo, este chất béo

Chất béo trong hạt nhục đậu khấu thường được gọi là trimyristin, bao gồm cả chất béo bão hoà và chất béo không bão hoà, và chiếm khoảng 28-34% trong thành phần của hạt, trong đó axit myristic là thành phần chủ yếu, rồi đến axit palmitic, axit lauric [46], [18], [38], năm axit béo: axit lauric, axit myristic, axit palmitic, axit stearic và axit pet-roselinic đã được phát hiện bằng GC–MS (phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ) [55]

Dịch chiết diclomethan của hạt cho thấy sự xuất hiện của các axit béo và este của axit béo như methyl pentadecanoic este, methyl 10-octadecenoic este, methyl 9-hexadecenoic este [6]

• Steroid, saponin và flavonoid

Steroid và saponin cũng có mặt trong hạt nhục đậu khấu tuy nhiên chưa có nhiều

nghiên cứu phân lập được các hợp chất thuộc nhóm này, trong đó steroid (β-sitosterol),

saponin (daucosterol) đã được xác định [20], [21], [31] Hơn nữa, campesterol và 5-avenasterol cũng được xác định có trong dầu hạt nhục đậu khấu và nghiên cứu còn chỉ ra việc chiết xuất nhanh dưới áp suất cao cho hàm lượng sterol cao hơn chiết soxhlet, và nhiệt độ càng cao thì hiệu suất càng lớn [56]

Ngoài ra, flavonoid (3',4',7 - trihydroxyflavon) đã được tìm thấy trong hạt của nhục đậu khấu [22], quercetin trong dịch chiết ethanol của hạt cũng được nghiên cứu tiềm năng chống viêm [17] Phổ MS/MS (phương pháp khối phổ nâng cao) cũng cho thấy sự hiện diện của catechin, apigenin và naringenin trong dịch chiết [81]

Hơn nữa, Olaleye và cộng sự đã khảo sát các hợp chất tự nhiên từ dịch chiết nước của hạt nhục đậu khấu, và chỉ ra sự xuất hiện của alkaloid, anthraquinon, glycosid, phlobatanin, saponin và flavonoid mà không có sự xuất hiện của tanin [57]

Một số thành phần hoá học được tổng hợp trong bảng 1.1

5

Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong Myristica fragrans

STT Tên hợp chất Công thức hóa học TLTK

1.2.2.1 Tác dụng kháng viêm và giảm đau:

Một số nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện của NO (nitric oxit) gây ra độc tính trên tế bào, xuất hiện trong phản ứng viêm và có thể gây tổn thương mô Quá trình sản xuất NO là hiện tượng điển hình diễn ra trong đại thực bào bị hoạt hoá bởi LPS (lipopolysaccharid) [11], [84]

8

Macelignan có tiềm năng ngăn chặn sự biểu hiện của COX-2 (cyclooxygenase-2) và enzym cảm ứng iNOS (nitric oxit synthase), sự biểu hiện quá mức của hai yếu tố này có liên quan đến phản ứng viêm dây thần kinh [48] Ngoài ra, macelignan còn có thể

ngăn chặn đáng kể việc sản xuất TNF-α và interleukin-6 (IL-6) [36]

Myrislignan làm giảm phản ứng viêm do LPS gây ra trong các đại thực bào bằng cách ức chế NO và ức chế sản xuất các cytokine gây viêm; ức chế sự biểu hiện gen và protein của iNOS và COX-2 Trong nghiên cứu về hoạt tính chống viêm của neolignan ở nhục đậu khấu của Cao và cộng sự, sáu loại neolignan benzofuranoid và tám loại

neolignan 8-O-4' đã chứng minh sự ức chế sản xuất oxit nitric trong đại thực bào đơn

nhân RAW264.7 bị hoạt hoá bởi lipopolysaccharid trên chuột [12], [13] Malabaricon C cũng thể hiện khả năng ức chế mạnh lên quá trình sản xuất NO ở trong đại thực bào RAW264.7 bị hoạt hoá bởi LPS Malabaricon C ở nồng độ 0,1 – 10 μM thể hiện hoạt tính làm giảm mức độ biểu hiện của COX-2 và iNOS do LPS gây ra

(cường độ tác dụng phụ thuộc liều lượng), nhưng không làm thay đổi biểu hiện α-tubulin

[80] Flavonoid trong hạt nhục đậu khấu cũng được chứng minh có khả năng chống viêm với thử nghiệm làm bền màng tế bào hồng cầu khi so sánh với Ibuprofen [5]

1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa:

Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết xuất hoặc chất phân lập từ nhục đậu khấu được nghiên cứu và đánh giá bằng nhiều thử nghiệm khác nhau: ước tính tổng nồng độ phenolic; khả năng loại bỏ gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH); ức chế peroxid hóa lipid (LPO); khả năng tạo phức với các ion sắt (II); khả năng khử sắt của huyết tương (FRAP) [26], [38], [91]

Các dịch chiết aceton, ethanol, metanol, butanol và nước của hạt nhục đậu khấu đều cho thấy hoạt động chống oxy hóa đáng kể chống lại vi sinh vật, trong đó dịch chiết aceton thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất [26]

Malabaricon C cho thấy hoạt tính bắt gốc tự do mạnh mẽ chống lại DPPH (IC50 = 6,56 μg/ml) so với đối chứng dương tính axit ascorbic (IC50 = 5,76 μg/ml) [69] Axit

meso-dihydroguaiaretic thể hiện khả năng chống oxy hóa lipoprotein trọng lượng thấp

(LDL) mạnh mẽ với giá trị IC50 = 2,6 μM trong xét nghiệm TBARS (Chất phản ứng với Axit Thiobarbituric) [43]

Malabaricon B và malabaricon C đều cho thấy tiềm năng chống lại loét dạ dày do indomethacin gây ra trên chuột, do chúng có hoạt tính chống oxy hoá cùng với khả năng điều hoà tiết chất nhầy, tổng hợp prostagladin và sự biểu hiện của thụ thể EGF Ngoài ra, nghiên cứu còn chỉ ra rằng malabaricon C không gây ra độc tính với liều dưới 500 mg/kg cân nặng, có tiềm năng phát triển trở thành hoạt chất chống loét dạ dày [9]

9

1.2.2.3 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm:

Trong số các dịch chiết aceton, ethanol, metanol, butanol và nước của hạt nhục đậu khấu, dịch chiết aceton có thể phát huy hoạt tính kháng khuẩn chống lại cả 4 loài vi

khuẩn (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas putida và Pseudomonas

aeruginosa) và 3 loài nấm (Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger và Aspergillus flavus) Dịch chiết aceton cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm mạnh nhất

chống lại Staphylococcus Aureus (đường kính vòng vô khuẩn là 13,8 ± 0,42 mm) và A

niger (14,4 ± 0,37 mm) [26]

Smith-Palmer và cộng sự phát hiện ra rằng tinh dầu từ hạt nhục đậu khấu đã ức

chế sự phát triển của Listeria monocytogenes bằng cách ngăn chặn việc sản xuất protein

ngoại bào của vi khuẩn (listeriolysin và enzyme phospholipase) [74] Chiết xuất methanol của hạt nhục đậu khấu cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh chống lại

vi khuẩn Salmonella typhi đa kháng thuốc với MIC = 12,5 μg/ml [67] Ba lignan (macelignan, axit meso-dihydroguaiaretic và nectandrin-B) cho thấy hoạt tính kháng nấm in vitro và in vivo chống lại nấm gây bệnh thực vật Alternaria

alternata, Magnaporthe grisea, Agrobacteria tumefaciens, Burkholderia glumae, Axitovorax konjaci, Colletotrichum coccodes và C gloeosporioides [16] Gần đây, hỗn

hợp axit succinic và axit fumaric cũng được nghiên cứu chỉ ra hoạt tính kháng khuẩn

mạnh mẽ với E.coli ATCC8739, với MIC = 8 μg/ml [20]

1.2.2.4 Tác dụng hạ đường huyết và bảo vệ tế bào gan:

Protein kinase được kích hoạt bởi AMP (AMPK) đang là mục tiêu tiềm năng để điều trị hội chứng chuyển hóa (bao gồm đái tháo đường type 2 và béo phì) khi có khả năng tăng vận chuyển glucose vào tế bào ([24], [53]) Ba lignan tetrahydrofuran: nectandrin B, tetrahydrofuroguaiacin B và nectandrin A ở nồng độ 5 μM tạo ra sự kích thích AMPK mạnh trên các tế bào C2C12 (dòng tế bào cơ) đã biệt hoá [53]

Macelignan điều hòa giảm biểu hiện gen gây viêm gan và tăng hoạt hóa AMPK trong cơ xương của mô hình chuột đái tháo đường type 2 và béo phì Hơn nữa, macelignan còn có khả năng làm tăng độ nhạy insulin và cải thiện rối loạn chuyển hoá

lipid bằng cách đối kháng PPARα/γ [51] và làm giảm áp lực ở lưới nội chất cho thấy

tiềm năng trở thành một chất điều trị đái tháo đường type 2 [29]

Axit meso-dihydroguaiaretic và otobaphenol từ dịch chiết methanol của nhục đậu

khấu được báo cáo có khả năng ức chế PTP1B – protein tyrosine phosphatase (sự biểu hiện quá mức của protein này sẽ gây ức chế con đường tín hiệu insulin nội bào và thường xuất hiện trong giai đoạn kháng insulin [4]) Giảm hoạt động của PTP1B là một trong những đích tiềm năng để giảm kháng insulin trong điều trị đái tháo đường type 2 [42],

10

từ đó cho thấy axit meso-dihydroguaiaretic có thể hoạt động như một chất tăng cường

truyền tín hiệu insulin nội bào, thông qua việc ức chế hoạt động PTP1B [89] Sử dụng LPS kết hợp với D-GalN (D-galactosamin) gây ra chu trình chết tế bào ở

gan thông qua hoạt động kích hoạt giải phóng TNF-α từ đại thực bào Mặc dù quá trình

chết tế bào ở gan không trực tiếp làm tổn thương gan nhưng lượng lớn tế bào bị chết sẽ tạo ra tín hiệu để bạch cầu trung tính di chuyển đến gan trong quá trình LPS/D-GalN gây tổn thương ở gan [44] Myristicin cho thấy hoạt tính bảo vệ tế bào gan bằng việc ức

chế sự tăng cường nồng độ TNF-α huyết thanh và sự phân mảnh ADN ở gan chuột do

LPS/D-GalN [48]

1.2.2.5 Tác dụng chống ung thư:

Myristicin làm chậm quá trình tăng sinh, gây áp lực mạng lưới nội chất và kích thích quá trình apoptosis ở tế bào ung thư dạ dày bằng việc làm giảm biểu hiện của cyclin, tăng biểu hiện Bax, tăng hoạt hoá caspase, tăng giải phóng cytochrom C và ROS của ty thể Ngoài ra, myristicin còn ức chế sự phát triển tế bào ung thư dạ dày cũng như con đường tín hiệu EGFR/ERK (con đường dẫn đến tự tăng sinh không kiểm soát trong ung thư [71]) [76]

Bốn lignan phân lập từ hạt nhục đậu khấu Việt Nam bao gồm macelignan, axit

meso-dihydroguaiaretic (DHGA), nectandrin-B và fragransin A2 đã được nghiên cứu

hoạt tính chống lại 8 dòng tế bào ung thư khác nhau: H1299 (ung thư biểu mô tế bào phổi), H358 (ung thư phổi phế quản), H460 (ung thư tế bào phổi), Hela (ung thư cổ tử cung ở người), HepG2 (tế bào ung thư gan), KPL4 (tế bào ung thư vú), MCF-7 (tế bào ung thư vú), RD (tế bào ung thư cơ vân) và tế bào MDCK (tế bào thường ở thận) [63] DHGA thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với hầu hết các tế bào ung thư H358, HepG2, RD, MCF-7, KPL4, H1299 và H460 với giá trị IC50 = 10,1 – 27,7 μM, so với đối chứng dương tính (taxol, IC50 = 4,9 – 6,6 μM) Macelignan cũng cho thấy khả năng gây độc tế bào mạnh đối với các tế bào ung thư H358 (IC50 = 10,2 μM) và Hela (IC50 = 25,1 μM), trong khi nectandrin-B và fragransin A2 cho thấy hoạt tính yếu hơn [63]

1.2.2.6 Tác dụng dược lý thần kinh:

Macelignan trong hạt nhục đậu khấu có khả năng bảo vệ neuron hồi hải mã khỏi độc tính của glutamat và ngăn chặn sự kích hoạt tế bào thần kinh đệm do LPS Jin và cộng sự (2005) cho thấy macelignan bảo vệ neuron thông qua việc làm giảm các gốc oxy hoá tự do (ROS) (một trong những yếu tố quan trọng trong bệnh thoái hoá thần kinh, ví dụ hội chứng Azheimer là sự không kiểm soát được mức độ oxy hoá và phản ứng viêm [25], [70]) , hơn nữa macelignan còn có khả năng vượt qua hàng rào máu não, cho thấy tiềm năng trở thành hoạt chất chống thoái hoá thần kinh [36]

11

Licarin A (dehydrodiisoeugenol) và licarin B không chỉ cho thấy sự kéo dài đáng kể thời gian ngủ do hexobarbital (HB) gây ra mà còn ức chế các hoạt động của

aminopyrin N-demethylase và hexobarbital hydroxylase ở chuột sau một thời gian sử

dụng Myristicin và licarin B gây ra cơn buồn ngủ ở liều thấp hơn liều gây ngủ của hexobarbital, từ đó cũng cho thấy đặc tính ức chế thần kinh trung ương [72]

Ngoài ra, myristicin đã được ghi nhận là có tác dụng đối kháng tác dụng chống lo âu của midazolam, làm tăng lo lắng và ảnh hưởng đến vận động [45] Hơn nữa, Muchtaridi và cộng sự đã báo cáo rằng myristicin, 4-terpineol và safrol có liên quan đến sự ức chế vận động trên chuột [50]

1.2.2.7 Tác dụng bảo vệ tim mạch

Kết tập tiểu cầu là yếu tố quan trọng trong tạo cục máu đông và kiểm soát xuất huyết thành mạch, tuy nhiên khi bị hoạt hoá quá mức sẽ tạo cục máu đông gây tắc nghẽn, dẫn đến biến chứng tim mạch như đột quỵ Nghiên cứu của Kang và cộng sự (2013) chỉ

ra rằng erythro-(7S,8R)-7-acetoxy-3,4,3',5'-tetramethoxy-8-O-4'-neolignan (EATN) có

thể điều hoà sự hoạt hoá và kết tập tiểu cầu do thrombin bằng việc điều chỉnh mức AMP vòng trong tế bào tiểu cầu [37], cho thấy tiềm năng sử dụng EATN như một chất ức chế kết tập tiểu cầu

Hơn nữa, malabaricon C có tiềm năng chống nguy cơ tăng huyết áp trên mô hình chuột bị tăng huyết áp do dùng muối deoxycorticosteron acetat (DOCA) thông qua việc làm giảm tình trạng oxy hoá và phì đại cơ quan, đồng thời cải thiện chức năng nội mô và mạch máu với tác dụng làm giảm huyết áp tâm thu, phì đại tâm thất, viêm ở tâm thất và động mạch chủ [68]

Ngoài ra, dịch chiết nước của hạt nhục đậu khấu có tiềm năng bảo vệ tim mạch trước nguy cơ nhồi máu cơ tim do isoproterenol Chuột đực trưởng thành bị nhồi máu cơ tim do isoproterenol gây ra khi được dùng chiết xuất nước từ hạt nhục đậu khấu liên tục trong trong 30 ngày cho thấy có hiệu quả làm giảm độc tính của isoproterenol trên đường huyết, lipid huyết tương, mô học của cơ tim [39]

1.2.2.8 Tác dụng gây độc tế bào:

Tiêu thụ lượng lớn tinh dầu hạt nhục đậu khấu có thể gây ra các triệu chứng như đỏ bừng mặt, mờ mắt, khô miệng, tăng huyết áp, nhịp tim nhanh, buồn nôn, nôn, ảo giác [23], [27]

Myristicin và elemicin trong hạt được cho là nguyên nhân chính gây ra độc tính khi bị chuyển hoá thành các dẫn xuất amphetamin trong cơ thể Trong đó myristicin chuyển hoá thành 3-methoxy-4,5-methylendioxyamphetamin; còn elemicin chuyển hoá thành 3,4,5-trimethyloxyamphetamin [23], [27]

12

Liều tối thiểu (liều gây độc) hạt nhục đậu khấu có thể gây tác động tâm lý là 5 g hạt nhục đậu khấu xay có chứa 1 - 2 mg myristicin Ở liều lượng myristicin cao hơn có thể gây tử vong [66]

1.2.3 Nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của hạt nhục đậu khấu ở Việt Nam

Hiện nay, các nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của hạt Nhục đậu khấu ở Việt Nam còn rất hạn chế Năm 2022, Phạm Văn Công và cộng sự đã phân lập được bảy hoạt chất từ hạt nhục đậu khấu trong đó có một hoạt chất mới là maceneolignan L và sáu hoạt chất đã được phân lập trước đó [62]

Có 24 hợp chất gồm neolignan và dẫn chất của diarylnonanoid đã được phân lập bởi Nguyễn Việt Phong và cộng sự vào năm 2023, với sự xuất hiện của hai neolignan mới được phân lập là myrifralignan F và myrifralignan G, bốn dẫn chất diarylnonanoid mới là myrifragranon A, myrifragranon B, myrifragranon C và myrifragranon D Ngoài ra nghiên cứu này còn đánh giá khả năng gây độc của các hợp chất này với các dòng tế bào ung thư Trong đó, myrifragranon C cho thấy độc tính trên dòng tế bào A2780, TOV-112D (dòng tế bào ung thư biểu mô buồng trứng nhạy cảm với cisplatin) và SK-OV3 (dòng tế bào ung thư biểu mô buồng trứng kháng cisplatin) với IC50 lần lượt là 14,1; 16,9; 33,4 μM Cơ chế tác dụng của nó trên dòng tế bào ung thư A2780 và SK-OV3 được chỉ ra là thông qua kích hoạt chu trình apoptosis [54]

Theo kết quả nghiên cứu của Phương Thiên Thương và cộng sự (2014), hợp chất

meso-dihydroguairetic phân lập từ hạt nhục đậu khấu có khả năng kháng mạnh trên

nhiều dòng tế bào ung thư như tế bào ung thư phổi H358 với IC50 = 10,11 μM Hơn nữa, hợp chất này lại không gây độc tính trên dòng tế bào thường MDCK (tế bào thường ở

thận) và ở thử nghiệm in vivo, nó có thể thu nhỏ kích thước khối u trên da và làm tăng

thời gian sống của chuột bị gây ung thư [63]

1.2.4 Công dụng của hạt nhục đậu khấu trong y học cổ truyền STT Nguồn gốc Công dụng TLTK

Cải thiện chức năng gan, thận, kích thích ăn uống, giảm đầy bụng, khó tiêu, cải thiện tình trạng rối loạn chức năng tình dục

[8], [59], [41], [64]

[15], [78]

5 Indonesia

Cầm tiêu chảy, giảm loét miệng, giảm triệu chứng mất ngủ, điều trị thấp khớp, giang mai, đau răng, tăng cường sức đề kháng ở trẻ em

[7], [73], [83]

7 Myanmar Dùng hạt nhục đậu khấu để chữa bệnh trĩ,

Hạt và quả được dùng để điều trị tê liệt, sốt rét, viêm khớp dạng thấp; bệnh phong và đau bụng

[47]

Hình 2.1: Hình ảnh hạt Nhục đậu khấu

2.2 Nguyên liệu:

2.2.1 Hóa chất:

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng

STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 n-hexan Trung Quốc DĐVN V

2.2.2 Dụng cụ:

• Cột sắc kí với đường kính 7 cm, 2,5 cm, 2 cm, 1,5 cm

• Quả bóp cao su, giá đỡ cột sắc ký, khay đựng ống nghiệm, micropipette, kẹp

2.2.3 Thiết bị:

• Tủ sấy Memmert (Đức) • Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thụy Sĩ) • Cân kỹ thuật

• Máy cất quay BUCHI Toledo AB204S (Thụy Sĩ) • Máy siêu âm Elmasonic (Đức)

• Buồng soi đèn UV bước sóng 365nm/254nm • Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm

Khoa học Việt Nam: Bruker AM600 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ)

2.3 Nội dung nghiên cứu:

• Chiết xuất cao chiết EtOH toàn phần và các cao chiết phân đoạn từ hạt nhục đậu khấu

• Phân lập một số hợp chất từ cao chiết phân đoạn của hạt nhục đậu khấu • Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

2.4.1 Phương pháp chiết xuất:

Sử dụng phương pháp ngâm nóng 60°C, chiết 3 lần với dung môi là EtOH 96%, tỉ lệ DM:DL lần lượt: 10:1; 8:1; 6:1 (v/v), lọc và gộp dịch cô rồi cất thu hồi dung môi lấy cắn chiết, thu được cao đặc EtOH Sau đó, cắn chiết được phân tán vào nước rồi chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: CH2Cl2 và EtOAc các phân đoạn dịch chiết thu được đem cô lấy cắn

2.4.2 Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của hợp chất hóa học:

Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường hoặc pha đảo kết hợp sắc ký lớp mỏng (TLC) Theo dõi các phân đoạn bằng TLC silicagel F254 và TLC silica gel 60 RP-18 F254S, phát hiện chất bằng đèn tử ngoại dưới bức xạ UV 254nm và dùng thuốc thử axit sulfuric 10%, sấy nóng để hiện màu

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), kết hợp so sánh tài liệu tham khảo

16

2.4.2.1 Sắc ký cột:

Nguyên tắc: • Hấp phụ bằng silica gel và giải hấp phụ bằng hệ dung môi thích hợp • Sắc ký cột pha thuận với pha tĩnh là silica gel có nhóm hydroxyl tự do có khả

năng tạo liên kết hydro để tách các hợp chất có độ phân cực khác nhau: chất ít phân cực được ly giải ra trước, chất phân cực ly giải ra sau

Các bước tiến hành sắc ký cột: • Lựa chọn pha tĩnh: Silica gel (Merck)

• Dung môi rửa giải (pha động): hệ dung môi được kết hợp từ n-hexan, diclomethan,

aceton, ethyl acetat, methanol và nước theo tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát qua sắc ký lớp mỏng

• Chuẩn bị cột sắc ký: chọn cột có đường kính và chiều dài phù hợp lượng mẫu đưa lên cột, có khoá chắc chắn tránh rò cột, rửa và tráng cột bằng ethanol, để khô và cố định trên giá Lót một lượng bông vừa đủ vào cột tránh silica chảy ra trong quá trình chạy cột

• Chuẩn bị mẫu: 1 Mẫu khô:

• Đối với lượng chất nhiều, một phần không tan trong dung môi rửa giải • Cho mẫu vào bình cầu, thêm một lượng dung môi trung gian vừa đủ hoà tan mẫu Thêm lượng silica gấp khoảng 1,5 – 2 lần lượng mẫu vào mẫu Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không, kết hợp làm tơi trong quá trình cô quay để mẫu được khô tơi

2 Mẫu ướt: • Đối với mẫu hoà tan hoàn toàn trong dung môi rửa giải, chạy tách chất

sạch • Mẫu được hoà tan trong lượng dung môi rửa giải tối thiểu • Nhồi cột: cho lượng silica vừa đủ với cột (tạo chiều dài pha tĩnh thích hợp) vào

cốc có mỏ, thêm dung môi chạy cột vào, khuấy đều cho hết bọt khí Đổ hỗn hợp vào cột đã chuẩn bị, mở van, rót tiếp dung môi để cột hết bọt khí và ổn định Giữ lại một ít dung môi để cột không bị khô trước khi khoá cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột

• Nạp mẫu: 1 Mẫu khô: Cho mẫu đã tẩm silica vào cột, tráng bình cầu bằng dung môi rửa

giải rồi cho dịch vào cột 2 Mẫu ướt: cho mẫu được hoà tan trong lượng tối thiểu dung môi vào cột

17

Mở van khi nạp mẫu, có thể dùng quả bóp cao su gõ nhẹ vào thành cột để dàn đều chất, chờ cho lượng dung môi chảy gần hết, thêm bông vào để tránh dung môi thêm vào tiếp làm xáo trộn bề mặt

• Rửa giải: cho hệ dung môi đã chọn vào cột và bổ sung liên tục tránh làm khô cột • Thu dịch: hứng dịch rửa giải vào các lọ/ống nghiệm với thể tích phù hợp phân

đoạn • Sử dụng sắc ký lớp mỏng TLC pha thuận và pha đảo để gộp phân đoạn và xác

• Đưa mẫu lên bản mỏng: hoà tan mẫu thử trong dung môi thích hợp, dùng mao quản để chấm dịch lên bản mỏng

• Chuẩn bị dung môi pha động: hệ dung môi thích hợp cho vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín để bão hoà dung môi 5-10 phút trước khi chạy

• Triển khai sắc ký: đặt bản mỏng vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín, để yên và quan sát Khi dung môi chạy gần mép bản mỏng thì lấy bản mỏng ra, chờ cho khô dung môi, có thể dùng máy sấy để sấy khô

• Sử dụng đèn UV 254nm để xác định vết, hiện màu bằng axit sulfuric 10%, dùng máy khò để sấy nóng từ từ quan sát vết

2.4.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử hợp chất:

Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định phổ 1H-NMR, 13C-NMR, kết hợp so sánh các dữ liệu thực nghiệm của các tài liệu công bố trước đó để xác định cấu trúc phân tử hợp chất tinh chế được

Phân tán cao đặc thu được vào một lượng nước tối thiểu, sau đó chiết phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần là CH2Cl2, EtOAc, mỗi dung môi chiết 1500 mL/lần x 3 lần, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 52 g cao chiết CH2Cl2, 15 g cao chiết EtOAc, và 25 g cao chiết nước

Quy trình chiết Nhục đậu khấu được trình bày cụ thể trong sơ đồ 3.1:

Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết xuất hạt Nhục đậu khấu

Hạt nhục đậu khấu (2,0 kg)

Ngâm nóng 60°C Ethanol 96%, Chiết 3 lần Tỷ lệ DM:DL: 10:1; 8:1; 6:1 (v/v) Lọc, gộp dịch rồi cô loại dung môi

Cao đặc EtOH (110 g)

Phân tán cao chiết tổng vào nước Chiết phân bố lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần

Cao chiết phân đoạn CH2Cl2

CH2Cl2

EtOAc Rửa, xay, sấy

Pha nước

19

3.2 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất:

Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập hợp chất NĐK-1 và NĐK-2

Phân đoạn EtOAc (15 g) phân lập qua cột sắc ký pha thuận (7x64 cm) sử dụng pha tĩnh là silica gel, pha động là hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH với tỷ lệ lần lượt 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:1 (v/v) x 500 mL/tỷ lệ thu được 5 phân đoạn (A-E)

Phân đoạn A (1,25 g) tiếp tục được phân lập qua cột sắc ký pha thuận (2x70 cm)

sử dụng pha tĩnh là silica gel, pha động là n-hexan:EtOAc (5:1 v/v) thu được hợp chất 1

ký hiệu là NĐK-1 (10 mg)

Phân đoạn C (5,5 g) tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột pha thuận (2,5x70cm) sử

dụng pha tĩnh là silica gel, pha động là hệ n-hexan:Aceton (1:1 v/v) thu được 5 phân đoạn C1-C5 Sử dụng cột sắc ký pha thuận (2x70 cm) và hệ dung môi n-hexan:EtOAc

(3:2 v/v) để phân lập tiếp phân đoạn C2 (3,9 g) thu được 5 phân đoạn C2.1-C2.5 Từ phân đoạn C2.5 (330 mg) phân lập qua cột sắc ký pha thuận (1,5x70 cm) với hệ dung

Cao chiết EtOAc (15 g)

Silica gelCH2Cl2: MeOH ( 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:1 v/v)

A (1,25 g) B C (5,5 g) D E

n-hexan:EtOAc (5:1 v/v)

NĐK-1(10 mg)

Silica gel

n-hexan:Aceton (1:1 v/v)

NĐK-2(7 mg)C2 (3,9 g)

trường thấp của hai proton vòng thơm là δH [6,37 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-6') và 6,41 (1H, br s, H-2')], cùng với giá trị của hằng số tương tác J = 1,2 Hz cho phép xác định được vị trí của hai proton trên vòng thơm ở vị trí meta Bên cạnh đó tín hiệu hấp thụ của ba proton ethenyl cũng được ghi nhận tại δH [5,94 (1H, m, H-2) và 5,05 (2H, m, H-3)]

Ngoài ra, một nhóm dioxymethylen, một nhóm methoxy và một nhóm methylen

đã được phát hiện với độ dịch chuyển hóa học lần lượt tương ứng là δH [5,89 (2H, s);

21

Ngoài ra, độ dịch chuyển hóa học cacbon tại δC 144,9 (C-3') xác định được vị trí gắn nhóm methoxy Kết hợp với dữ liệu phổ 1H-NMR cùng với phân tích dữ liệu phổ 13C-NMR, vị trí của nhóm methylen tại δC 41,1 (C-1) được xác định gắn với carbon C-

1' tại δC 134,9 và nhóm ethynyl tại δC [139,0 (C-2) và 115,9 (C-3)] Từ các dữ liệu phổ thu được kết hợp với so sánh tài liệu đối chiếu tham khảo, hợp

chất NĐK-1 được xác định là Myristicin [90] (Xem hình 3.1, hình 3.2 và bảng 3.1)

Hình 3.2: Phổ 13C-NMR của hợp chất NĐK-1

Hình 3.3: Cấu trúc hợp chất NĐK-1 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất NĐK-1