Phân tích các yếu tố Ảnh hưởng Đến biểu hiện của dấu Ấn mô cd142 Để dự Đoán nguy cơ Đông máu Ở bệnh nhân truyền tế bào gốc trung mô

Phân tích các yếu tố Ảnh hưởng Đến biểu hiện của dấu Ấn mô cd142 Để dự Đoán nguy cơ Đông máu Ở bệnh nhân truyền tế bào gốc trung mô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

~~~~~~*~~~~~~

Lê Đức Sơn

PHÂN TÍCH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN BIỂU HIỆN CỦA DẤU ẤN MÔ CD142 ĐỂ DỰ ĐOÁN NGUY CƠ ĐÔNG MÁU Ở BỆNH NHÂN TRUYỀN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

~~~~~~*~~~~~~

Lê Đức Sơn

PHÂN TÍCH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN BIỂU HIỆN CỦA DẤU ẤN MÔ CD142 ĐỂ DỰ ĐOÁN NGUY CƠ ĐÔNG MÁU Ở BỆNH NHÂN TRUYỀN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hà Nội - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: “Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện của dấu ấn mô CD142 để dự đoán nguy cơ đông máu ở bệnh nhân truyền tế bào gốc trung mô” là một công trình nghiên cứu được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của

GS.TS.BS Nguyễn Thanh Liêm, TS Hoàng Thanh Vân và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Số liệu trình bày trong luận văn thuộc sở hữu của Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec Kết quả nghiên cứu của luận văn là trung thực, tài liệu tham khảo đã được ghi rõ nguồn trích dẫn Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

về lời cam đoan này

Người cam đoan

Lê Đức Sơn

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành nhờ sự hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và đóng góp của quý thầy cô, các anh chị đồng nghiệp và các bạn học viên cùng khóa Vì vậy tôi xin chân thành cảm ơn cho những công sức và thời gian mà quý thầy cô và các anh chị, bạn bè đã dành ra để hỗ trợ tôi hoàn thiện luận văn này

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS.BS Nguyễn Thanh Liêm đã

tạo điều kiện để tôi thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ, hỗ trợ tôi được tham gia môi trường học tập và làm việc chuyên nghiệp, khoa học và đầy đủ tiện nghi

Xin được bày tỏ lòng sâu sắc đến người hướng dẫn trực tiếp của tôi, TS Hoàng Thanh Vân, người đã tạo điều kiện để tôi được học hỏi về lĩnh vực tế bào, mở rộng

kiến thức, kỹ năng phòng thí nghiệm cũng như những kinh nghiệm sống quý báu

Những cảm xúc sâu sắc đến từ đáy lòng tôi xin được dành tặng cho PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều từ thời điểm bước chân vào

con đường khoa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các anh chị tại viện nghiên cứu Tế bào gốc

và Công nghệ gen Vinmec đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập tại đây Cuối cùng, xin gửi những cảm xúc hân hoan vui vẻ đến những người bạn, những người học viên đã cùng tôi bước đi trên chặng đường thạc sĩ này

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về tế bào gốc trung mô 3

1.1.1 Sơ lược về tế bào gốc trung mô 3

1.1.2 Các nguồn phân lập tế bào gốc trung mô 3

1.1.3 Tiềm năng trị liệu của tế bào gốc trung mô 5

1.2 Hiện tượng đông máu sau truyền tế bào gốc trung mô 6

1.2.1 Báo cáo trên mô hình động vật và bệnh nhân 6

1.2.2 Tác nhân gây đông máu sau truyền tế bào gốc trung mô 8

1.3 Dấu ấn mô và vai trò 9

1.3.1 Biểu hiện của dấu ấn mô trong các loại mô, tế bào 9

1.3.2 Cấu trúc của dấu ấn mô 10

1.3.3 Chức năng của dấu ấn mô 12

1.3.4 Mối liên hệ giữa dấu ấn mô và tế bào gốc trung mô 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Hóa chất và thiết bị 25

2.3 Phương pháp 27

2.2.1 Rã đông tế bào 27

2.2.2 Nuôi tế bào 28

2.2.3 Phân tích thời gian tăng sinh 30

2.2.4 Nuôi tế bào ở các mật độ khác nhau 30

2.2.5 Nuôi tế bào trong điều kiện oxy sinh lý 30

2.2.6 Phân tích thời gian hình thành cục fibrin 31

2.2.7 Xử lý tế bào với môi trường có chứa cytokine 32

2.2.8 Đánh giá tác động của điều kiện bảo quản tế bào 33

2.2.9 Phân tích tế bào theo dòng chảy - flow cytometry 33

2.2.10 Phân tích biểu hiện gen bằng PCR định lượng – real-time PCR 36

2.2.11 Phân tích số liệu 37

2.4 Sơ đồ thí nghiệm 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 38

3.1 Biểu hiện của dấu ấn mô trên các nguồn tế bào gốc trung mô 38

3.1.1 Thời gian kích hoạt đông máu trên các nguồn tế bào gốc trung mô 38

3.1.2 Biểu hiện của dấu ấn mô trên các nguồn tế bào gốc trung mô 40

3.1.3 Biểu hiện các gen tiền kích thích / ức chế đông máu trên các nguồn tế bào gốc trung mô 44

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng biểu hiện dấu ấn mô 46

3.2.1 Dấu ấn mô và thời gian nuôi 46

3.2.2 Dấu ấn mô và mật độ tế bào 48

3.2.3 Dấu ấn mô và điều kiện oxy sinh lý 51

3.2.4 Dấu ấn mô và ảnh hưởng của cytokine 52

3.2.5 Dấu ấn mô trong điều kiện chuẩn bị mẫu và bảo quản 54

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN 57

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Kiến nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 77

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aPTT Thời gian hoạt hóa thromboplastin từng phần

(activated Partial Thromboplastin Time)

(Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cells)

(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells) COL1A1 Gen mã hóa collagen loại 1 - (type I collagen)

DP-MSCs Tế bào gốc trung mô từ tủy răng

(Dental Pulp-derived Mesenchymal Stem Cells)

HUVECs Tế bào nội mô – (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)

MFI Trung vị cường độ tín hiệu huỳnh quang

(Median Fluorescence Intensity)

MSCs Tế bào gốc trung mô - (Mesenchymal Stem Cells)

PT Thời gian tiền thrombin - (Prothrombin Time)

(Prostaglandin Receptor)

RL Dung dịch đệm truyền tế bào - (Ringer’s Lactate)

TF – CD142 Dấu ấn mô - (Tissue Factor - Cluster of Differentiation 142)

(Tissue Factor III encoded by the F3 gene)

TFPI Gen mã hóa yếu tố ức chế dấu ấn mô

(anti-Tissue Factor Pathway Inhibitor)

TT Thời gian thrombin - (Thrombin Time)

(Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách và số lượng các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.2 Danh mục các tiêu chí đánh giá MSCs dùng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.3 Danh mục hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 2.4 Danh mục thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 26

Bảng 2.5 Các điều kiện nồng độ cytokine được sử dụng trong nghiên cứu 33

Bảng 2.6 Danh sách các gen và đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu 36

Bảng 3.1 Thời gian tạo cục fibrin chuẩn hóa của các dòng tế bào 38

Bảng 3.2 Phân tích thống kê thời gian tạo cục giữa các dòng tế bào 39

Bảng 3.3 Đồng biểu hiện CD142 và CD90, CD73, CD105 trên UC-MSCs 41

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các bệnh đã được nghiên cứu, điều trị bằng liệu pháp MSCs 6

Hình 1.2 Sơ đồ biểu hiện TF theo giới tính 9

Hình 1.3 Cường độ biểu hiện TF ở các mô, cơ quan 9

Hình 1.4 Sơ đồ phiên mã các dạng đồng phân của protein TF 10

Hình 1.5 Vị trí và cấu trúc các đồng phân của TF 11

Hình 1.6 TF kích hoạt các con đường chuyển hóa trong tế bào 12

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt con đường đông máu 14

Hình 1.8 Sơ đồ nguyên lý quá trình khử mã hóa TF thông qua phospholipid 21

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm phân tích thời gian hình thành cục fibrin 32

Hình 3.1 Thời gian tạo cục fibrin giữa các dòng tế bào 39

Hình 3.2 Tương quan biểu hiện gen TFF3 trên một số dòng tế bào 40

Hình 3.3 Sự đồng biểu hiện CD142 và các dấu ấn đặc trưng của MSCs 42

Hình 3.4 Biểu hiện của CD142 trên các dòng tế bào 43

Hình 3.5 Biểu hiện gen liên quan đông máu trên các dòng tế bào 45

Hình 3.6 Thời gian tăng sinh giữa các thế hệ nuôi trên UC-MSCs 46

Hình 3.7 Chu trình tế bào giữa các thế hệ nuôi trên UC-MSC 47

Hình 3.8 Biểu hiện của CD142 theo các thế hệ nuôi trên UC-MSC 48

Hình 3.9 Tương quan mật độ tế bào và biểu hiện của CD142 49

Hình 3.10 UC-MSCs nuôi tại các mật độ khác nhau 50

Hình 3.11 Mật độ tế bào và mức độ biểu hiện CD142 trên UC-MSCs 51

Hình 3.12 Ảnh hưởng của oxy sinh lý đối với biểu hiện CD142 52

Hình 3.13 Ảnh hưởng của cytokine viêm TNF-α và cytokine chống viêm IFN-γ đối với biểu hiện của CD142 53

Hình 3.14 Cytokine và thời gian tạo cục fibrin trên UC-MSCs 53

Hình 3.15 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi liên tục/rã đông đối với biểu hiện CD142 trên UC-MSCs 54

Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian lưu trữ ngắn hạn đối với sức sống và biểu hiện CD142 trên UC-MSCs 55

Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian lưu trữ ngắn hạn đối với thời gian hình thành cục fibrin trên UC-MSCs 56

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSCs) là một tập hợp các dòng tế bào gốc đa năng, được tìm thấy trong nhiều loại mô trưởng thành, mô chu sinh và mô thai nhi Hiện nay, MSCs được coi là một công cụ đầy hứa hẹn cho các phương pháp tiếp cận y học tái tạo MSCs đã được sử dụng để điều một số bệnh, bao gồm suy tim, viêm khớp gối, tổn thương tủy sống, phổi tắc nghẽn mãn tính, bại não, loạn sản phế quản phổi, đái tháo đường tuýp II, v.v Tuy nhiên, liệu pháp MSCs có nguy cơ dẫn đến một số biến chứng

Thuyên tắc là một trong những tác dụng phụ nghiêm trọng khi bệnh nhân được truyền MSCs Phản ứng này có thể gây ra các biến chứng nguy hiểm, chẳng hạn như huyết khối tĩnh mạch cửa và thuyên tắc phổi Dấu ấn mô (Tissue Factor - TF, hay protein đánh dấu bề mặt - CD142), yếu tố khởi đầu con đường đông máu ngoại sinh, được chỉ ra là tác nhân chính dẫn đến thuyên tắc được ghi nhận ở cả mô hình động vật và bệnh nhân truyền MSCs Do đó, TF/CD142 được đề xuất như một dấu ấn sinh học để dự đoán tình trạng đông máu sau khi truyền MSCs

Biểu hiện của TF/CD142 trên tế bào bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Trong đó, biểu hiện của protein này bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, môi trường viêm, nồng độ oxy sinh lý, tình trạng chết tế bào, v.v Thêm nữa, các dòng tế bào khác nhau có mức độ biểu hiện TF/CD142 khác nhau Tuy nhiên, những nghiên cứu trước đây chỉ thực hiện so sánh theo cặp hai hoặc ba dòng MSCs,

do đó chưa đưa ra cái nhìn tổng quát về biểu hiện TF/CD142 giữa nhiều nguồn MSCs Ngoài ra, những hiểu biết hiện nay về TF/CD142 chủ yếu được khám phá dựa trên MSCs nuôi cấy trong môi trường có bổ sung huyết thanh động vật, đã được một nghiên cứu chỉ ra là làm gia tăng biểu hiện TF/CD142 và thúc đẩy hoạt tính đông máu Một lý do nữa, biểu hiện của TF/CD142 trong những điều kiện như oxy sinh lý

và môi trường cytokine chủ yếu được thực hiện trên các dòng tế bào không phải

MSCs Trên cơ sở đó, đề tài nghiên cứu “Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện của dấu ấn mô CD142 để dự đoán nguy cơ đông máu ở bệnh nhân truyền tế

bào gốc trung mô” được thực hiện nhằm cung cấp thêm hiểu biết về TF/CD142 trên

MSCs nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh và không yếu tố động vật

Đề tài nghiên cứu được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Đánh giá tổng thể hoạt tính đông máu và biểu hiện TF/CD142 ở các nguồn MSCs khác nhau, bao gồm tủy xương, mô mỡ, dây rốn, tủy răng sữa

2 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng biểu hiện TF/CD142 trên MSCs từ dây rốn,

bao gồm:

• Thời gian nuôi

• Mật độ tế bào

• Điều kiện nuôi 2% oxy

• Môi trường cytokine (TNFα và INF-γ)

• Điều kiện rã đông và lưu trữ ngắn hạn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về tế bào gốc trung mô

1.1.1 Sơ lược về tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSCs) là một tập hợp các dòng tế bào gốc đa năng, được tìm thấy trong nhiều loại mô trưởng thành, mô chu sinh và mô thai nhi [13] Mặc dù sự tồn tại của MSCs đã được đề xuất bởi Cohnheim vào năm 1867, nhưng phải đến năm 1970, người ta mới thừa nhận sự tồn tại của loại

tế bào gốc đa năng này khi chúng lần đầu được phân lập từ tủy xương bởi Friedenstein [28] MSCs có nhiều đặc tính nổi bật có thể kể đến như khả năng tăng sinh mạnh mẽ,

cả trong cơ thể và môi trường nuôi nhân tạo; khả năng điều hòa miễn dịch/chống viêm nhờ biểu hiện thấp MHC lớp I và không biểu hiện HLA-DR - kháng nguyên đóng vai trò then chốt trong thải ghép; khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau như nguyên bào xương, tế bào sụn, tế bào mỡ, tế bào hình thoi, tế bào cơ, tế bào thần kinh, tế bào da, tế bào giác mạc và nguyên bào sợi, v.v [100] Do tiềm năng biệt hóa lớn nên tế bào gốc trung mô được coi là một công cụ đầy hứa hẹn cho các phương pháp tiếp cận y học tái tạo Các đặc tính và tiềm năng ứng dụng của MSCs phần nào khác nhau phụ thuộc vào nguồn phân lập của chúng

1.1.2 Các nguồn phân lập tế bào gốc trung mô

MSCs có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau Các tế bào gốc từ tủy xương là nguồn MSCs đầu tiên được báo cáo, và cho đến nay vẫn là dòng tế bào được nghiên cứu thường xuyên nhất, cũng như là được chỉ định làm tiêu chuẩn vàng trong các nghiên cứu về MSCs [118] Bên cạnh tủy xương, một số nguồn chính cho phân lập MSCs có thể được chỉ ra như mô mỡ, dây rốn, tủy răng, máu ngoại vi, nội mạc tử cung, da, cơ, v.v [81] Trong số những nguồn MSCs này, tủy xương (Bone Marrow-derived Mesenchymal Stromal Cells - BM-MSCs), mô mỡ (Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stromal Cells - AT-MSCs), dây rốn (Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells - UC-MSCs) là các nguồn chính được sử dụng trong nghiên

cứu ứng dụng lâm sàng Ngoài ra, tủy răng (Dental Pulp-derived Mesenchymal Stem Cells - DP-MSCs) cũng là một nguồn hứa hẹn trong y học tái tạo

BM-MSCs là quần thể tế bào nằm trong lớp nền của tủy xương Chúng có ưu điểm về tiềm năng tăng sinh nhanh chóng và tính an toàn sau cấy ghép [17], khiến chúng trở thành một công cụ quan trọng trong y học tái tạo Tuy nhiên BM-MSCs cũng có những điểm hạn chế Chúng được phân lập bằng cách chọc hút dịch tủy xương Kỹ thuật phân lập tuy đơn giản và thuận tiện nhưng lại gây khó chịu cho bệnh nhân vì có tính xâm lấn cao, đau đớn và cần gây mê toàn thân [17] Sau phân lập, BM-MSCs chỉ chiếm 0.001-0.01% tổng số quần thể tế bào thu thập được từ tủy xương [8] Đặc điểm của BM-MSCs cũng phụ thuộc nhiều vào độ tuổi, giới tính và tình trạng bệnh lý của người hiến tặng [90] Những vấn đề này là “nhẹ nhàng” hơn đối với AT-MSCs

AT-MSCs là một nguồn MSCs hứa hẹn bởi chúng dễ dàng được phân lập với

số lượng lớn thông qua phương pháp hút mỡ xâm lấn tối thiểu [88] AT-MSCs sở hữu những đặc tính tương tự BM-MSCs bao gồm khả năng điều hòa miễn dịch, khả năng tăng sinh nhanh chóng Hơn thế, đặc tính của AT-MSCs ít bị ảnh hưởng bởi độ tuổi hơn so với BM-MSCs [23] Tuy nhiên do quá trình phân lập bằng kỹ thuật hút mỡ khiến AT-MSCs trở nên kém hấp dẫn hơn so với UC-MSCs và DP-MSCs, vốn không yêu cầu các thao tác xâm lấn phức tạp để thu thập

UC-MSCs có thể thu được từ các phần khác nhau của dây rốn, chẳng hạn như lớp Wharton Jelly, mô quanh mạch và khoang nội mạch, thông qua một phương pháp không xâm lấn, không đau và an toàn [80] UC-MSCs thể hiện khả năng tăng sinh và biệt hóa lớn so với BM-MSCs [20] Đặc biệt, chúng ít gặp vấn đề liên quan đến đạo đức vì dây rốn là bộ phận thường được loại bỏ sau khi sinh

Sự hiện diện của các dạng quần thể MSCs khác nhau trong răng đã được mô

tả và tùy thuộc vào vị trí phân lập mà chúng được gọi là tế bào gốc tủy răng MSCs), tế bào gốc dây chằng nha chu, tế bào gốc đỉnh nhú, tế bào gốc nang răng và

(DP-tế bào gốc mô nướu [89] Trong số các dòng (DP-tế bào gốc này, DP-MSCs được chú ý

vì khả năng tiếp cận dễ dàng DP-MSCs có thể được phân lập từ răng trưởng thành,

hoặc răng sữa khi chúng được thay mới Vì vậy, DP-MSCs từ răng sữa là nguồn MSCs dễ tiếp cận và không gặp vấn đề đạo đức khi mà chúng có thể được thu thập

từ các mô bị loại bỏ về mặt lâm sàng/sinh học [61] Không chỉ dễ phân lập, đặc tính của DP-MSCs cũng không hề thua kém các dòng MSCs khác DP-MSCs thể hiện khả năng điều hòa miễn dịch và biệt hóa đa dòng tương tự BM- và AT-MSCs, thậm chí khả năng tăng sinh còn nhanh hơn so với BM- và AT-MSCs [116] Đồng thời, DP-MSCs còn sở hữu khả năng chống lão hóa mạnh hơn trong môi trường căng thẳng oxy hóa [116] Hơn thế, DP-MSCs có tiềm năng lớn trong việc tái tạo các mô cơ quan

có nguồn gốc tế bào thần kinh [99], qua đó nâng cao tiềm năng trị liệu của MSCs

1.1.3 Tiềm năng trị liệu của tế bào gốc trung mô

Hiện nay MSCs đã và đang được thử nghiệm cho điều trị một loạt các bệnh như nhồi máu cơ tim, bệnh viêm ruột, ung thư, rối loạn hệ thần kinh, các bệnh về răng hàm mặt, SARS-CoV-2, bệnh Crohn, bệnh ghép chống chủ, v.v [42] Theo Thư viện

Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ, tổng cộng 9356 thử nghiệm lâm sàng về liệu pháp tế bào gốc trên toàn thế giới đã được đăng ký cho đến ngày 23/3/2023 Trong số đó, 1505 thử nghiệm có liên quan đến liệu pháp MSCs [122] Các thử nghiệm lâm sàng dựa trên MSCs chủ yếu được áp dụng cho viêm, chữa lành vết thương, nhiễm khuẩn, rối loạn chức năng cơ quan, cũng như các bệnh thoái hóa ở các cơ quan và mô khác nhau (Hình 1.1) [42]

Việt Nam cũng đang chứng kiến sự gia tăng mạnh mẽ của các nghiên cứu về

tế bào gốc nói chung và MSCs nói riêng Một số thử nghiệm về MSCs trong điều trị bệnh đã được thực hiện, có thể kể đến như: sử dụng BM-MSCs để điều trị suy tim (2007); sử dụng AT-MSCs để điều trị viêm khớp gối (2012), tổn thương tủy sống (2013), phổi tắc nghẽn mãn tính (2015); sử dụng UC-MSCs để điều trị phổi tắc nghẽn mãn tính (2020) [51, 106], v.v Đặc biệt, viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec cũng là một cơ sở nổi tiếng ở Việt Nam chuyên về lĩnh vực tế bào gốc Một số nghiên cứu nổi bật trong các năm gần đây bao gồm: sử dụng BM-MSCs tự thân để điều trị bại não (2017) [63], sử dụng UC-MSCs để điều trị loạn sản phế quản phổi (2020) [64], sử dụng BM-MSCs tự thân để điều trị đái tháo đường tuýp II (2021)

[62], sử dụng AT-MSCs để điều trị cho bệnh nhân suy giảm chức năng tình dục (2021) [65], sử dụng BM-MSCs để điều trị trẻ tự kỷ (2021) [67], sử dụng UC-MSCs

để điều trị di chứng thần kinh nghiêm trọng do viêm não (2022) [66], v.v

Hình 1.1 Các bệnh đã được nghiên cứu, điều trị bằng liệu pháp MSCs [42]

1.2 Hiện tượng đông máu sau truyền tế bào gốc trung mô

1.2.1 Báo cáo trên mô hình động vật và bệnh nhân

MSCs đã cho thấy những tiềm năng trong ứng dụng y học tái tạo và điều trị bệnh, tuy nhiên vẫn tồn tại những thách thức lớn về vấn đề an toàn Một số nghiên cứu đã cho thấy MSCs kích hoạt quá trình đông máu và gây ra biến chứng huyết khối

ở cả mô hình động vật và trên bệnh nhân điều trị Tỷ lệ tử vong cao ∼85% ở chuột

đã được ghi nhận sau khi truyền AT-MSCs qua tĩnh mạch với nguyên nhân là do thuyên tắc phổi [98] Một thử nghiệm khác trên chuột cho thấy tiêm AT-MSCs dẫn đến giảm tuần hoàn máu Kiểm tra sau đó phát hiện có MSCs mắc kẹt trong hệ thống mao mạch, dẫn đến 25-40% động vật tử vong do thuyên tắc phổi, tương ứng với liều truyền 0.2x106 và 1x106 tế bào [30] Thậm chí, BM-MSCs, một dòng tế bào gốc có tính an toàn cao cũng thể hiện hoạt tính đông máu và hình thành huyết khối gây tắc nghẽn vi mạch trên lợn (truyền 25x106 tế bào) [37] Nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra

hoạt tính đông máu của MSCs có phụ thuộc vào liều truyền Truyền BM-MSCs trên chuột ở mức 5x106/kg hoặc ít hơn dẫn đến hoạt tính đông máu tối thiểu, nhưng vẫn phát hiện lượng nhỏ tế bào mắc kẹt trong phổi Liều truyền từ 5-10x106/kg tuy làm gia tăng tình trạng đông máu với chỉ số đông máu prothrombin time kéo dài nhưng không tạo ra khác biệt có ý nghĩa thống kê Liều truyền trên 10x106/kg dẫn đến hình thành huyết khối mạnh mẽ với các chỉ số nồng độ fibrinogen và tiểu cầu thấp đáng

kể, tăng nồng độ lactate và gia tăng bạch cầu trong phổi [109]

Các biến chứng sau cấy ghép MSCs trên bệnh nhân cũng được ghi nhận Năm

2013, một người đàn ông tại Hàn Quốc đến bệnh viện thăm khám vì cơn đau ngực bắt đầu từ một tháng trước Bệnh viện sau đó phát hiện nhiều vị trí thuyên tắc trong các nhánh động mạch phổi của cả hai phổi, đồng thời có biến chứng nhồi máu phổi phải Được biết, người đàn ông này trước đó đã từng 3 lần truyền tĩnh mạch AT-MSCs để điều trị thoát vị đĩa đệm cột sống, tại một cơ sở chưa đủ thẩm quyền để điều trị bằng liệu pháp MSCs Cha mẹ của người đàn ông này cũng thực hiện liệu pháp tương tự năm lần Kết quả chụp cắt lớp phát hiện cả hai người đều có nhiều thuyên tắc ở cả hai nhánh động mạch phổi kèm theo tràn dịch phổi phải [47]

Trong một báo cáo khác, hai bệnh nhân ghép thận và bệnh thận mãn tính đã trải qua huyết khối sau khi truyền UC-MSCs (6x107 tế bào, tương đương 1x106/kg thể trọng) Vào ngày thứ hai và thứ ba sau khi truyền, cả hai đều bị đau và sưng gần

vị trí tiêm Siêu âm doppler sau đó đã phát hiện các cục máu đông ở tĩnh mạch gần vị trí tiêm, kèm theo đó là sự gia tăng nồng độ D-dimer trong máu (chỉ số đánh giá mức

độ thoái hóa của cục máu đông, phản ánh đã có sự hình thành huyết khối trước đó) [110] Ở pha 1b của nghiên cứu sử dụng MSCs từ nhau thai để điều trị bệnh Crohn, một trong ba bệnh nhân điều trị đã xuất hiện huyết khối tĩnh mạch tại vị trí tiêm (truyền 1.5x108 tế bào) [56] Một báo cáo khác ghi nhận đã xuất hiện biến chứng huyết khối trong quá trình truyền MSCs có nguồn gốc từ gan (hai lần truyền với 1.25

và 2.3x106 tế bào) Huyết khối tĩnh mạch cửa gan trái đã được quan sát thấy bằng siêu âm doppler, cùng với đó là sự gia tăng nồng độ D-dimer sau đợt truyền thứ hai

Bệnh nhân sau đó được điều trị bằng thuốc chống đông máu và may mắn không có bất kỳ hậu quả nào [92]

1.2.2 Tác nhân gây đông máu sau truyền tế bào gốc trung mô

Các báo cáo về biến chứng huyết khối sau cấy ghép MSCs đã dẫn đến những nghiên cứu sâu hơn về nguyên nhân của hiện tượng này Một nghiên cứu đã chỉ ra cả MSCs từ gan và BM-MSCs đều thể hiện hoạt tính đông máu Xét nghiệm PCR và phân tích tế bào theo dòng chảy sau đó đã chỉ ra mối tương quan giữa hoạt tính đông

máu của MSCs và mức độ biểu hiện cao của protein gọi là dấu ấn mô (tissue factor

- TF, hay protein đánh dấu bề mặt - CD142) [95]

Mối tương quan giữa hoạt tính đông máu và biểu hiện của TF cũng được một

số nghiên cứu khác xác nhận Một công bố chỉ ra hoạt tính đông máu liên quan trực tiếp đến lượng TF biểu hiện trên MSCs, trong đó BM-MSCs có hoạt tính đông máu

và biểu hiện TF thấp hơn so với UC-MSCs [60] Trong một nghiên cứu khác, hoạt tính đông máu của MSCs có tương quan với tỷ lệ tế bào biểu hiện TF trên bề mặt Tác giả cũng chỉ ra rằng AT-MSCs có hoạt tính đông máu cao hơn, cùng với biểu hiện TF cao hơn khi so với BM-MSCs Tuy nhiên, MSCs từ cùng một nguồn có thể khác nhau về mức độ biểu hiện TF và hoạt tính đông máu phụ thuộc vào người hiến tặng [15] Ngoài ra, biểu hiện của TF và hoạt tính đông máu trên nhiều nguồn MSCs khác bao gồm tủy xương, mỡ, nước ối, dây rốn cũng được các nhóm nghiên cứu xác nhận [35]

Mặt khác, một số bằng chứng về sự hiện diện của TF trong các mảng huyết khối đã được xác nhận TF được tìm thấy trong lõi lipid của các mảng xơ vữa động mạch [40] TF nội mạch tăng cao đã được báo cáo trong các bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn huyết [31], hội chứng kháng phospholipid [3] và bệnh hồng cầu hình liềm [49] Mối liên hệ giữa TF với các bệnh khác nhau đã dẫn tới những nghiên cứu chi tiết về loại protein này

1.3 Dấu ấn mô và vai trò

1.3.1 Biểu hiện của dấu ấn mô trong các loại mô, tế bào

Về tổng thể, TF được biểu hiện ở hầu khắp các mô cơ quan trên cơ thể, với mức độ biểu hiện khác nhau giữa các cơ quan, các dòng tế bào, và thậm chí là giới tính (Hình 1.2) [119] Phân tích sâu hơn về mức độ biểu hiện ARN cho thấy các cơ quan thể hiện mạnh mẽ TF là nhau thai, mô mỡ, buồng trứng, tụy, tuyến nước bọt, ống dẫn trứng, cũng như các cơ quan ở não (Hình 1.3) [13, 119] Điều này không phải một sự ngẫu nhiên, khi mà những cơ quan như nhau thai, mô mỡ hay não, v.v

là nơi tập trung mật độ cao các mạch máu

Hình 1.2 Sơ đồ biểu hiện TF theo giới

tính [119]

Mức độ biểu hiện TF ở nữ (trái) và nam (phải) được thể hiện bằng độ đậm nhạt của màu đỏ

Hình 1.3 Cường độ biểu hiện TF ở các mô, cơ quan [119]

Tuy rằng TF biểu hiện mạnh ở các cơ quan tập trung nhiều mạch máu, nhưng thực tế protein này phần lớn biểu hiện ở những dòng tế bào không có sự tiếp xúc trực

tiếp với máu Những tế bào biểu hiện cao TF có thể kể đến như: tế bào phế nang, tế bào sao, nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn, tế bào cơ tim, tế bào quanh thành mạch, v.v [119] Ngược lại, protein TF được tìm thấy rất thấp, hoặc gần như không có ở các dòng tế bào như hồng cầu, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, v.v [119] Nhìn chung,

TF hình thành ranh giới bao quanh các mạch máu và bao phủ các cơ quan để bảo vệ chúng khỏi bị thương và các tình trạng bệnh lý khác Ngược lại, để ngăn chặn sự kích hoạt đông máu bất thường, TF thường không được biểu hiện ở các tế bào có sự tiếp xúc trực tiếp với máu Sự khác biệt về phân bổ biểu hiện TF giữa các dòng tế bào là

do liên quan đến chức năng chính của TF - đông máu

1.3.2 Cấu trúc của dấu ấn mô

TF còn được gọi là yếu tố đông máu III, hoặc thromboplastin mô hoặc CD142,

là một glycoprotein xuyên màng thuộc họ thụ thể cytokine lớp 2 Glycoprotein này

được mã hóa bởi gen F3 gồm 6 exon Quá trình cắt nối luân phiên có thể tạo ra 3

dạng đồng phân ARN TF khác nhau, bao gồm TF toàn chiều dài (Full length TF – flTF), TF cắt nối (alternatively spliced TF – asTF) thiếu exon 5, và TF kết thúc sớm (Hình 1.4) [25] Trong đó, dạng TF thứ ba do trong quá trình cắt nối luân phiên còn sót lại một phần của intron 1, dẫn tới kết thúc sớm dịch mã và không thể hình thành protein của nó Vì vậy mà các nghiên cứu chỉ tập trung vào flTF và asTF

Hình 1.4 Sơ đồ phiên mã các dạng đồng phân của protein TF [25]

Về cấu trúc, sự thiếu vắng exon 5 của asTF so với flTF đã dẫn đến những khác biệt trong đặc điểm của hai protein flTF là một glycoprotein xuyên màng dài 263 acid amin, gồm ba miền là ngoại bào, xuyên màng và nội bào Trong khi đó, asTF chỉ dài 206 acid amin và chỉ có duy nhất miền ngoại bào (Hình 1.5) flTF còn được tìm thấy trên bề mặt các vi hạt (túi tiết – microvesicles) Sự xuất hiện của vi hạt mang flTF đã được tìm thấy trong nhiều loại dịch cơ thể như sữa, nước bọt, nước tiểu và nước ối, được mô tả như một cơ chế bảo vệ cơ thể khỏi những tổn thương xuất huyết [46] Việc giải phóng flTF vào lưu thông giúp mở rộng tầm hoạt động của phân tử protein này Điều này cũng được thực hiện đối với asTF nhưng không cần sự tham gia hỗ trợ của các vi hạt.

Hình 1.5 Vị trí và cấu trúc các đồng phân của TF

A) TF có mặt ở ba dạng đồng phân: (1) dạng neo màng sinh chất - flTF, (2) dạng hòa tan asTF và (3) flTF trên bề mặt vi hạt B) Sơ đồ cấu trúc flTF và asTF [101]

asTF mang những đặc điểm khác với flTF Đồng phân này thiếu miền xuyên màng cũng như các gốc hóa học quan trọng để tương tác với yếu tố đông máu X [25, 101] Nó có thể lưu thông trong máu giống như flTF trên các vi hạt, nhưng chỉ thể hiện hoạt tính đông máu ở mức cơ bản [102] Chỉ khi asTF tiếp xúc với phospholipid,

nó mới trở thành tiền chất đông máu và tham gia vào quá trình hình thành thrombin [102] Ngoài ra, dạng đồng phân này gần đây đã được chứng minh là liên quan chặt

chẽ với nhiều chức năng khác nhau trong tế bào thông qua kích hoạt các con đường tín hiệu (Hình 1.6) [52]

Hình 1.6 TF kích hoạt các con đường chuyển hóa trong tế bào

asTF trực tiếp kích hoạt integrin αvβ3 cũng như α6β1 dẫn đến kích hoạt kinase bám dính khu trú (FAK), sau đó tiếp tục hoạt hóa con đường tín hiệu tế bào bằng PI3K hoặc thông qua MAPK Trái ngược với asTF, flTF liên kết yếu tố đông máu FVIIa Phức hợp này có thể kích hoạt thụ thể hoạt hóa protease 2 (PAR-2) và truyền tin thông qua các protein kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào 1 và 2 (ERK1 / 2), protein kinase B (Akt), p44 / 42 MAPK và

PKC [52]

1.3.3 Chức năng của dấu ấn mô

TF là một protein đa chức năng TF tham gia vào nhiều hoạt động trên các dòng tế bào và có vai trò quan trọng đối với cơ thể Bên cạnh vai trò chính trong đông máu, TF còn tham gia vào nhiều hoạt động khác, bao gồm truyền tin [52], hình thành mạch [25], duy trì sự sống [101], tăng sinh tế bào [25], xâm lấn di căn [52] và thậm chí là ngăn chặn sự lây lan của mầm bệnh [39], kháng khuẩn [74] Ngoài ra, TF còn liên hệ mật thiết tới nhiều bệnh, như bệnh đái tháo đường tuýp II [108], nhiễm khuẩn

huyết [41], bệnh gan mãn tính [14], bệnh hồng cầu hình liềm [11], COVID-19 [38], v.v TF được biểu hiện mạnh mẽ và thúc đẩy phát triển khối u trong nhiều loại ung thư như ung thư phổi, ung thư vú, ung thư bạch cầu, và nhiều loại ung thư khác [25,

71, 101] Điều này góp phần tăng đáng kể tỷ lệ mắc bệnh và tử vong của bệnh nhân [115] Do đó, nhắm mục tiêu TF được mô tả như là một trong những hướng đi mới nhằm điều trị ung thư [25] Để phù hợp với nội dung của đề tài, nghiên cứu này chỉ thảo luận về TF dưới vai trò là nhân tố khởi đầu con đường đông máu cũng như tác động của TF đối với MSCs

Đông máu là một quá trình sinh lý để bảo vệ cơ thể khỏi bị thương và chảy máu TF đóng một vai trò quan trọng trong quá trình đông máu, bằng cách khởi đầu con đường đông máu ngoại sinh Miền ngoại bào TF không có hoạt tính enzyme, nhưng lại là thụ thể cho yếu tố đông máu VII (Factor VII – FVII) [45] Sau tương tác, yếu tố FVII sẽ chuyển thành dạng hoạt động (FVII activated - FVIIa), và khởi động hoạt tính protease kích hoạt con đường đông máu (Hình 1.7) [54] Phức hợp TF-FVIIa lúc này phân cắt protein đông máu FX thành dạng hoạt động FXa Thêm vào đó, FVIIa cũng có thể kích hoạt FIX hình thành phức hợp FIXa/FVIIIa để tăng cường hoạt hóa FXa nhiều hơn FXa sau đó thực hiện phân giải prothrombin thành thrombin Thrombin tiếp tục cắt fibrinogen thành fibrin Fibrin sau đó điều hòa hoạt động của

FV, FVIII và tiểu cầu trong giai đoạn khuếch đại, nhằm tạo ra lượng fibrin ổn định

và đủ theo nhu cầu [54] Cuối cùng, fibrin sẽ tham gia tạo thành các cục đông để ổn định và đóng chặt miệng vết thương

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt con đường đông máu [54]

1.3.4 Mối liên hệ giữa dấu ấn mô và tế bào gốc trung mô

Nếu xét trên khía cạnh cấy ghép, rõ ràng biểu hiện của TF trên MSCs có tác động tiêu cực khi mà chúng là nguyên nhân dẫn đến các biến chứng huyết khối gây nguy hiểm cho bệnh nhân Ức chế biểu hiện TF là một trong những con đường đầy hứa hẹn để cải thiện đặc tính của MSCs Đã có một số báo cáo về việc giảm biểu hiện

TF thông qua việc tăng cường biểu hiện chất ức chế TF (TFPI) [82] hoặc ức chế gen

mã hóa TF bởi hệ thống CRISPR [72] Một nghiên cứu gần đây đã thành công trong

việc ức chế ~72% sự biểu hiện của TF thông qua siARN hướng đích gen F3 (gen mã

hóa TF) nhờ hệ thống hạt nano vận chuyển [79] Các thí nghiệm tiếp sau đó đã chỉ ra MSCs thiếu TF đã làm giảm phản ứng viêm tức thì qua trung gian máu so với nhóm MSCs đối chứng [79] Ngoài ra, MSCs bị ức chế TF còn tăng cường tiềm năng biệt hóa tạo xương và tạo mỡ [79] Một nghiên cứu khác với mục tiêu bất hoạt TF trên

mô lợn nhằm tạo ra các mô cơ quan tương thích máu cho cấy ghép nội tạng cũng đã bước đầu thành công với việc làm giảm đáng kể thời gian đông máu và hình thành huyết khối Thử nghiệm này đem lại ý nghĩa rằng bất hoạt TF có thể tạo ra những mô

cơ quan lợn biến đổi gen an toàn cho cấy ghép [2] Tuy nhiên, việc chỉnh sửa gen tồn tại những nguy cơ về mặt an toàn, khi mà tác động của chúng đối với tế bào, cơ thể vẫn chưa thể nắm bắt

Những giải pháp an toàn khác đối với cấy ghép MSCs đã được khuyến nghị Heparin được sử dụng đồng thời trong cấy ghép MSCs nhằm giảm thiểu tác động đông máu bằng cách làm bất hoạt thrombin và yếu tố X trong con đường đông máu Với các dòng MSCs có đặc tính gây huyết khối càng cao, lượng heparin cần dùng cũng phải tăng lên tương ứng [34] Nhưng sử dụng heparin quá liều có thể dẫn đến biến chứng và tử vong [124] Một nghiên cứu khác còn cho thấy chỉ sử dụng heparin

là không đủ để ngăn chặn khả năng hình thành huyết khối gây ra bởi MSCs có nguồn gốc từ gan người trưởng thành [95] Bằng cách sử dụng đồng thời heparin và bivalirudin (một chất ức chế thrombin), hai bệnh nhân đã thành công cấy ghép MSCs

có nguồn gốc từ gan người trưởng thành mà không ghi nhận bất kỳ biến chứng huyết khối nào [95] Thêm vào đó, heparin được chỉ ra là ức chế các thụ thể và phối tử của con đường tín hiệu SDF-1/CXCR4, dẫn tới ảnh hưởng quá trình hướng đích và di chuyển của BM-MSCs [86] Điều này không xảy ra ở bivalirudin Nhưng việc sử dụng bivalirudin cũng chưa hẳn là an toàn tuyệt đối Một nghiên cứu báo cáo trong mười bốn bệnh nhân ghép MSCs từ gan sử dụng thuốc chống đông bivalirudin đã có

một bệnh nhân bị biến chứng huyết khối tĩnh mạch cửa trái và một bị huyết khối cục

bộ tại chỗ và phải điều trị kéo dài với heparin trong vài tháng sau đó [91]

Tình trạng đông máu gây ra bởi TF trong cấy ghép MSCs vẫn chưa thể tìm được những giải pháp khắc phục triệt để, và do đó vẫn cần thêm những nghiên cứu nhằm nâng cao hiểu biết về mối liên hệ giữa TF và MSCs Luận văn này sẽ tập trung thảo luận về mối liên hệ giữa TF và MSCs trong quá trình cấy ghép Vì vậy, các khía cạnh được thảo luận sẽ liên quan đến các yếu tố trước cấy ghép MSCs như: nguồn MSCs, thời gian nuôi, dung dịch đệm truyền, cũng như các điều kiện sau cấy ghép MSCs như: tình trạng viêm, nồng độ oxy, tình trạng chết tế bào và các đặc điểm lâm sàng

• TF và các nguồn MSCs

MSCs biểu hiện TF không đồng nhất, tùy thuộc vào nguồn mô phân lập [15,

60, 68] BM-MSCs trước nay được lựa chọn sử dụng trong điều trị vì đặc tính an toàn của nó Thật vậy, dòng tế bào này cũng đã được chứng minh là ít có nguy cơ gây biến chứng huyết khối cũng như mức độ biểu hiện của TF rất thấp [15] Những nghiên cứu khác chỉ ra tỷ lệ biểu hiện TF cao ở các nguồn MSCs như AT-, UC-, DP-MSCs [4] Thời gian hình thành huyết khối cũng khác nhau giữa các nguồn MSCs, khi mà AT-MSCs có thời gian đông máu nhanh hơn BM-MSCs [15], trong khi DP-MSCs và UC-MSCs có thời gian hình thành cục fibrin tương đồng nhau [4] Tuy nhiên, việc lựa chọn nguồn MSCs cho cấy ghép không chỉ phụ thuộc mức độ biểu hiện TF mà còn phải suy xét đến đặc tính nổi bật, điều kiện phân lập và mục đích sử dụng của từng dòng tế bào gốc Vì vậy, mặc dù tồn tại bất lợi về nguy huyết khối cao, các dòng MSCs như AT- và UC-MSCs vẫn được ứng dụng rộng rãi

• TF và môi trường nuôi MSCs

Yếu tố huyết thanh bổ sung vào môi trường nuôi MSCs có thể làm tăng biểu hiện của TF Một nghiên cứu so sánh biểu hiện TF ở MSCs nuôi trong môi trường có huyết thanh thai bò (fetal bovine serum – FBS) và môi trường chứa dung dịch ly giải tiểu cầu người (human platelet lysate – HPL) đã thể hiện điều này [68] Kết quả nghiên cứu chỉ ra FBS làm tăng biểu hiện TF ở MSCs từ tủy xương và mô mỡ, trong

khi HPL làm tăng biểu hiện TF ở MSCs từ dây rốn Mặt khác, cả ba dòng MSCs kể trên khi nuôi trong FBS đều có thời gian hình thành cục fibrin nhanh hơn, cũng như kích thước cục fibrin to hơn so với khi nuôi trong môi trường có chứa HPL Đây là vấn đề đáng bận tâm, bởi phần lớn các nghiên cứu về TF được thực hiện trong môi trường có FBS Trong khi đó, những nghiên cứu trên môi trường không huyết thanh

và không yếu tố động vật vẫn còn rất hạn chế

Đồng thời, việc sử dụng FBS cũng không được khuyến khích bởi các cơ quan quản lý do nguy cơ lây nhiễm sinh học (nấm, vi khuẩn, prion, vi rút và nội độc tố) và các hợp chất có nguồn gốc động vật có thể ảnh hưởng đến đặc tính của tế bào [16] Hơn nữa, việc thu thập FBS cũng gây ra cái chết đau đớn của thai bò và làm dấy lên tranh cãi về mặt đạo đức [16] Vì vậy việc loại bỏ huyết thanh và yếu tố động vật ra khỏi quy trình nuôi tế bào đã và đang là xu thế của ngành công nghệ sinh học

• TF và thời gian nuôi MSCs

Thời gian nuôi MSCs có thể làm suy giảm biểu hiện của TF Nghiên cứu của Christy đã chỉ ra biểu hiện của TF bị suy giảm khi nuôi lâu dài (lên đến 20 lần nhân đôi tế bào) [15] Sự giảm biểu hiện TF ở các thế hệ nuôi cao hơn có thể làm giảm nguy cơ biến chứng huyết khối khi cấy ghép, nhưng lại tạo ra mối lo ngại khác về đặc tính của MSCs khi mà chúng bị thay đổi theo thời gian Thế hệ nuôi càng cao thì khả năng tăng sinh, khả năng biệt hóa, sức sống, v.v của tế bào gốc đều trở nên suy giảm

và qua đó làm giảm hiệu quả điều trị [117] Vì vậy, cần cân nhắc lựa chọn MSCs ở các thế hệ nuôi phù hợp sao cho vừa đảm bảo đặc tính của chúng, mà vừa đem lại sự

an toàn cần thiết

• MSCs và dung dịch đệm truyền

Tế bào cần phải được hòa trong các dung dịch đệm truyền, thường là đẳng trương, trước khi truyền vào cơ thể bệnh nhân Có nhiều loại dung dịch đệm truyền đẳng trương khác nhau như nước muối sinh lý NaCl 0.9%, ringer’s lactate (RL), Dextrose 5% Trong đó phổ biến là hai loại đệm NaCl 0.9% và RL Các loại dung dịch đệm truyền này không làm thay đổi biểu hiện của TF trên bề mặt MSCs, nhưng chúng vẫn có những tác động nhất định đối với quá trình đông máu Vì RL có chứa

canxi, một số bác sĩ khuyến nghị không sử dụng chúng trong quá trình truyền máu bởi lượng canxi dư thừa có thể làm tăng nguy cơ đông máu [123] Thực tế ghi nhận trong ghép tạng, hai trường hợp biến chứng huyết khối động mạch thận đã được báo cáo trong nhóm sử dụng RL ngay sau khi ghép thận [50] Trong một nghiên cứu khác, việc sử dụng RL trong ghép gan có liên quan đến tỷ lệ tử vong cao hơn so với sử dụng nước muối sinh lý [18] Tuy tác động của RL đối với quá trình cấy ghép MSCs còn chưa được làm rõ, nhưng những bằng chứng trên đã phần nào chỉ ra nguy cơ kích thích đông máu gây ra bởi RL là nguy hiểm hơn so với NaCl 0.9%

• TF và tình trạng viêm

Điều hòa biểu hiện TF và ảnh hưởng của các yếu tố gây viêm đã được nghiên cứu kỹ Nhiều yếu tố trong quá trình viêm dẫn tới thay đổi biểu hiện TF, có thể kể đến như: lipopolysaccharide vi khuẩn, histamine, cytokine, MCP-1, CD40L, tế bào

T, VEGF, PDGF, v.v

Lipopolysaccharide vi khuẩn (LPS, còn được gọi là nội độc tố), cấu tạo nên màng ngoài của vi khuẩn gram âm, kích hoạt sự biểu hiện của TF trên tế bào đơn nhân và tế bào nội mô [10, 114] Histamine, một chất trung gian gây viêm, làm tăng

TF trên bạch cầu đơn nhân, tế bào nội mô và cơ trơn mạch máu [70, 94] Các cytokine tiền viêm như IL-6, IL-17, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-33 cũng làm tăng cường biểu hiện TF [32, 96] Hiệu ứng này bị giảm bớt bởi các cytokine chống viêm như IFN-γ, IL-4, IL-10 và IL-13 [1, 58, 73] Protein hóa hấp dẫn bạch cầu đơn nhân 1 (MCP-1),

có nhiệm vụ thu hút các tế bào miễn dịch đến các vị trí viêm, cũng làm tăng TF trên bạch cầu đơn nhân và tế bào cơ trơn [84] Thụ thể CD40L trên tế bào T CD4+ là một tác nhân kích thích TF hoạt động trong tế bào nội mô, bạch cầu đơn nhân và tế bào

cơ trơn mạch máu [53, 57, 85] Các yếu tố tăng trưởng có thể làm trung gian điều hòa

TF Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF) làm tăng mức TF trong các

tế bào nội mô [9] Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGF) kích hoạt biểu hiện TF trong các tế bào cơ trơn mạch máu và bạch cầu đơn nhân [33]

Như vậy, có rất nhiều yếu tố miễn dịch và tăng trưởng có thể ảnh hưởng biểu hiện của TF Quá trình viêm có thể xảy ra trong khi truyền MSCs hoặc khi MSCs tiếp

xúc với các mô cơ quan tổn thương, dẫn đến làm thay đổi biểu hiện TF và gây ra các biến chứng huyết khối

• TF và nồng độ oxy

Thông thường, MSCs được nuôi trong điều kiện oxy khí quyển (21% ~ 159mmHg), nhưng khi được cấy ghép, chúng sẽ phải tiếp xúc với nồng độ oxy vào khoảng 75-100mmHg trong hệ mạch Thực tế, những vị trí mà tế bào gốc tồn tại bên trong cơ thể chúng ta đều có nồng độ oxy thấp hơn, vào khoảng 1% đến 6% trong tủy xương, 2-8% trong mô mỡ, và khoảng 2-3% trong nhau thai [27, 43, 93]

Nồng độ oxy thấp có những tác động khác nhau đến tế bào gốc Nồng độ oxy thấp giúp tế bào duy trì tính gốc lâu dài hơn, thúc đẩy sự tăng sinh, sống sót và di cư của MSCs [113] Vì vậy, nuôi trong điều kiện oxy sinh lý đã được đề xuất như một phương pháp kỹ thuật nhằm cải thiện tiềm năng điều trị của MSCs [113]

Điều kiện oxy thấp có thể dẫn đến sự gia tăng về biểu hiện của TF Nghiên cứu trên đại thực bào cho thấy nồng độ oxy thấp dẫn đến tăng cường tích lũy Egr-1 (early growth response gene-1), một yếu tố phiên mã bám trên promoter gen mã hóa

TF [112] Trong một nghiên cứu khác, HIF-1α (hypoxia-inducible factor-1α), làm trung gian cho quá trình điều chỉnh tăng biểu hiện TF do thiếu oxy gây ra thông qua yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu trên tế bào ung thư vú [97] Tình trạng oxy thấp còn dẫn tới sự biểu hiện của các yếu tố cắt nối luân phiên Clk1 và Clk4, cũng như các yếu tố thúc đẩy tăng sinh và tạo mạch Cyr61, từ đó làm tăng cường sản xuất asTF cũng như flTF trong tế bào ung thư phổi [26]

Biểu hiện của TF trên MSCs trong điều kiện oxy thấp chưa được nghiên cứu nhiều Trong một nghiên cứu trên MSCs, điều kiện oxy sinh lý được chứng minh là làm tăng biểu hiện TF trên MSCs từ tủy xương lợn, nhưng không làm thay đổi biểu hiện TF trên MSCs từ tủy xương người [6] Dù vậy, kết luận này được đưa ra đối với MSCs từ tủy xương người, vốn có hoạt tính kích thích đông máu thấp hơn rất nhiều nếu so sánh với MSCs từ dây rốn, mô mỡ hay tủy răng ở người

• TF và tình trạng chết tế bào

Điều kiện chuẩn bị và bảo quản có những tác động nhất định tới chất lượng tế bào Quy trình rã đông, hoặc những biến cố trong quá trình thao tác có thể dẫn đến chết tế bào và làm tăng biểu hiện TF Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các tổn thương

tế bào (tế bào bị phá vỡ, hư hỏng), dẫn đến tăng giải phóng các ARN ngoại bào (eARN), gây ra sự điều hòa tăng biểu hiện của TF được trung gian qua thụ thể Toll-

3 (Toll-like receptor 3) [7]

Cách thứ hai, những tế bào MSCs xấu số này giải phóng phosphatidylserine, một chiếc chìa khóa để khử mã hóa TF [39] Mặc dù TF được biểu hiện trên bề mặt

tế bào, nhưng nhiều ý kiến cho rằng hầu hết chúng được duy trì ở trạng thái mã hóa

và cần có bước hoạt hóa để có thể kích hoạt con đường đông máu Phospholipid đóng vai trò trung tâm trong quá trình này Trong các tế bào khỏe mạnh, họ P4 của enzyme flippase lipid duy trì sự phân bố không đối xứng của phospholipid trên màng tế bào, với phosphatidylserine (PS) và phosphatidylethanolamine trên màng trong và phosphatidylcholine, sphingomyelin và glycosphingolipids trên lớp màng ngoài (Hình 1.8) [39] TF được sphingomyelin giữ ở trạng thái mã hóa và đặc trưng bởi hoạt tính tiền đông máu thấp Khi các tế bào trải qua quá trình chết theo chương trình, các enzym màng có tên là scramblase chuyển PS và phosphatidylethanolamine tích điện âm từ màng trong ra màng ngoài của màng tế bào, để báo hiệu quá trình thực bào hoặc đông máu Scramblase làm trung gian cho sự gia tăng PS trên bề mặt tế bào, cho phép biến đổi TF thành dạng hoạt động (khử mã hóa) [39]

Về mặt nguyên lý, có hai cơ chế giải thích sự kích thích TF thông qua phân tử

PS Thứ nhất, sự định vị của PS trên màng ngoài đóng vai trò là vị trí liên kết với các protein đông máu như FX, dẫn tới thúc đẩy tiếp xúc giữa FX và TF-FVIIa, qua đó làm tăng đáng kể phản ứng đông máu [87].Một cơ chế thứ hai được đề xuất dù còn nhiều tranh cãi, sự tương tác trực tiếp giữa PS và TF hoặc TF-FVIIa sẽ dẫn đến những thay đổi cấu trúc trong TF, làm lộ các vị trí liên kết cho các yếu tố X và IX [69] Cách thứ ba, các kích thích tế bào như viêm hoặc chết theo chương trình dẫn đến giải phóng axit sphingomyelinase xúc tác quá trình chuyển đổi SM thành ceramide, dẫn tới hoạt

hóa TF [39] Tổng kết lại, sự chết tế bào theo nhiều cơ chế khác nhau đã dẫn đến tăng cường hoạt động của TF

Hình 1.8 Sơ đồ nguyên lý quá trình khử mã hóa TF thông qua phospholipid

Ở trạng thái nghỉ, phospholipid trong màng sinh chất tế bào phân bố một cách không đối xứng Phosphatidylcholine (PC) và sphingomyelin (SM) chủ yếu ở lớp màng ngoài, trong khi phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS) và phosphatidylethanolamine (PE) tập trung ở lớp màng bên trong Sự hiện diện của SM và PC ở lớp màng bên ngoài giúp duy trì TF ở trạng thái mã hóa (hoạt động chức năng cơ bản) Sau khi tế bào được kích thích, phospholipid scramblase làm trung gian chuyển PS từ lớp màng trong sang lớp màng ngoài Đồng thời, kích hoạt tế bào cũng dẫn đến giải phóng axit sphingomyelinase (ASM) xúc tác quá trình chuyển đổi SM thành ceramide (Cer) Hai quá trình này dẫn đến việc khử mã hóa

TF [39]

• Biểu hiện của gen mã hóa TF và các gen tiền kích thích/ức chế đông máu

Như đã trình bày trước đó, TF được mã hóa bởi gen F3, hay còn gọi là TFF3 Xác định mức độ phiên mã gen TFF3 trên các dòng tế bào được kỳ vọng sẽ cung cấp

thêm những hiểu biết về biểu hiện của TF đối với hoạt tính gây đông máu trên MSCs Ngoài ra, TF không phải yếu tố duy nhất ảnh hưởng đến hoạt tính đông máu trên MSCs Một số yếu tố khác cũng tham gia quá trình đông máu, có thể kể đến như

collagen-1 (COL1A1) kích thích quá trình đông máu, trong khi TFPI và thụ thể

Prostaglandin I2 (PTGIR) ức chế quá trình này Sự tiếp xúc của collagen và tiểu cầu

khi thành mạch tổn thương dẫn đến hoạt hoá tiểu cầu và gây ra sự kết tập tiểu cầu bằng cầu nối trung gian fibrinogen, qua đó kích thích quá trình đông máu [105]

Ngược lại, TFPI ức chế phức hợp TF‐FVIIa‐FXa, do đó ức chế khởi đầu đông máu, làm giảm các kích thích tiền đông máu trước khi thrombin được tạo ra [55] PTGIR

hay prostacyclin, là một trong những prostanoids, một nhóm các hormone làm trung

gian trong quá trình viêm Đồng thời, PTGIR cũng hoạt động như một thuốc giãn

mạch và một chất ức chế mạnh kết tập tiểu cầu và làm giảm đông máu [22] Vì vậy,

đánh giá biểu hiện các gen COL1A1, TFPI và PTGIR được kỳ vọng sẽ giúp phần nào

đánh giá tiềm năng tiền kích thích / ức chế đông máu giữa các dòng tế bào MSCs khác nhau

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên các các dòng MSCs người có nguồn khác nhau, bao gồm AT-MSCs, BM-MSCs, DP-MSCs, UC-MSCs Bên cạnh đó, tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn người (Human umbilical vein endothelial cells – HUVECs) được sử dụng như một mẫu đối chứng sinh học HUVECs là tế bào lót thành mạch

và có sự tiếp xúc trực tiếp với dòng máu Vì vậy chúng biểu hiện rất thấp TF cũng như hoạt tính đông máu gần như không có Những đặc tính này khiến HUVECs được lựa chọn để làm dòng tế bào đối chứng Số lượng các dòng tế bào sử dụng trong đề tài được trình bày chi tiết tại bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách và số lượng các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu Dòng tế bào AT-MSCs BM-MSCs DP-MSCs UC-MSCs HUVECs

*Thế hệ 2-10 sử dụng cho thí nghiệm phân tích dấu ấn mô và thời gian nuôi

**Thế hệ 04 sử dụng cho các thí nghiệm còn lại

Tất cả dòng tế bào dùng trong nghiên cứu này được chấp thuận sử dụng từ nguồn lưu trữ của các đề tài khác thuộc nội bộ bệnh viện đa khoa quốc tế Vinmec Trong đó:

• Các dòng MSCs được phân lập, lưu trữ trong quá trình thực hiện đề tài “Xây dựng ngân hàng tế bào gốc trung mô từ tủy xương, mô mỡ và dây rốn” Mã

quyết định: 122/2019/QĐ-VMEC

• Dòng tế bào HUVECs được phân lập, lưu trữ trong nội dung thực hiện đề tài

“Ứng dụng tế bào gốc MUSE trong tạo mạch máu nhân tạo bằng công nghệ

in 3D sinh học không sử dụng khuôn”, mã số: VINIF 2020 DA07

Các dòng tế bào sau phân lập đều được kiểm tra bộ tiêu chí đánh giá MSCs theo Hiệp Hội Quốc tế về liệu pháp tế bào ISCT 2006 [21], cùng với một số xét nghiệm vi khuẩn vi nấm, bao gồm:

Bảng 2.2 Danh mục các tiêu chí đánh giá MSCs dùng trong nghiên cứu

Tiêu chuẩn Phương pháp Tiêu chuẩn mẫu

Thế hệ Nuôi cấy Thế hệ 0 và 1

Hình thái Quan sát dưới kính hiển vi Kiểu hình tế bào đặc trưng của MSCs

Tỷ lệ sống Nhuộm Trypan Blue ≥ 90%

Khả năng biệt hoá xương

Nuôi cấy trong môi trường biệt hoá tế bào xương và nhuộm với Alizarin Red

Hiển thị màu đỏ với thuốc nhuộm

Khả năng biệt hoá mỡ

Nuôi cấy trong môi trường biệt hoá tế bào mỡ và nhuộm

với Oil Red O

Các giọt mỡ trong tế bào hiển thị màu đỏ với thuốc nhuộm

Khả năng biệt hoá sụn

Nuôi cấy trong môi trường biệt hoá tế bào sụn và nhuộm với Alcian Blue

Hiển thị màu xanh với thuốc nhuộm

Vi khuẩn, vi nấm Nuôi cấy Dưới ngưỡng phát hiện của phản ứng

*Những kết quả về định danh và kiểm tra chất lượng tế bào được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài trực tiếp phân lập Do đó, những kết quả trên sẽ không được thể hiện trong nội dung đề tài này

2.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất, thiết bị dùng trong nghiên cứu được cân nhắc lựa chọn và đạt tiêu chuẩn chất lượng cho các thí nghiệm trên tế bào Danh mục các mặt hàng hóa chất (Bảng 2.3) và thiết bị (Bảng 2.4) dùng trong nghiên cứu được trình bày bên dưới

Bảng 2.3 Danh mục hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất

Bộ đệm tái tạo khả năng thẩm thấu màng

Bộ kit phân tích MSCs của người BD Biosciences Hoa Kỳ

Chất nền phủ bề mặt chai/đĩa nuôi

Dung dịch đệm truyền Ringer’s Lactate Fresenius Kabi Việt Nam

Kháng thể CD105-PerCP-Cy5.5 BD Biosciences Hoa Kỳ

Tên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất

Kit PCR PerfeCTa SYBR Green

Kit phiên mã ngược SuperScriptTM IV Invitrogen Hoa Kỳ

Kit tách chiết ARN QIAamp RNA Blood

Môi trường chuyên biệt cho tế bào gốc

(StemMACS™ MSC Expansion Media

XF)

Miltenyi Biotec Đức

Bảng 2.4 Danh mục thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

Hệ thống đọc vi bản đa chế độ Tecan

Kính hiển vi huỳnh quang soi ngược Olympus Hoa kỳ Máy lắc có điều nhiệt MAXQ 4000 Thermo Scientific Hoa kỳ

Máy nhân gen Real-time PCR 7500 Applied

Biosystems Hoa Kỳ

Máy phân tích tế bào theo dòng chảy BD

Máy phân tích tế bào theo dòng chảy

Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

Tủ an toàn sinh học cấp 2 Thermo Scientific Hoa Kỳ

Tủ lạnh 4oC, -20oC, -80oC Panasonic Nhật Bản

Tủ nuôi oxy thấp chuyên dụng InvivO2

Physiological Cell Culture Workstations Baker Anh

2.3 Phương pháp

2.2.1 Rã đông tế bào

Các mẫu tế bào dùng trong nghiên cứu được bắt đầu từ mẫu đông lạnh sau quá trình phân lập Tế bào được rã đông khi bắt đầu tiến hành thí nghiệm (thế hệ 2) và nuôi cho đến khi đạt thế hệ 10

Quy trình rã đông tế bào được thực hiện như sau:

• Chuẩn bị 1 ống falcon 50ml nước cất pha tiêm và làm ấm ở bể ổn nhiệt 37oC

ít nhất 20 phút trước khi tiến hành rã đông

• Cho môi trường nuôi ra ống falcon 50ml (tối thiểu 5ml môi trường cho 1ml tế bào đông lạnh) Làm ấm dung dịch nuôi ở 37ºC ít nhất 20 phút

• Sau khi lấy ống chứa mẫu ra khỏi ngăn đông -20oC, nhúng ống vào ống falcon chứa nước cất đã được làm ấm trong vòng 1 phút Chú ý không để mực nước vượt quá phần mép dưới của nắp ống lưu mẫu

• Dùng pipette 1ml nhỏ từ từ tế bào vào ống falcon 50ml chứa môi trường đã làm ấm Sau đó, tiến hành thu tế bào đã giải đông

• Ly tâm tốc độ 400g trong vòng 4 phút, nhiệt độ phòng

• Đổ dịch nổi sang 1 ống falcon 50ml

• Nhẹ nhàng hòa tế bào với 45ml dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0.9%

• Ly tâm tốc độ 400g trong vòng 4 phút, nhiệt độ phòng

• Đổ dịch nổi có ghi chú nước muối sinh lý NaCl 0.9%

• Hòa khối tế bào với 10ml môi trường nuôi, nhẹ nhàng trộn đều sản phẩm

• Tính toán lượng tế bào để gieo với mật độ 4x103 tế bào/cm2 lên các chai chuyên

dụng đã xử lý bề mặt (NUNC cell culture flasks - Thermo Scientific, Hoa Kỳ),

được phủ trước bằng chất nền (CellStart™- Thermo Scientific, Hoa Kỳ) và

nuôi trong điều kiện 37oC cùng 5% CO2

2.2.2 Nuôi tế bào

Phương pháp nuôi tế bào trong môi trường không huyết thanh và không yếu

tố động vật được thực hiện theo quy trình đã được công bố trước đây [44] Quy trình

nuôi và cấy chuyển tế bào được thực hiện như sau:

Bước 1: Chuẩn bị môi trường nuôi tế bào

Bộ kit môi trường thương mại StemMACS MSC Expansion Media Kit XF,

human (Miltenyi Biotec) bao gồm: 01 dung dịch nuôi nền (Basal medium), và 01

dung dịch chất tăng sinh bổ sung (Supplement) Pha môi trường theo đúng hướng dẫn

của nhà sản xuất

Chú ý: Môi trường phải được ủ ấm đến nhiệt độ 37oC trong bể ổn nhiệt ít nhất

20 phút trước khi sử dụng để nuôi Không ủ ấm quá 2 tiếng trong bể ổn nhiệt

để tránh ảnh hưởng đến hoạt chất của các chất tăng sinh tế bào (growth factors)

Bước 2: Xử lý bề mặt chai nuôi

• Pha loãng cơ chất phủ bề mặt (CTS™ CELLstart™ Substrate Gibco) bằng

dung dịch PBS ở tỉ lệ 1:300

• Phủ hoàn toàn bề mặt chai nuôi với lượng thể tích khuyến cáo (chai T75 phủ

10ml, các chai khác tính tỷ lệ tương ứng)

• Ủ chai nuôi có chứa chất phủ bề mặt ở 37oC trong 1 giờ

• Rửa chai tế bào đã xử lý phủ bề mặt bằng dung dịch PBS

• Hút bỏ PBS và thêm dung dịch nuôi tế bào đã ủ ấm theo bảng dưới đây, sau

đó chuyển chai nuôi vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37oC

Bước 3: Cấy chuyển MSCs bằng phương pháp enzyme

• Bắt đầu tiến hành quy trình cấy chuyển MSCs bằng việc quan sát tế bào dưới kính hiển vi (tế bào đạt 80% diện tích bao phủ) và lưu trữ hình ảnh của tế bào trước khi cấy chuyển

• Hút bỏ dung dịch nuôi trong chai nuôi sau đó rửa lại bề mặt nuôi bằng dung dịch PBS

Chú ý: bổ sung dung dịch PBS bằng cách sử dụng serological pipette và hướng

dung dịch vào cạnh bên của chai nuôi

• Hút hoàn toàn dung dịch PBS và thêm vào chai nuôi dung dịch enzyme TryPLE select (chai T75 bổ sung 2ml, các chai khác chia tỷ lệ tương tự)

• Ủ tế bào với TryPLE Select trong tủ nuôi ở 37oC trong 3 phút

• Vỗ nhẹ cạnh bên của chai nuôi để tế bào rời khỏi bề mặt chai nuôi, quan sát nhanh dưới kính hiển vi nếu cần thiết

• Trung hoà hoạt tính của enzyme bằng cách thêm vào dung dịch nuôi (chai T75

bổ sung 8ml, các chai khác chia tỷ lệ tương tự)

• Hút nhả bằng serological pipette (từ 3-5 lần) để thu toàn bộ tế bào sau khi xử

lý bằng enzyme và chuyển vào ống ly tâm thích hợp (30 ml Universal tube với dung dịch dưới 30ml, và 50ml Conical tube với dung dịch dưới 50 ml, nếu dung dịch lớn hơn 50ml thì sử dụng nhiều hơn 01 ống ly tâm)

• Kiểm tra sống chết tế bào và đếm số lượng tế bào (lấy trung bình 3 lần đếm)

• Ly tâm với tốc độ 400g trong vòng 4 phút, nhiệt độ phòng

• Sau khi ly tâm, hút bỏ toàn bộ dung dịch và hoà tế bào nhẹ nhàng với dung dịch nuôi với thể tích dung dịch để có mật độ tế bào là 1x106 tế bào/ml

• Rửa chai nuôi đã chuẩn bị với dung dịch PBS, sau đó bổ sung lượng dung dịch nuôi tương ứng với thể tích chai

• Thêm dung dịch có chứa tế bào vào chai với mật độ khoảng 4x103 tế bào/cm2

• Chuyển chai nuôi vào tủ nuôi tế bào ở nhiệt độ 37oC và 5% CO2

• Thay môi trường 3-4 ngày/lần cho đến khi tế bào đạt độ phủ bề mặt từ 70% - 80% cho lần cấy chuyển kế tiếp

2.2.3 Phân tích thời gian tăng sinh

Thời gian tăng sinh (Population Doubling Time - PDT) của MSCs được thu

thập, tính toán và phân tích nhằm xác định sự già hóa của tế bào Phương pháp phân

tích PDT được thực hiện theo quy trình đã được công bố trước đây [44] Trước hết,

số lượng tế bào tại mỗi thế hệ được thu thập bằng buồng đếm hồng cầu một lần cải

tiến Neubauer (INCYTO, Đức) Tế bào chết được xác định bằng thuốc nhuộm Trypan

Blue Quá trình được thực hiện lặp lại ba lần nhằm có độ chính xác tin cậy Thời gian

tăng sinh của mỗi thế hệ được xác định bằng công thức:

Thời gian tăng sinh - PDT (giờ) = 𝑇ℎờ𝑖 𝑔𝑖𝑎𝑛 𝑛𝑢ô𝑖 𝑐ấ𝑦 (𝑔𝑖ờ)

2.2.4 Nuôi tế bào ở các mật độ khác nhau

Để phân tích mối tương quan giữa mật độ tế bào và biểu hiện TF, UC-MSCs

ở thế hệ thứ 4 được gieo ở các mật độ khác nhau (2x103, 8x103 và 32x103 tế bào/cm2)

trên đĩa 6 giếng với hai lần lặp lại, nhằm thu được tế bào ở các mật độ thưa, trung

bình và bão hòa Sau hai ngày nuôi, mật độ bao phủ bề mặt thực tế trên đĩa được đo

bằng hệ thống đọc vi bản đa chế độ Tecan Spark 20 M (Tecan, Thụy Sĩ) Tế bào sau

đó được thu bằng TrypLE Select Enzyme (Gibco, Hoa Kỳ) và nhuộm bằng kháng thể

CD142-PE (BD Biosciences, Hoa Kỳ) để phân tích bằng kỹ thuật tế bào theo dòng chảy

2.2.5 Nuôi tế bào trong điều kiện oxy sinh lý

Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy sinh lý đối với biểu hiện của CD142,

UC-MSCs được nuôi trong điều kiện 37oC, 5%CO2 và 2% oxy bằng tủ nuôi oxy thấp

chuyên dụng InvivO2 (Baker, Anh) Nồng độ 2% oxy được tham khảo trong các công

bố trước đây, khi mà điều kiện này được chỉ ra là làm thúc đẩy các đặc tính của MSCs

khi nuôi cấy trong môi trường oxy sinh lý [19, 113] Trong thí nghiệm này, tế bào

được nuôi trong điều kiện 2% oxy tại thế hệ 4 Sau đó tế bào được xác định biểu hiện

của CD142 bằng hệ thống phân tích tế bào theo dòng chảy và so sánh với mẫu nuôi

ở điều kiện 21% oxy

2.2.6 Phân tích thời gian hình thành cục fibrin

Quy trình thực hiện phân tích thời gian hình thành cục fibrin (cục fibrin là sản phẩm của quá trình đông máu xảy ra trong huyết tương nghèo tiểu cầu, vốn đã được

ly tâm để loại bỏ các tế bào máu và là một trong các xét nghiệm cơ bản để đánh giá tình trạng đông máu) được tham khảo từ các tài liệu đã công bố [120, 121] Sơ đồ thí nghiệm được miêu tả trong hình 2.1 Đầu tiên, máu ngoại vi được thu thập từ những người hiến tặng khỏe mạnh (n=6) trong các ống chống đông natri citrate Huyết tương nghèo tiểu cầu được thu thập bằng cách ly tâm máu chống đông ở 2500g trong 15 phút, hai lần Các mẫu huyết tương từ sáu người hiến tặng được trộn lẫn và đông lạnh

ở -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo MSCs ở thế hệ 4 được hòa trong dung dịch đệm NaCl 0.9% hoặc Ringer’s lactate ở nồng độ 5x104 tế bào/ml HUVECs được sử dụng làm đối chứng sinh học do hầu như không biểu hiện TF cũng như hoạt tính đông máu thấp của chúng Đối với mỗi xét nghiệm, 25 μl huyết tương nghèo tiểu cầu được trộn với 50μl dung dịch tế bào trong ống eppendorf 2ml và ủ ở 37°C trong 5 phút Sau đó, 25μl canxi clorua đã được thêm vào với nồng độ cuối là 25 mM để bắt đầu quá trình hình thành cục fibrin Thời gian hình thành cục fibrin được ghi nhận là thời gian từ khi thêm canxi clorua đến khi khối kết tụ fibrin không bị bong ra khi đảo ngược ống eppendorf Để giảm thiểu sai số kỹ thuật giữa các lần thí nghiệm, một lượng cố định

104 tế bào UC-MSCs ly giải đã được đưa vào dưới dạng đối chứng dương để kiểm soát thí nghiệm và chuẩn hóa thời gian hình thành cục fibrin của các mẫu quan tâm Đối chứng âm bao gồm hai loại dung dịch NaCl 0.9% và Ringer’s lactate nhưng không chứa tế bào