Phân Tích Methyl Hóa Của Yếu Tố Vận Động Alu Ở Bệnh Nhân Ung Thư Vú Việt Nam.pdf

Viết tắt Viết đầy đủ Dịch nghĩa tiếng Việt MeDIP seq Methylated DNA immunoprecipitation sequencing Giải trình tự, trên cơ sở kết tủa miễn dịch DNA bị methyl hóa PCR MS-RE-Methylation-sen

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Quỳnh Trang

PHÂN TÍCH METHYL HÓA CỦA YẾU TỐ VẬN ĐỘNG Alu

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Quỳnh Trang

PHÂN TÍCH METHYL HÓA CỦA YẾU TỐ VẬN ĐỘNG Alu

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VÕ THỊ THƯƠNG LAN

TS VƯƠNG DIỆU LINH

Bên cạnh đó, em xin chân thành cảm ơn TS Vương Diệu Linh đã luôn cùng cô Lan

tạo điều kiện thuận lợi để em được hoàn thành tốt luận văn này

Tiếp đó, em xin trân trọng cảm ơn sự tài trợ của dự án VINIF.2022.DA00036, sự cung cấp mẫu nghiên cứu từ Bệnh viện K (Hà Nội) và sự quan tâm, hỗ trợ trang thiết bị từ Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội, Học viện Quân Y 103 để em có thể thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn NCS Phạm Thế Tùng, CN Nguyễn Thị Thân

cùng các em sinh viên trong Phòng thí nghiệm Sinh Y đã luôn bên cạnh em, cùng em nghiên cứu, học hỏi và chia sẻ vui buồn trong suốt hai năm qua Mọi người đã hỗ trợ để em học tập suôn sẻ và cho em những kỉ niệm đẹp để thêm gắn bó với công việc khoa học

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo của Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn tin tưởng, động viên và giúp đỡ em cả về vật chất và tinh thần để em có thể hoàn thành luận văn và học tập tốt hơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Học viên

Trần Thị Quỳnh Trang

enzyme catalytic subunit 3A

Enzyme chỉnh sửa mRNA Apolipoprotein B, tiểu đơn vị xúc tác 3A

APOBEC3G Apolipoprotein B mRNA editing

enzyme catalytic subunit 3G

Enzyme chỉnh sửa mRNA Apolipoprotein B, tiểu đơn vị xúc tác 3G

COBRA Combined bisulfite-restriction analysis Phân tích trên cơ sở sử dụng kết

hợp bisulfite và enzyme giới hạn

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic EM-seq Enzymatic methyl sequencing Giải trình tự, trên cơ sở sử dụng

enzyme nhạy cảm methyl hóa

phân giải cao

LINE-1 Long interspersed nuclear elements Yếu tố lặp lại dài, nằm xen kẽ

trong hệ gen nhân

Viết tắt Viết đầy đủ Dịch nghĩa tiếng Việt

MeDIP seq Methylated DNA immunoprecipitation

sequencing

Giải trình tự, trên cơ sở kết tủa miễn dịch DNA bị methyl hóa

PCR

MS-RE-Methylation-sensitive restriction endonuclease-PCR

PCR kết hợp sử dụng emzyme giới hạn nhạy cảm methyl hóa MS-SnuPE Methylation-sensitive single-nucleotide

primer extension

Mở rộng mồi đơn nucleotide đặc hiệu methyl hóa

ONT-seq Oxford nanopore technology sequencing Giải trình tự theo công nghệ sử

dụng lỗ kích thước nano, từ Đại học Oxford

qMSP Quantitative methylation-specific PCR PCR định lượng đặc hiệu

methyl hóa

SINE Short interspersed nuclear elements Yếu tố lặp lại ngắn, nằm xen kẽ

trong hệ gen nhân SRP Signal recognition particles Hạt nhận biết tín hiệu T4-BGT T4-phage beta-glucosyltransferase Enzyme T4-phage beta-

glucosyltransferase TET2 Tet methylcytosine dioxygenase 2 Enzyme Tet methylcytosine

dioxygenase 2

TPRT Targeted-priming reverse transcriptase Phiên mã ngược hướng đích

WGBS Whole-genome bisulfite sequencing Giải trình tự bisulfite toàn bộ

hệ gen

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Các giai đoạn của ung thư vú theo hệ thống phân loại TNM 15

Bảng 3 Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu 24

Bảng 4 Điều kiện phản ứng kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi đối với trình tự

Alu bị methyl hoá

28

Bảng 5 Thành phần, điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn chèn Alu bị

methyl hóa

29

Bảng 7 Thành phần và điều kiện để thực hiện phản ứng nối 30

Bảng 8 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc có mang

đoạn chèn

31

Bảng 9 Thành phần, điều kiện phản ứng PCR duỗi thẳng plasmid 32

Bảng 10 Tỉ lệ phối trộn các plasmid để tạo mẫu chuẩn có tỉ lệ Alu bị methyl hóa

là 200%

33

Bảng 11 Thành phần hóa chất và điều kiện tối ưu cho phản ứng qMSP 34

Bảng 12 Kết quả qPCR mẫu chuẩn được sử dụng để xây dựng đường chuẩn 43

Bảng 13 Giá trị Ct và tỉ lệ (%) methyl hóa Alu của một số mẫu bệnh phẩm 45

Bảng 14 Mối liên hệ giữa đặc điểm mô bệnh học và mức độ methyl hóa Alu

Phân tích thực hiện với 58 cặp mẫu của nhóm Alu hypermethylation (HM) và 42 cặp mẫu của nhóm Alu hypomethylation (LM)

50

Bảng 15 Mối liên hệ giữa đặc điểm mô bệnh học và mức độ methyl hóa Alu

Phân tích thực hiện với tổng 100 cặp mẫu mô ung thư vú - liền kề

51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4 Cơ chế xuất hiện đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể qua tái tổ hợp tương

đồng Alu

7

Hình 5 Minh họa các tác động của Alu tới biểu hiện gen ở mức sau phiên mã 9

Hình 6 Minh họa một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng chuyển vị của Alu 11

Hình 8 Nguyên lí thiết kế mồi đặc hiệu methyl hóa 20

Hình 9 Vị trí thiết kế các mồi nhận biết đặc hiệu trình tự Alu bị methyl hóa 25

Hình 11 Kết quả điện di 14 mẫu DNA tổng số trên gel agarose 1% 36

Hình 12 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu methyl hóa dựa trên trình tự bảo thủ của

Hình 15 Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn Alu methyl hóa 40

Hình 16 Kết quả giải trình tự đoạn chèn trong pAlu-Me thuộc khuẩn lạc số 3 40

Hình 17 Kết quả mở vòng plasmid LINE-Ref và Alu-Me dạng siêu xoắn thành

dạng thẳng

41

Hình 18 Đường chuẩn biểu diễn giá trị Ct ở các nồng độ khuôn khác nhau

trong phản ứng khuếch đại trình tự đích Alu-Me và trình tự tham chiếu

LINE-Ref

42

Hình 19 Kết quả phân tích nhiệt độ nóng chảy và điện di sản phẩm qMSP của

một số mẫu DNA sau xử lí

44

Hình 20 Đường cong khuếch đại trình tự đích Alu-Me (A) và trình tự tham

chiếu LINE-Ref (B) từ 14 mẫu bệnh phẩm đại diện

45

Hình 21 Kết quả phân tích mức độ methyl hóa Alu ở 100 cặp mẫu ung thư -

liền kề ở mô vú

46

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về yếu tố vận động Alu 2

1.1.1 Cấu trúc và cơ chế vận động của Alu 2

1.1.2 Chức năng sinh học của Alu trong tế bào 6

1.1.3 Các cơ chế kiểm soát sự vận động của Alu 9

1.2 Methyl hóa DNA và ung thư vú 11

1.2.1 Methyl hóa DNA và ung thư 11

1.2.2 Ung thư vú 13

1.2.3 Methyl hoá Alu và ung thư vú 16

1.3 Phân tích methyl hóa DNA 17

1.3.1 Các phương pháp phân tích methyl hóa DNA 17

1.3.2 Định lượng đặc hiệu methyl hóa (quantitative Methylation-Specific PCR - qMSP) 19

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Tách chiết DNA từ mẫu mô tươi 26

2.2.2 Đo mật độ quang học 26

2.2.3 Xử lí DNA với bisulfite 27

2.2.4 Phương pháp PCR 28

2.2.5 Phương pháp điện di 28

2.2.6 Tạo mẫu chuẩn cho qMSP 28

2.2.7 Phản ứng định lượng qMSP 33

2.2.8 Phương pháp định lượng tương đối tỷ lệ methyl hóa DNA 34

2.2.9 Phân tích thống kê 34

2.3 Sơ đồ nghiên cứu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tươi 36

3.2 Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại trình tự Alu bị methyl hóa 36

3.3 Tạo mẫu chuẩn cho phản ứng qMSP và xác định hiệu suất khuếch đại 38

3.3.1 Tạo plasmid tái tổ hợp mang trình tự Alu bị methyl hóa 38

3.3.2 Tạo dạng thẳng hai plasmid tái tổ hợp mang trình tự Alu-Me và LINE-Ref 40 3.3.3 Tạo mẫu chuẩn và xác định hiệu suất khuếch đại của phản ứng qMSP 41

3.4 Phân tích mức độ methyl hóa Alu trong mẫu mô ung thư vú và mô liền kề 43

3.4.1 Phân tích mức độ methyl hóa Alu 43

3.4.2 Mối liên hệ giữa methyl hóa Alu với các đặc điểm mô bệnh học của ung thư 49

KẾT LUẬN 53

KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 1: Thông tin bệnh nhân ung thư vú

PHỤ LỤC 2: Kết quả qMSP và tỉ lệ methyl hóa Alu của 100 cặp mẫu DNA tách từ

mô ung thư và liền kề

MỞ ĐẦU

Ung thư vú đang là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu đối với phụ nữ trên thế giới Tại Việt Nam, trong năm 2020 đã ghi nhận 21.555 ca mắc mới với 9.345 trường hợp tử vong, khiến ung thư vú trở thành loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân thứ tư gây tử vong liên quan tới ung thư ở phụ nữ Việt Số ca mắc tăng nhanh chóng cùng với xu hướng bệnh nhân ngày càng trẻ hóa đã gia tăng áp lực lên việc sàng lọc ung thư vú, đặc biệt là nhu cầu phát hiện tế bào ung thư từ giai đoạn sớm Bởi vậy, việc tìm kiếm thêm các dấu chuẩn sinh học phân tử để hỗ trợ tầm soát ung thư vú là rất cần thiết

Mang đặc điểm nổi bật có số bản sao lớn (> 106 bản sao/hệ gen lưỡng bội), yếu

tố vận động Alu thể hiện các đặc điểm tiềm năng phản ánh ung thư ngay khi số lượng

tế bào ung thư vẫn còn ít và biểu hiện bệnh chưa rõ ràng Hơn 23% tổng số vị trí CpG

của hệ gen nằm trong trình tự Alu và có đến hơn 90% các vị trí này bị methyl hoá trong tế bào bình thường Do vậy, tình trạng methyl hóa Alu được xem là đại diện

cho tình trạng methyl hóa DNA toàn hệ gen và có liên quan mật thiết với trạng thái tế bào

Để đánh giá được vai trò của Alu đối với bệnh nhân ung thư ở nước ta, chúng

tôi thực hiện đề tài “Phân tích methyl hóa của yếu tố vận động Alu ở bệnh nhân

ung thư vú Việt Nam” Áp dụng kĩ thuật PCR định lượng đặc hiệu methyl hóa qMSP

(quantitative Methylation-Specific PCR) với ưu điểm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nghiên cứu được tiến hành theo hai mục tiêu là: (1) xây dựng mẫu chuẩn và tối ưu

hóa điều kiện qMSP để xác định tỉ lệ methyl hóa Alu và (2) phân tích methyl hóa Alu

ở bệnh nhân ung thư vú người Việt Trên cơ sở đó, mối liên hệ giữa mức độ methyl

hóa Alu với ung thư vú đã được đánh giá Những kết quả đạt được sẽ góp phần làm rõ hơn tiềm năng của Alu trở thành dấu chuẩn di truyền ngoại gen trong sàng lọc,

chẩn đoán ung thư vú ở nước ta

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về yếu tố vận động Alu

Alu thuộc họ DNA retrotransposon lặp lại ngắn nằm xen kẽ khắp hệ gen (Short Interspersed Nuclear Elements - SINE), đa dạng nhất và đặc trưng nhất ở linh trưởng Số lượng của Alu trong mỗi tế bào lên tới hơn 1.000.000 bản sao, tương ứng khoảng 11% hệ gen lưỡng bội của người Bên cạnh đó, Alu có khả năng vận động mạnh mẽ Do đó, Alu đã và đang trở thành đối tượng được quan tâm ngày càng nhiều trong các

nghiên cứu sinh học và y sinh [9, 32]

1.1.1 Cấu trúc và cơ chế vận động của Alu

Hình 1 Cấu trúc của một trình tự Alu điển hình (A) Hai domain của Alu được nối với nhau

bởi chuỗi poly(A) ngắn ở giữa và kết thúc bởi một đoạn poly(A) dài [17] Trong đó, domain

2 (cánh phải) dài hơn domain 1 (cánh trái) là 31 nucleotide (B) Alu có nguồn gốc từ gen mã

hóa cho 7SL RNA, với các vùng tô màu đại diện cho vùng trình tự của 7SL RNA xuất hiện

trong trình tự bảo thủ của Alu [29].

Yếu tố Alu điển hình có kích thước xấp xỉ 300 bp, cấu tạo gồm hai vùng khá

tương đồng nhau về mặt trình tự (domain 1 và 2) và được phân cách bởi một chuỗi poly(A) ngắn (Hình 1A) Hai domain này có nguồn gốc từ gen mã hóa cho 7SL RNA - một thành phần của phức SRP (Signal Recognition Particles), tham gia vào quá trình định hướng protein tiết vào khoang lưới nội chất (Hình 1B) Cụ thể, domain 1 dài 132 bp có chứa hộp A (box A) và B (box B) của promoter được nhận biết bởi RNA polymerase III Domain 2 có kích thước khoảng 160 bp có chứa một đoạn poly(A)

dài, có thể lên tới 200 bp ở tận cùng đầu 3’ Đây là trình tự kết thúc điển hình cho Alu và là đặc trưng ở tất cả các SINE [32]

Hiện nay, Alu được biết đến rộng rãi là yếu tố vận động thông qua cơ chế phiên mã ngược và sự chuyển vị phụ thuộc vào yếu tố vận động LINE-1 (Long Interspersed Nuclear Elements) [43] Cả hai mô hình về cơ chế chuyển vị của Alu đều bao gồm ba

giai đoạn chính là: (1) phiên mã tạo RNA, (2) phiên mã ngược tạo DNA và (3) hoàn thành việc tích hợp DNA vào vị trí mới (Hình 2) [3, 32]

Hình 2 Hai mô hình về sự vận động của Alu RNA Alu được phiên mã bởi RNA Pol III

chứa 1 chuỗi poly(A) ở đầu tận cùng 3’ và 1 đoạn poly(U) ngắn ở phía sau (A) Mô hình thứ nhất cho rằng đầu tận cùng 3’ của RNA có thể gập lại và poly(U) bắt cặp với chuỗi poly(A) của chính RNA này để làm mồi cho quá trình phiên mã ngược DNA trung gian được tạo ra, sau đó sẽ được chèn vào một vị trí mới trong hệ gen, đánh dấu sự chuyển vị thành công của

Alu [32] (B) Mô hình thứ hai đề xuất rằng chuỗi poly(A) ở đầu 3’ của RNA Alu có thể bắt

cặp trực tiếp với vùng giàu T ở vị trí tích hợp để thực hiện phiên mã ngược và thông qua đó

chèn bản sao mới của Alu vào trong hệ gen [3].

Phiên mã Quá trình phiên mã ở Alu được bắt đầu khi các yếu tố phiên mã

TFIIIC và TFIIIB nhận biết box A (TGGCTCACGCC) và box B (GTTCGAGAC)

có trong promoter của Alu, hỗ trợ RNA Polymerase III thực hiện phiên mã [43]

Enzym kết thúc phiên mã tại trình tự có từ 4 nucleotide thymine liên tục trở lên Kết

quả là RNA hoàn chỉnh của Alu sẽ chứa 1 chuỗi poly(A) ở đầu tận cùng 3’ và 1 đoạn

poly(U) ngắn ở phía sau [3]

Phiên mã ngược RNA Alu tiếp đó tham gia vào quá trình phiên mã ngược

Theo mô hình vận động thứ nhất (Hình 2A), đầu tận cùng 3' của RNA sẽ gập lại tạo điều kiện thuận lợi cho các gốc uracil ghép cặp với vùng giàu A bên trong và đoạn poly(U) này sau đó trở thành mồi cho quá trình phiên mã ngược [32] Trong khi đó,

theo mô hình vận động thứ hai của Alu (Hình 2B), còn gọi là phiên mã ngược hướng

đích (Target-primed reverse transcription - TPRT), chuỗi poly(A) ở đầu 3’ của RNA có thể bắt cặp trực tiếp với vùng giàu T ở vị trí đích tích hợp đã bị đứt gãy trên mạch đơn để có mồi cho phiên mã ngược [3] Nguồn gốc của enzyme phiên mã ngược tham

gia vào quá trình tổng hợp mạch bổ sung với RNA Alu cho đến nay vẫn là vấn đề đang được thảo luận Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, phiên mã ngược của Alu phụ thuộc vào protein ORF2 mã hoá bởi yếu tố vận động LINE-1 [43] ORF2p có hoạt

tính endonuclease và reverse transcriptase phục vụ cho việc phiên mã ngược RNA

của LINE-1 và cắt - dán chúng vào vị trí mới trong hệ gen Bản thân RNA Alu có khả

năng liên kết với phức 7SL RNA SRP9/14 và protein liên kết polyA (Poly(A)-binding

protein - PABP), từ đó cho phép RNA Alu dễ dàng tiếp cận với các ribosome đang tổng hợp ORF2p và tranh giành protein này với RNA LINE-1 để đạt được sự phiên

mã ngược và tích hợp vào hệ gen cho riêng chúng [9]

Tích hợp Alu tích hợp khá ngẫu nhiên vào một vị trí mới giàu A+T khi tại đó

có hai vết cắt so le trên hai mạch đơn DNA (đứt gãy DNA dạng nick) [32] Vết cắt đầu tiên do hoạt tính endonuclease của ORF2p tại vị trí ưa thích 5’ - TTAAAA - 3’

Sau đó là quá trình phiên mã ngược dựa trên hoạt tính reverse transcriptase của ORF2p Cơ chế tạo vết cắt thứ hai ở mạch DNA còn lại để tích hợp mạch DNA thứ

hai của Alu hiện vẫn chưa rõ ràng Việc sửa chữa các vết cắt sau khi Alu chèn thành

công dẫn đến sự hình thành 2 đoạn DNA lặp lại ngắn (7 - 20 bp), cùng chiều ở 2 đầu

yếu tố Alu tại vị trí chuyển đến (Hình 3A) [3, 9]

Hình 3 Các cơ chế tích hợp vào hệ gen của Alu [39] (A) Alu chuyển vị theo cơ chế TPRT

kinh điển giống LINE-1 Protein ORF2 lần lượt thể hiện hoạt tính endonuclease và reverse transcriptase giúp phân cắt một mạch DNA hệ gen (vị trí mũi tên đỏ) và tổng hợp cDNA Alu

dựa trên sự bắt cặp bổ sung của vùng giàu T trên mạch đơn DNA này với đuôi poly(A) của

RNA Alu Mạch thứ hai trên DNA hệ gen được phân cắt cách vị trí đứt gãy số một khoảng

7-20 bp, tạo vết đứt gãy so le mà tương ứng hình thành hai trình tự lặp lại cùng chiều (hộp

màu xanh lam) khi quá trình tổng hợp mạch DNA thứ hai của Alu và quá trình xen cài hoàn tất (B) Alu chuyển vị nhờ đứt gãy trên mạch đôi DNA, cũng thông qua cơ chế phiên mã

ngược nhưng chỉ phụ thuộc vào enzyme có hoạt tính reverse transcriptase và sự bắt cặp bổ

sung giữa RNA Alu với vùng DNA liền kề vị trí đứt gãy

Ngoài cơ chế chủ đạo chuyển vị phụ thuộc endonuclease, Alu còn được tích hợp vào vị trí mới trong hệ gen không phụ thuộc endonuclease [39, 42] Theo đó, khi xảy ra đứt gãy trên mạch kép DNA, một phân tử RNA tồn tại tự do của Alu có thể tương

tác với 2 vùng DNA liền kề vị trí đứt gãy này, dựa trên nguyên tắc bắt cặp bổ sung của nucleotide Sau khi hai đầu của vết đứt gãy trên một mạch DNA được cố định

bởi “cầu nối” là RNA Alu, phía đầu 3’ tận cùng của nó sẽ được kéo dài cho tới khi

gặp phía còn lại (đầu 5’) thông qua quá trình tổng hợp DNA nhờ ORF2p hoặc

polymerase sửa chữa của tế bào hoặc cả hai, với khuôn là mạch RNA Alu tương ứng [39, 42] Trên cơ sở này, khi Alu tích hợp vào vị trí đứt gãy là dạng đầu bằng thì sẽ

bị thiếu đoạn lặp cùng chiều của vị trí đích xen cài hay chuỗi polyA ở tận cùng đầu

3’ (Hình 3B) Tuy nhiên, khi Alu tích hợp vào vị trí đứt gãy là đầu so le thì có thể xuất hiện Alu có trình tự không hoàn chỉnh nhưng vẫn được giới hạn bởi hai trình tự

lặp cùng chiều [41] Nhìn chung, chuyển vị không phụ thuộc endonuclease là cơ chế chuyển vị mang tính “cơ hội” nên xảy ra với tần suất không cao và để lại tỉ lệ nhỏ bản

sao của Alu trong hệ gen [42] 1.1.2 Chức năng sinh học của Alu trong tế bào

Yếu tố Alu được báo cáo lần đầu tiên năm 1979 bởi Houck và cộng sự [43] Tương tự như các yếu tố vận động khác, ban đầu Alu được coi là “DNA ích kỉ” bởi

chỉ tồn tại đơn thuần trong hệ gen mà không thể hiện chức năng tế bào hay tác động di truyền tích cực nào Tuy nhiên, ngày càng nhiều bằng chứng cho thấy vai trò đa

năng của Alu đối với tổ chức, chức năng và sự tiến hóa của hệ gen [32] Đầu tiên, Alu có vai trò cung cấp nguyên liệu và tạo động lực cho hệ gen tiến hóa Thông qua quá trình xen cài de novo trực tiếp vào vùng mã hóa hoặc không mã hóa của gen, Alu có thể gây đột biến cục bộ, làm thay đổi số lượng hoặc trình tự chuỗi

axit amin của protein do gen mã hóa Bên cạnh đó, do có số lượng bản sao lớn phân

bố rải rác trong hệ gen nên Alu có xu hướng tạo điều kiện cho tái tổ hợp tương đồng

diễn ra, dẫn đến các đột biến chuyển vị, thêm đoạn, mất đoạn trong hệ gen (Hình 4) Những đột biến này sẽ là nguyên liệu cho chọn lọc tự nhiên sàng lọc và góp phần đẩy

nhanh tốc độ tiến hóa hệ gen Dưới tác động của chọn lọc, chỉ một số ít những thay đổi này được giữ lại còn phần lớn đột biến gây bất lợi cho kiểu hình của tế bào và cơ thể như bệnh tật và tác động xấu tới sức sống của cá thể sẽ bị đào thải [9, 20, 43]

Hình 4 Cơ chế xuất hiện đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể qua tái tổ hợp tương đồng Alu, xảy

ra giữa hai yếu tố Alu có mặt trên hai nhiễm sắc thể khác nhau hoặc trên cùng một nhiễm sắc thể Các hộp màu xanh lá cây và màu vàng tượng trưng cho yếu tố Alu, đường nối thẳng

đứng màu đỏ biểu diễn vùng trình tự tương đồng [20]

Vai trò thứ hai của Alu là tham gia vào điều hòa phiên mã gen [6, 32] Trình tự Alu được biết là giàu CpG, có mức độ methyl hóa khác nhau giữa các mô và ở các thời điểm khác nhau, gợi ý Alu có ảnh hưởng đến quá trình điều hòa phiên mã [6] Yếu tố Alu chứa vị trí nhận biết của một số yếu tố phiên mã như NF-kappaB và p53, do vậy, Alu có tiềm năng cao trở thành một yếu tố điều hòa phiên mã dạng cis đối với các gen lân cận [9, 17] Thậm chí, các Alu nằm phía trước của gen có thể đóng vai trò

là promoter tùy tiện và phiên mã tạo ra miRNA hoặc RNA bất thường Các miRNA này sau đó có thể tham gia vào nhiều con đường khác nhau như điều hòa biểu hiện

gen, tăng sinh, biệt hóa hoặc gây chết theo chu trình [6] Ngoài ra, Alu còn có vai trò

trong việc thúc đẩy tương tác đặc hiệu giữa enhancer và promoter, qua đó giải thích cơ chế enhancer có thể tương tác với các promoter ở khoảng cách xa trong hệ gen [2]

Thứ ba, mặc dù Alu không mã hóa cho bất kỳ protein nào nhưng chúng có thể

tác động tới biểu hiện của gen ở cấp độ sau phiên mã, thông qua cắt nối luân phiên

mRNA, chỉnh sửa RNA và dịch mã protein [17] Cụ thể, khi yếu tố Alu chèn vào

vùng intron của một gen thì có thể cung cấp các vị trí cắt nối luân phiên mới, dẫn đến

quá trình exon hóa Alu hay giữ lại intron trong mRNA trưởng thành hoặc cả hai Kết

quả cuối cùng là nguy cơ phá vỡ hoặc làm thay đổi chức năng gen Trên thực tế, các

yếu tố Alu chứa 9 vị trí tiềm năng được nhận biết như điểm cắt intron đầu 5’ và 14 vị

trí được nhận biết là điểm cắt intron đầu 3’ Đáng chú ý là 19 trong số 23 vị trí này

nằm trên mạch âm của Alu, vậy nên Alu có khả năng bị exon hóa cao hơn khi chèn ngược chiều vào một gen cụ thể (Hình 5A) [17, 20] Ngược lại, Alu khi chèn vào

vùng exon của gen có thể dẫn đến hiện tượng xóa exon, tức là một exon bị coi như intron và bị loại bỏ, điều này làm thay đổi khung đọc mở và sản phẩm protein do gen mã hóa Bên cạnh đó, với cấu trúc đuôi poly(A) ở đầu 3’ như một tín hiệu kết thúc

dịch mã sớm, việc Alu chèn vào giữa vùng mã hóa của gen có thể dẫn đến các sản phẩm protein không có chức năng hoặc chức năng bị sai hỏng [20] Ngoài ra, Alu có mặt trong RNA có thể tạo cấu trúc vòng kép khi hai bản sao Alu nằm trong cùng một

gen bổ sung với nhau Cấu trúc mạch kép ở RNA nhận biết bởi yếu tố ADAR (Adenosine Deaminase Acting on RNA) thực hiện biên tập lại RNA (RNA editing

biến đổi A thành I) (Hình 5B) [9, 17] Trong trường hợp Alu phân bố ở 5′ UTR của

mRNA có thể hình thành một cấu trúc thứ cấp ổn định ngăn cản tiểu đơn vị ribosome

40S tìm được codon khởi đầu dịch mã trên mRNA Khi Alu có mặt ở vùng 3′-UTR

của mRNA, chúng có thể ảnh hưởng tới độ bền của mRNA hay tương tác với RNAi

để ức chế dịch mã RNA Alu được phiên mã độc lập bằng RNA Pol-III có khả năng bắt cặp bổ sung với trình tự Alu có mặt trong mRNA dẫn đến ức chế dịch mã, tuy

nhiên cơ chế chi tiết vẫn cần được tìm hiểu thêm [6]

Hình 5 Minh họa các tác động của Alu tới biểu hiện gen ở mức sau phiên mã [17] (A) Alu

chèn vào vùng intron của gen, cung cấp thêm hai vị trí cắt-nối mới trên tiền mRNA Trải qua

quá trình cắt-nối luân phiên, Alu có thể được exon hóa (trường hợp 2) hoặc tác động làm giữ lại intron trong mRNA trưởng thành (trường hợp 3, 4) (B) Các Alu nằm ngược chiều nhau

trong intron của gen có thể tương tác tạo cấu trúc bậc hai dạng RNA mạch kép, được nhận biết bởi yếu tố ADAR ADAR biên tập lại RNA, dẫn đến thay đổi quá trình cắt nối luân phiên hoặc giữ lại RNA trong nhân [9]

Xét ở mức độ hệ gen, Alu tham gia vào việc tổ chức hệ gen và có liên quan đến

sửa chữa đứt gãy mạch đôi DNA, qua đó góp phần duy trì sự ổn định của hệ gen [32,

42] Ngoài ra, RNA Alu tham gia hỗ trợ tế bào đáp ứng với điều kiện stress Bình thường, RNA Alu hiện diện ở mức rất thấp (103 –104 phân tử trên mỗi tế bào) nhưng số lượng sẽ gia tăng nhanh chóng khi tế bào bị stress (nhiễm virus hoặc sốc nhiệt) rồi nhanh chóng giảm xuống khi tế bào đã phục hồi Đây được xem là cơ chế điều hòa

hoạt động sinh hóa cho tế bào RNA Alu ở nồng độ cao sẽ kích hoạt quá trình tự

phosphoryl hóa Protein kinase R (PKR) dẫn tới sự phosphoryl hóa yếu tố elF2α, từ đó ức chế khởi đầu dịch mã nhưng khi ở nồng độ thấp thì cho phép dịch mã với hiệu suất cao giúp tạo ra lượng lớn protein cần thiết trong thời gian ngắn [17]

1.1.3 Các cơ chế kiểm soát sự vận động của Alu Alu tác động tích cực lẫn tiêu cực đến hoạt động của tế bào Do đó, sự vận động của Alu được kiểm soát bằng nhiều cơ chế khác nhau để tế bào tồn tại và thực hiện

chức năng của mình Di truyền ngoại gen, bao gồm methyl hóa DNA và methyl/acethyl hóa histon được xem là các cơ chế chính đảm nhận vai trò kiểm soát

Alu Ở động vật có vú, methyl hóa DNA chủ yếu xảy ra nhờ phản ứng cộng hóa trị

gắn nhóm methyl vào carbon số 5 của cytosine trong phức CpG nhờ DNA

methyltransferase (DNMT) [43] Kết quả in vivo đã chỉ ra rằng phần lớn CpG trong các phân họ Alu trẻ nhất đều bị methyl hóa [43] Bất hoạt DNMT gắn liền với Alu

giảm phiên mã, chứng tỏ methyl hoá DNA tham gia kiểm soát vận động của yếu tố này [43] Ngoài ra, có nghiên cứu cho rằng methyl hóa ở H3K9 chứ không phải

methyl hóa DNA sẽ ngăn cản quá trình phiên mã Alu [43] Tuy nhiên, đa số công bố

cùng đưa ra kết luận methyl hóa DNA và methyl hóa histone phối hợp với nhau để

kiểm soát chặt chẽ quá trình phiên mã và chuyển vị của Alu [43] Một số yếu tố khác có ảnh hưởng tới chuyển vị của Alu như: (1) chiều dài và tính không đồng nhất của đuôi poly(A) ở RNA Alu; (2) chiều dài và đặc trưng ở trình tự vùng 3' của RNA Alu; (3) sự đa dạng của trình tự mã hóa cho RNA Alu; (4) trình tự lân cận ở vị trí tích hợp (Hình 6) [9] Thực tế, chỉ một lượng nhỏ bản sao Alu trong hệ gen có khả năng chuyển vị tạo ra các bản sao mới mặc dù các Alu khác được phiên mã nhiều hơn Phân tích các Alu chuyển vị cho thấy trình tự của chúng tương đồng

cao với trình tự bảo thủ và có đuôi poly(A) dài Sự rút ngắn hay gián đoạn bởi các nucleotide không phải adenine ở đuôi poly(A) hay các đột biến tích lũy trong trình tự

của Alu gây suy giảm khả năng chuyển vị theo thời gian tiến hóa [9] Bên cạnh đó, thông qua chuyển vị bằng cơ chế TPRT phổ biến, RNA của Alu vẫn giữ được promoter của bản thân sau phiên mã Tuy nhiên, để Alu có thể phiên mã hiệu quả ở

vị trí mới thì còn phụ thuộc vào trình tự lân cận ở phía trước promoter Do đó, phần

lớn các yếu tố Alu không được phiên mã bởi RNA polymerase III, trừ khi được đưa

vào một vị trí thuận lợi trong hệ gen mà ngẫu nhiên cung cấp cho chúng trình tự điều

hòa 5' cis phù hợp [32] Trình tự Alu có ít nhất 24 dinucleotide CpG và dễ bị đột biến

do quá trình khử amin của gốc 5’-methylcytosine ở CpG Khi đó, khả năng chuyển

vị của Alu có thể bị giảm hoặc biến mất [3] Ngoài ra, RNA Alu có thể bị giữ trong

phức hợp ribonucleoprotein với APOBEC3G, do đó không tiếp cận được với các enzyme phiên mã ngược nên không thể chuyển vị [9]

Hình 6 Minh họa một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng chuyển vị của Alu [9] Những Alu

thể hiện hoạt động chuyển vị mạnh nhất có đuôi poly(A) dài từ 20 A trở lên và một vùng 3’

đặc trưng ngắn theo sau Những Alu mà khả năng chuyển vị kém hơn có vùng 3’ đặc trưng

dài ở sau đuôi poly A, đuôi poly(A) ngắn hơn hoặc đuôi poly(A) bị gián đoạn bởi các

nucleotide khác A hay tích lũy các đột biến ngẫu nhiên ở vùng trình tự do Alu mã hóa.

1.2 Methyl hóa DNA và ung thư vú

1.2.1 Methyl hóa DNA và ung thư Methyl hóa DNA là cơ chế di truyền ngoại gen xảy ra phổ biến ở cytosine trong phức CpG ở hệ gen động vật có vú dưới sự xúc tác của DNA methyltransferase (Hình 7A) Có ít nhất ba loại DNMT, bao gồm DNMT1, DNMT3A và DNMT3B tham gia vào quá trình thiết lập và duy trì sự hiện diện của mCpG Trong đó, DNMT1 ưu tiên hoạt động trên DNA sau khi tái bản còn DNMT3A và DNMT3B chịu trách nhiệm gắn mới nhóm methyl vào cytosine [51]

Trong điều kiện sinh lý bình thường, methyl hóa DNA rất quan trọng đối với việc duy trì tính toàn vẹn và sự ổn định của hệ gen do ngăn cản các yếu tố vận động chuyển vị [23] Cơ chế này đã được chứng minh là “công tắc” điều chỉnh quá trình phiên mã gen, liên quan tới sự ức chế gen đặc hiệu mô và cần thiết cho quá trình bất hoạt nhiễm sắc thể X ở cơ thể XX cũng như in vết hệ gen (Hình 7B) [51]

Hình 7 Methyl hóa DNA (A) DNA methyltransferases (DNMT) xúc tác chuyển cytosine

thành 5-mC (B) Methyl hóa cytosine trong phức CpG ở vùng dị nhiễm sắc hoặc promoter liên quan đến ức chế phiên mã SAM, S-adenosylmethionine; SAH: S-adenosylhomocysteine [7]

Thay đổi methyl hóa bất thường ở hệ gen có liên quan tới sự khởi phát, duy trì và tiến triển của nhiều loại bệnh bao gồm cả ung thư [23] So với các tế bào bình thường, tế bào ung thư thể hiện sự rối loạn methyl hóa DNA ở hai dạng methyl hóa DNA quá mức (mức độ methyl hóa DNA cao hơn bất thường) và methyl hóa DNA dưới mức (mức độ methyl hóa thấp hơn hoặc không có) [23, 51] Sự methyl hóa quá mức CpG ở promoter các gen ức chế khối u hoặc methyl hóa dưới mức CpG ở promoter các gen tiền ung thư là dẫn chứng điển hình cho sự giảm hoặc tăng biểu hiện của hai nhóm gen này Methyl hóa DNA bất thường được coi là bước ngoặt quyết định chuyển tế bào từ trạng thái bình thường sang trạng thái ác tính rồi phát triển thành ung thư [23, 51] Cho đến nay, rối loạn methyl hóa DNA được ghi nhận trong nhiều loại ung thư gồm các ung thư phổ biến như ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày [51]

1.2.2 Ung thư vú 1.2.2.1 Thực trạng

Hiện nay, ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tật và tử vong trên thế giới Gánh nặng ung thư toàn cầu được báo động với thống kê khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và gần mười triệu ca tử vong trong năm 2020 Đáng chú ý, ung thư vú hiện đã vượt qua ung thư phổi để trở thành loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu đối với phụ nữ [44] Số bệnh nhân mắc ung thư vú gia tăng nhanh chóng, từ 1,7 triệu ca mắc năm 2012 tới 2,3 triệu ca mắc trong năm 2020 với xu hướng dường như ngày càng trẻ hóa [14, 44, 46] Chỉ riêng trong năm 2020 có khoảng 2,3 triệu phụ nữ bị ung thư vú, chiếm 11,7% tổng số ca ung thư toàn cầu [44] Tại Việt Nam, báo cáo của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế ước tính trong năm 2020 có khoảng 21.555 ca mắc mới với 9.345 trường hợp tử vong, khiến ung thư vú trở thành loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân thứ tư gây tử vong liên quan tới ung thư ở phụ nữ Việt Nam [31] Do vậy, ung thư vú đã và đang trở thành trọng tâm của sinh y học

1.2.2.2 Yếu tố dẫn tới ung thư vú Ung thư vú là bệnh đa yếu tố góp phần vào sự phát sinh ung thư [28] Đầu tiên là các yếu tố nhân khẩu học như giới tính và tuổi Phân tích số liệu thống kê cho thấy hầu hết các ca mắc xảy ra ở phụ nữ trong khi đây là bệnh ác tính hiếm gặp ở nam giới với tỉ lệ chưa tới 1% tổng số các trường hợp ung thư [28, 44] Tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú ở phụ nữ tăng đáng kể theo độ tuổi, cao nhất ở độ tuổi mãn kinh và sau đó giảm dần hoặc không đổi [28] Tiếp đến, các yếu tố sinh sản và ung thư vú có liên quan đến tác động của các hormone buồng trứng như Estrogen và Progesteron, bắt đầu ở tuổi dậy thì và tiếp tục trong các chu kỳ kinh nguyệt Nồng độ các hormone này bị ảnh hưởng bởi các lần mang thai của phụ nữ và cuối cùng giảm dần ở thời kỳ mãn kinh [28] Bên cạnh đó, di truyền là yếu tố rất cần lưu ý Phụ nữ mang đột biến ở gen

BRCA1 hoặc BRCA2 có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú là 50%–85% [40] Nếu một

phụ nữ có tiền sử gia đình là mẹ, chị gái hoặc em gái bị chẩn đoán mắc ung thư vú

thì nguy cơ người đó sẽ bị bệnh tăng gấp 2,46 lần so với những phụ nữ không có tiền sử người thân trong gia đình mắc bệnh [50] Ngoài ra, chủng tộc, yếu tố lối sống (như béo phì, thừa cân, uống rượu, hút thuốc,…) và các yếu tố khác liên quan đến vú (như mật độ tế bào mô vú, bệnh vú lành tính) đều được xem là có liên quan tới ung thư vú ở phụ nữ [28]

1.2.2.3 Phân loại ung thư vú Dựa trên khả năng xâm lấn của tế bào ung thư, ung thư vú được chia thành hai loại là tại chỗ và xâm lấn Thuật ngữ “xâm lấn” được dùng khi các tế bào ung thư có hiện tượng lan sang mô vú xung quanh Mỗi loại ung thư vú trên lại được chia thành hai loại chính là ung thư biểu mô ống và ung thư biểu mô thùy Ung thư biểu mô ống tại chỗ xảy ra tại các tế bào biểu mô lót trong ống dẫn sữa (Ductal carcinoma in situ - DCIS) Khi tế bào ung thư đã lan qua thành ống dẫn vào mô vú gần đó cũng như các bộ phận khác của cơ thể thì là ung thư biểu mô ống xâm lấn (Invasive ductal carcinoma - IDC) Ung thư biểu mô thùy tại chỗ xảy ra tại các tế bào trong thùy tạo sữa khi chúng chưa lan qua thành của thùy (Lobular carcinoma in situ - LCIS) hoặc là xâm lấn khi tế bào ung thư vượt qua thành các thùy đi vào mô lân cận hoặc di căn (Invasive lobular carcinoma - ILC) Trong đó, IDC là loại phổ biến nhất, gặp ở khoảng 80% số bệnh nhân ung thư vú Ngoài ra, còn một số loại ung thư vú hiếm gặp như ung thư vú dạng viêm, bệnh Paget của vú, khối u Phyllodes và angiosarcoma nguyên phát ở vú [59]

1.2.2.4 Các giai đoạn của ung thư vú Theo hệ thống phân loại TNM gần đây nhất của Ủy ban Hỗn hợp về Ung thư Hoa Kỳ (AJCC), ung thư vú gồm 5 giai đoạn từ 0, I, II, III đến IV (Bảng 1) [1] Việc phân chia giai đoạn dựa trên ba tiêu chí là kích thước khối u (Tumor), mức độ xâm lấn tới các hạch vùng (Node) và tình trạng di căn xa (Metastasis) Trong đó, kích thước được tính là chiều dài nhất của khối u Các hạch bạch huyết được xem xét gồm hạch nách, hạch vú trong, hạch hạ đòn và hạch thượng đòn Hạch nách là vị trí chính để dẫn lưu dịch bạch huyết của vú nên khả năng tổn thương của nó liên quan trực tiếp

tới khối u nguyên phát còn hạch thượng đòn phản ánh giai đoạn muộn của tổn thương hạch nách và cho thấy tiên lượng thấp trong ung thư vú Khi tế bào ung thư được phát hiện ở các cơ quan xa hoặc ở các hạch không phải hạch vùng thì được tính là có hiện tượng di căn xa

Bảng 1 Các giai đoạn của ung thư vú theo hệ thống phân loại TNM [1]

Tis: ung thư vú tại chỗ T0: Không có khối u T1: U có kích thước ≤ 2 cm T2: 2 cm < kích thước của u ≤ 5 cm T3: U có kích thước > 5 cm

T4: U có kích thước bất kỳ, đã lan đến thành ngực và/hoặc da, ung thư vú dạng viêm

Di căn hạch vùng (N):

N0: Không di căn hạch Nmi: Di căn vi mô (khối u khoảng 200 tế bào, kích thước > 0,2 mm nhưng ≤ 2 mm)

N1: Đã di căn tới 1 đến 3 hạch nách và/hoặc hạch vú trong

N2: Đã di căn tới 4 đến 9 hạch nách và/hoặc hạch vú trong

N3: Đã di căn tới 10 hạch nách trở lên Hoặc đã lan đến hạch hạ đòn, thượng đòn hay hạch vú trong

Di căn xa (M): M0 là không, M1 là có di căn xa

1.2.2.6 Sàng lọc ung thư vú So sánh số liệu thống kê về tỉ lệ mắc và tử vong ở phụ nữ giữa các nước trên thế giới năm 2020, một xu hướng trái ngược đáng lưu ý đã được ghi nhận [44] Theo đó, phụ nữ sống ở nhóm nước đang phát triển có tỷ lệ tử vong do ung thư vú cao hơn 17% so với những người sống ở nhóm nước phát triển trong khi tỷ lệ mắc ung thư vú của phụ nữ ở các nước phát triển lại cao hơn 88% so với phụ nữ ở các nước đang phát triển Điều này được cho là có liên quan tới khả năng tiếp cận với các chương trình sàng lọc để phát hiện và điều trị ung thư vú kịp thời [31, 44] Sàng lọc ung thư vú hiện nay chủ yếu thông qua chụp X quang tuyến vú và chụp cộng hưởng từ (Magnetic

resonance imaging - MRI) [60] Chụp X quang có thể giúp phát hiện ung thư vú ở

giai đoạn sớm nhưng có độ nhạy dao động mạnh (68% tới 93%), tùy thuộc nhiều yếu tố như kinh nghiệm của bác sĩ, tuổi bệnh nhân, mật độ tế bào vú, và đôi khi là đưa ra kết quả dương tính giả, hoặc chẩn đoán quá mức dẫn tới điều trị không cần thiết, gây tốn kém và để lại tác dụng phụ không mong muốn [44, 57] Chụp MRI vú được sử dụng kết hợp với chụp X quang để sàng lọc những phụ nữ có nguy cơ mắc ung thư vú cao Bởi vì MRI vú có thể xuất hiện bất thường ngay cả khi không phải ung thư nên không chỉ định đối với phụ nữ có nguy cơ trung bình [60] Do đó, việc tìm kiếm thêm các dấu chuẩn sinh học phân tử để hỗ trợ tầm soát ung thư vú là đáng quan tâm Hiện tại, nhiều dấu chuẩn methyl hóa DNA có tiềm năng trong phát hiện và điều trị ung thư vú đã được đánh giá và xác nhận Ví dụ, phân tích sự kết hợp đồng thời 10

dấu chuẩn methyl hóa DNA trên các gen AKR1B1, APC, CCND2, COL6A2, HIST1H3C, HOXB4, RASGRF2, RASSF1, TMEFF2, và ZNF671 đã phát hiện ung

thư vú với độ nhạy và độ đặc hiệu đều trên 85% [13]

1.2.3 Methyl hoá Alu và ung thư vú

Với số lượng bản sao lớn (> 106 bản sao/hệ gen lưỡng bội), Alu có ưu thế trở

thành dấu chuẩn sàng lọc sớm ung thư, khi số lượng tế bào ung thư vẫn còn ít và biểu hiện bệnh chưa rõ ràng Đáng chú ý, hơn 23% tổng số vị trí CpG của hệ gen nằm

trong trình tự của Alu [23, 26] Do đó, tình trạng methyl hóa Alu được xem là đại diện

cho tình trạng methyl hóa DNA của toàn hệ gen và liên quan mật thiết với trạng thái

tế bào [26] Tăng cường methyl hóa Alu cũng đã được chứng minh là đem lại ưu thế

cho tế bào trong việc chống lại các tác nhân gây tổn thương DNA, giúp tế bào giảm

nguy cơ căng thẳng do mất ổn định hệ gen Các tế bào có trình tự Alu được tăng cường methyl hóa thể hiện tốc độ tăng sinh nhanh hơn so với tế bào đối chứng có Alu bị methyl hóa thấp hơn [35] Bên cạnh đó, sự tích lũy RNA Alu trong khối u, đặc biệt

là khi RNA ở dạng mạch kép, gần đây đã được chứng minh là yếu tố kích thích hệ thống miễn dịch bẩm sinh nhận biết và tiêu diệt tế bào ung thư, giúp tăng khả năng

sống sót cho bệnh nhân ung thư [15] Lượng RNA Alu trong tế bào bị tác động bởi quá trình methyl hóa, do đó đã gợi mở về vai trò của methyl hóa Alu trong ung thư Cho tới nay, methyl hóa Alu đã được phân tích trên nhiều loại ung thư khác nhau như

ung thư vú, ung thư đại tràng, u màng não thất, hay ung thư máu ác tính và cho thấy

mối tương quan có ý nghĩa thống kê giữa mức độ methyl hóa Alu với trạng thái ung thư [33, 55] Đặc biệt, hiện tượng Alu bị giảm methyl hóa trong các tế bào miễn dịch

có liên quan đến sự tiến triển nhanh hơn của bệnh ung thư vú và tiên lượng kém hơn

cho bệnh nhân [11] Methyl hóa bất thường ở Alu xảy ra sớm ở nhiều khối u và mức độ methyl hóa Alu có liên quan tới trạng thái ác tính của khối u, trong đó có ung thư

vú [11, 26, 53] Những kết quả khả quan này thúc đẩy nghiên cứu theo dõi biến đổi

methyl hóa Alu cho mục đích chẩn đoán và điều trị ung thư vú

Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về mối liên hệ giữa methyl hóa DNA và ung thư vú ở phụ nữ đã được báo cáo gần đây Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu này đều tập trung vào methyl hóa DNA ở gen đơn bản và phân tích ở mức độ định tính mà chưa phân tích định lượng [12, 36, 37, 48] Trên cơ sở đó, việc định lượng mức độ

methyl hóa Alu như một hướng tiếp cận mới tìm kiếm dấu chuẩn sinh học hỗ trợ cho

chẩn đoán sớm và điều trị ung thư vú ở nước ta

1.3 Phân tích methyl hóa DNA

1.3.1 Các phương pháp phân tích methyl hóa DNA Dựa trên đặc tính kĩ thuật, có thể chia các phương pháp phân tích methyl hóa DNA thành hai nhóm chính: sử dụng bisulfite và không sử dụng bisulfite [19, 27]

Nhóm phương pháp đầu tiên thực hiện xử lý DNA với bisulfite, dẫn đến cytosine (C) không được methyl hóa bị khử amin và chuyển thành uracil (U) trong khi cytosine bị methyl hóa được giữ nguyên Thông qua phản ứng PCR, uracil được chuyển thành thymine (T) Sau phản ứng với bisulfite, các sợi đơn DNA khác nhau ở vị trí CpG (nếu bị methyl hoá) và TpG (nếu không bị methyl hoá) Các vị trí khác nhau này có thể được phân tích trực tiếp bằng đọc trình tự truyền thống Sanger, pyrosequencing hoặc gián tiếp qua PCR đặc hiệu methyl hóa (methylation-specific PCR - MSP), phân tích nhiệt độ nóng chảy (metlting temperature - Tm) của sản phẩm PCR (high-resolution melting - HRM) hay tổng hợp đơn nucleotide nhạy cảm methyl (methylation-sensitive single-nucleotide primer extension hay MS-SnuPE) [19] Bên cạnh đó, DNA sau xử lí bisulfite còn có thể được phân tích bởi enzyme giới hạn (combined bisulfite-restriction analysis - COBRA) hay PCR, phiên mã ngược kết hợp enzyme phân cắt RNA đặc hiệu base và sắc kí khối phổ (phương pháp Epityper) [19, 27] Tuy nhiên, các phương pháp trên phù hợp để phân tích methyl hóa của cytosine ở phạm vi nhỏ trong hệ gen [27] Đối với khảo sát trạng thái methyl hóa của từng cytosine trên quy mô toàn hệ gen, phương pháp giải trình tự bisulfite toàn bộ hệ gen (whole-genome bisulfite sequencing -WGBS) hiện đã được phát triển trên cơ sở giải trình tự thế hệ mới (next-generation sequencing - NGS) [19, 27]

Nhóm phương pháp thứ hai không sử dụng bisulfite Thay vào đó, enzyme giới hạn nhạy cảm với gốc methyl (methylation-sensitive restriction enzymes - MREs), enzyme có khả năng biến đổi cytosine hoặc protein liên kết đặc hiệu với DNA bị methyl có thể được sử dụng MREs không cắt DNA nếu vị trí nhận biết của nó chứa cytosine bị methyl hóa Các protein liên kết đặc hiệu với DNA bị methyl hóa, như methyl-CpG-binding domain (MBD) hay kháng thể kháng 5-methyl cytosine, được ứng dụng trong kết tủa miễn dịch (immunoprecipitation - IP) để phân lập được DNA bị methyl hóa từ DNA hệ gen [19, 45] Đối với các enzyme có khả năng biến đổi cytosine, bộ ba enzyme TET2 (Tet methylcytosine dioxygenase 2), T4-BGT (T4-phage beta-glucosyltransferase) và APOBEC3A (Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A) đã được sử dụng trong hai phản ứng liên tiếp

Trong đó, TET2 và T4-BGT xúc tác chuyển cytosine bị methyl hóa thành các dạng 5-carboxycytosine, 5-(β-glucosyloxymethyl) Các cytosine không bị methyl hóa thì không được biến đổi, do đó sẽ bị APOBEC3A chuyển thành uracil ở phản ứng thứ hai [47] Sản phẩm DNA sau xử lí enzyme, protein thường được đem giải trình để phân tích methyl hóa DNA mức độ toàn hệ gen (MRE-seq, Methylated DNA immunoprecipitation sequencing - MeDIP seq, Enzymatic methyl sequencing - EM-seq) hoặc có thể kết hợp với PCR để phân tích methyl hóa đặc hiệu locus (Methylation-sensitive restriction endonuclease-PCR - MS-RE-PCR) [19, 27, 45, 47] Ngoài ra, phương pháp Oxford nanopore technology sequencing (ONT-seq) đã được phát triển để phân tích trực tiếp tình trạng methyl hóa DNA toàn hệ gen mà không cần bước tiền xử lí, dựa trên nguyên lí là tín hiệu dòng điện truyền tới điện cực khác nhau khi cytosine bị methyl hóa và cytosine không bị methyl hóa khi đi qua lỗ kích thước nano Đây là phương pháp cho phép phân tích các phân tử DNA siêu dài nhưng có tỉ lệ lỗi tương đối cao và yêu cầu lượng DNA đầu vào lớn [52]

Như vậy, phương pháp phân tích methyl hóa DNA là đa dạng Tuy nhiên, cần dựa trên các ưu nhược điểm đã biết để lựa chọn kỹ thuật phù hợp nhất cho trình tự đích và điều kiện trang thiết bị, nguồn lực

1.3.2 Định lượng đặc hiệu methyl hóa (quantitative Methylation-Specific PCR - qMSP)

1.3.2.1 Nguyên lí và đặc điểm của kỹ thuật qMSP được sử dụng phổ biến để định lượng methyl hóa DNA Thực chất qMSP là phản ứng realtime PCR với khuôn DNA đã được xử lí với bisulfite và cặp mồi được thiết kế đặc hiệu với cytosine bị methyl hóa (Hình 8) Các mồi được thiết kế đặc hiệu dựa trên các trình tự giàu CpG cho phép phân biệt DNA bị methyl hoá với DNA không bị methyl hóa [19]

Hình 8 Nguyên lí thiết kế mồi đặc hiệu methyl hóa Các mồi được thiết kế dựa trên các

trình tự giàu CpG, với mồi M đặc hiệu cho DNA bị methyl hóa có các cytosine trong phức CpG được giữ nguyên còn mồi U đặc hiệu cho DNA không bị methyl hóa chứa các cytosine tương ứng bị chuyển thành thymine [58]

Một nhược điểm của phương pháp xử lý bisulfite là có thể xảy ra sự biến đổi không hoàn toàn các cytosine không methyl hóa thành thymine, do đó dẫn đến kết quả dương tính giả (mức độ methyl hóa DNA thu được tăng so với thực tế) Bởi vậy, cần chú ý giám sát các yếu tố quan trọng như chất lượng DNA, độ pH, nhiệt độ và thời gian của phản ứng để giảm thiểu sai số và tăng hiệu suất xử lý [8, 16] Hiện nay, nhiều loại kit xử lí DNA với bisulfite đã được thương mại hóa, cung cấp điều kiện tối ưu để áp dụng cho các gen đơn bản Các công bố gần đây cho thấy phân tích methyl hóa của các trình tự lặp cần lượng DNA đầu vào cho phản ứng xử lí ít hơn rất nhiều so với khuyến cáo [24] Nguyên nhân là do quá trình xử lí bisulfite yêu cầu nghiêm ngặt DNA phải ở dạng mạch đơn Việc sử dụng quá nhiều trình tự DNA đích dạng mạch kép có thể tạo điều kiện thuận lợi cho hai mạch đơn DNA liên kết bổ sung với nhau và hồi tính (tương tự như phản ứng PCR ở những chu kỳ đã bão hòa), dẫn đến giảm lượng DNA mạch đơn cho bisulfite thực hiện phản ứng

Mức độ methyl hóa của trình tự đích được phản ánh thông qua kết quả PCR định lượng thời gian thực (qPCR) Chu kì ngưỡng (giá trị Ct - threshold cycle) đánh dấu thời điểm phản ứng đã tích lũy lượng DNA đủ lớn để thu nhận được tín hiệu huỳnh quang Kết quả nhân bản DNA được thể hiện qua đồ thị đường cong khuếch

đại với trục tung là mức độ tín hiệu huỳnh quang, trục hoành là số chu kỳ Theo đó, lượng DNA khuôn đưa vào phản ứng sẽ tỉ lệ nghịch với giá trị Ct [4] Đối với phản ứng định lượng qPCR, hai tham số quan trọng là hệ số tuyến tính (R2) và hiệu suất khuếch đại (E) được xác định qua việc xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn được dựng dựa trên giá trị Ct của dải nồng độ khuôn được pha loãng từ một mẫu chuẩn Hệ số R2 phản ánh mức độ tuyến tính giữa lượng DNA đầu vào và giá trị Ct thu được Giá trị tối ưu cho R2 là > 0,98 và khoảng giá trị tối ưu cho hiệu suất khuếch đại là 90% - 105% Khi hai giá trị nằm trong khoảng khuyến cáo và giá trị Ct ổn định qua các lần lặp lại thì chứng tỏ điều kiện phản ứng đã tối ưu, có thể áp dụng để khảo sát trên các mẫu bệnh phẩm nghiên cứu [4]

1.3.2.2 Định lượng tương đối tỉ lệ methyl hóa DNA Bản chất của việc xác định tỉ lệ methyl hóa DNA bằng phương pháp định lượng tương đối là so sánh số lượng trình tự đích bị methyl hóa với tổng số trình tự tham chiếu cùng xuất hiện trong mẫu [4] Phương pháp này thường sử dụng mẫu chuẩn có tỷ lệ methyl hóa đã biết Mẫu chuẩn cần chứa đồng thời trình tự đích là trình tự DNA bị methyl hóa và trình tự tham chiếu đại diện cho tổng số DNA sau xử lí bisulfite, cả hai trình tự đều được biết rõ nồng độ hoặc số lượng bản sao Thông thường, mẫu chuẩn được tạo bằng cách phối trộn các plasmid mang đoạn chèn là trình tự đích và trình tự tham chiếu, sử dụng mẫu chuẩn để xây dựng đường chuẩn sẽ phản ánh được mức độ tối ưu của điều kiện qPCR và tính ổn định của phản ứng

Hiện nay, hai mô hình toán học phổ biến được đề xuất trong định lượng tương đối là công thức Pfaffl và công thức Livak, 2-ΔΔCt Để áp dụng được công thức Livak, hiệu suất khuếch đại của trình tự đích và trình tự tham chiếu phải tương tự nhau, chênh lệch không quá 5% Trong khi đó, công thức Pfaffl có bản chất tương tự như công thức Livak nhưng cho phép áp dụng cả khi trình tự đích và trình tự tham chiếu có hiệu suất khuếch đại chênh lệch nhiều hơn 5% [4]

Nhận thấy được tiềm năng của việc phân tích methyl hóa Alu trong ung thư vú

và các ưu điểm của phương pháp qMSP là độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi đã

thực hiện đề tài “Phân tích methyl hóa của yếu tố vận động Alu ở bệnh nhân ung

thư vú Việt Nam” Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu là: (1) xây dựng mẫu

chuẩn và tối ưu hóa điều kiện qMSP để xác định tỉ lệ methyl hóa Alu và (2) phân tích methyl hóa Alu ở bệnh nhân ung thư vú Việt Nam Chúng tôi hi vọng xác định được tiềm năng, tính khả thi trở thành dấu chuẩn di truyền ngoại gen của Alu phục vụ cho

sàng lọc, chẩn đoán ung thư vú ở nước ta

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Mẫu nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện trên phạm vi 100 cặp mẫu mô ung thư và mô liền kề của 100 bệnh nhân ung thư vú và 1 mẫu máu từ người lành do Bệnh viện K (Hà Nội) cung cấp trong thời gian 2020-2022 Vị trí thu mẫu liền kề cách khối u ung thư từ 3-5 cm Nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (03-2020/NCHG-HDDD) Thông tin các bệnh nhân ung thư vú được trình bày trong Phụ lục 1

2.1.2 Plasmid tái tổ hợp Mẫu chuẩn sử dụng trong nghiên cứu là mẫu trộn của DNA hệ gen trước xử lí

với hai plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng là trình tự tham chiếu LINE-1 (pLINE-Ref) và trình tự đích Alu bị methyl hoá (pAlu-Me) Việc lựa chọn LINE-1 để thiết kế trình tự tham chiếu là dựa trên mối tương quan về số lượng bản sao của LINE-1 trong tế bào so với Alu và cơ chế chuyển vị của Alu phụ thuộc vào LINE-1 Thông tin các plasmid được trình bày trong Bảng 2 Plasmid pLINE-Ref được cung cấp bởi

phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại

học Quốc Gia Hà Nội Plasmid pAlu-Me được hoàn thiện bởi nghiên cứu này

Bảng 2 Thông tin plasmid dùng làm mẫu chuẩn

Plasmid tái tổ hợp

Kích thước đoạn chèn (bp)

Vector tách dòng Mục đích sử dụng

pAlu-Me 229 pJET 1.2 Plasmid chứa trình tự Alu bị methyl hóa,

dùng để tạo mẫu chuẩn

Easy

Plasmid chứa trình tự LINE-1 không bị

methyl hóa, dùng để làm tham chiếu đại diện cho tổng số DNA sau xử lí

Bảng 3 Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu Chữ t (ở mồi xuôi) và a (ở mồi ngược)

đại diện cho C không bị methyl hóa sau xử lý bisulfite, chữ C (ở mồi xuôi) và G (ở mồi ngược) đại diện cho C bị methyl hóa sau xử lí bisulfite và được gạch chân

Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Sản phẩm (bp) Mục đích sử dụng

ScaI-F CTGAGAATAGTGTATGCGGCGAC (pJET1.2) hoặc 2903 bp

2944 bp (pGEM-T easy)

+ kích thước đoạn chèn

Tạo plasmid thẳng từ dạng tròn ScaI-R CAGTGCTGCCATAACCATGAGTG

pJET1.2-F ACGACTCACTATAGGGAGAGC 118 bp +

kích thước đoạn chèn

Sàng lọc khuẩn lạc tách dòng

pJET1.2-R GAACATCGATTTTCCATGGCA

Hình 9 Vị trí thiết kế các mồi nhận biết đặc hiệu trình tự Alu bị methyl hóa Cặp mồi

Alu-Me-F/Alu-Me-R cho phép khuếch đại cả 2 domain của yếu tố Alu để tạo đoạn chèn cho plasmid Alu-Me Trong khi đó, cặp mồi Alu-Me-F/Alu-Me-R1 chỉ khuếch đại trình tự đích

thuộc domain 1

2.1.4 Hóa chất và thang chuẩn DNA ̶ Tách DNA từ mẫu mô tươi: PureLinkTM Genomic DNA Kit (Invitrogen) ̶ Tách dòng DNA: CloneJetTM PCR Cloning Kit (Thermo Scientific) ̶ Tách DNA plasmid: PureLinkTM Quick Plasmid Miniprep kit (Invitrogen) ̶ Xử lí bisulfite: EZ DNA Methylation-GoldTM Kit (Zymo Research) ̶ Tinh sạch sản phẩm PCR: Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega) ̶ Hóa chất PCR thường: JumpstartTM Taq DNA polymerase (Sigma), GoTaq® G2

Hot Start Colorless Master Mix (Promega) ̶ Hóa chất qPCR: GoTaq® qPCR Master Mix (Promega) ̶ Hóa chất cho điện di: agarose (SERVA); acrylamide và bis-acrylamide

(Affymetrix); APS (Ammonium persulfate) (Merck); TEMED (Tetramethylethylenediamine) (Sigma); EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic), Tris base, Boric acid (Bio Basic); EtBr (Ethidium Bromide) (Bioneer) ̶ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: LB Broth Powder (Bio Basic)

̶ Ampicillin (Bio Basic) Các hóa chất thông dụng đều đạt độ tinh khiết dùng trong sinh học phân tử Ngoài ra, đề tài sử dụng thang chuẩn DNA 4,6 kb do Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp; thang chuẩn DNA 50 bp (Invitrogen) và thang chuẩn DNA 1 kb (Fermentas)

2.1.5 Trang thiết bị

Đề tài sử dụng các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội, Học viện Quân Y 103

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA từ mẫu mô tươi DNA được tách chiết từ 25 mg mẫu mô ung thư và mô liền kề của bệnh nhân ung thư vú, sử dụng PureLinkTM Genomic DNA Kit (Invitrogen) Quá trình tách chiết được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Cụ thể, đầu tiên là cân 25 mg mẫu mô rồi đem cắt nhuyễn Tiếp đó, bổ sung 180 µL Digestion Buffer và 20 µL Proteinase K vào mẫu, trộn đều rồi đem ủ tại 55 0C qua đêm Lưu ý, mỗi 15-20 phút trộn mẫu một lần và tiến hành trộn 4-5 lần trước khi để mẫu qua đêm Mẫu đã xử lí qua đêm sau đó được đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút rồi chuyển dịch sang ống eppendorf mới Kế đó, bổ sung 20 µL RNase A vào dịch mẫu, trộn đều và ủ 2 phút tại nhiệt độ phòng Lần lượt thêm 200 µL Lysis Binding và 200 µL Ethanol 99% vào hỗn hợp, sử dụng pipet để trộn đều rồi chuyển toàn bộ hỗn hợp dịch mẫu lên cột, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút Sau đó, chuyển cột sang ống thu mới, thêm 500 µL Wash Buffer 1 rồi đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút tại nhiệt độ phòng Chuyển cột lần thứ hai sang ống thu mới, thêm 500 µL Wash Buffer 2 rồi đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 3 phút tại nhiệt độ phòng Tiếp theo, chuyển cột lần thứ ba lên ống eppendorf 1,5 mL mới rồi bổ sung 100 µL Elution Buffer và ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA tổng số và bảo quản ở -20 0C

2.2.2 Đo mật độ quang học Nồng độ DNA được xác định bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ trên máy Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) dựa vào độ hấp thụ (A260) ở bước sóng 260 nm Độ tinh sạch của mẫu DNA không còn protein được xác định theo tỷ lệ độ hấp thụ ở

bước sóng 260 nm và 280 nm Tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0 thì mẫu DNA là được coi là tinh sạch [38]

2.2.3 Xử lí DNA với bisulfite Hai trăm picogram (200 pg) DNA của mỗi mẫu mô cùng 300 pg oligo carriers được đem xử lí với bisulfite sử dụng EZ DNA Methylation-GoldTM Kit (Zymo Reasearch) Quá trình xử lí được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất mà bước một là chuẩn bị CT-conversion Cụ thể, mỗi ống bột CT-conversion được bổ sung 900 µL nước PCR, 300 µL M-Dilution Buffer và 50 µL M-Dissolving Buffer rồi đem vortex ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Sản phẩm từ mỗi ống CT-conversion sau đó được sử dụng cho 10 phản ứng xử lí (130 µL dịch CT-conversion/1 phản ứng) Bước hai, bổ sung 20 µL DNA (tương ứng có tổng 0,2 ng DNA tổng số và 0,3 ng oligo carriers) cho mỗi phản ứng xử lí rồi trộn đều Như vậy, tổng thể tích dịch của mỗi mẫu trở thành 150 µL Bước ba, đem các phản ứng ủ theo chu trình nhiệt: 98 0C-10 phút, 64 0C-150 phút Tiếp đó, thao tác với mỗi mẫu DNA tại nhiệt độ phòng theo cùng một quy trình như sau: (1) gắn cột Zymo-SpinTM IC lên trên ống thu rồi lần lượt thêm 600 µL M-Binding Buffer và 150 µL dịch mẫu đã ủ nhiệt lên cột, đóng nắp và đảo ống cho hỗn hợp đồng nhất; (2) ly tâm cột mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ dịch chảy qua cột; (3) thêm 100 µL M-Wash Buffer lên cột rồi đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút; (4) thêm 200 µL M-Desulphonation Buffer lên cột, ủ 15 phút rồi đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 1 phút; (5) thêm 200 µL M-Wash Buffer lên cột rồi đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút; (6) tiếp tục thêm 200 µL M-Wash Buffer lên cột lần thứ hai, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ dịch chảy qua cột; (7) thực hiện ly tâm khô trong 2 phút với tốc độ 12000 vòng/phút Cuối cùng, chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 mL mới, thêm 20 µL M-Elution vào giữa màng Tiến hành ủ 5 phút tại nhiệt độ phòng rồi đem ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA sau xử lí cho mỗi mẫu DNA sau xử lí được bảo quản tại -20 0C để sử dụng

2.2.4 Phương pháp PCR Phản ứng PCR được thực hiện để xác định tính đặc hiệu của cặp mồi đối với

trình tự Alu bị methyl hoá Điều kiện phản ứng được trình bày trong Bảng 4 Đối

chứng âm sử dụng nước thay khuôn DNA, đối chứng dương sử dụng khuôn là mẫu DNA đã xử lí tại các lượng 50 ng và 5 ng

Bảng 4 Điều kiện phản ứng kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi đối với trình tự Alu bị

95 0C-2 phút, (95 0C-30 giây, 59 0C-30 giây, 72 0C-30 giây) x40 chu kỳ, 72 0C-5 phút

2.2.5 Phương pháp điện di Các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ (dưới 300 bp) được điện di trên gel polyacrylamide 8% Thành phần gel polyacrylamide 8% gồm: TBE 10X, acrylamide: bisacrylamide (tỷ lệ theo khối lượng là 29:1), APS 10% và TEMED DNA kích thước lớn hơn được điện di trên gel agarose 1% Quá trình điện di được thực hiện trong đệm TBE 1X Gel polyacrylamide và gel agarose đều được nhuộm với EtBr và chụp ảnh bằng Hệ thống DigiDoc It (Analytik Jena – Đức)

2.2.6 Tạo mẫu chuẩn cho qMSP

Mẫu chuẩn được tạo ra bằng cách phối trộn plasmid pAlu-Me chứa trình tự đích Alu bị methyl hóa với pLINE-Ref chứa trình tự tham chiếu LINE-1 và DNA tổng số

từ mẫu máu bình thường Các plasmid phải ở dạng thẳng để đảm bảo hiệu quả gắn

mồi và hiệu suất tổng hợp tối ưu [18] Plasmid Alu-Me chưa có nên cần tạo plasmid

tái tổ hợp