Phân tích methyl hóa và biểu hiện của yếu tố line 1 Ở bệnh nhân ung thư vú việt nam

Phân tích methyl hóa và biểu hiện của yếu tố line 1 Ở bệnh nhân ung thư vú việt nam Phân tích methyl hóa và biểu hiện của yếu tố line 1 Ở bệnh nhân ung thư vú việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thân

PHÂN TÍCH METHYL HÓA VÀ BIỂU HIỆN CỦA YẾU TỐ VẬN ĐỘNG

LINE-1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thân

PHÂN TÍCH METHYL HÓA VÀ BIỂU HIỆN CỦA YẾU TỐ VẬN ĐỘNG

LINE-1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Vương Diệu Linh

PGS.TS Võ Thị Thương Lan

Hà Nội – 2023

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Võ Thị Thương Lan, người đã

hướng dẫn, chỉ dạy cho em không chỉ trong công việc mà còn luôn thấu hiểu, giúp đỡ

em cả trong cuộc sống Cô là người đã dạy em cách sắp xếp công việc và giải quyết vấn đề trong thí nghiệm, sự lạc quan và nhẫn nại khi gặp khó khăn trong cả công việc

và cuộc sống Bên cạnh đó, cô cũng luôn tha thứ, nhẹ nhàng chỉ bảo khi em mắc lỗi

và có tinh thần trách nhiệm dù làm bất kỳ công việc nào Cô đã giúp em có thêm niềm tin vào bản thân, cho em những lời khuyên để em tự tin hơn với những quyết định của

bản thân Bên cạnh đó, em cũng xin chân thành cảm ơn TS Vương Diệu Linh, người

đã luôn động viên và chỉ dạy cho em các kỹ thuật, những kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập và làm việc Em cảm thấy mình thật may mắn khi được sự hướng dẫn của hai cô

Tiếp theo, em rất cảm ơn NCS Phạm Thế Tùng, người đã giúp đỡ trong công

việc cũng như lắng nghe em trình bày, phân tích thí nghiệm, giúp em tự tin hơn và tiến xa hơn trong quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm Sinh Y Em cũng xin cảm

ơn các bạn và các em trong phòng đã cùng làm việc và sẻ chia những khó khăn, những kỷ niệm buồn vui trong hai năm học Thạc sĩ

Em xin trân trọng cảm ơn sự tài trợ của dự án VINIF.2022.DA00036, sự hỗ

trợ cung cấp mẫu nghiên cứu và các trang thiết bị từ bệnh viện K (Hà Nội) đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện tốt đề tài này

Em cũng xin cảm ơn tới các thầy cô Bộ môn Sinh học Tế bào, các thầy cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lời cho em học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian qua

Hà Nôi, ngày tháng năm 2023

Học viên

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CpG Cytosine phosphate Guanin Phức CpG

DCIS Ductal carcinoma in situ Ung thư biểu mô ống tại chỗ DMNT DNA methyl transferase Enzym DNA methyltransferase

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

HDAC Histone deacetylase Enzyme khử acetyl histone

H3K9 Lysine 9 trên histone H3 Vùng điều khiển cấu trúc dị

nhiễm sắc

HELZ2 Helicase with Zinc Finger 2 Protein được mã hóa bởi các

gen kích thích interferon

IDC Invasive ductal carcinoma Ung thư biểu mô ống xâm lấn

bởi hệ miễn dịch

ILC Invasive lobular carcinoma Ung thư tiểu thùy xâm lấn ISG Interferon-Simulated Gene Gen kích thích interferon

LCIS Lobular carcinoma in situ Ung thư biểu mô nội tiểu thùy

element-1

NGS Next-Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới

NSCLC Non-small-cell lung cancer Ung thư phổi không tế bào nhỏ

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

qMSP Quantitative methylation PCR định lượng đặc hiệu

RUNX Runt-domain transcription Yếu tố phiên mã có domain

UTR Untranslated region Vùng không dịch mã

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Các giai đoạn ung thư vú được phân chia theo hệ thống TNM 4

Bảng 5: Thành phần và điều kiện phản ứng qMSP khuếch đại trình tự đích

LINE-Me và trình tự tham chiều LINE-Ref

21

Bảng 6: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi LINE-1 24

Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi GAPDH 26

Bảng 8: Thành phần và điều kiện phản ứng RT-qPCR với cặp mồi LINE-1 26

Bảng 9: Mối liên hệ giữa đặc điểm mô bệnh học và mức độ methyl hóa LINE-1

trong nhóm LINE-1 hypermethylation (HM) và nhóm hypomethylation (LM)

33

Bảng 10: Giá trị Ct trung bình và độ lệch chuẩn của đường chuẩn LINE-Me và

LINE-Ref trên các hệ thống qPCR

35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Cấu trúc của yếu tố di truyền vận động LINE-1 ở người 7

Hình 3: Kết quả điện di một số mẫu DNA tổng số trên gel agarose 1 % 29

Hình 4: (A) Đường chuẩn biểu diễn giá trị Ct ở các nồng độ khuôn khác nhau của

trình tự đích LINE-Me và trình tự tham chiếu LINE-Ref (B) Đồ thị đánh giá hiệu

suất khuếch đại trình tự đích LINE-Me và trình tự tham chiếu LINE-Ref

30

Hình 5: Đường cong khuếch đại của trình tự tham chiếu LINE-Ref (A) và trình tự

đích LINE-Me (B) từ các mẫu bệnh phẩm

31

Hình 6: Mức độ methyl hóa LINE-1 trong nhóm mẫu ung thư và liền kề 32

Hình 7: Đường chuẩn LINE-Me và LINE-Ref lần lượt trên các hệ thống Applied

Biosystems™ 7500 (A), QuantStudio™5 Dx (B), abCyclerQ (C)

Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại với cặp mồi LINE-1 37

Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của 6 cặp mẫu u và liền kề với cặp

mồi gen GAPDH trên gel polyacrylamide 8%

37

Hình 12: Kết quả biểu diễn đường cong nóng chảy của một số mẫu 39

Hình 13: Đồ thị thể hiện giá trị Ct gen GAPDH trên 50 mẫu ung thư và liền kề 40

Hình 14: Mối liên hệ giữa mức độ methyl hóa và biểu hiện của LINE-1 41

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về ung thư vú 2

1.1.1 Ung thư vú 2

1.1.2 Các phương pháp trong sàng lọc, chẩn đoán và tiên lượng ung thư vú 4

1.2 Tổng quan về LINE-1 6

1.2.1 Cấu trúc, cơ chế vận động và tác động của LINE-1 6

1.2.2 Methyl hóa DNA là cơ chế kiểm soát sự vận động của LINE-1 8

1.2.3 Biểu hiện ORF1 và ORF2 của LINE-1 trong ung thư vú 9

1.2.4 LINE-1 và ung thư 11

1.3 Phân tích tỉ lệ methyl hóa DNA bằng kĩ thuật qMSP 13

1.4 Một số phương pháp phân tích mức độ biểu hiện phiên mã LINE-1 15

1.4.1 Lai northern 15

1.4.2 RT-qPCR 16

1.4.3 RNA sequencing 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Mẫu nghiên cứu 18

2.2 Nguyên liệu và hóa chất 18

2.2.1 Các cặp mồi 18

2.2.2 Các plasmid tái tổ hợp để xây dựng mẫu chuẩn 18

2.2.3 Hóa chất 19

2.2.4 Trang thiết bị 19

2.3 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích methyl hóa LINE-1 20

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tươi 20

2.3.2 Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA sau tách chiết 20

2.3.3 Xử lý DNA với bisulfite 20

2.3.4 Tạo mẫu chuẩn (PC) 20

2.3.5 Phản ứng qMSP và tính toán tỷ lệ methyl hóa 21

2.3.6 Phương pháp phân tích thống kê 22

2.4 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện LINE-1 23

2.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô tươi 23

2.4.2 Xử lý DNase I, tinh sạch RNA 23

2.4.3 Kiểm tra chất lượng RNA 24

2.4.4 Phản ứng tổng hợp cDNA 24

2.4.5 Phản ứng RT-qPCR 25

2.4.6 Phân tích số liệu 27

2.5 Sơ đồ nghiên cứu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Kết quả tách chiết, kiểm tra chất lượng, nồng độ DNA tổng số 29

3.2 Kết quả phân tích mức độ methyl hóa LINE-1 trên mẫu ung thư và liền kề 29

3.2.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn 29

3.2.2 Xác định tỷ lệ methyl hóa LINE-1 trong mẫu mô ung thư và liền kề 31

3.2.3 Khảo sát tỷ lệ methyl hóa LINE-1 trên ba hệ thống máy qPCR khác nhau: Applied Biosystems™ 7500, QuantStudio™5 Dx, abCyclerQ (AIT Biotech) 34

3.3 Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của LINE-1 36

3.3.1 Kết quả tách RNA tổng số và kiểm tra chất lượng RNA, cDNA 36

3.3.2 Đánh giá độ đặc hiệu của cặp mồi cho phản ứng RT-qPCR 38

3.3.3 Phân tích mức độ biểu hiện LINE-1 trên nhóm mẫu ung thư và liền kề 40

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN 42

KẾT LUẬN 46

KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 1: Thông tin bệnh nhân ung thư vú

PHỤ LỤC 2: Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tươi sử dụng kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen)

PHỤ LỤC 3: Quy trình xử lý bisulfite mẫu DNA sử dụng kit EZ DNA Gold Kit (Zymo Reasearch)

Methylation-PHỤ LỤC 4: Quy trình tách RNA tổng số từ mẫu mô sử dụng kit SV Total RNA Isolation System (Promega)

PHỤ LỤC 5: Kết quả qPCR của 60 cặp mẫu nhóm HM và 40 cặp mẫu nhóm LM của bệnh nhân ung thư vú

PHỤ LỤC 6: Kết quả xác định nồng độ, độ sạch RNA của 50 cặp mẫu bằng phương

pháp đo quang phổ hấp thụ

MỞ ĐẦU

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến và dẫn đầu về số ca tử vong ở nữ giới trên toàn cầu Việc phát hiện sớm ung thư cải thiện hiệu quả điều trị và tăng khả năng sống sót cho bệnh nhân Hiện nay, methyl hóa DNA là dấu chuẩn di truyền ngoại gen tiềm năng phát hiện một số bệnh ung thư ở giai đoạn sớm Methyl hoá ở yếu tố vận động

“Long interspersed element-1” (LINE-1) đang được tập trung nghiên cứu do chúng

có số bản sao rất lớn trong hệ gen, nhờ đó có thể tăng độ nhạy phát hiện khi sử dụng một lượng mẫu nhỏ cho xét nghiệm

LINE-1 là retrotransposon duy nhất còn khả năng vận động ở người thông qua phiên mã và phiên mã ngược LINE-1 chiếm 17% hệ gen người với khoảng 105 bản

sao Trong tế bào bình thường, quá trình phiên mã LINE-1 được kiểm soát chặt chẽ

thông qua cơ chế methyl hóa DNA Ngược lại, trong tế bào bất thường, đặc biệt là tế

bào ung thư, LINE-1 bị giảm methyl hóa và vận động, gây mất ổn định hệ gen theo nhiều cơ chế khác nhau Hoạt động của LINE-1 đã được chứng minh có liên quan đến ung thư và quá trình phát triển khối u Vì thế, thay đổi methyl hóa LINE-1 được xem

là chỉ thị cho phép đánh giá trạng thái methyl hóa của toàn bộ hệ gen cũng như tình trạng bệnh của cơ thể Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tình trạng giảm methyl hóa

LINE-1 là một dấu chuẩn hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng các loại ung thư khác nhau Tuy nhiên hiện nay mức độ methyl hoá LINE-1 trong tế bào ung thư còn có những ý

kiến trái chiều

Đứng giữa hai định hướng trái ngược này, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài

“Phân tích mức độ methyl hóa và biểu hiện của yếu tố vận động LINE-1 ở bệnh

nhân ung thư vú Việt Nam” nhằm đánh giá mối liên hệ giữa sự biến đổi tỉ lệ methyl

hóa LINE-1 giữa mô ung thư/liền kề; đồng thời phân tích mối tương quan giữa methyl hóa và mức độ biểu hiện LINE-1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về ung thư vú

1.1.1 Ung thư vú

Ung thư vú là bệnh ung thư phổ biến và gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ trên thế giới; ước tính có gần 2,3 triệu ca mắc mới và hơn 600 000 người tử vong trong năm

2020 [58] Đáng chú ý, ở các nước phát triển, tỷ lệ mắc mới ung thư vú cao nhưng tỷ

lệ tử vong lại thấp so với các nước kém phát triển [58] Điều này cho thấy tầm quan trọng của sàng lọc, phát hiện sớm ung thư

Tại Việt Nam, báo cáo của năm 2020 cho thấy ung thư vú là loại ung thư đứng đầu về tỷ lệ mắc ở nữ giới, đứng thứ ba về tỷ lệ tử vong sau ung thư phổi và ung thư gan [66] Ở Miền Bắc với tỉ lệ mắc theo tuổi là 27,3/100.000 dân, ở Miền Nam tỉ lệ này là 17,1/100.000 dân [64] Đây là một con số lớn và đáng báo động

a Phân loại ung thư vú: Ung thư vú thường xuất hiện ở các tế bào biểu mô

thùy tuyến sữa hay ống dẫn sữa Có thể phân biệt ung thư vú thành hai dạng chính: Ung thư tại chỗ và ung thư xâm lấn

Ung thư vú tại chỗ bao gồm ung thư biểu mô ống tại chỗ (Ductal carcinoma in

situ – DCIS) và ung thư biểu mô tiểu thùy tại chỗ (Lobular carcinoma in situ – LCIS) DCIS gồm các tế bào ung thư phát sinh trong ống dẫn sữa, chưa di căn ra khỏi vú đến các bộ phận các của cơ thể [68] LCIS liên quan đến các tế bào bất thường phát triển trong tiểu thùy, các tuyến sản xuất sữa ở cuối ống dẫn sữa, nhưng chưa phát triển qua thành của tiểu thùy và không lan ra các mô xung quanh

Ung thư vú xâm lấn gồm các khối u đã lan rộng vào mô vú xung quanh Có

hai loại hay gặp nhất chiếm khoảng 90% ung thư vú xâm lấn, gồm ung thư biểu mô ống xâm lấn (Invasive ductal carcinoma – IDC) và ung thư biểu mô tiểu thùy xâm lấn (Invasive lobular carcinoma – ILC) [68] IDC là loại ung thư phổ biến nhất chiếm khoảng 80%, có các tế bào ung thư xuất hiện đầu tiên trong tế bào lót ống dẫn sữa, xâm lấn qua thành ống và phát triển vào các mô vú xung quanh [68] ILC là ung thư phổ biến thứ hai sau IDC, khoảng 10% tất cả các trường hợp mắc ung thư vú xâm

lấn ILC bắt đầu trong các thùy sản xuất sữa, sau đó lan sang các phần khác của vú

và có thể di căn đến bộ phận khác của cơ thể [68]

Ngoài ra còn có các loại ung thư ít phổ biến:

Ung thư vú dạng viêm (Inflammatory breast cancer – IBC): Đây là loại ung

thư vú hiếm gặp và ác tính, thường xuất hiện dưới dạng phát ban hoặc xuất hiện những vùng dưới da bị kích ứng [68]

Bệnh Paget vú: là một loại ung thư vú không phổ biến, hình thành trong hoặc

xung quanh núm vú Nó chiếm từ 1%-4% ở bệnh ung thư vú [68]

Khối u Phyllodes: chỉ chiếm dưới 1% trong tổng số các khối u vú Các khối u

Phyllodes phát triển trong mô liên kết hay được gọi là mô đệm [68]

b Độ mô học của ung thư vú:

Phân độ mô học của ung thư vú được Elson và cộng sự đề xuất từ năm 1993, chỉ áp dụng cho ung thư biểu mô ống xâm lấn [20] Độ mô học của khối u được xếp

c Các giai đoạn của ung thư vú:

Việc điều trị ung thư vú có hiệu quả hay không phụ thuộc nhiều vào việc phát hiện bệnh sớm Cũng giống như các loại ung thư khác, ung thư vú được phân loại theo hệ thống TNM (Tumor-Node-Metastasis) Hệ thống này phân loại khối u theo

ba tiêu chí: Kích thước khối u (Tumor), hạch bạch huyết có liên quan đến bệnh (Node)

và khả năng di căn khối u (Metastasis) [68] Theo hệ thống phân loại này, tiến triển của ung thư chia thành các giai đoạn từ 0 đến IV, được trình bày trong Bảng 1

Bảng 1: Các giai đoạn ung thư vú được phân chia theo hệ thống TNM [68]

Tis: ung thư vú tại chỗ T0: Không có khối u T1: U có đường kính lớn nhất ≤ 2 cm T2: 2 cm < đường kính u lớn nhất ≤ 5 cm T3: đường kính u lớn nhất > 5 cm

T4: kích thước khối u bất kỳ có thể lan đến thành ngực, da

Di căn hạch vùng (N):

N0: Không di căn hạch N1: hạch nách di căn cùng bên di động N2: Hạch nách cùng bên dính vào nhau hoặc vào tổ chức khác

N3: Hạch trên xương đòn hay dưới xương đòn phù nề tay, và/hoặc hạch vú trong cùng bên

Di căn xa (M):

M0: không di căn M1: di căn xa

d Các yếu tố tăng nguy cơ ung thư vú: Ung thư vú gây ra do nhiều yếu tố

như tuổi tác, giới tính, nồng độ estrogen, tiền sử gia đình, đột biến các gen BRCA1 và BRCA2, chế độ dinh dưỡng và những biến đổi di truyền ngoại gen, trong đó methyl

hóa DNA đóng vai trò quan trọng [68] Vì vậy, khi nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán và điều trị ung thư vú, các nhà khoa học cũng rất quan tâm đến các nguyên nhân gây ung thư vú, đặc biệt là mối liên hệ giữa các yếu tố nguy cơ này

1.1.2 Các phương pháp trong sàng lọc, chẩn đoán và tiên lượng ung thư vú

a Các phương pháp sử dụng phổ biến

Phương pháp bộ ba kinh điển: Đây là phương pháp xét nghiệm thường quy đối với bệnh nhân khi chẩn đoán ung thư Phương pháp này gồm chẩn đoán lâm sàng kết

hợp với chụp X quang tuyến vú và xét nghiệm tế bào học Việc chẩn đoán ung thư vú

có thể được tiến hành khi người bệnh tự quan sát, nhận biết được một số dấu hiệu bất thường ở tuyến vú: vết lõm ở da, núm vú tụt vào trong, tiết dịch núm vú [65] Khối u thường không đau và dễ nhận biết vì có mật độ chắc hơn mô tuyến vú xung quanh Phương pháp chụp X quang tuyến vú sẽ cho thấy thấy tổn thương điển hình có dạng hình sao nhiều chân, co kéo tổ chức tuyến vú, có nhiều chấm vi canxi hóa tập hợp thành đám [65]

Phương pháp sinh thiết: Nếu một trong ba kết quả của phương pháp bộ ba kinh điển có nghi ngờ, bác sĩ lâm sàng có thể chỉ định làm xét nghiệm giải phẫu bệnh định typ mô bệnh học thông qua sinh thiết kim, sinh thiết tức thì hoặc sinh thiết mở rộng thường quy để khẳng định chẩn đoán [65]

Hóa mô miễn dịch: Kỹ thuật này dựa trên các dấu ấn sinh học của tế bào u, được tiến hành khi các bệnh nhân đã phẫu thuật cắt bỏ khối u Đối với ung thư vú, Her2/neu, ER, PR là ba dấu ấn sinh học quan trọng Tùy thuộc vào mức độ biểu hiện của các dấu ấn sinh học này trên khối u mà các bác sĩ quyết định phương thức điều trị là hóa trị, xạ trị hay điều trị nội tiết

b Dấu chuẩn methyl hóa DNA

Các phương pháp chẩn đoán truyền thống dựa trên tế bào học, mô bệnh học, hóa mô miễn dịch được hỗ trợ rất hữu hiệu bởi các dấu chuẩn phân tử DNA, RNA và protein Từ cuối thập kỷ 20, những nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh ung thư cho thấy thay đổi nhóm methyl trên phân tử DNA là một trong các dấu hiệu đầu tiên dẫn đến hình thành và phát triển của hầu hết các loại ung thư [54] Quá trình methyl hóa DNA diễn ra ở những giai đoạn sớm trong tế bào ung thư vú Việc phát hiện những thay đổi này có ý nghĩa quan trọng với chẩn đoán sớm ung thư vú, tăng khả năng sống sót cho bệnh nhân

PCR dựa trên dấu chuẩn methyl hóa DNA được phát triển và cấp phép là CE-IVD tiên lượng ung thư vú [51] Xét nghiệm IVD này có ý nghĩa đối với bệnh nhân ung

thư vú nguy cơ cao (ER+/HER2- và LN+) được hóa trị liệu dựa trên anthracycline;

có hoặc không có điều trị bằng nội tiết Do đó, không phù hợp với bệnh nhân dương tính với HER2+; nhóm ung thư vú tam âm (TNBC) hoặc nhóm ung thư vú không di căn hạch bạch huyết [51]

1.2 Tổng quan về LINE-1

1.2.1 Cấu trúc, cơ chế vận động và tác động của LINE-1

Long interspersed element-1 (LINE-1/L1) là yếu tố vận động độc lập

retrotransposon duy nhất còn khả năng vận động ở người thông qua phiên mã (tổng

hợp RNA) và phiên mã ngược (tổng hợp cDNA) [40] LINE-1 chiếm 17% trong hệ gen người với khoảng 500 000 bản sao [25, 40] Tuy nhiên, phần lớn LINE-1 không

hoạt động do bị mất vùng 5’ promoter hoặc vùng 5’UTR bị đảo ngược hay đột biến

xảy ra trong hai trình tự ORF của chúng [25] Chỉ có khoảng 80-100 bản sao LINE-1

còn khả năng vận động trong dòng tế bào soma và có mối liên hệ với bệnh tật [25, 46]

LINE-1 nguyên vẹn có độ dài khoảng 6 kb, chứa hai khung đọc mở ORF1 và ORF2, cả hai đều cần thiết cho quá trình di chuyển của LINE-1 đến các vị trí khác

nhau trong hệ gen [25, 46] (Hình 1) Vùng 5’UTR dài khoảng 910 bp, chứa promoter phiên mã bởi RNA polymerase II, vùng này cũng chứa một promoter ngược chiều để phiên mã khung đọc mở thứ ba (ORF0) chưa rõ chức năng [21] Ngoài ra vùng 5’UTR

còn chứa các vị trí liên kết của nhiều yếu tố phiên mã khác như YY1, RUNX hay SRY cần thiết cho sự phiên mã của LINE-1 [4, 63], đồng thời dẫn đến sự phiên mã bất thường của các gen nằm liền kề LINE-1 ORF1 mã cho protein p40 liên kết đặc hiệu

với RNA [36] Tương tự như nucleocapsid của virus, p40 giúp sợi mRNA tồn tại ở cấu hình bền nhất về mặt nhiệt động lực học trong môi trường tế bào chất [36] ORF2

mã cho protein có khối lượng khoảng 150 kDa, có hoạt tính endonuclease (EN) [22]

và reverse transcriptase (RTase) [37], cùng với domain giàu cystein được chứng minh

hoạt động như zinc-fingers cần thiết cho quá trình chuyển vị của LINE-1 Vùng 3’UTR

có chứa đuôi polyA, là vị trí bám của protein ORF2 và cần cho sự vận động của

LINE-1 [LINE-18]

Hình 1: Cấu trúc của yếu tố di truyền vận động LINE-1 ở người [21]

LINE-1 vận động theo cơ chế “Target-site–primed reverse transcription”, được

hiểu là phiên mã ngược hướng đích [14] Sau khi được phiên mã, phân tử mRNA với

chiều dài đầy đủ của LINE-1 được đưa ra tế bào chất và được dịch mã tạo ra 2 protein ORF1p và ORF2p Hai protein này sẽ quay lại bám vào phân tử mRNA của LINE-1,

ORF1p tồn tại dưới dạng trimer bám dọc vào mRNA còn ORF2p bám vào vùng 3’ RNA, tạo thành phức RNP (Ribonuleoprotein) Phức hệ này di chuyển vào nhân nhờ quá trình phân chia tế bào [35, 38] Khi vào trong nhân, hoạt tính endonuclease của ORF2p cắt một mạch DNA tại vị trí có trình tự bảo thủ 5′-TTTTT/AA-3′, để lộ ra vị

trí 3’OH tự do trên đoạn DNA đích [14] Tiếp đó, đuôi polyA của sợi mRNA LINE-1

bổ sung với trình tự này và sử dụng để làm mồi cho phản ứng phiên mã ngược nhờ hoạt tính phiên mã ngược của ORF2p [14] Cuối cùng, mạch còn lại sẽ được tổng hợp

bổ sung, kết quả tạo ra một bản sao mới của LINE-1 Phần lớn các bản sao mới của LINE-1 bị mất đầu 5’UTR do các con đường sửa chữa DNA nhận biết và làm hỏng quá trình phiên mã ngược [15] Ngoài ra, do bản thân trình tự LINE-1 giàu A làm ảnh hưởng đến quá trình kéo dài sợi mRNA LINE-1, tạo ra các dấu hiệu kết thúc phiên

mã sớm (premature polyadenylation), dẫn đến các bản sao LINE-1 có một hoặc cả

hai ORF không còn nguyên vẹn

LINE-1 tác động lên hệ gen thông qua xen cài bản sao mới vào vị trí bất kỳ trong

hệ gen, làm tăng tính “mềm dẻo” của hệ gen, tạo ra sự đa dạng di truyền giữa các cá

thể [42] Tuy nhiên, LINE-1 chuyển vị còn là tác nhân gây đột biến, thay đổi biểu

hiện gen hoặc thậm chí sửa đổi cấu trúc gen theo nhiều cách khác nhau Đặc biệt, việc

LINE-1 xen cài vào exon hoặc intron có thể gây ra sự cắt nối sai intron-exon, phá vỡ trình tự gen hoặc thậm chí làm gen im lặng, không biểu hiện [46] Ngoài ra, LINE-1

xen cài vào vùng điều hòa của gen gây kích hoạt biểu hiện gen dẫn đến sự chuyển

sang trạng thái ác tính ở các dòng tế bào soma [48] Đến nay, việc LINE-1 xen cài

gây đột biến mang tính chất quyết định (driver mutation) hay các đột biến thứ yếu

(passenger mutation) vẫn chưa rõ ràng LINE-1 chèn vào các gen ức chế khối u APC hoặc PTEN đã được chứng minh liên quan đến hình thành khối u [25] Ngoài ra, biểu hiện của gen có LINE-1 chèn vào còn phụ thuộc vào độ dài và chiều phiên mã của LINE-1 [46] Trình tự LINE-1 giàu adenosine tạo ra các vị trí polyadenyl hóa báo hiệu kết thúc phiên mã sớm Bên cạnh đó, promoter APS (antisense promoter site) của LINE-1 cũng có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen [48]

Đặc biệt, LINE-1 vận động không chỉ làm tăng số bản sao của chính nó và các yếu tố vận động phụ thuộc như Alu mà còn gây đứt gãy sợi đôi làm mất ổn định hệ

gen và thay đổi cấu trúc của gen đồng thời làm đa dạng hệ gen [17, 48] Sau khi tích

hợp vào các vị trí khác nhau trong hệ gen, hai bản sao của LINE-1 có thể tái tổ hợp

tương đồng dẫn đến sắp xếp lại nhiễm sắc thể, bao gồm đảo đoạn, thêm đoạn, mất đoạn lên đến megabase hoặc dung hợp nhiễm sắc thể [47, 53] Mất đoạn trên nhiễm

sắc thể đôi khi loại bỏ các gen ức chế khối u (ví dụ CDKN2A) hoặc kích hoạt gen ung thư (ví dụ CCND1) [46]

1.2.2 Methyl hóa DNA là cơ chế kiểm soát sự vận động của LINE-1

Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế di truyền ngoại gen phổ biến trong

hệ gen của động vật có vú Đây là quá trình gắn gốc methyl vào vị trí carbon số 5 của cytosine đứng trước guanine (CpG) thông qua hoạt tính enzyme DNA methyltransferase (DMNT) [43] Khoảng 60% promoter của gen ở động vật có vú chứa trình tự giàu CpG được gọi là đảo CpG; sự methyl hóa đảo CpG có liên quan mật thiết đến hoạt động của gen [43] Khi các đảo CpG không bị methyl hóa thì gen hoạt động Ngược lại, nếu đảo CpG bị methyl hóa, gen im lặng Điều này có thể giải thích thông qua tương tác của các yếu tố phiên mã với các trình tự DNA bị methyl

hóa hoặc không bị methyl hóa [43] Quá trình methyl hóa DNA đặc trưng cho mô và

loại tế bào Methyl hóa DNA de novo trong quá trình tạo phôi và phát triển tế bào

mầm được thực hiện bởi họ enzyme DNMT3 (DNMT3a và DNMT3b) rồi tiếp tục duy trì qua các thế hệ tế bào nhờ enzyme DNMT1 [23]

Hoạt động của LINE-1 được kiểm soát chặt chẽ bởi methyl hoá DNA [10, 46] Methyl hóa LINE-1 xảy ra ở 33 vị trí CpG phân bố trong 460 bp thuộc vùng promoter

[9, 45] Các trình tự cần thiết cho quá trình phiên mã tập trung ở 100bp đầu tiên trong vùng 5’UTR [52, 63] Ví dụ, vị trí +13 đến +21 là vị trí bám của yếu tố phiên mã YY1 (Yin Yang-1) [4]; vị trí +83 đến +101 là vị trí tương tác của yếu tố RUNX (runt-domain transcription factor) [63] Khi các trình tự này bị methyl hóa sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho các protein có khả năng liên kết với CpG bị methyl hóa (methyl-CpG-binding protein) bám vào và tương tác với các protein tham gia điều chỉnh cấu trúc chất nhiễm sắc như enzyme có hoạt tính deacetylase (HDAC1) Lúc đó chất nhiễm

sắc sẽ đóng xoắn chặt hơn, dẫn đến giảm biểu hiện của LINE-1 [19, 41]

Tùy vào loại tế bào và giai đoạn phát triển của cơ thể, tỉ lệ methyl hóa LINE-1

sẽ khác nhau Trong quá trình phát triển phôi sớm hay trong quá trình biệt hóa của tế

bào thần kinh, LINE-1 bị methyl hóa ở mức thấp, khiến tần suất chuyển vị tăng cao [21, 25] Trong tế bào soma, LINE-1 bị methyl hóa rất mạnh, dẫn đến hoạt động của

chúng chỉ đạt mức tối thiểu [11, 46, 56] Sự thay đổi methyl hóa bất thường trên các dòng tế bào soma gây ra tác động xấu đến hệ gen theo các cơ chế đã nêu trên, dẫn đến sự thay đổi trạng thái tế bào và là nguyên nhân của nhiều bệnh lý trong đó bao gồm cả ung thư

1.2.3 Biểu hiện ORF1 và ORF2 của LINE-1 trong ung thư vú

Biểu hiện LINE-1 được kích hoạt trở lại trong bệnh ung thư thông qua bằng chứng phát hiện các protein do LINE-1 mã hóa (ORFp) [49] ORFp phân bố trong

nhân có liên quan với ung thư vú di căn hạch và có tiên lượng xấu; trong khi ORFp phân bố chủ yếu trong tế bào chất ở bệnh nhân thư vú tại chỗ và không liên quan quan đến tiên lượng bệnh [12, 26]

Biểu hiện của khung đọc mở thứ nhất (ORF1)

Thông qua các thí nghiệm trên dòng tế bào ung thư, sự tăng biểu hiện mRNA

và protein của ORF1 giúp tế bào ung thư tăng sinh [60] Điều đáng quan tâm, mRNA của ORF1 được phát hiện ở cả mẫu ung thư và mẫu mô lành nhưng protein ORF1p

lại không thu nhận được ở mẫu mô lành [38] Hơn nữa, ORF1p biểu hiện khác nhau trong quá trình tiến triển ung thư: Biểu hiện mạnh ở khối u ác tính cao, nhưng ít khi biểu hiện ở ung thư giai đoạn sớm, độ mô học thấp và không có ở các tế bào mô lành [49] Trong ung thư vú, biểu hiện cao của ORF1p trong nhân có liên quan đến di căn

xa và tiên lượng xấu [26] Đáng chú ý, cả biểu hiện của mRNA/protein của ORF1

khác nhau giữa các loại ung thư, mang tính đặc trưng cho ung thư bắt nguồn từ tế bào biểu mô, chẳng hạn như ung thư vú, buồng trứng, tuyến tụy, thực quản, bàng quang,

phổi và đại trực tràng biểu hiện quá mức ORF1; trong khi các bệnh ung thư khác,

chẳng hạn như ung thư thận, gan, cổ tử cung, não, máu ít biểu hiện hoặc hầu như

không biểu hiện ORF1 [2, 38] Ngoài ra, có báo cáo chỉ ra rằng ORF1p biểu hiện mạnh hơn ORF2p gấp 1000-10000 lần trong thí nghiệm in vitro [3], vì thế ORF1p trở

thành đối tượng được tập trung nghiên cứu hơn ORF2p

Biểu hiện khung đọc mở thứ 2 (ORF2)

Trái ngược với ORF1 biểu hiện mạnh trong khối u ác tính [26], biểu hiện của mRNA/protein của ORF2 gắn liền với sự kiện mở đầu trong quá trình phát sinh ung thư [16] ORF2 mã hóa protein có hoạt tính sao chép ngược và endonuclease Sự biểu

hiện cao của endonuclease gây đứt gãy DNA, gây tổn thương và ảnh hưởng đến quá trình sửa chữa DNA và tăng sự mất ổn định hệ gen [29] Kích hoạt enzyme phiên mã ngược có thể thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa tế bào, đồng thời làm thay đổi phiên

mã non-coding RNA khác, dẫn đến thay đổi mạng lưới điều hòa tế bào, phát triển khối u và các quá trình liên quan đến bệnh lý [13, 48] De Luca và cộng sự (2016) đã

sử dụng một kháng thể đơn dòng đặc hiệu cao (mAb chA1-LINE-1) cho thấy ORF2p biểu hiện cao trong các dòng tế bào ung thư và các loại ung thư phổi, ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư vú; trong khi không thu nhận được tín hiệu

ở mô lành [16] Sự biểu hiện mạnh của ORF2p xảy ra ở giai đoạn tiền ung thư hay

loạn sản của ung thư đại tràng và ung thư tuyến tiền liệt nhưng biểu hiện của ORF2p không đồng nhất hay theo một xu hướng tăng hoặc giảm theo độ mô học của ung thư

biểu mô tuyến [16] Điều này, trái ngược với sự biểu hiện mRNA-ORF2 tăng theo độ

mô học của khối u [6] và quá trình hình thành ung thư [52] Sự mâu thuẫn giữa biểu hiện ở cấp độ RNA và protein gợi ý cơ chế kiểm soát sau phiên mã và dịch mã khiến

không có sự tương quan tỷ lệ thuận giữa RNA của LINE-1 và ORFp Gần đây, các

nghiên cứu lập hồ sơ protein của khối u dựa trên khối phổ; Western blot, hóa mô miễn dịch, kết tủa miễn dịch chỉ ra rằng ORF2p rất khó được phát hiện; ngay cả khối u có biểu hiện rất cao ORF1p thì cũng không phát hiện được ORF2p [3] Do đó, phát triển

kỹ thuật phát hiện được ORF2p đang là thách thức hiện tại

1.2.4 LINE-1 và ung thư

Như đã trình bày ở trên, LINE-1 hoạt động ở dòng tế bào mầm và trong quá

trình tạo phôi [27], nhưng chúng bị bất hoạt trong các tế bào soma do bị methyl hóa

[11, 46, 56] Tuy nhiên khi methyl hóa LINE-1 giảm (hypomethylation), sự vận động của LINE-1 được kích hoạt, gây mất ổn định nhiễm sắc thể, bất ổn định bộ gen và

liên quan đến nhiều bệnh lý và tiến triển ung thư [10, 21, 25] Cùng với sự phát triển

của giải trình tự NGS, nhiều báo cáo phát hiện sự xen cài của LINE-1 trong hệ gen tế

bào ung thư phổi, đại tràng, vú, buồng trứng [2, 57] Trong đó theo báo cáo của Lee

và cộng sự, mức độ LINE-1 xen cài được tìm thấy cao nhất trong ung thư đại tràng

sau đó đến ung thư tuyến tiền liệt, ung thư buồng trứng, trong khi đa u tủy và u nguyên

bào thần kinh đệm, không quan sát thấy sự xen cài của LINE-1 [33]

Hơn nữa, sự vận động của LINE-1 được xem là kết quả của giảm mức độ methyl hóa Hiện tượng LINE-1 giảm methyl hoá có liên quan đến các giai đoạn tiến triển

của ung thư, đặc biệt như ung thư phổi, vú, dạ dày, gan, trực tràng, ung thư thực quản,

ung thư tuyến tiền liệt và ung thư nội mạc tử cung [32, 43] Tình trạng LINE-1 giảm

methyl hóa được nghiên cứu nhiều nhất ở ung thư đại tràng Sự giảm methyl hóa

LINE-1 ở mẫu ung thư biểu mô tuyến so với mẫu mô lành xảy ra sớm trong quá trình tiến triển của ung thư đại trực tràng [57] Mức độ methyl hóa LINE-1 giảm dần từ

mẫu loạn sản/tiền ung thư sang mẫu u tuyến (advanced adenoma), ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma), nhưng không có sự khác biệt đáng kể giữa u tuyến và ung

thư biểu mô tuyến [52, 57] Hiện nay, giảm methyl hoá LINE-1 được xem là dấu

chuẩn cho bệnh nhân ung thư đại tràng trong giai đoạn sớm ung thư, trước khi tế bào chuyển sang trạng thái ác tính Việc phát hiện sớm sự hình thành u tuyến có tầm quan trọng rất lớn trong chẩn đoán ung thư, giúp bệnh nhân được phẫu thuật kịp thời, tăng

cơ hội sống sót cho bệnh nhân

Tương tự như ung thư đại trực tràng, mức độ giảm methyl hóa của LINE-1 cũng

là một sự kiện khởi đầu trong quá trình sinh ung thư vú, quan sát từ mô lành sang tình trạng loạn sản/hay tăng sản của các tế bào mô vú (ADH/FEA) và mức độ methyl hóa không thay đổi từ ung thư biểu mô ống tại chỗ sang ung thư biểu mô ống xâm lấn [44] Tuy nhiên, nghiên cứu của Hoesel và cộng sự (2012) lại chỉ ra không có sự khác

biệt giữa mức độ methyl hóa LINE-1 từ mô vú lành sang loạn sản/tăng sản tế bào

nhưng có sự giảm methyl hóa ở ung thư biểu mô tại chỗ và ung thư biểu mô vú xâm

lấn giai đoạn I [62] Nhưng, cả hai nghiên cứu đều chỉ ra mức độ methyl hóa LINE-1

là dấu ấn sinh học cho chẩn đoán và tiên lượng loại ung thư này

Ngoài ra trong ung thư phổi, giảm mức độ methyl hóa LINE-1 gắn liền với tăng

tính bất ổn định của hệ gen trong các giai đoạn tiến triển của ung thư [59] Suzuki và

cộng sự (2013) nhận thấy mức độ methyl hóa LINE-1 giảm tới 54% ở mẫu ung thư

phổi không tế bào nhỏ khi so với mẫu mô không phải ung thư [59] Hơn nữa, có sự

giảm methyl hóa LINE-1 rõ ràng giữa loại ung thư phổi tế bào vảy (squamous cell

carcinoma) và tế bào tuyến (adenocarcinoma) [59] Ikeda và cộng sự (2013) khi nghiên cứu trên 211 bệnh nhân NSCLC đã báo cáo sự giảm có ý nghĩa thống kê của

mức độ methyl hóa LINE-1 ở mẫu u so với mẫu mô liền kề [28] Như vậy, tình trạng giảm methyl hóa LINE-1 có thể được xem là một dấu chuẩn hỗ trợ chẩn đoán, tiên

lượng các loại ung thư khác nhau

Tuy nhiên, các bằng chứng gần đây đã chỉ ra rằng cần xem xét lại nhận định

LINE-1 giảm methyl hóa trong ung thư Nghiên cứu của Ardeljan và cộng sự (2020)

đã chỉ ra LINE-1 tăng biểu hiện trong khối u ở giai đoạn sớm nhưng LINE-1 bị bất

hoạt gắn liền với tăng trưởng khối u trong mẫu ung thư đại tràng [1] Một nghiên cứu trên quần thể khối u có khả năng kháng thuốc của bệnh nhân ung thư phổi, việc tăng methyl hóa của H3K9 (lysine 9 trên histone H3), dẫn đến hình thành cấu trúc dị nhiễm sắc, giúp hệ gen của tế bào khối u giảm thiểu tổn hại trong quá trình điều trị và tiếp

tục sống sót [24] H3K9 bị methyl hóa phân bố chủ yếu trên vùng 5’UTR LINE-1 và

có mối liên hệ mật thiết với methyl hoá LINE-1 [24] Một nghiên cứu khác về việc

tăng biểu hiện protein HELZ2 được mã hóa bởi các gen kích thích interferon (ISG)

ức chế hoạt động chuyển vị của LINE-1 [35] Interferon là các cytokines được tăng

tiết khi tế bào vật chủ chống lại các quá trình xâm nhiễm virus hay các tác nhân lạ (axit nucleic ngoại lai, bất thường), vì vậy được coi như là chất chống khối u [39] HELZ2 có hoạt tính exoribonuclease và có khả năng nhận biết được vùng 5’-UTR

của phân tử LINE-1 RNA, qua đó phân cắt phân tử RNA và ngăn cản sự hình thành của phức LINE-1 ribonucleprotein từ đó làm giảm khả năng chuyển vị của LINE-1,

sau đó làm giảm phản ứng IFN [35] Bên cạnh ung thư, kết quả trái chiều về tăng và

giảm methyl hoá LINE-1 cũng được báo cáo ở các bệnh lý thần kinh như bệnh rối

loạn phổ tự kỉ (Autism spectrum disorder), bệnh tâm thần phân liệt (Schizophrenia), rối loạn thần kinh (First-episode psychosic) [50] Việc tăng hay giảm hoạt động của

LINE-1 trong ung thư vẫn đang vấp phải tranh cãi Rất có thể, ở những giai đoạn sớm LINE-1 tăng hoạt động gắn liền với tích lũy đột biến, gây ra những biến đổi trạng thái

tế bào sang ác tính Ở những giai đoạn sau, LINE-1 bị giảm hoạt động khi có quá

nhiều đột biến, nhờ đó các tế bào khối u có thể tiếp tục tồn tại và phát triển

1.3 Phân tích tỉ lệ methyl hóa DNA bằng kĩ thuật qMSP

Kĩ thuật qMSP là sự kết hợp giữa phương pháp xử lí bisulfite và thiết kế mồi đặc hiệu methyl hóa cho phản ứng realtime PCR (qPCR), để định lượng tình trạng methyl hóa DNA Kĩ thuật này khuếch đại DNA đích đã được xử lý với bisulfite Bisulfite biến đổi các cytosine không bị methyl hóa thành uracil trong khi các cytosine

bị methyl hóa được giữ nguyên [55] Sử dụng DNA khuôn đã xử lý và các mồi được thiết kế đặc hiệu ở vùng giàu CpG, chỉ có trình tự DNA bị methyl hóa (có các vị trí

CpG được giữ nguyên) sẽ được khuếch đại [55]

Điểm yếu của phương pháp xử lý bisulfite là khi xảy ra sự biến đổi không hoàn toàn các cytosine không methyl hóa thành thymine thì sẽ dẫn đến kết quả dương tính giả (mức độ methyl hóa cao) Đồng thời, việc biến đổi 5-methylcytosine (5mC) thành thymine có thể xảy ra khi quá trình chuyển đổi cytosine hoàn tất, do đó làm giảm mức

độ methyl hóa trên mẫu bệnh phẩm Để giảm thiểu các lỗi này và tăng hiệu suất xử

lý, các yếu tố quan trọng cần được xem xét là chất lượng DNA, độ pH thích hợp, nhiệt độ và thời gian ủ hợp lý [67] Hầu hết các kit thương mại trên thị trường đều áp

dụng cho gen đơn bản, giới hạn ngưỡng đầu vào 2000 ng tương đương 106 bản sao

của gen đơn bản [31] Đối với LINE-1 là yếu tố lặp, 105 bản sao trong một tế bào thì lượng DNA đầu vào xử lý phải thấp hơn rất nhiều so với gen đơn bản để đảm bảo

trình tự LINE-1 được xử lý hoàn toàn [45] Bên cạnh nồng độ DNA, hiệu suất xử lý

bisulfite còn ảnh hưởng bởi các yếu tố như mức độ phức tạp của trình tự đích, hàm lượng CG, cấu trúc bậc hai và thậm chí một vị trí cytosine nhất định trong một trình

tự cụ thể cũng gây cản trở đến kết quả [45]

Mức độ methyl hóa ở trình tự đích được định lượng kết quả thông qua realtime

PCR Đây là kĩ thuật định lượng cho phép hiển thị kết quả khuếch đại DNA đích ngay

sau mỗi chu kỳ nhiệt [8] Lượng sản phẩm PCR tăng tỉ lệ thuận với tín hiệu huỳnh quang thu được Đối với phản ứng định lượng qPCR, hiệu suất phản ứng E và hệ số tuyến tính R2 là hai thông số rất quan trọng Giá trị của hai thông số được tính toán dựa vào đường hồi quy tuyến tính (gọi là đường chuẩn) biểu diễn mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng và lượng khuôn DNA Đường chuẩn được xây dựng dựa vào các mẫu chuẩn chứa trình quan tâm đã biết nồng độ Hiệu suất phản ứng E được phép dao động trong khoảng 90%-105% và hệ số tuyến tính R2 > 0,98 thì phản ứng được coi

là ổn định [8] Từ hiệu suất phản ứng, người làm thực nghiệm sẽ lựa chọn mô hình tính toán phù hợp với điều kiện thí nghiệm của mình

Phương pháp định lượng tương đối được sử dụng phổ biến để so sánh số lượng của trình tự đích so với số lượng của một trình tự tham chiếu, cả 2 đều có trong mẫu

phân tích [8] Mô hình toán học phổ biến trong định lượng tương đối là phương pháp Livak 2-∆∆Ct Nguyên lý của phương pháp là so sánh chênh lệch giữa giá trị Ct của trình tự đích và trình tự tham chiếu trong mẫu bệnh phẩm và mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ [34] Mẫu chuẩn được tạo ra thông qua việc trộn plasmid mang các đoạn trình tự đích và tham chiếu đã biết trước số bản sao Yêu cầu để áp dụng mô hình Livak vào tính toán là hiệu suất khuếch đại của trình tự đích và trình tự tham chiếu phải xấp xỉ bằng nhau và đạt trong ngưỡng cho phép của phản ứng qPCR là từ 90% đến 105% Nếu chưa đạt yêu cầu trên, cần phải tối ưu lại điều kiện phản ứng hoặc thiết kế lại mồi

1.4 Một số phương pháp phân tích mức độ biểu hiện phiên mã LINE-1

1.4.1 Lai northern

Northern blot là phương pháp nghiên cứu sự biểu hiện gen thông qua việc phát hiện các phân tử RNA đích trong hỗn hợp RNA tổng số Nguyên tắc của lai Northern dựa trên lai giữa các mẫu đầu dò axit nucleic có trình tự bổ sung với RNA đích Kỹ thuật này đã được sử dụng để xác định sự biểu hiện của các gen gây ung thư và sự giảm hoạt động của các gen ức chế khối u trong tế bào ung thư khi so sánh với mô bình thường [61]

Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong di truyền học phân tử do phân tích được nguyên sợi RNA Dựa trên nguyên tắc của kĩ thuật này, nhóm nghiên cứu của Belancio và cộng sự (2010) đã sử dụng đầu dò RNA lai đặc hiệu với một trăm

nucleotide đầu tiên của vùng 5’UTR LINE-1 để phát hiện tất cả các trình tự LINE-1 nguyên vẹn đã biết [5] Với đầu dò này, nhóm nghiên cứu đã phát hiện LINE-1 nội sinh biểu hiện khác nhau ở trên các dòng tế bào soma ở người với lượng LINE-1 nguyên vẹn, trong đó một số mô lành có mức độ biểu hiện tương đương với mức độ

biểu hiện trong tế bào ung thư

1.4.2 RT-qPCR

RT-qPCR được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc phân tích định lượng mRNA

Ưu điểm của kĩ thuật là có độ chính xác và độ nhạy cao, phù hợp phân tích với lượng mẫu nhỏ và cung cấp thông tin tin cậy về cả định tính và định lượng [61]

Với kỹ thuật RT-qPCR, nhóm nghiên cứu của Berrino và cộng sự (2022) sử dụng phương pháp 2-∆Ct đã xác định thành công biểu hiện ORF1 và ORF2 của LINE-

1 mRNA so với nhóm gen quản gia GAPDH/18S Công thức tính mức độ biểu hiện LINE-1= 2-∆Ct, trong đó ∆Ct = [CtLINE-1 - Ctgen quản gia] Nhóm nghiên cứu đã đưa ra

được mối tương quan thuận giữa biểu hiện của hai ORF1 và ORF2 LINE-1 mRNA

trong mô ung thư vú cũng như dòng tế bào ung thư vú; đồng thời đưa kết luận có mối

tương quan tỷ lệ nghịch giữa methyl hóa và biểu hiện LINE-1 [6] Ngoài ra, LINE-1

biểu hiện tương quan thuận với cấp độ mô học của khối u vú Một nhóm nghiên cứu

khác cũng áp dụng kỹ thuật này để định lượng vùng 5’UTR của LINE-1 trên nhóm

mẫu loạn sản/u tuyến và ung thư biểu mô tuyến đại tràng so với mô liền kề Kết quả

thu được mức độ biểu hiện LINE-1 tăng dần từ mẫu loạn sản, u tuyến đến ung thư biểu mô tuyến đại tràng Biểu hiện LINE-1 ở ung thư biểu mô tuyến đại tràng cao hơn mẫu mô liền kề, trong khi không quan sát thấy biểu hiện LINE-1 khác biệt giữa mẫu

loạn sản và mẫu u tuyến so với mô liền kề [52]

1.4.3 RNA sequencing

Phương pháp RNA sequencing xác định biểu hiện 5’ LINE-1 được McKerrow

và cộng sự (2023) áp dụng [38] Nhóm nghiên cứu đã phát hiện LINE-1 biểu hiện

trong các tế bào biểu mô lành của người và biểu hiện mạnh trong tế bào ung thư,

trong khi không xác định được biểu hiện của LINE-1 trong tế bào miễn dịch Đồng thời, nhóm nghiên cứu còn quan sát thấy sự gia tăng biểu hiện LINE-1 theo tuổi

(p<0,05) [38]

Trên đây là ba phương pháp thường được sử dụng để phân tích biểu hiện phiên

mã của LINE-1 Ưu điểm của Northen blot là phân tích được các kích thước khác

nhau của sợi mRNA Tuy nhiên, thao tác thực hiện phức tạp, tốn thời gian đồng thời

yêu cầu lượng RNA lớn để phân tích Hơn nữa, mỗi lần chỉ phân tích biểu hiện của một gen Do đó phương pháp khó áp dụng cho các trường hợp gen có mức độ biểu hiện thấp hay mức chênh lệch biểu hiện giữa các loại tế bào/mô tương đối nhỏ [62] RNA sequencing là phương pháp có độ nhạy cao, độ bao phủ (coverage) rộng khi phân tích biểu hiện ở mức độ phiên mã đồng thời của nhiều gen Bên cạnh định lượng biểu hiện gen, dữ liệu RNA sequencing còn giúp ích cho phát hiện ra những bản phiên

mã mới, dung hợp gen, các kiểu cắt nối hay xen cài gen và phát hiện biểu hiện đặc hiệu alen mà không bị giới hạn về trình tự đích trước đó, hay phụ thuộc và đầu dò được định sẵn [30] Tuy nhiên, đây là một phương pháp có chi phí cao do yêu cầu thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền Phương pháp RT-qPCR được sử dụng phổ biến trong phân tích biểu hiện; thời gian thực hiện rút ngắn, ít thao tác, cho phép định lượng số bản sao thấp với độ chính xác cao, đơn giản phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm cơ bản

Để hiểu biết rõ hơn tình trạng methyl hóa LINE-1 trong ung thư cũng như mối

liên quan giữa methyl hoá và biểu hiện của LINE-1, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân

tích mức độ methyl hóa và biểu hiện của yếu tố vận động LINE-1 ở bệnh nhân

ung thư vú Việt Nam” với 4 tiêu chí:

(1) Chọn kỹ thuật xử lý DNA với bisulfite để phân tích methyl hóa LINE-1

(2) Chọn nồng độ DNA cho phản ứng xử lý bisulfite xảy ra hoàn toàn

(3) Chọn kỹ thuật định lượng tỷ lệ allen bị methyl hoá qMSP

(4) Chọn kỹ thuật RT-qPCR để phân tích biểu hiện LINE-1

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mẫu nghiên cứu

100 cặp mẫu ung thư và liền kề của bệnh nhân ung thư vú được cung cấp bởi bệnh viện K (Hà Nội) năm 2020-2022 Mẫu liền kề được lấy cách khối u từ 3-5 cm Thông tin bệnh nhân được trình bày trong Phụ lục 1 Nghiên cứu được thông qua Hội đồng Y đức Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (01-2023/NCHG-HDDD)

2.2 Nguyên liệu và hóa chất

2.2.1 Các cặp mồi

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu do phòng thí nghiệm Sinh Y thiết kế với trình tự và mục đích sử dụng như trong Bảng 2 Các trình tự nucleotide này được tổng hợp bởi hãng IDT (Singapore)

Bảng 2: Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu Chữ t (ở mồi xuôi) và a (ở mồi

ngược) đại diện cho C sau xử lý bisulfite

gen quản gia

2.2.2 Các plasmid tái tổ hợp để xây dựng mẫu chuẩn

Các mẫu chuẩn được sử dụng trong nghiên cứu là mẫu trộn của plasmid tái tổ

hợp có mang đoạn chèn của trình tự LINE-1 bị methyl hóa (pLINE-Me) và plasmid mang trình tự đại diện cho tất cả LINE-1 sau xử lý (pLINE-Ref) Các plasmid được

cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Thông tin các plasmid được trình bày trong Bảng 3

Bảng 3: Thông tin plasmid dùng trong mẫu chuẩn

Plasmid tái

tổ hợp

Kích thước đoạn chèn (bp)

Plasmid tách

pLINE-Me 82 pTZ57 R/T Plasmid chứa trình tự LINE-1 bị

methyl hóa

pLINE-Ref 79 pGEM-T Easy Plasmid chứa trình tự đại điện

LINE-1 sau xử lý bisulfite

2.2.3 Hóa chất

- Kit PureLink Genomic DNA kit (Invitrogen)

- Kit EZ DNA Methylation-Gold kit (Zymo Reasearch)

- Kit Total RNA Isolation System (Promega)

- Kit SuperScript IVTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)

- GoTaq®qPCR Master Mix (Promega)

- GoTaq® Green Master Mix (Promega)

- DNase I (Thermo Fisher)

-iHóa chất điện di: TEMED, Acrylamide, N, N’-methylene(acrylamide) (Tanaka), đệm TBE 1X với thành phần chứa trong 100 mL như sau: 1,08 g Tris-base; 0,55 g Boric acid và 400 L EDTA pH 8

- Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ tinh khiết phù hợp cho nghiên cứu sinh học phân tử

2.3 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích methyl hóa LINE-1

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô tươi

DNA được tách chiết từ 25 mg mô của bệnh nhân ung thư vú sử dụng kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen) Các bước tách chiết tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất và được trình bày trong Phụ lục 2

2.3.2 Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA sau tách chiết

DNA sau tách chiết được kiểm tra nồng độ và tinh sạch bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ trên máy Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) cho phép phát hiện nồng độ từ 2 – 15 000 ng Chỉ số A260/A280 đánh giá độ tinh sạch của mẫu, chỉ số này dao động từ 1,8 – 2,0 thì mẫu được coi là đảm bảo độ sạch

2.3.3 Xử lý DNA với bisulfite

Xử lí DNA với bisulfite nhằm mục đích biến đổi C không bị methyl hóa thành

U trong khi các C bị methyl hóa sẽ giữ nguyên DNA tổng số (genomic DNA) được

xử lí bisulfite với kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các bước thực hiện được trình bày trong Phụ lục 3

2.3.4 Tạo mẫu chuẩn (PC)

Xác định số bản sao của plasmid sử dụng cho mẫu chuẩn: Nồng độ plasmid được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ trên máy NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), sau đó sẽ được tính toán số bản sao/µL theo công thức sau:

Số bản sao = (Ax1000x9,11x1011 bản sao/µL)/Y Trong đó: 1 ng/µL của 1000

bp DNA = 9,1x1011 bản sao/µL, A: nồng độ DNA plasmid, (ng/µL), Y: kích thước plasmid đã bao gồm cả đoạn chèn (bp)

Sau đó các plasmid p.LINE-Me và p.LINE-Ref sẽ được pha loãng bậc 10 và phối trộn với nhau tạo thành một dải nồng độ có tỉ lệ methyl hóa 10% và trộn cùng 5

ng DNA tổng số (gDNA) từ mẫu máu thường được trình bày trong Bảng 4

Bảng 4: Tỉ lệ phối trộn plasmid để tạo mẫu chuẩn Plasmid

2.3.5 Phản ứng qMSP và tính toán tỷ lệ methyl hóa

Phản ứng qMSP khuếch đại trình tự đích LINE-Me và trình tự tham chiếu LINE-Ref được thực hiện theo điều kiện tối ưu trình bày trong Bảng 5

Bảng 5: Thành phần và điều kiện phản ứng qMSP khuếch đại trình tự đích LINE-Me và

trình tự tham chiếu LINE-Ref

Phản ứng qMSP đạt chuẩn bao gồm 3 điều kiện [8]:

- Đường chuẩn tuyến tính với hệ số tuyến tính R2>0,98

- Hiệu suất khuếch đại đạt yêu cầu trong khoảng 90-105% Khi hiệu suất khuếch đại đạt 100%, sau mỗi chu kỳ tín hiệu huỳnh quang tăng gấp đôi Nếu hai ống

phản ứng ban đầu có lượng DNA cách nhau hệ số pha loãng A thì hai đường biểu diễn khuếch đại sẽ cách nhau n chu kỳ với n thỏa mãn: A= 2n

- Sự nhất quán trong các phản ứng lặp lại Các giá trị Ct, đường cong khuếch đại của mẫu chuẩn phải ổn định qua các lần chạy

Trong ba điều kiện trên, điều kiện thứ nhất và điều kiện hai đã được kiểm chứng thông qua các đường chuẩn thử nghiệm bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y Vì thế, trong mỗi lần thực hiện phản ứng qMSP, chúng tôi sử dụng ít nhất 2 mẫu chuẩn PC để kiểm tra điều kiện còn lại

Khi các điều kiện của phản ứng qMSP thỏa mãn, mức độ methyl hóa LINE-1

được tính toán theo mô hình 2-∆∆Ct của Livak [34]:

∆∆Ct = ∆Ct mẫu bệnh phẩm - ∆Ct mẫu chuẩn

Trong đó:

∆Ct mẫu bệnh phẩm = Ct (trình tự đích mẫu bệnh phẩm) - Ct (trình tự tham chiếu

mẫu bệnh phẩm)

∆Ct mẫu chuẩn = Ct (trình tự đích mẫu chuẩn) – Ct (trình tự tham chiếu mẫu chuẩn)

Trình tự đích là LINE-1 bị methyl hóa, trình tự tham chiếu là toàn bộ số bản sao của LINE-1 sau xử lý (bao gồm trình tự bị methyl hóa và không bị methyl hóa)

Phầm trăm methyl hóa của mẫu bệnh phẩm được tính:

% Methyl hóa mẫu bệnh phẩm = %methyl hóa mẫu chuẩn x 2 -∆∆Ct

2.3.6 Phương pháp phân tích thống kê

Dữ liệu được tổng hợp, xử lý bằng Excel, sau đó phần mềm Graphpad Prism v9.3.0 (GraphPad Software LLC) được sử dụng để lập đồ thị và phân tích Đường hồi quy tuyến tính được biểu diễn thông qua các giá trị Ct trung bình của dải nồng độ plasmid được pha loãng bậc 10 để tìm ra giá trị R2 và hiệu suất phản ứng So sánh

mức độ methyl hóa LINE-1 trên các mẫu bệnh phẩm được kiểm định bằng phương

pháp Wilcoxon matched-pair signed-rank test dành cho bộ số liệu theo cặp, không tuân theo phân phối chuẩn Đánh giá mối tương quan giữa mức độ methyl hóa và đặc

điểm mô bệnh học được sử dụng kiểm định Mann–Whitney U test khi so sánh hai bộ

số liệu và Kruskal – Wallis test được áp dụng khi so sánh ba bộ số liệu trở lên So

sánh mức độ methyl hóa LINE-1 của mẫu bệnh phẩm chạy trên ba hệ thống máy

qPCR được kiểm định bằng phương pháp Friedman test dành cho phép đo lặp lại, không tuân theo phân phối chuẩn Sự khác biệt giữa hai hay nhiều giá trị trung vị được coi là có ý nghĩa thống kê khi p<0,05

2.4 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện LINE-1

2.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô tươi

Lựa chọn 50 cặp đã được xác định methyl hóa LINE-1 để tách chiết RNA từ

mẫu mô ung thư và mô liền kề sử dụng kit SV Total RNA Isolation System (Promega) Quy trình tách chiết được trình bày trong Phụ lục 4

2.4.2 Xử lý DNase I, tinh sạch RNA

Để đảm bảo loại bỏ tối đa DNA tổng số (gDNA) do LINE-1 là gen lặp không có

intron và chiếm lượng lớn trong hệ gen, RNA được xử lý với DNase I hai lần trong

và sau khi tách chiết Nồng độ RNA được kiểm tra bằng đo quang phổ hấp thụ

OD260nm trên máy NanoDrop 2000

Ủ 37oC trong 30 phút Sau đó thêm 1µL EDTA 50 mM và ủ 70oC trong 15 phút

để ức chế hoạt động của DNase I

Hỗn hợp RNA sau khi được xử lý DNase I sẽ được tinh sạch bằng phương pháptủa cồn Các bước thực hiện gồm:

- Thêm 100µL nước không có nuclease để tổng thể tích là 200µL

- Thêm 20µL CH3COONa 3M pH 5,2 Trộn hỗn hợp bằng pipet

- Thêm 400µL Ethanol 100% lạnh vào hỗn hợp Ủ -20oC qua đêm

- Ly tâm 10.000 rpm-4oC-30 phút Loại bỏ dịch

- Thêm 500µL Ethanol 70% lạnh Ly tâm 10.000 rpm-4oC-10 phút Loại bỏ dịch

- Thêm 500µL Ethanol 70% lạnh Ly tâm 10.000 rpm-4oC-10 phút Loại bỏ dịch

- Để khô tủa trong 15 phút tại nhiệt độ phòng

- Hòa tủa RNA trong 15 µL nước không có nuclease

2.4.3 Kiểm tra chất lượng RNA

Sau khi tách chiết, RNA được xử lý một lần nữa với DNase I và được so sánh với RNA không xử lý để kiểm tra mức độ lẫn gDNA trong dịch thu RNA Thành phần

và điều kiện phản ứng phát hiện gDNA của LINE-1 được trình bày trong Bảng 6

Bảng 6: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi LINE-1

Biến tính đầu tiên: 95o 2 phút Lặp lại 40 chu kỳ: 95o 30 giây 64o20 giây 72o20 giây Tổng hợp sau cùng: 72o 5 phút

2.4.4 Phản ứng tổng hợp cDNA

RNA tổng số được làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngược để tổng hợp cDNA nhờ enzym phiên mã ngược của kit SuperScript IV First-Strand Synthesis System (Invitrogen) Phản ứng này được thực hiện đúng theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước chính sau:

Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp RNA

SuperScript™ IV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 1

Gen GAPDH được chọn làm gen nội chuẩn trong phản ứng RT-qPCR Trình tự

của mồi của gen quản gia được thiết kế vắt ngang qua hai exon, do đó không cho phép khuếch đại DNA tổng số Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại cDNA

của GAPDH được trình bày trong Bảng 7

Bảng 7: Thành phần và điều kiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi GAPDH

Biến tính đầu tiên: 95o 2 phút

Lặp lại 40 chu kỳ: 95o 30 giây 64o20 giây 72o20 giây

Tổng hợp sau cùng: 72o 5 phút

Phần lớn trình tự LINE-1 đều mất đầu 5’promoter và quá trình phiên mã của chúng đều dựa vào phiên mã của gen mà LINE-1 chèn vào chứ không phải do vùng 5’promoter LINE-1 Vì thế, ở đây chúng tôi quan tâm đến cả định lượng mRNA LINE-1 vùng 5’ và vùng 3’ để đánh giá để đánh giá lượng mRNA của LINE-1 ở mô

ung thư vú so với mô liền kề mà không thể phân biệt được mRNA đó phiên mã từ

promoter của LINE-1 hay từ promoter của gen có LINE-1 chèn vào Thành phần và điều kiện phản ứng phát hiện cDNA của LINE-1 được trình bày trong Bảng 8

Bảng 8: Thành phần và điều kiện phản ứng RT-qPCR với cặp mồi LINE-1

2.4.6 Phân tích số liệu

Để kiểm tra độ đặc hiệu hay số sản phẩm được khuếch đại ở mỗi phản ứng, phân tích đường cong nóng chảy DNA (dissociation melting curves) được thực hiện bằng cách giữ ở 95oC trong 15 giây trước khi tăng nhiệt đều từ 60oC lên 95oC

Phương pháp 2∆Ct [8] được áp dụng để định lượng tương đối mức độ biểu hiện

LINE-1 giữa mô ung thư và mô liền kề so với gen tham chiếu GAPDH

Mức độ biểu hiện LINE-1 trên mẫu bệnh phẩm được tính theo công thức:

Mức độ biểu hiện LINE-1 [LINE-1/GAPDH]= 2(Ct [GAPDH] - Ct[LINE-1])

Phần mềm Excel và phần mềm GraphPad Prism v9.0.0 được sử dụng để xử lý,

phân tích số liệu và dựng đồ thị Đánh giá mức độ biểu hiện LINE-1 của mẫu bệnh

phẩm được kiểm định bằng phương pháp Wilcoxon matched-pair signed-rank test dành cho bộ số liệu theo cặp, không tuân theo phân phối chuẩn Giá trị p<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê

2.5 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1: Sơ đồ thí nghiệm