Biểu hiện, tinh sạch và Đánh giá tính chất của xylanase b tái tổ hợp từ chủng aspergillus niger dsm 1957

Biểu hiện, tinh sạch và Đánh giá tính chất của xylanase b tái tổ hợp từ chủng aspergillus niger dsm 1957 Biểu hiện, tinh sạch và Đánh giá tính chất của xylanase b tái tổ hợp từ chủng aspergillus niger dsm 1957

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

x

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2022

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo của trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN những người dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa Sinh và Sinh học phân

tử, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, cũng như các anh chị tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi và hướng dẫn em trong quá trình thực tập, nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đỗ Thị Tuyên đã định hướng ý tưởng

nghiên cứu, tận tình hướng dẫn thí nghiệm và thực hiện khóa luận trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme – Viện Công nghệ sinh học Ngoài ra em cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia Nafosted đã tài trợ thực hiện đề tài

Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy Thầy không những là người thầy tận tâm giúp em tìm ra đam mê của

mình, giúp em định hướng bước đi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học,

mà còn cho em những lời khuyên chân thành trong cuộc sống, tiếp thêm động lực cho em trong suốt thời gian qua Đây sẽ là những hành trang quý giá để em có thể

tự tin, vững chãi hơn trên con đường sự nghiệp và cuộc sống mai này

Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ, người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em trên con đường học tập và rèn luyện bản thân

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 12 năm 2022

Học viên

Lưu Ngọc Hưng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan xylanase 3

1.1.1 Sự thủy phân xylan, vai trò của xylanase 3

1.1.2 Giới thiệu endoxylanase 5

1.1.3 Cơ chế xúc tác của xylanase 7

1.1.4 Sinh tổng hợp xylanase 9

1.1.5 Tình hình nghiên cứu xylanase 10

1.2 Biểu hiện gene xylanase tái tổ hợp 12

1.2.1 Biểu hiện gene xylanase trong nấm men 12

1.2.2 Chủng biểu hiện Pichia pastoris GS115 12

1.3 Ứng dụng xylanase 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 18

2.1.1 Chủng giống 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.1.3 Môi trường 19

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy biểu hiện xylanase trong nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp 21

2.2.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện xylanase tái tổ hợp 22

2.2.3 Phương pháp tinh sạch xylanase tái tổ hợp 22

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tái tổ hợp 23

2.2.5 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) 24 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính xylanase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 25

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt độ xylanase 25

2.2.8 Xác định một số tính chất của xylanase 27

2.2.9 Xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Nghiên cứu điều kiện biểu hiện xylanase tái tổ hợp 29

3.1.1 Biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong điều kiện cơ bản 29

3.1.2 Khảo sát thời gian biểu hiện xylanase tái tổ hợp 31

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 32

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng môi trường biểu hiện 33

3.2 Nghiên cứu tinh sạch enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng Pichia pastoris GS115/pXlnB 35

3.3 Nghiên cứu một số tính chất của enzyme xylanase tái tổ hợp 36

3.3.1 Nhiệt độ thích hợp và độ bền nhiệt độ 36

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH 38

3.3.3 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ 40

3.3.4 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa 42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase 9

Bảng 2.1 Thành phần các loại đệm và dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.3 Thành phần gel polyacrylamide 12,5% 25

Bảng 3.1.Hoạt độ xylanase và hàm lượng protein ở điều kiện cơ bản 30

Bảng 3.2 Quá trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp 36

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc xylan trong gỗ mềm (A) gỗ cứng (B) 4

Hình 1.2 Các enzyme khác nhau tham gia thủy phân xylan 5

Hình 1.3 Mô hình hoạt động của xylanase 8

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể của quá trình nghiên cứu 21

Hình 2.2 Đường chuẩn Bradford 24

Hình 2.3 Đường chuẩn xylose 26

Hình 3.1 Hoạt tính xylanase trong dịch nuôi cấy P pastoris GS115/pXlnB được thể hiện trên đĩa thạch 29

Hình 3.2 Dung dịch sau phản ứng xác định hoạt độ xylanase trong môi trường nuôi cấy P pastoris GS115/pXlnB ở điều kiện cơ bản, sử dụng phương pháp DNS trên cơ chất xylan 30

Hình 3.3 Dịch nuôi biểu hiện từ chủng chủng P pastoris GS115/pXlnB đo hàm lượng protein bằng phản ứng với dung dịch Bradford 30

Hình 3.4 Hoạt tính xylanase từ dịch nuôi cấy chủng P pastoris GS115/pXlnB được thu ở các khoảng thời gian nuôi cấy cảm ứng khác nhau được định tính trên đĩa thạch có cơ chất xylan 0,5 % 31

Hình 3.5 Hoạt độ enzyme xylanase B từ P pastoris GS115/pPXlnB sau các khoảng thời gian nuôi cấy cảm ứng khác nhau 32

Hình 3.6 Hoạt độ enzyme xylanase B từ dịch nuôi cấy P pastoris GS115/pPXlnB được cảm ứng với các nồng độ methanol khác nhau 33

Hình 3.7 Hoạt độ enzyme xylanase B từ dịch nuôi cấy P pastoris GS115/pPXlnB trong các môi trường nuôi cấy khác nhau 34

Hình 3.8 Phân tích protein trong dịch nuôi cấy chủng Pichia pastoris GS115/pPXlnB biểu hiện xylanase (A) và xylanase tinh sạch (B) bằng SDS-PAGE trên gel polyacrylamide12,5% 35

Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt độ của xylanase tái tổ hợp 37

Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền của xylanase tái tổ hợp sau các mốc thời gian ủ khác nhau 38

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của xylanase tái tổ hợp 39 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH lên độ bền của xylanase tái tổ hợp sau các mốc thời gian

ủ khác nhau 40 Hình 3.13 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính xylanase 41

BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

BMM Yeast nitrogen base; biotin; đệm phosphate, methanol BMMY YP; biotin; đệm phosphate, methanol

DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid

IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology

MM Yeast nitrogen base; biotin; methanol

MMY YP; Yeast nitrogen base; biotin; methanol

NPB Native purification buffer

NBB Native binding buffer

NEB Native elution buffer

PBS Phosphate buffer saline

SDS Sodium dodecyl sulfat

SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

YPCTM YP; methanol; triton X 100, casaminoacids

YPTM YP; methanol; triton X 100

YNB Yeast nitrogen base

endo-β-1,4-D-Endoxylanase có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Endoxylanase dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc (chlorine) thường dùng để tẩy lignin trong giấy, làm trong nước hoa quả, rượu vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo Xylanase cũng được ứng dụng trong ngành sản xuất dược phẩm và hoá chất Các sản phẩm thủy phân bởi xylanase với các cơ chất xylan, arabinoxylan (gốc β-D-xylopyranosyl) có thể được sử dụng trong sản xuất chất lỏng dễ cháy (ethanol), dung môi và chất làm ngọt nhân tạo có hàm lượng calo thấp Xylanase thủy phân hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) và chuỗi Arabinoxylan oligosaccharide ngắn hơn (Arabinoxylan‐oligosaccharides -AXOS) Arabinoxylan (AX) là một thành phần chất xơ chính được tìm thấy trong một loạt các loại ngũ cốc, được dùng cho chế độ

ăn kiêng có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người

Mặc dù xylanase có thể được chiết xuất và tinh chế từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên nhưng hoạt tính của chúng còn thấp và chi phí sản xuất còn cao Những hạn chế này gây ra khó khăn khi ứng dụng xylanase trong công nghiệp và là nguyên nhân khiến một phần lớn xylan trong tự nhiên không được sử dụng hiệu quả, gây lãng phí nhiều tài nguyên Các kỹ thuật ADN tái tổ hợp hiện nay được sử

dụng để phân lập và biểu hiện các gen xylanase ở vật chủ thích hợp (Escherichia

coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris và nấm sợi) nhằm đáp ứng nhu cầu

xylanase ở quy mô công nghiệp Trong số các hệ biểu hiện, nấm men hiện là hệ thống rất hứa hẹn, chúng có khả năng phát triển tới mật độ rất cao, thực hiện các sửa đổi sau dịch mã của sinh vật nhân thực và tiết ra các protein ngoại bào lớn

Trong số các loại nấm men, Pichia pastorislà một trong những vật chủ được sử

dụng phổ biến nhất, do khả năng biểu hiện và tiết các protein tái tổ hợp hiệu quả Với mong muốn ứng dụng chủng vào thực tế sản xuất enzyme xylanase tái tổ hợp

cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau chúng tôi tiến hành đề tài “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase B tái tổ hợp từ chủng Aspergillus niger DSM 1957” với mục tiêu:

(1) Xác định được điều kiện thích hợp cho biểu hiện xylanase từ chủng

Aspergillus niger trong Pichia pastoris;

(2) Tinh sạch được xylanase tái tổ hợp;

(3) Đánh giá được một số tính chất của xylanase tái tổ hợp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xylanase

1.1.1 Sự thủy phân xylan, vai trò của xylanase

Xylan là loại hemicellulose (những polysaccharide bao gồm xyloglucan, xylan, mannan và glucomannan, và β-(1,4)-glucan[60]) phổ biến nhất trong tự nhiên và

là polyme sinh học phổ biến thứ hai, đứng sau cellulose [70] Xylan bao hàm các đơn phân là xylose (một loại đường pentose), cụ thể là các loại β-D-xylose Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác Xylan hiện diện với số lượng lớn trong gỗ cứng từ thực vật hạt kín (hàm lượng tế bào 15-30% thành tế bào) và gỗ mềm từ cây hạt trần (7-10%)[69] Xylan có thể được phân loại thành bốn nhóm chính [11]:

- Arabinoxylan, arabinoxylan là thành phần quan trọng của chất xơ trong ngũ

cốc Arabinoxylan thường được phân loại thành arabinoxylan có thể chiết xuất được trong nước và arabinoxylan không thể chiết xuất được trong nước Trong đó, arabinoxylan có thể chiết xuất được trong nước liên kết lỏng lẻo với bề mặt thành tế bào Ngược lại, arabinoxylan không thể chiết xuất được trong nước được giữ lại trong thành tế bào bởi các tương tác cộng hóa trị và không cộng hóa trị của arabinoxylan và protein, lignin và cellulose

- Glucuronoxylan, là chuỗi xylan có thêm nhánh trong đó axit α-D- glucoronic

hoặc dẫn xuất 4-O-metyl ete của nó là nhóm thế duy nhất

- Glucuronoarabinoxylan là chuỗi xylan có nhánh gồm cả hai nhóm axit

α-D-glucoronic (4-O-methyl-α-D-α-D-glucoronic) và α-l-arabinose

- Galactoglucuronoarabinoxylan là loại xylan đặc trưng bởi sự hiện diện của

gốc β-D-galactopyranosyl tận cùng bên trên chuỗi bên oligosaccharide phức tạp của xylan và thường được tìm thấy trong các cây lâu năm

Xylan là một nhân tố kháng dinh dưỡng đối với động vật một dạ dày (ví

dụ người) Nó làm tăng độ nhớt của thức ăn, cản trở quá trình tiêu hóa các thành phần khác và làm giảm mức độ hấp thu dinh dưỡng Người ta đã xử lý các thức ăn

cho vật nuôi bằng enzyme xylanase để thủy phân xylan, giúp cho thức ăn dễ tiêu hóa hơn [70]

Hình 1.1 Cấu trúc xylan trong gỗ mềm (A) gỗ cứng (B) [9]

Một số phương pháp sử dụng phổ biến hiện nay để thủy phân hoàn toàn xylan

là dùng kiềm hoặc axit mạnh do hiệu quả thủy phân tốt và kinh tế nhưng gây chất thải ảnh hưởng tới môi trường Việc sử dụng enzyme để thủy phân sinh học xylan hạn chế các vấn đề về môi trường nhưng các enzyme hiện nay chưa có hoạt tính thủy phân nhanh, hiệu quả Nhóm enzyme thủy phân xylan gồm endoxylanase (endo-1,4-β-xylanase, EC3.2.1.8), β-xylosidase (xylan-1,4-β-xylosidase, EC 3.2.1.37), α-glucuronidase (α-glucosiduronase, EC3.2.1.139), α-arabinofuranosidase (α-Larabinofuranosidase, EC 3.2.1.55) và acetylxylan esterase (EC3.1.1.72) [57] Tất cả các enzyme này đều hoạt động nhằm cắt xylan thành các đường đơn phân Trong số các enzyme này, xylanase là enzyme quan trọng nhất, liên quan trực tiếp đến việc cắt các liên kết glycoside và giải phóng các xylooligosaccharide ngắn

Hình 1.2 Các enzyme khác nhau tham gia thủy phân xylan [48]

1.1.2 Giới thiệu endoxylanase

Endoxylanase có mã số EC 3.2.1.8 (Theo IUBMB)[56] với tên hệ thống là β-D-xylan xylanohydrolase Ngoài ra enzyme có một số tên gọi khác như endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β-xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase [56]

4-Phân loại: Do đặc tính không đồng nhất và phức tạp của xylan dẫn đến các enzyme thủy phân xylan cũng rất đa dạng, phong phú, điển hình với sự đa dạng thành phần đặc trưng, trình tự sơ cấp, cấu trúc khác nhau dẫn đến việc phân loại enzyme bị hạn chế nếu chỉ dựa vào tính đặc hiệu cơ chất Hiện có nhiều cách phân loại xylanase trên thế giới Wong và cộng sự (1988) phân loại xylanase trên cơ sở các đặc tính hóa lý và đề xuất hai nhóm: nhóm có khối lượng phân tử thấp (< 30 kDa) và pI cơ bản, và nhóm có khối lượng phân tử cao (> 30 kDa) và pI có tính axit [71] Tuy nhiên, một số ngoại lệ đối với cách phân loại này đã được tìm thấy và khoảng 30% xylanase hiện tại, đặc biệt là xylanase từ nấm, không thể phân loại bằng cách này [25] Một hệ thống phân loại mới ra đời dựa trên sự khác biệt cấu trúc cơ bản của các chất xúc tác và các nhóm enzyme trong các họ của các phân tử

liên quan cho phép phân loại không chỉ nhóm xylanase nói riêng, mà là nhóm enzyme glycosidease nói chung (EC 3.2.1.x) [44] Nhóm phân loại ban đầu đã nhóm các cellulase và xylanase thành 6 họ (A – F) [44], đến năm 2005 nhóm enzyme đã được phân thành 96 họ glycoside hydrolase [25] Trong hệ thống phân loại này, xylanase thường nằm trong họ GH10 (trước đây là F) và họ GH11 (trước đây là G) [62-64] Tuy nhiên trong họ 5, 7, 8, 10, 11 và 43 cũng chứa các miền xúc tác với endo-1,4-β Do đó, quan điểm hiện tại cho rằng các enzyme có hoạt tính xylanase chỉ giới hạn ở các họ 10 và 11 là không hoàn toàn đúng và nên được mở rộng sang các họ 5, 7, 8 và 43 [25]

Họ GH5 (trước đây là họ A) bao gồm nhiều enzyme có hoạt tính khác nhau được chứng minh có hoạt tính trên các cơ chất khác nhau và có các hoạt tính endoglycosyl-ceramidase (EC 3.2.1.123), cellulase (EC 3.2.1.4), licheninase (EC 3.2.1.73), b-mannosidase (EC 3.2.1.25), glucan 1,3-bglucosidase (EC 3.2.1.58), glucan endo-1,6-b-glucosidase (EC 3.2.1.75), mannan endo-1,4-b-mannosidase (EC 3.2.1.58), cellulose 1,4-b-cellobiosidase (EC 3.2.1.91), endo-1,6-b-galactanase (EC 3.2.1.-), 1,3-bmannanase (EC 3.2.1.-) and endo-1,4-b-xylanase (EC 3.2.1.8) [43]

Họ GH8 (trước đây là họ D) chủ yếu bao gồm cellulase (EC 3.2.1.4), nhưng cũng chứa chitosanase (EC 3.2.1.132), lichenase (EC 3.2.1.73) và endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) Năm 2024, họ này bao gồm 61 thành viên, trong đó có bốn

xylanase Ba trong số các xylanase đã được phân lập từ Bacillus sp trong khi loại thứ tư là một vi khuẩn được phân lập từ vi khuẩn Nam Cực P haloplanktis TAH3a

[26]

Họ GH10 bao gồm endo-1,4-b-xylanase (EC 3.2.1.8), endo-1,3-β-xylanase (EC 3.2.1.32) và cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) Các enzyme chính của họ này là endo-1,4-β-xylanase, tuy nhiên, những enzyme này không hoàn toàn chỉ có hoạt tính trên xylan mà còn có thể hoạt động trên cơ chất cellulose có khối lượng phân tử thấp, đặc biệt trên arylcellobioside và một số cellooligosaccharide Các thành viên của họ này cũng có khả năng thủy phân aryl β-glycoside của xylobiose và xylotriose

ở liên kết aglyconic, thường có khối lượng phân tử cao, pI(độ đẳng điện) thấp [25]

Họ GH11 là một họ đơn chỉ gồm endoxylanase và chỉ hoạt động duy nhất trên các chất nền có chứa D-xylose Giống như họ GH10, những enzyme này có thể thủy phân aryl β-glycoside của xylobiose và xylotriose ở liên kết aglyconic, nhưng ngược lại với họ này, chúng không hoạt động trên aryl cellobioside [19] Các enzyme thuộc họ GH11 thường được đặc trưng bởi pI cao, khối lượng phân tử thấp,

cơ chế xúc tác chuyển vị kép [34] Sự khác biệt về đặc tính xúc tác là endo-xylanase của họ 10 có khả năng thủy phân các liên kết glycoside cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế [19]

Đối với họ GH7 và họ GH43 cho đến nay mới xác định một enzyme thể hiện hoạt tính xylanase đối với mỗi họ, do đó tầm quan trọng của chúng vẫn chưa được

xác định rõ ràng Họ endoglucanase I (EGI) GH7 từ T reesei không được tạo ra

trong quá trình sinh trưởng trên xylan [18]và trong khi hoạt tính của nó trên cellulose cao gấp 10 lần so với trên xylo-oligosaccharide (X3, X5) [17] Enzyme họ

GH43 có khối lượng phân tử 64 kDa và được phát hiện trong Paenibacillus

polymyxa Vì vậy, nhóm enzyme này cần có những nghiên cứu sâu hơn về chức

năng và các đặc tính hóa lý

1.1.3 Cơ chế xúc tác của xylanase

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua hình 1.3 a) Xylanase nhận diện và liên kết xylan bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 (a); [45]

Hình 1.3 Mô hình hoạt động của xylanase[45]

a) Hai gốc glutamat (Glu) có vị trí hoạt động khoảng 5,5 Å Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện tử [45];

b) Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác (Glu 78), liên kết glycoside bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzyme – cơ chất (b) [45];

c) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thànhion dương gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi ion âm gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, sản phẩm được giải phóng[51];

d) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và phân tán các đường (xylose) [45]

1.1.4 Sinh tổng hợp xylanase

Xylanase được tách chiết trong tự nhiên chủ yếu từ các chủng vi khuẩn, nấm

như Trichoderma, Bacillus, Aspergillus, Streptomyces, Fusarium, Thermomyces …

[14, 39, 71] được công bố là có khả năng sản xuất xylanase Xylanase sinh tổng hợp

từ các chủng vi sinh vật tự nhiên thường có lẫn nhiều tạp protein khác nhau Vì vậy

đã có rất nhiều nghiên cứu về phương pháp tinh sạch xylanase tự nhiên để đạt độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi enzym cao nhất [3,6]

Bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [63]

Vi sinh vật Hoạt tính enzyme xylanase

(IU/ml) Nấm mốc

được sử dụng để cải thiện năng suất và chất lượng của các enzyme mong muốn Những phương pháp được sử dụng rộng rãi là phương pháp dựa trên kỹ thuật di truyền, tạo các đột biến làm tăng hoạt tính enzyme hoặc sản xuất enzyme bằng công nghệ DNA tái tổ hợp Công nghệ DNA tái tổ hợp có thể sản xuất cá enzyme có hoạt tính tương đương với các enzyme tự nhiên nhưng có năng suất cao Một số nghiên cứu cho thấy gen xylanase mong muốn đã được tách dòng vào vectơ phù hợp, sau

đó được biểu hiện trong các hệ vi sinh vật phù hợp như vi khuẩn, nấm men và nấm [38, 46]

1.1.5 Tình hình nghiên cứu xylanase

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật Nhiều loại vi khuẩn và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase

Goswami và cộng sự (2014) đã nghiên cứu sự biểu hiện của gen xylanase từ B

brevis trong E coli BL21 Chủng tái tổ hợp chủ yếu tiết ra xylanase trong môi

trường nuôi cấy với hoạt tính xylanase đạt 30 IU/ml và xylanase hoạt động trong khoảng pH và nhiệt độ rộng[38] Gen mã hóa xylanase bền nhiệt kiềm (Mxyl) đã

được nhân dòng vào vector pET28a và được biểu hiện trong E coli BL21 (DE3)

Xylanase tái tổ hợp có pH thích hợp và nhiệt độ tương ứng là 9,0 và 90°C [68]

E coli được sử dụng rộng rãi do môi trường nuôi cấy không tốn kém, thao tác

dễ dàng, yêu cầu kỹ thuật đơn giản, mức độ tích lũy sản phẩm cao trong tế bào chất

của tế bào [46] Tuy nhiên, với E coli có hạn chế về khả năng biểu hiện của một số

xylanase do sự có mặt của các mã hiếm trên gen cũng như yêu cầu sửa đổi enzyme sau dịch mã (hình thành liên kết disulfide và glycosyl hóa [15, 47] Zhou và cộng sự

2008 đã tách dòng và giải trình tự gen mã hóa xylanase của A usamii E001 Gen mã

hóa một protein gồm 184 amino acid, có khối lượng 19,8 kDa Vùng mã hóa của gen có một intron nên việc nhân dòng gen được tiến hành thông qua bước tổng hợp cDNA từ RNA Cùng với việc sử dụng pET-28a(+) làm vector biểu hiện, gene được

biểu hiện trong E coli BL21-codonPlus (DE3)-RIL Xylanase từ chủng tái tổ hợp

có hoạt tính cao nhất đạt 49,6 U/mg Nhiệt độ và pH thích hợp cho sự hoạt động của

enzyme là 50°C, pH 4,6 Hơn 50% hoạt lực enzyme duy trì trong dải pH từ 4,2 đến 5,3 [75]

Xylanase mã hóa bởi gen xylanase (xynB) từ Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1được biểu hiện trong B subtilis có độ pH thích hợp và nhiệt độ thích hợp

của enzyme tái tổ hợp lần lượt là 6,5 và 85°C Hoạt tính xylanase vẫn còn được duy trì khi được ủ với các chất hoạt động bề mặt như EDTA, DTT, và Triton X-100 [73, 74]

Do tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực mà xylanase đã thu hút mạnh mẽ

sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ các chủng vi sinh vật và ứng dụng Trần Thị Nhung và cộng sự (2013) đã nghiên cứu thu nhận xylooligosaccharide (XOS) từ cám gạo bằng công nghệ enzyme, kết quả thu được XOS từ cám gạo ở qui mô phòng thí nghiệm có độ sạch đạt 81,4% bằng qui trình thủy phân cám gạo đã xử lý loại bỏ protein và tinh bột với enzyme xylanase ở nhiệt độ 50oC tại pH 7,0 với nồng độ enzyme 0,6% trong thời gian 15 giờ [2] Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2021) đã tinh sạch và đánh giá khả năng thủy phân arabinoxylan của xylanase tự nhiên và tái tổ hợp Quá trình tinh chế

thu được xylanase tự nhiên từ chủng Aspergillus niger DSM1957 có khối lượng

phân tử khoảng 25 kDa, hoạt tính riêng đạt 3240 IU/mg, độ sạch tăng so với enzyme thô ban đầu là 1,68 lần, với hiệu suất thu hồi 36% Xylanase tái tổ hợp từ

chủng P pastoris GS115/pPXlnA được tinh sạch qua cột sắc kí ái lực ProbondTM

có khối lượng phân tử khoảng 36 kDa, hoạt tính riêng đạt 423,11 IU/mg protein, độ sạch tăng so với enzyme thô ban đầu là 3,2 lần, với hiệu suất thu hồi 21,1% Xylanase tự nhiên có khả năng thủy phân ra đường L- arabinose tốt hơn enzyme tự nhiên và tái tổ hợp Xylanase tự nhiên thủy phân arabinoxylan hãng Megazyme ra đường L-arabinose trong đệm sodium acetate 50 mM, pH 5,0 [5]

Trần Liên Hà, Nguyễn Thị Ngọc Ngà (2015) đã nghiên cứu về việc tách dòng

và biểu hiện gene mã hóa enzyme xylanase từ nấm mốc A.niger C1 vào E coli BL21 đã tách dòng thành công gene xylanase từ A niger vào E coli TOP10 Gene

có kích thước 746 bp chứa 1 intron ở vị trí 278 - 347 Biểu hiện thành công gen mã

hóa xylanase kích thước 668 bp vào E coli BL21 và thu dịch enzyme có hoạt độ

381 U/ml và có khối lượng phân tử 30 kDa [1]

1.2 Biểu hiện gene xylanase tái tổ hợp

1.2.1 Biểu hiện gene xylanase trong nấm men

Mức độ biểu hiện của gen ngoại lai phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có hàm lượng G+C trong gen, tần xuất sử dụng của codon và đặc biệt là sự có mặt của

các codon hiếm có thể dẫn đến lỗi dịch mã ở P pastoris

Sự biểu hiện protein dị loại trong hệ thống nấm men nhờ khả năng thực hiện các sửa đổi sau dịch mã của sinh vật nhân chuẩn và có thể phát triển đến mật độ tế bào rất cao với khả năng tiết enzyme vào môi trường lên men Hầu hết các loại nấm

men không tạo ra độc tố Saccharomyces cerevisiae được coi như một vi sinh vật

công nghiệp, do đó có thể được sử dụng thuận tiện cho sản xuất xylanase

Việc sử dụng P pastoris làm hệ thống biểu hiện khá dễ dàng nhờ sử dụng

methanol làm nguồn carbon thúc đẩy sự biểu hiện của protein Methanol là chất

cảm ứng protein ngoại lai dễ kiếm và rẻ tiền [47] Hơn nữa, P pastoris là nấm men

có khả năng phát triển tốt, đạt tới mật độ tế bào rất cao, được điều hòa chặt chẽ và tạo ra protein tái tổ hợp (g/L) cao cả trong nội bào và ngoại bào [8] Việc nhân bản của hai gen GH11 xylanase, MYCTH_56237 và MYCTH_49824, từ nấm ưa nhiệt

Myceliophthora thermophila và biểu hiện trong P pastoris đã thu được xylanase có

hoạt độ lần lượt là 1533,7 U/mg và 1412,5 U/mg Xylanase tái tổ hợp ổn định trong điều kiện khắc nghiệt (pH và nhiệt độ cao) và cho hiệu quả đường hóa sinh khối cao

[12] P pastoris tạo ra XynCDBFV có hoạt tính xúc tác cao hơn so với enzyme biểu hiện trong Escherichia coli do E coli không hình thành liên kết disulfide hiệu

quả [12]

1.2.2 Chủng biểu hiện Pichia pastoris GS115

Trình tự bộ gen dòng P pastoris GS115 [29] được công bố năm 2009 tại Đại

học Gent (Bỉ), bao gồm 4 nhiễm sắc thể với tổng chiều dài khoảng 9,22 Mb (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Thông tin bộ gen Pichia pastoris GS115[30]

Nhiễm sắc thể Trình tự tham chiếu Kích thước %GC Số gen

Nấm men P pastoris được biết đến như là một nhà máy sản xuất protein

được sử dụng trong lĩnh vực enzyme công nghiệp và ngành công nghiệp dược

phẩm Tính đến năm 2009, P pastoris “được coi là an toàn” và đã được sử dụng sản

xuất hơn 500 protein dược phẩm và hơn 1000 protein tái tổ hợp [33] Được thúc đẩy bởi nhu cầu ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn

nuôi, đến nay P pastoris đã trở thành vật chủ quan trọng trong sản xuất enzyme tái

tổ hợp xylanase và phytase dùng trong chăn nuôi Gần đây, P pastoris đã được sử

dụng để biểu hiện các protein màng của sinh vật nhân chuẩn, tạo điều kiện cho nghiên cứu về sinh học cấu trúc[22]

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành biểu hiện, thích hợp các điều kiện biểu hiện để nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase B tái tổ hợp từ

chủng P pastorisGS115/pXylB, từ đó tìm ra được môi trường thích hợp, cũng như

tinh sạch được xylanase B, đánh giá tính chất của xylanase B, làm cơ sở khoa học cho việc tạo các sản phẩm xylanase ứng dụng trong công nghiệp

1.3 Ứng dụng xylanase

dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi bên cạnh một số enzyme khác như mananase, β– glucanase và cellulase, α – amylase, protease và phytase Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn[27]

Arabinoxylan là polysaccharide hòa tan một phần trong nước có mặt với số lượng đáng kể trong ngũ cốc như lúa mạch và tạo ra dung dịch nước có độ nhớt cao Ứng dụng xylanase để xử lý trước các thực phẩm chứa arabinoxylan là một giải pháp giúp tăng hấp thụ nitơ và chất xơ, cải thiện thời gian chuyển hóa thức ăn Thức

ăn cho gia cầm được bổ sung 0,1% avizyme 1500 (chứa xylanase, protease và amylase) giúp làm tăng đáng kể về trọng lượng, giảm tỷ lệ chết so với nhóm đối chứng [61]

Bổ sung xylanase vào lúa mạch đen (chế độ ăn của gà thịt) giúp giảm độ nhớt của ruột, do đó cải thiện tăng trọng và hiệu quả chuyển đổi thức ăn của gà con [13] Xylanase, được sử dụng giúp xử lý các loại rau làm thức ăn gia súc, cải thiện các đặc tính dinh dưỡng của thức ăn ủ chua nông nghiệp và ngũ cốc [13, 50, 63] cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn của động vật nhai lại và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ủ phân [42] Tuy nhiên, trong xử lý thức ăn chăn nuôi không nên lạm dụng xylanase vì hemicellulose là thành phần của chế độ ăn uống và việc loại bỏ hoàn toàn có thể làm gia tăng các bệnh về đường ruột [53]

Ứng dụng xylanase trong sản xuất thực phẩm: trong công nghiệp sản xuất bánh,

xylanase được dùng để làm tăng độ phồng và giảm độ dính của bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiên liệu Bánh mì được tạo thành từ lúa mì bao gồm hemicellulose như arabinoxylan và xylanase có thể hòa tan arabinoxylan Butt và cộng sự (2008) đã chứng minh vai trò của GH11

endoxylanase từ B subtilis trong việc hòa tan arabinoxylan [21] Việc bổ sung thêm

enzyme đã làm tăng độ nhớt và khối lượng bột và giảm sự kết tụ gluten và độ cứng

của bột làm tăng độ đều và mịn GH11 xylanase (0,12 U/g bột) từ P constitanis

Pol6 cải thiện quá trình sản xuất bánh mì như giảm sự hấp thụ nước (8%) và tăng bột nhào (36,8%), khối lượng (17,8%), cụ thể khối lượng (34,9%) và độ kết dính Bánh mì đã được cải thiện tính chất lưu biến và cảm quan (kết cấu, hương vị, độ mềm) Xylanase sử dụng trong sản xuất bánh mì làm sản phẩm có đặc tính cảm quan tốt hơn (màu sáng hơn) [37] Việc bổ sung xylanase cũng dẫn đến tăng khối

lượng riêng và thời hạn sử dụng, với độ cứng thấp hơn và thuận tiện trong quá trình

bảo quản Xylanase tái tổ hợp (r-XynBS27) từ Pichia pastoris (gen xynBS27 từ

Streptomycessp S27) được sử dụng làm phụ gia trong quá trình làm bánh mì [28]

Xylanase tinh sạch từ Streptomyces sp AOA40 được sử dụng trong ngành công

nghiệp nước ép trái cây để tăng độ trong của nước ép từ táo (17,8%), cam (18,4%)

và nho (17,9%) [7] Xylanase cố định hoạt hóa glutaraldehyde được sử dụng để làm

trong nước ép cà chua Xylanase từ P acidilactici GC25 được sử dụng cho dịch

chiết các loại quả như kiwi, táo, đào, cam, mơ, nho và lựu giúp tăng lượng đường

và giảm độ đục của nước ép [6]

Ứng dụng xylanase trong công nghiệp quá trình tẩy trắng giấy hay quá trình loại

bỏ lignin từ bột gỗ thường sử dụng các chất tẩy trắng hóa học như clo [14] Hiện nay, việc sử dụng các enzyme thủy phân cellulose để tẩy trắng được ưa chuộng do không độc hại, thân thiện với môi trường Xylanase có khả năng thủy phân xylan do phân giải các liên kết với cellulose và lignin của sợi bột giấy dẫn đến sự phân tách giữa các thành phầm giúp cải thiện việc chiết xuất lignin từ bột giấy [66] Xylanase được sử dụng kết hợp với enzyme phân giải lignin giúp tăng độ sáng của bột giấy

Sự tiếp xúc enzyme với sợi cellulose trong quá trình nghiền giúp tăng cường lực liên kết và cải thiện độ bền của giấy thông qua sự phân giải xylan và loại bỏ lignin trong quá trình xử lý enzyme [66]

Tiền xử lý bột giấy với xylanase của P campinasensis BL11 cho thấy độ sáng

và độ nhớt của bột giấy của cây gỗ cứng tăng lên Xylanase từ S thermophilum xylanase hoạt động ở nhiệt độ cao (50-70°C) được sử dụng để tẩy trắng bã mía T

lanuginosus VAPS24 xylanase ổn định ở phạm vi pH rộng có thể hữu ích trong cả

hai chế phẩm sinh học kiềm và axit [49] Các nước sản xuất giấy ở Nam Mỹ, Bắc

Mỹ và Châu Âu hay Nhật Bản đang dần thay thế tẩy trắng bột hóa học bằng tẩy trắng bột qua trung gian xylanase Canada được biết đến là nhà sản xuất bột giấy hàng đầu và hiện đang áp dụng công nghệ tẩy trắng cho hơn 10% bột giấy thông qua xylanase [32]

Ứng dụng xylanase trong dược phẩmquá trình thủy phân của xylan bằng

xylanase tạo ra các xylo-oligosacharide (XOS), có thể được sử dụng trong ngành dược phẩm XOS cấu tạo từ các đơn vị D-xylose được liên kết bởi liên kết β-1,4 glycoside có chuỗi polymer hóa từ 2 đến 12 bao gồm xylobiose, xylotriose, xylotetraose, xylopentose, xylohexose và xylohepatose Một số XOS có ít hơn 4 đơn phân có vai trò quan trọng như prebiotic (một thành phần thức ăn không được tiêu hóa nhưng có lợi cho vật chủ [41]) nhưng không phải là chất thiết yếu [40] XOS có mặt trong rau, trái cây, mật ong, sữa và măng với số lượng hạn chế khiến việc sản xuất quy mô lớn và tinh chế XOS từ những nguồn này không phù hợp về mặt kinh tế [67] Tổng hợp hóa học hoặc sử dụng enzyme thủy phân một cơ chất phù hợp như xylan để tạo ra XOS là quy trình được áp dụng quy mô công nghiệp [23]

XOS không bị thủy phân cũng như không được hấp thụ ở đường tiêu hóa và tác động lên cơ thể bằng cách thiết lập có chọn lọc sự phát triển hoặc hoạt động của một hoặc một số vi khuẩn trong cơ thể, do đó cải thiện sức khỏe Trong số những

ưu điểm chính của XOS là giảm cholesterol, duy trì sức khỏe đường tiêu hóa tăng cường hấp thụ canxi XOS ức chế sự phân hủy tinh bột, cải thiện các đặc tính dinh dưỡng và hợp lý của thực phẩm [23]

Các sản phẩm thủy phân của xylan như β-D-xylopyranosyl có thể được lên men

(chủ yếu nấm men Pichia spititis và Candida shehatae) để sản xuất xylitol Xylitol

có khả năng làm ngọt tương đương với sucrose, là một chất làm ngọt không tạo năng lượng, thích hợp cho bệnh nhân tiểu đường và béo phì và được khuyến nghị để phòng ngừa loãng xương và nhiễm trùng đường hô hấp, rối loạn chuyển hóa lipid, tổn thương thận và đường tiêu hóa [55]

Ứng dụng xylanase trong sản xuất nhiên liệu sinh học Sản xuất nhiên liệu thân

thiện với môi trường ngày càng trở nên quan trọng để thay thế cho các nguồn năng lượng đang giảm dần về trữ lượng như năng lượng hóa thạch và để phù hợp với các yêu cầu về bảo vệ môi trường Nhiều nghiên cứu cho thấy liên quan đến việc sản xuất ethanol từ chất thải nông nghiệp bằng cách kết hợp xử lý xylanase Xylanase,

cùng với các enzyme thủy phân khác, có thể được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học, chẳng hạn như ethanol, từ sinh khối lignocellulose

Tuy nhiên, quá trình thủy phân bằng enzyme vẫn là một yếu tố chi phí chính trong quá trình chuyển đổi nguyên liệu thô lignocellulose thành ethanol Trong sản xuất nhiên liệu ethanol sinh học, bước đầu tiên là phân tách lignocellulose, để giải phóng cellulose và hemicellulose khỏi phức hợp của chúng với lignin Bước thứ hai

là quá trình khử trùng hợp của carbohydrate để tạo ra đường tự do, tiếp theo là quá trình lên men hỗn hợp đường pentose và hexose để tạo ra ethanol [61] Ngày nay, năng lượng tái tạo dưới dạng nhiên liệu sinh học từ lignocellulose đã trở thành một trong những phương thức sản xuất năng lượng bền vững quan trọng Sinh khối lignocellulose rất dồi dào vì sản lượng sinh khối này được ước tính là 10–50 tỷ tấn khô trên toàn thế giới [24, 35]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Chủng giống

Chủng P pastoris GS115/pXlnB tái tổ hợp được cung cấp bởi phòng Công

nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học Chủng được tạo ra bằng cách đưa

đoạn gen 678 bp (mã số EU848305.1) mã hóa xylanase B có 225 amino acid từ A

Xbal Plasmid tái tổ hợp được đưa vào P pastoris để tạo chủng P pastoris

GS115/pXlnB

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất dùng trong nuôi cấy như xylan, pepton, cao nấm men,… và các hóa chất dùng trong sinh học phân tử như Tris-HCl, SDS, acrylamide, mercapthoethanol, TEMED… và một số hóa chất thông dụng khác như NaOH, HCl, ethanolđược cung cấp bởi các hãng hóa chất uy tín như Bio Basic Canada Inc (Canada), Honeywell Fluka (Mỹ), Sigma (Mỹ), Sigma (Nhật Bản), Merck (Đức) Các hóa chất được sử dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất

Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các thínghiệm chuẩn tương ứng được tóm tắt trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần các loại đệm và dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

Bradford stock solution 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva Blue G; 200 ml

88% phosphoric acid Bradford working buffer 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88%

phosphoric acid; 30 ml Bradford stock solution Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8

Dung dịch APS 10% amonium persulfate

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

Đệm điện di protein 20 mM Tris-HCl; 192 mM glycerin; 0,1% (w/v) SDS;

pH 8,8 Đệm tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol;

pha trong đệm 1M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch cơ chất 0,5% xylan, pha trong đệm 20 mM potassium

phosphate pH 6,5 Dung dịch đệm tinh chế

không biến tính (native

biến tính (NWB)

250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 20 mM imidazole

pH 8,0 Dung dịch đệm ly giải

Bảng 2.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

YP 2% peptone; 1% cao nấm men

BMM 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,1 M đệm phosphate, pH 6,0; 0,5% methanol BMMY YP; 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,1 M đệm phosphate, pH 6,0; 0,5%

methanol

MM 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,5% methanol

MMY YP; 1,34% YNB; 4.10-5 biotin; 0,5% methanol

YPD YP, 2% glucose

YPD đặc YPD, 2% agar

YPM YP; 0,5% methanol

YPG YP, 1% glycerol

YPTM YPM; 0,01% triton X 100

YPCTM YPTM, 1% casaminoacids

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị sử dụng thuộc phòng Công nghệ sinh họcEnzyme, Viện Công nghệ sinh học

Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG Công nghệ (Việt Nam)

Máy lắc rung ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu được thực hiện theo các bước trong sơ đồ hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ tổng thể của quá trình nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy biểu hiện xylanase trong nấm men Pichia pastoris tái tổ hợp

Nuôi cấy hoạt hóa nấm men: Các chủng P pastoris từ các ống giống được

hoạt hóa lại trên môi trường YPD agar ở 28oC, từ 3-5 ngày, sau đó được nuôi trong môi trường YPD lỏng ở 28oC, lắc 200 rpm trong 16- 18 giờ

Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của

xylanase B tái tổ hợp từ chủng Aspergillus

niger DSM 1957

Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên mức độ biểu

hiện xylanase

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ methanol lên mức

độ biểu hiện xylanase

Khảo sát ảnh hưởng các môi trường khác nhau

lên mức độ biểu hiện xylanase

Tinh sạch xylanase tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực

Đánh giá nhiệt độ phản ứng tối thích, pH phản ứng tối thích, xác định độ bền nhiệt độ, xác định độ bền pH, ảnh hưởng của chất tẩy rửa,

ảnh hưởng của các dung môi

Nuôi biểu hiện: Chủng P pastoris được nuôi lắc trong môi trường YP bổ

sung 1% (w/v) glycerol, lắc 200 rpm ở 28oC qua đêm, sau đó chuyển sang môi trường YP, tiếp 0,5% (v/v) methanol sau mỗi 24 giờ để cảm ứng biểu hiện xylanase

2.2.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy biểu hiện xylanase tái tổ hợp

Trong nghiên cứu 3 thông số của điều kiện nuôi cấy được khảo sát gồm: thời gian thu mẫu, môi trường biểu hiện và nồng độ chất cảm ứng

Thời gian thu mẫu: Để xác định thời gian thu mẫu thích hợp cho biểu hiện

xylanase tái tổ hợp, chủng P pastoris tái tổ hợp được nuôi lắc trong môi trường YP

lỏng, pH 7,0, lắc 200 rpm ở 28oC, thu mẫu và cảm ứng 1% (v/v) methanol sau mỗi

24 giờ Mật độ tế bào, hàm lượng protein và hoạt tính enzymexylanase được xác định tại các thời điểm khảo sát khác nhau

Nồng độ chất cảm ứng: Để xác định nồng độ methanol có ảnh hưởng như thế

nào đến cảm ứng biểu hiện xylanase tái tổ hợp, chủng tái tổ hợp được nuôi cấy trong môi trường YP lỏng; pH 7,0; nhiệt độ và thời gian nuôi cấy thích hợp, bổ sung methanol với các nồng độ 0; 0,5; 1; 1,5; 2% Dịch nuôi biểu hiện được thu để xác

định mật độ tế bào, hàm lượng protein và hoạt tính enzyme xylanase tái tổ hợp

Môi trường biểu hiện: Để lựa chọn môi trường thích hợp cho biểu hiện

xylanase tái tổ hợp, chủng P pastoris tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong 6 môi

trường khác nhau (BMMY, MMY, MM, YPM, YPTM, YPTCM) Các mẫu nuôi biểu hiện được thu để xác định mật độ tế bào, hàm lượng protein và hoạt tính enzyme xylanase tái tổ hợp Thu 8mL dịch nuôi biểu hiện ở môi trường có hoạt độ cao nhất để tiến hành nghiên cứu tinh sạch xylanase tái tổ hợp

2.2.3 Phương pháp tinh sạch xylanase tái tổ hợp

Xylanase tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-Sepharose/NTA chuyên dùng cho các protein tái tổ hợp có đuôi polyhistidine theo qui trình tại phòng thí nghiệm [62]

Nguyên lý: Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực Sepharose /NTA chuyên dùng cho các protein tái tổ hợp có đuôi polyhistidine Trong

Ni-đó, resin là chất mang dạng agarose liên kết chéo, chứa thụ thể iminodiacetic acid

và chất này làm cầu nối với Ni2+ Cột resin-nickel có ái lực cao với đuôi polyhistidine Việc gắn kết hình thành thông qua liên kết giữa ion Ni2+ và đuôi 6xHis trong phân tử protein Tinh sạch protein được thực hiện dưới điều kiện không biến tính như chỉ dẫn của Invitrogen Protein liên kết với resin được rửa giải bằng đệm pH thấp hoặc bằng đệm chứa muối imidazole

Tiến hành: 8 ml dịch nuôi biểu hiện xylanase tái tổ hợp ở nấm men được sử

dụng trực tiếp để đưa lên cột chứa 2 ml resin đã được cân bằng với đệm gắn NBB Sau đó, mẫu được ủ với resin trong cột khoảng 45- 60 phút, lắc đảo nhẹ nhiều lần Cột được rửa 3 lần, mỗi lần với 8 ml đệm NWB Cuối cùng, mẫu được thôi bằng 8-

10 ml đệm NEB (1 ml/ phân đoạn) Điện di kiểm tra protein trên gel polyacrylamide 12,5%

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tái tổ hợp

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [20]

Nguyên tắc: protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ tạo phức hợp

màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm Cường độ màu

tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò

Tiến hành:

Ống thí nghiệm:100 μl dịch mẫu được bổ sung 1 ml dung dịch bradford

working Hỗn hợp được đảo đều và so màu ở bước sóng 595 nm

Ống đối chứng: Thay dung dịch cần định lượng protein bằng nước cất

Dựng đường chuẩn: albumin huyết thanh bò (BSA) được pha trong nước cất

với dải nồng độ 25-200μg/ml 100 μl dung dịch BSA chuẩn được bổ sung 1 ml dung dịch Bradford working, đảo đều và tiến hành so màu ở bước sóng 595 nm

Đường chuẩn có phương trình y = ax + b Trong đó, y là độ hấp phụ ở bước sóng 595 nm (OD595nm) và x là hàm lượng protein (μg/ml)

Đường chuẩn xây dựng được thể hiện như trong đồ thị:

Hình 2.2 Đường chuẩn Bradford

2.2.5 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)

Điện di protein trên gel polyacrylamide được tiến hành theo phương pháp

điện di biến tính của Leammli và cộng sự (1970) [52]

Nguyên lý: Các phân tử protein trong môi trường có SDS và mecaptoethanol

bị duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử

Tiến hành:

Chuẩn bị bản gel: Bản gel gồm 2 lớp, lớp dưới là gel tách được đổ cách mặt

trên 1,5 cm, để đông hoàn toàn trong 30 phút, đổ tiếp lớp gel cô phía trên, cài lược

để định vị từng giếng riêng biệt, để 30 phút cho bản gel đông hoàn toàn và ổn định Thành phần gel như bảng 2.5

Biến tính mẫu: Mẫu protein được bổ sung đệm tra mẫu protein với tỷ lệ

mẫu/đệm là 5/1, biến tính ở 950C, 10 phút

Điện di: Bản gel được lắp vào hệ thống điện di và chạy với cường độ dòng

điện là 20 mA cho lớp gel cô và 35 mA cho lớp gel tách trong 45 phút Sau điện di,