BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THU THỦY BIÊU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH Cơ CHẤT CHUYỀN HÓA CỦA ENZYM CYP154C TỪ STREPTOMYCES CA VOVRENSIS YBQ59 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI 2023 BỘ[.]
BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THU THỦY BIÊU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH Cơ CHẤT CHUYỀN HÓA CỦA ENZYM CYP154C TỪ STREPTOMYCES CA VOVRENSIS YBQ59 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2023 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THU THỦY MÃ SINH VIÊN: 1801687 BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH Cơ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA ENZYM CYP154C TỪ STREPTOMYCES CA VOURENSIS YBQ59 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: TS Lý Thị Bích Thủy TS Đào Thị Mai Anh Nơi thực hiện: Viện Cơng nghệ sinh học Bộ mơn Hóa Sinh HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội Trong năm học tập rèn luyện trường, thầy cô dạy dỗ truyền đạt cho em không nguồn tri thức quý báu, mà nhân cách đạo đức người dược sỹ niềm say mê với nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn thầy cán phịng Sinh hóa Thực vật - Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện, tận tình hướng dẫn hỗ trợ em trình thực tập, nghiên cứu Em xin gửi lòng biết ơn tới TS Lý Thị Bích Thủy, người ln bên cạnh em, giúp em định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn em từ thí nghiệm từ ngày đầu em đến với cô dạy kiến thức chuyên môn giúp em hồn thành tốt khóa luận Cảm ơn giúp em dần hình thành nên suy nghĩ, tác phong nhạy bén người nghiên cứu Đó điều may mắn mà em nhận chọn theo đường nghiên cứu khoa học Đặc biệt, em muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đào Thị Mai Anh Cảm ơn chọn đặt niềm tin vào em, niềm tin động lực, khích lệ đế em cố gắng hoàn thiện thân kiên định với đường chọn Cách nhìn nhận giải vấn đề nghiên cứu sống cô “tài liệu tham khảo” quý giá mà em có năm rèn luyện trường đại học Dược Hà Nội Dưới bảo tận tình cơ, em dần nhận khả vượt qua tường giới hạn mà em tự vẽ Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Vũ Mạnh Cường, chị Trần Thị Thanh Diệp, bạn Khổng Văn Mạnh, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Kim Anh đà giúp đỡ em nhiều trình em thực tập nghiên cứu lab Cảm ơn bạn Hoàng Hà Phương, Lê Thị Hà, Bùi Thị Nhung, Nguyễn Thị Hương đà bên cạnh, động viên chỗ dựa tinh thần tớ suốt thời gian qua Cảm ơn bạn Trần Thị Thu Thảo, Mai Thị Bích Phượng, Nguyễn Thị Lý, Trịnh Thu Nga, Phạm Quỳnh Mai, Nguyễn Thị Thu Ngân bạn tồ 10 lóp N1K73 khiến năm tháng học tặp, rèn luyện HƯP tớ trở nên ý nghĩa đáng nhớ Cuối xin cảm ơn bà, bác Thoa, bố mẹ, gia đình Bắp, em Tồn ln bên cạnh con, u thương vơ điều kiện Gia đình ln điểm tựa vững nhất, động lực để cố gắng phấn đấu đường học tập nghiên cứu phía trước Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Mai Thị Thu Thủy MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VÊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN 1.1 Cytochrom P450 (EC 1.14.-.-.) 1.1.1 Định nghĩa danh pháp 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc 1.1.4 Chu trình xúc tác hệ thống P450 1.2 Sàng lọc chất enzym P450 1.2.1 Vai trị việc tìm chất đặc hiệu P450 1.2.2 Các phương pháp sàng lọc chất tiềm cùa P450 1.3 CYP154C 11 1.3.1 Nguồn gốc 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu CYP154C giới 11 1.3.3 Tình hình nghiên cứu CYP154C tạiViệt Nam 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1 Nguyên vặt liệu thiết bị 14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Hóa chất .14 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Biểu CYP154C tái tổ họp tế bào E coli 18 2.3.2 Tinh enzym CYP154C tái tổ hợp 20 2.3.3 Sàng lọc chất tiềm CYP154C 21 2.3.4 Đánh giá khả chuyến hóa chất tiềm ỉn vitro cùa CYP154C 23 2.3.5 Điện di protein 25 2.3.6 Xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Kết 27 3.1.1 Kết biểu CYP154C-sca8 tái tổ họp E coli 27 3.1.2 Kết tinh CYP154C-sca8 tái tổ họp 27 3.1.3 Kết sàng lọc chất tiềm CYP154C-sca8 30 3.1.4 Kết đánh giá khả chuyển hóa chất tiềm ỉn vitro CYP154C-sca8 33 3.2 Bàn luận .35 3.2.1 kết biểu CYP154C-sca8 tái tổ họp E coli 36 3.2.2 kết tinh enzym CYP154C-sca8 tái tổ hợp 38 3.2.3 kết xác định chất đặc hiệu enzym CYP154C-sca8 38 CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN 42 CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỦ VIÉT TẮT Ký hiệu, Tiếng Việt Tiếng Anh chữ viết tắt APS Ammonium persulfate Amoni persulfat AQ Amodiaquine Amodiaquin bp Base pair Cặp base BLAST The Basic Local Alignment Search Tool CPR Cytochrome P450 reductase Cytochrom P450 reductase DHEA Dehydroepiandrosterone Dehydroepiandrosteron DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DPPT 5,6-diphenyl-3-(2-pyridyl)-1,2,4- 5,6-dipheny 1-3 -(2-pyridy 1)- triazine 1,2,4-triazin FAD Flavin adenine dinucleotide Flavin adenin dinucleotid FMN Flavin mononucleotide Flavin mononucleotid GDH Glucose dehydrogenase HPLC High performance liquid Sac ký lỏng hiệu cao chromatography HS High spin Spin cao IPTG Isopropyl P-D-l- Isopropyl p-D-1- thiogalactopyranoside thi ogal actopyranosi d Dissociation constant Hằng số phân ly chất - Kd enzym Kali phosphat KPP Kali phosphate LB Lysogeny broth LS Low spin NA Nutrient agar NADH Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamid adenin dinucleotid NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamid adenin dinucleotid phosphate phosphat Spin thấp National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Công Information nghệ sinh học Quốc gia NMR Nuclear magnetic resonance Phố cộng hưởng từ OD Optical density Mật độ quang PDB Protein data bank Ngân hàng liệu protein P450 Cytochrome P450 Cytochrom P450 RIT Ritonavir Ritonavir Rt Retention time Thời gian lưu SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate - Điện di gel polyacrylamid NCBI polyacrylamide gel electrophoresis TB Terrific broth TEMED T etramethylethylenediamine T etramethylethylenediamin TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TTN Total turnover number UV-VIS Ultraviolet-visible Quang phổ tử ngoại khả kiến Ô-ALA Ô-Aminolevulinic acid Acid ô-Aminolevulinic DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Thú tự Bảng 1.1 Phân loại P450 nhóm phụ dựa chuỗi truyền điện tử Trang Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Cơng thức pha dung dịch 15 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy E coli 16 Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng 16 Bảng 2.5 Thành phần gel cô gel tách 25 Bảng 3.1 Phổ hấp thụ CYP154C-sca8 có mặt Nooakaton Testosteron Bảng 3.2 Giá trị chênh lệch độ hấp thụ cực đại cực tiểu CYP154C-sca8 phụ thuộc vào nồng độ co chất 31 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Thứ tự Tên hình Trang Hình 1.1 P450 nhóm I II Hình 1.2 cấu trúc P450 Hình 1.3 Vùng chứa phối tử Cys/ P450cam Hình 1.4 Nhóm ngoại Hem (Fe3+- protoporphyrin IX) Hình 1.5 Cơ chế xúc tác P450 Hình 1.6 Phổ hấp thụ P450 trạng thái không gắn chất trạng , ’ , ■ ■ thái găn chât 10 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 17 Hình 3.1 Điện di đồ SDS - PAGE tế bào E colỉ 27 Hình 3.2 Qui trình tách chiết, tinh CYP154C-sca8 tái tổ hợp từ E ’ V coli 28 Hình 3.3 Điện di đồ SDS - PAGE CYP154C-sca8 sau tinh 29 Hình 3.4 Phổ hấp thụ ƯV-VIS CYP154C-sca8 tinh trạng thái 77 ố khử gắn CO 29 Hình 3.5 Phổ UV-VIS CYP154C-sca8 có mặt hợp chất khảo * sát 30 Sự phụ thuộc chênh lệch độ hấp thụ cực đại cực tiểu Hình 3.6 ’ 777 ? 7 ' ■ CYP154C-sca8 với nồng độ chất 32 Hình 3.7 Sắc ký đồ TLC phân tích kết chuyển hóa Nootkaton L Testosteron 34 Hình 3.8a sắc ký đồ HPLC phân tích kết chuyển hóa Nootkaton 35 Hình 3.8b sắc ký đồ HPLC phân tích kết chuyển hóa Testosteron 35 Hình 3.9 Kết so sánh trình tự CYP154C-sca8 với protein có độ tương đông cao nhât ngân hàng NCBI 39 7 1771 ĐẶT VẤN ĐÈ Tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ tử vong bệnh lý tim mạch, ung thư nhiễm khuẩn kháng kháng sinh ngày gia tăng, trở thành gánh nặng y tế toàn cầu động lực thúc nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm loại thuốc [43] Trong cơng nghiệp hóa dược truyền thống, phản ứng oxy hóa, đặc biệt oxy hóa liên kết C-H khơng hoạt hóa địi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, dẫn đến chi phí cao có tác động xấu đến mơi trường Chính năm gần đây, xuất xu hướng sử dụng chất xúc tác sinh học enzym để giúp phản ứng diễn điều kiện bình thường, từ tiết kiệm chi phí sản xuất giảm thiểu tác động đến môi trường Một enzym nghiên cứu sâu có ứng dụng ngành công nghiệp Dược phẩm enzym P450 Đây họ enzym đa chức với khả xúc tác 20 phản ứng oxy hóa hợp chất có cấu trúc đa dạng, với đặc tính xúc tác chọn lọc vùng (regioselective), chọn lọc lập thể (stereoselective) cao [7] Vì vậy, P450 coi chất xúc tác sinh học có tiềm ứng dụng lớn lĩnh vực nghiên cứu phát triển thuốc Trong số nhà máy tự nhiên sản xuất P450, chi Streptomyces ứng cử viên sáng giá Kết giải trình tự gen tiết lộ Streptomyces chứa lượng gen mã hóa P450 lớn so với vi sinh vật khác, chang hạn s coeỉicolor A3(2) mang 18 gen; s avermitilis mang 33 gen scabies mang 25 gen [52] Bên cạnh đó, nghiên cứu rang P450 Streptomyces thường tham gia vào giai đoạn cuối đường sinh tổng họp, từ làm tăng hoạt tính sinh học cùa sản phẩm chuyển hóa thứ cấp [44], [48], [61] Tuy nhiên, tổng số 7.500 P450 Streptomyces, có khoảng 2,4% P450 đà xác định chức 0,4% P450 xác định cấu trúc [30] Vì vậy, nghiên cứu P450 Streptomyces hướng đầy tiềm ngành ứng dụng cơng nghệ enzym nói chung cơng nghiệp dược phấm nói riêng s cavourensỉs YBQ59 chủng xạ khuẩn phân lập từ Quế (Cinnamomum cassia) Yên Bái - Việt Nam Kết đánh giá hoạt tính sinh học họp chất chuyển hóa thứ cấp phân lập từ mơi trường ni cấy s cavourensỉs YBQ59 thể hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, chống nấm, tiêu diệt tế bào ung thư [50] Ở nghiên cứu “Biểu hiện, tỉnh xác định tính chất enzym P450 từ vỉ khuẩn Streptomyces YBQ59 tái tổ họp E colỉ” trước đó, đà tiến hành biểu tinh CYP154C từ Streptomyces cavourensis YBQ59 [5] Tuy nhiên mức độ biểu enzym thấp dẫn tới thực nghiên cứu sinh hóa sâu ve CYP154C nhằm tiến tới xác định chức enzym Vì với mong muốn nghiên cứu sâu công cụ xanh tiềm CYP154C từ s