BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỀN NHẬT LINH BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÃ TÍNH CHÁT LÝ HÓA CỦA XYLANASE D TÁI TỒ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ HÀ NỘI 2023 BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘ[.]
BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỀN NHẬT LINH BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÃ TÍNH CHÁT LÝ HÓA CỦA XYLANASE D TÁI TỒ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ HÀ NỘI - 2023 BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NHẬT LINH Mã sinh viên: 1801391 BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHÁT LÝ HĨA CỦA XYLANASE D TÁI TỔ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ Giảng viên hướng dẫn: TS Đào Thị Mai Anh PGS.TS ĐỖ Thị Tun Nơi thực hiện: 1.1 Bộ mơn Hóa Sinh 2.1 Viện công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÃ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, người tâm huyết giảng dạy kiến thức quý báu cho em suốt thời gian năm năm học tập rèn luyện trường Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa Sinh - khoa Cơng nghệ sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội, anh chị phịng Cơng nghệ sinh học Enzym - Viện Công nghệ sinh học đà tạo điều kiện thuận lợi cho em trình thực tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Đỗ Thị Tuyên đà định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình bổ sung cho em kiến thức chuyến môn cần thiết tạo điều kiện tốt giúp em học tập, rèn luyện thực khóa luận suổt q trình thực tập phịng Cơng nghệ sinh học Enzym - Viện Công nghệ sinh học Sự đồng hành quan tâm cô trở thành nguồn động lực lớn mà em nhặn Đặc biệt, em gửi lời cảm ơn lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh, người giảng viên hướng dẫn đầy nhiệt huyết em Cô người thầy tận tâm lời giảng, định hướng nghiên cứu giúp em, mà cịn người chị, người mẹ gửi gắm cho em kỳ vọng, tiếp cho em niềm tin đưa em lời khuyên chân thành sống Đây hành trang quý giá để em vừng vàng hơn, tự tin đường nghiệp sống mai Thêm vào đó, giúp đỡ nhiệt tình TS Nguyễn Thị Thảo, anh Tùng anh Hoàng đà tạo cho em nguồn cảm hứng vô lớn Cảm ơn anh chị cho em lời nhận xét dẫn chun mơn xác, lời động viên chân thành để em hồn thành khóa luận tốt khoảng thời gian bị giới hạn Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ba mẹ, người thân gia đình, bạn bè bên cạnh, động viên tiếp thêm niềm tin, động lực cho em đường học tập rèn luyện thân Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2023 Sinh Viên Nguyễn Nhật Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VÀN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 EMZYM XYLANASE 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Nguồn gốc 1.2 XYLANASE TỪ CHI ASPEGILLUS 1.2.1 Các loại gen mã hóa xylanase 1.2.2 Cấu trúc chế xúc tác 1.2.3 Tính chất 10 1.2.4 ứng dụng 11 1.3 XYLANASED 13 1.3.1 Gen mã hóa từ chủng Aspergillus niger DMS1957 13 1.3.2 Đặc tính cấu trúc enzym xylanase D 13 1.3.3 Tình hình nghiên cứu 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu .15 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 15 2.1.1 Chủng giống 15 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Môi trường 17 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN cứu 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 19 2.3.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase 19 2.3.2 Xác định hoạt tính enzym xylanase 19 2.3.3 Xác định hàm lượng protein .21 2.3.4 Tinh xylanase 21 2.3.5 Điện di SDS-PAGE 23 2.3.6 Nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase 24 2.3.7 Xử lý số liệu 25 CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 KẾT QUẢ 26 3.1.1 Biểu hiện xylanase D từ chủng p.pastoris GS115 tái tổ hợp 26 3.1.2 Tinh xylanase D tái tổ hợp 28 3.1.3 Nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase D tái tố hợp 33 3.2 BÀN LUẬN 37 3.2.1 kết biểu xylanase D tái tổ hợp 38 3.2.2 kết tinh xylanase D tái tổ họp 38 3.3.3 kết nghiên cứu tính chất lý hóa xylanase D tái tổ hợp 41 CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN 44 CHƯƠNG 5: KIÉN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẤT Tiếng Việt Viết tắt Tiếng Anh AOX Alcohol oxidase APS Ammonium persulphat Bis-acrylamid N, N’-Methylen-bis-acrylamid bp Base pair Cặp base BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CBB Coomassie brilliant blue DNS Dinitro salysilic acid DEAE Diethylaminoethyl EC The Enzym Commission EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid GH Glycosid hydrolase kDa Kilo Dalton KP Kali phosphate MW Molecular weight NaP Sodium phosphate OD Optical density SDS Sodium dodecyl sulfat PAGE Polyacrylamid gel electrophoresis Tiêu ban Enzym Khôi lượng phân tử N,N,N’,N’TEMED Tetramethylethylenediamin Tris Tris -(hydroxymethyl)-aminomethan v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể thích DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng STT Trang Bảng 1.1 Phân loại enzym xylanase theo liên kết bị tác động Bảng 1.2 Đặc điểm họ GH có hoạt tính xylanase Bảng 1.3 Tính chất lý hóa cùa số xylanase từ chi Aspergillus 10 Bảng 1.4 Tính chất số xylanase D 13 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 16 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 16 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng 18 Bảng 2.4 Thành phần gel co gel tách 24 Bảng 3.1 Kết hoạt độ xylanase D tái tổ hợp từ chủng p.pastoris GS115 28 10 Bảng 3.2 Ket hoạt độ enzym tinh cột cut-off 10 kDa 28 11 Bảng 3.3 Hoạt tính phân đoạn sau qua cột DEAE-Sepharose 29 12 Bảng 3.4 Hoạt tính phân đoạn sau qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G100 30 13 Bảng 3.5 Tóm tắt q trình tinh xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 32 14 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tô họp 33 15 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 34 16 Bảng 3.8 Ánh hưởng pH lên hoạt tính xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình STT Trang Hình 1.1 Cơ chế trì cấu hình anomer đường khử Hình 1.2 Cơ chê đảo ngược câu hình anomer đường khử Hình 1.3 Cấu trúc phân tử số dẫn xuất trung gian để tống hợp thuốc điều trị ung thư, kháng virus điều chế từ xylose 12 Hình 1.4 Cấu trúc khơng gian enzym xylanase D 13 Hình 2.1 Cấu tạo vector biểu pPICZaA 15 Hình 2.2 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 19 Hình 2.3 Đường chuân xylose 20 Hình 2.4 Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 21 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình tinh xylanase từ chúng p.pastorisGS115 tái tơ hợp 22 10 Hình 3.1 Ni cấy chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tổ họp YPD agar bô sung zeocin 26 11 Hình 3.2 Định tính xylanase 24h 27 12 Hình 3.3 Định tính xylanase dịch thơ 27 13 Hình 3.4 Khả thủy phân agar xylanase D 27 14 Hình 3.5 Hoạt tính hàm lượng protein cácphân đoạn qua cột DEAESepharose 29 15 Hình 3.6 Điện di đồ SDS-PAGE qua cột DEAE-Sepharose 30 16 Hình 3.7 Hoạt tính hàm lượng protein phân đoạn qua cột Sephadex G-100 31 17 Hình 3.8 Điện di đồ phân đoạn 7-12 qua cột Sephadex G-100 31 18 Hình 3.9 Điện di đồ trình tinh xylanase D từ chủng p.pastorỉs GS115/pXlnD tái tổ hợp 32 19 Hình 3.10 Ánh hưởng thời gian phản ứng lên hoạt tính xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tồ hợp 33 20 Hình 3.11 Anh hưởng cúa nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tố hợp 34 21 Hình 3.12 Anh hưởng pH lên hoạt tính xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tồ hợp 35 22 Hình 3.13 Ảnh hưởng pH đến độ bền enzym xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tổ hợp 36 23 Hình 3.14 Ánh hưởng nhiệt độ đến độ bền cùa enzym xylanase D từ chủng p.pastoris GS115/pXlnD tái tô hợp 37 ĐẶT VÁN ĐÈ Trong kỷ 21, thay chạy theo hiệu kinh tế đon thuần, sử dụng nhiều hóa chất độc hại sản xuất gây tổn hại trầm trọng đến mơi trường, “cơng nghiệp xanh” (green industry/sustainable development) xu ngày nhiều ngành sản xuất quan tâm ứng dụng Do biến đổi khí hậu tồn cầu ngày khắc nghiệt với hàng loạt thảm họa tự nhiên người gây nhận thức trách nhiệm bảo vệ môi trường nhà sản xuất người tiêu dùng tăng lên rõ rệt, các nhà sản xuất sẵn sàng thay đổi nắm bắt hội phát triển bền vững để có lợi cạnh tranh Thị trường cơng nghệ xanh bền vững toàn cầu dự báo phát triển từ 35,5 tỷ đô la Mỹ vào năm 2021 đến đỉnh 417,35 tỷ đô la Mỹ vào năm 2030 Tốc độ tăng trưởng kép hàng năm 21,6% từ năm 2022 đến năm 2030 [45] Một số quốc gia tồn giới sử dụng cơng nghệ xanh để quản lý tái chế chất thải từ ngành cơng nghiệp hộ gia đình Cơng nghệ xanh hỗ trợ doanh nghiệp tiết kiệm nước, giảm rác thải, sử dụng lượng so với công nghệ truyền thống Những lợi công nghệ bền vững có tác động đáng kể đến việc áp dụng tồn cầu [61] Để thực ngành công nghiệp xanh, cần giải số vấn đề như: nguồn lượng tái tạo, cồng cụ xanh, kỹ thuật thân thiện với môi trường Một giải pháp ưu việt việc ứng dụng enzym - công cụ xanh vào sản xuất xử lý phế phấm công nghiệp, nơng nghiệp Trong đó, xylanase, nhóm enzym có khả thủy phân polysaccharid mạch thắng p-l,4-xylan thành oligosacharid ngắn (oligoxylose) xylose, biết đến phương pháp hữu hiệu việc xử lý chất thải công nghiệp, ứng dụng ngành công nghiệp giấy, sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất cồn nhiên liệu, [28, 58, 60, 70, 74] Nhiều dạng chế phấm xylanase thương mại hóa bán thị trường giới Theo báo cáo, dù chịu ảnh hưởng COVID-19, thị trường xylanase toàn cầu tăng trưởng dự đoán tiếp tục xu hướng năm 2028 [66] Không vậy, ngày nay, xylanase cịn quan tâm đến cơng cụ hiệu sản xuất xylose xylooligosaccharid (XOs), hợp chất ngày có nhiều ứng dụng quan trọng ngành Dược, kể đến vai trị probiotic, chống oxy hóa, kháng khuẩn, giảm cholesterol máu thay glucose chế độ ăn cho người bị tiểu đường, [14, 18, 40, 46] Đặc biệt, năm gần nhà Dược học ý tới ứng dụng tiềm khác cùa xylose sử dụng chúng để tống hợp dẫn xuất trung gian điều chế thuốc điều trị ung thư, kháng virus HIV [2] Tuy nhiên, enzym trở thành cơng cụ hữu dụng cho ngành cơng nghiệp địi hỏi phải hoạt động điều kiện khắc nghiệt nhiệt độ cao, pH acid hay kiềm Đây lý