Nghiên Cứu Tạo Chủng Nấm Cordyceps Militaris Tái Tổ Hợp Có Khả Năng Tăng Sinh Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học.pdf

Nghiên cứu biểu hiện các gen có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp chất có hoạt tính sinh học ở C.. militaris phục vụ cho nghiên cứu tăng cường sự biểu hiện của các gen liên quan đến

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC -

Bùi Thị Khánh Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG NẤM CORDYCEPS MILITARIS

TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG TĂNG SINH CÁC CHẤT CÓ

HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC -

Bùi Thị Khánh Linh

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG NẤM CORDYCEPS MILITARIS

TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG TĂNG SINH CÁC CHẤT CÓ

HOẠT TÍNH SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS Trần Văn Tuấn

HÀ NỘI, 2023

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này, lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn sâu sắc PGS.TS Trần Văn Tuấn – Trưởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phó giám đốc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người đã nhiệt tình hướng dẫn, trực tiếp chỉ bảo, cung cấp tài liệu và thông tin khoa học cần thiết cho em, đặc biệt thầy luôn hỏi han, động viên và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp một cách tốt nhất

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN, Phòng đào ta ̣o Sau đa ̣i ho ̣c, Khoa Sinh học, Bô ̣ môn Vi sinh vật học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, đề tài nghiên cứu cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số: KLEPT.20.03 đã ta ̣o điều kiê ̣n, giúp đỡ em trong quá trình ho ̣c tâ ̣p và nghiên cứu

Bên cạnh đó, em vô cùng biết ơn TS Thái Hạnh Dung, một người chị tận tâm luôn cho em những lời khuyên bổ ích Cảm ơn các em sinh viên ở phòng Genomic, sự nhiệt tình, tài năng và nỗ lực của mọi người là nguồn động lực to lớn để em cố gắng hoàn thiện bản thân

Cuối cùng, em chân thành cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên ca ̣nh yêu thương, chăm sóc, đô ̣ng viên để em có điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn thạc sĩ này

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2023

Học viên

Bùi Thị Khánh Linh

PDA Potato dextrose agar

SDS Sodium dodecyl sulfate WT Wild type (chủng dại, chủng tự nhiên)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 (A-E) Một số loài thuộc chi Cordyceps được phát hiện trong tự nhiên 4

Hình 2 Đặc điểm hình thái của nấm C militaris 5

Hình 3 Hình thức sinh sản của C militaris 7

Hình 4 Các thành phần có hoạt tính sinh học ở C militaris 9

Hình 5 Cơ chế sinh tổng hợp cordycepin 12

Hình 6 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dưới kính hiển vi 17

Hình 7 Cấu trúc của Ti – plasmid 17

Hình 8 Cơ chế chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 18

Hình 9 Gen phát huỳnh quang được biểu hiện ở nấm sợi 24

Hình 10 Xác nhận lại các chủng C militaris sử dụng trong nghiên cứu 43

Hình 11 Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự vùng ITS của rDNA 44

Hình 12 Xác định gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 ở 5 chủng nấm 45

Hình 13 Xác nhận xóa gen pyrG ở các chủng C militaris sử dụng trong chuyển gen 48

Hình 14 Quy trình chuyển gen vào C militaris trợ dưỡng uridine/uracil sử dụng phương pháp ATMT 49

Hình 15 Hiệu quả chuyển gen của các chủng C militaris xóa gen pyrG 50

Hình 16 Sự phân phối các giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) cho các gen tham chiếu trên các mẫu thí nghiệm ở C militaris 52

Hình 17 Tạo vector pEX2-Tef1 chứa gen phát huỳnh quang đỏ DsRed sử dụng marker AopyrG 54

Hình 18 Tạo vector biểu hiện gen CmpyrG - Tef1- DsRed dưới sự điều hòa của promoter Tef1 với marker CmpyrG 55

Hình 19 Kết quả chuyển cấu trúc pEX2-Tef1 vào C militaris 57

Hình 20 Kết quả chuyển cấu trúc CmpyrG-Tef1-Dsred vào C militaris 59

Hình 21 Tạo vector biểu hiện gen CNS2 dưới sự điều hòa của promoter Tef1 sử dụng marker AopyrG 62

Hình 22 Tạo vector biểu hiện gen CNS2 dưới sự điều hòa của promoter Tef1 sử dụng marker CmpyrG 63

Hình 23 Kết quả chuyển cấu trúc pEX2-Tef1-CNS2 vào C militaris 65

Hình 24 Kết quả chuyển cấu trúc CmpyrG-Tef1-CNS2 vào C militaris 67

Hình 25 Lựa chọn chủng C militaris dựa vào màu vàng của hệ sợi 68

Hình 26 Kết quả real-time PCR ở các chủng biểu hiện quá mức gen CNS2 trên chủng nền C militaris G2 (WT) 70

Hình 27 Hàm lượng cordycepin của các chủng tăng cường biểu hiện gen CNS2 71

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về nấm Cordyceps militaris 3

1.1.1 Phân loại và phân bố loài C militaris 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm C militaris 5

1.1.3 Ký chủ và chu trình sống của nấm C militaris 6

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm C militaris 8

1.1.5 Giá trị dược liệu của C militaris 9

1.2 Một số phương pháp chuyển gen 15

1.2.1 Phương pháp chuyển gen bằng xung điện 15

1.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (PMT) 16

1.2.3 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) 16

1.3 Marker chọn lọc dùng cho chuyển gen ở nấm 19

1.4 Một số promoter điều hòa biểu hiện gen ở nấm sợi 21

1.5 Gen chỉ thị GFP và DsRed dùng trong chuyển gen ở nấm sợi 23

1.6 Một số thành tựu chuyển gen ở C militaris 24

Chương 2 26

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2 Thiết bị và hóa chất 27

2.3 Môi trường nuôi cấy 28

2.4 Các mồi dùng cho PCR 29

2.5 Sơ đồ nghiên cứu 32

2.6 Phương pháp nghiên cứu 33

2.6.1 Thu bào tử và hệ sợi nấm 33

2.6.2 Tách DNA tổng số, tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA 33

2.6.7 Tạo các vector nhị thể phục vụ biểu hiện gen ở nấm C militaris 36

2.6.8 Chuyển gen vào nấm sử dụng vi khuẩn A tumefaciens 38

2.6.9 Sàng lọc và đánh giá các thể chuyển gen 40

Chương 3 42

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Định danh lại các chủng nấm C militaris sử dụng trong luận văn 42

3.2 Xác định gen giới tính MAT1-1-1 và MAT1-2-1 ở các chủng nấm dược liệu C militaris 44

3.3 Tạo các chủng C militaris xóa gen pyrG khuyết dưỡng uridine/uracil phục vụ chuyển gen 46

3.4 Kết quả chuyển gen vào các chủng C militaris∆pyrG 49

3.5 Chọn lựa promoter đặc hiệu phục vụ nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen ở nấm dược liệu C militaris 51

3.5.1 Tạo cấu trúc biểu hiện gen DsRed phát huỳnh quang đỏ dưới sự điều hòa của promoter Tef1 sử dụng marker trợ dưỡng CmpyrG và AopyrG vào nấm C

militaris 53

3.5.2 Chuyển cấu trúc biểu hiện gen DsRed phát huỳnh quang đỏ dưới sự điều hòa của promoter Tef1 sử dụng marker trợ dưỡng CmpyrG và AopyrG vào nấm

C militaris bằng phương pháp ATMT 55

3.6 Nghiên cứu biểu hiện các gen có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp chất có

hoạt tính sinh học ở C militaris 61

3.6.1 Tạo vector biểu hiện gen CNS2 liên quan đến quá trình tổng hợp cordycepin dưới sự điều hòa của promoter Tef1 vào nấm C.militaris 61 3.6.2 Chuyển cấu trúc tăng cường biểu hiện gen CNS2 vào các chủng nấm C

militaris trợ dưỡng urridine/uracil bằng phương pháp ATMT 63

3.6.3 Lựa chọn các chủng C militaris biểu hiện quá mức gen CNS2 sử dụng dưới sự điều hòa của promoter Tef1 sử dụng marker pyrG 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Cordyceps militaris là loài nấm có dược liệu quý và an toàn đối với sức khỏe

con người Do đó loài nấm này được sử dụng rộng rãi làm thực phẩm chức năng và dùng trong bào chế thuốc đông y tại Việt Nam và nhiều nước Châu Á Các nghiên

cứu gần đây cho thấy loài C militaris có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất

(cordycepin, pentostatin, polysaccharide, enzym protease phân giải cục máu đông) hỗ trợ chăm sóc sức khỏe như chống ung thư, kháng viêm, tăng cường hệ miễn dịch

Tuy nhiên, việc phát triển C militaris thành nhà máy tế bào phục vụ sản xuất các chất có hoạt tính sinh học và enzym có giá trị kinh tế ở C militaris vẫn đang đối diện với

nhiều khó khăn Một trong những rào cản quan trọng nhất là việc thiếu các nghiên cứu sinh học chuyên sâu để cải biến di truyền của loài nấm này Cho đến nay, hướng

nghiên cứu phân tử trên C militaris cũng chưa được thực hiện nhiều ở nước ta Điều này đã tạo ra một trở ngại đối với việc thúc đẩy sản xuất nấm C militaris có khả năng

tăng sinh hoạt chất có lợi, đặc biệt là tại Việt Nam

Để tạo ra các chủng nấm có năng suất cao, các kỹ thuật cải biến di truyền thường được áp dụng Một trong những phương pháp chuyển gen phổ biến hỗ trợ cho kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen ở nấm dược liệu là phương pháp chuyển gen thông qua vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phương pháp này đã được chứng minh là rất hiệu

quả đối với nhiều loài nấm sợi khác nhau Tuy nhiên các phương pháp chuyển gen và

cải biến di truyền nấm C militaris vẫn chủ yếu dựa vào gen kháng kháng sinh Điều

này không đáp ứng được các tiêu chuẩn về an toàn đối với sản phẩm liên quan đến thực phẩm, chăm sóc sức khỏe cũng như tiềm ẩn nguy cơ phát tán gen kháng kháng sinh ra ngoài môi trường Do đó, việc xây dựng một hệ thống chuyển gen sử dụng marker trợ dưỡng thay thế sẽ có tiềm năng cao trong các ứng dụng thực tiễn, giúp loại bỏ việc sử dụng các gen kháng thuốc và giảm chi phí thí nghiệm Việc tăng cường

biểu hiện gen ở C militaris cũng cần sử dụng các promoter phù hợp Đây là cơ sở quan trọng để hướng đến khai thác các promoter có nguồn gốc từ chính C militaris

phục vụ cho nghiên cứu tăng cường sự biểu hiện của các gen liên quan đến sinh tổng hợp các hoạt chất

Nhằm phát triển và khai thác hiệu quả hệ thống biểu hiện enzym/protein tái tổ

hợp ở nấm dược liệu C militaris, em tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo chủng nấm Cordyceps militaris tái tổ hợp có khả năng tăng sinh các chất có hoạt tính sinh

học” với mục tiêu như sau:

 Chọn lựa promoter phù hợp phục vụ nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen ở

nấm dược liệu C militaris

 Tạo cấu trúc để kích hoạt tăng cường sự biểu hiện của gen liên quan đến sinh

tổng hợp hoạt chất cordycepin ở C militaris dưới sự điều hòa của promoter

biểu hiện mạnh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về nấm Cordyceps militaris

Trong lịch sử y học Trung Hoa, các loài nấm thuộc chi Cordyceps là nguồn

dược liệu quý được sử dụng nhiều trong bào chế thuốc đông y Cho đến nay,

Cordyceps đã được xác định có hơn 700 loài, chúng ký sinh trên các loài côn trùng

và động vật chân đốt Trong đó, nổi tiếng nhất là Cordyceps sinensis, loài nấm này

sinh trưởng ở những vùng núi cao tự nhiên thuộc Tây Tạng (Trung Quốc) hoặc các khu vực của dãy Himalaya thuộc Ấn Độ, Nepal và Bhutan [19, 29] Tuy nhiên cho

đến nay việc nuôi trồng nấm C sinensis dạng quả thể ở quy mô công nghiệp vẫn chưa

thành công do còn có một số hạn chế về điều kiện nuôi và khó khăn trong việc tìm

kiếm chủng giống phù hợp Khác với loài C sinensis, nấm Cordyceps militaris được

nuôi trồng rộng rãi với quy mô công nghiệp ở nhiều nước châu Á, trong đó có Việt

Nam Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh loài C militaris có đặc tính dược học,

khả năng tổng hợp các hoạt chất hỗ trợ chăm sóc sức khỏe tương đồng với nấm đông

trùng hạ thảo C sinensis [32] Do đó, C militaris đã trở thành đối tượng quan trọng trong nghiên cứu sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học thay cho loài C sinensis

phục vụ việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe con người

Hệ gen của nấm C militaris đã được giải trình tự hoàn toàn và các nhóm gen

liên quan đến việc sản xuất các chất có hoạt tính sinh học đã được xác định thông qua việc phân tích tin sinh học và tiến hành thử nghiệm xóa gen Vào năm 2012, bộ gen

hoàn chỉnh của C militaris đã được mô tả và phân tích bằng phương pháp sequencing shotgun C militaris có tổng cộng 9684 gen mã hóa protein được được dự đoán và 13,7% trong số các gen này đặc trưng cho loài Khoảng 16% gen C militaris (1.547

gen) có liên quan đến tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ Hơn 63% gen được biểu hiện trong cả quá trình phát triển sợi nấm và hình thành quả thể Không có gen gây độc cho người nào được phát hiện, do vậy loài nấm này an toàn để sử dụng trong y, dược học [122] Đây là cơ sở hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho điều tra chức năng của các gen, cải biến di truyền ở mức độ phân tử phục cho các nghiên cứu biểu

hiện protein tái tổ hợp nhằm tăng cường biểu hiện các gen mong muốn trên loài nấm này

Hình 1 (A-E) Một số loài thuộc chi Cordyceps được phát hiện trong tự nhiên (A) C militaris trên nhộng lepidopteran; (B) C kyusyuënsis trên nhộng

lepidopteran; (C) C chichibuënsis trên nhộng coleopteran; (D) C cf ochraceostromata trên nhộng lepidopteran; (E) C Scarabaeicola trên bọ hung

(Coleoptera) [100]

1.1.1 Phân loại và phân bố loài C militaris

C militaris tên khoa học là C militaris (L.) Fr (1818), thuộc giới Nấ m, ngành

Ascomycota, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, chi

Cordyceps Trong họ Clavicipitaceae, chi Cordyceps là chi đa dạng nhất về số lượng loài và phổ ký chủ [53] Tất cả các loài thuộc chi Cordyceps đều là nấm ký sinh Ước

tính 700 loài đã được định danh, tuy nhiên chỉ có số ít loài có thể nuôi trồng nhân tạo thành công ở điều kiện phòng thí nghiệm và sản xuất sinh khối quả thể [7, 29]

Trong đó, C militaris là loài đầu tiên được trồng ở quy mô lớn do loài này chứa

nhiều dược chất có lợi và thời gian nuôi trồng thu quả thể ngắn [6]

Trong tự nhiên, C militaris được tìm thấy ở độ cao 2000-3000 m so với mực

nước biển, phân bố rộng rãi từ vùng cận nhiệt đới đến vùng ôn đới như ở châu Mỹ,

châu Âu và một số nước châu Á C militaris là loài nấm được thương mại hóa nhiều

ở một số nước khu vực Đông Á [25, 66]

Ở Việt Nam cũng có một số khu vực xác nhận có sự phân bố của C militaris

như khu di tích Tây Yên Tử (huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang), vườn Quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai), huyện Vũ Quang (tỉnh Hà Tĩnh) Đây đều là các khu vực có

khí hậu mát mẻ phù hợp với nhiệt độ sinh trưởng của loài nấm C militaris [4] Sự đa

dạng về hình thái và khả năng thích nghi của loài này ở nhiều sinh cảnh khác nhau có thể là nguyên nhân khiến chúng có măt ở nhiều vùng địa lý và sinh thái trên trái đất

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm C militaris

C militaris trong tự nhiên là loài nấm ký sinh trên côn trùng Quả thể (stroma)

nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, có dạng chùy, hơi cong, phần đỉnh rộng hơn phần đáy, màu vàng cam đến đỏ cam, chiều dài khoảng 5 cm [60], khi phóng đại dưới vật

kính lớn có thể thấy bề mặt quả thể khá nhẵn Tương tự C militaris được tìm thấy trong tự nhiên, loài C militaris nuôi trồng nhân tạo có cùng màu sắc và hình dạng

Tuy nhiên, quả thể của nấm nuôi trồng nhân tạo có kích thước lớn hơn so với loài tự nhiên

Hình 2 Đặc điểm hình thái của nấm C militaris

Các dạng bào tử củ a nấ m C militaris Conidia: bào tử tròn tạo ra trên môi

trường nuôi cấy rắn Blastospores: chồi bào tử tao ra trên môi trường nuôi cấy lỏng

Fruiting-body: quả thể Perithecia: thể quả hình chai Asci: nang Fragmented ascospores: các mảnh nang bào tử Microcycle conidiation: vi chu kỳ tạo bào tử

[122]

Hệ sợi nấm C militaris trên môi trường thạch agar có màu trắng, sợi nấm dài

mọc thẳng và tỏa tròn đều về các hướng Khi được chiếu sáng, hệ sợi chuyển sang màu vàng đến vàng cam tùy từng chủng, hình thành bào tử chồi (blastospore, một dạng bào tử sinh sản vô tính) Bào tử đính - conidia, một dạng bào tử sinh sản vô tính phổ biến ở nấm có hình ovan hoặc hình trứng, màu trong khi quan sát dưới kính hiển vi [121]

1.1.3 Ký chủ và chu trình sống của nấm C militaris

C militaris là loài nấm có số lượng ký chủ đa dạng nhất trong chi Cordyceps

Trong tự nhiên, C militaris được đặc trưng bởi các quả thể hình thành trên ấu trùng

và những con nhộng có vỏ bọc của các loài bướm Ngoài ra còn có các ký chủ khác như các loài côn trùng thuô ̣c bô ̣ cánh cứng (Coleoptera), bô ̣ cánh màng (Hymenoptera) và bộ hai cánh (Diptera) Một số loài tiêu biểu như Ips sexdentatus,

Lachnosterna quercina, Tenebrio molitor (thuộc bô ̣ cánh cứng), Cimbex similis

(thuộc bộ cánh màng) và Tipula paludosa (thuô ̣c bô ̣ hai cánh) [34, 52, 69, 82]

Sự phát tán của loại nấm dược liệu quý hiếm này được thực hiện qua không khí, mưa và côn trùng Toàn bộ vòng đời của nấm theo ba giai đoạn là xâm nhiễm,

ký sinh và hoại sinh [81] Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C militaris là

một loài nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông Bào tử nấm theo gió dính vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử hình thành các ống nảy mầ m có các thể bám Các ống này tiết ra các enzym như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó hê ̣sơi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và giết chết ký chủ Đến cuối hè hoặc đầu thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí Các quả thể nấm C militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam Nấ m C militaris có các dạng bào tử khác nhau trong chu trình sống của nấm Ở các điều kiên môi trường khác nhau, sự hình thành các dạng bào tử cũng cho thấy sư khác biệt, ̣ví dụ như dạng bào tử tròn được tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắ n hoặc các chồi bào tử được tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng [6]

Hình 3 Hình thức sinh sản của C militaris

(A) Hình thức sinh sản vô tính (B) Hình thức sinh sản hữu tính [65]

Sinh sản ở C militaris bao gồm chu kỳ vô tính và chu kỳ hữu tính tạo ra bào tử túi thông qua giao phối Quả thể của nấm C militaris được hình thành theo cơ chế chính là sinh sản hữu tính và được điều hòa bởi hệ thống gen giới tính MAT Liên

quan đến hệ thống gen giới tính, những nghiên cứu về sinh học phân tử đã chứng

minh các gen giới tính ở C militaris bao gồm MAT1-1-1 và MAT1-2-1 tồn tại riêng

biệt trong hai bào tử đơn lẻ khác nhau trong con đường sinh sản hữu tính Việc giao

phối có thể bắt đầu khi hai bào tử đơn lẻ có hình dạng MAT khác nhau kết hợp [119] Trong đó, MAT1-1 và MAT1-2 mã hóa cho các nhân tố điều hòa phiên mã khác biệt

chứa các vùng (motifs) có chức năng gắn kết với DNA bảo thủ Yếu tố điều hòa phiên

mã MAT1-1 có chứa tiểu phần α (α domain) đóng vai trò vùng gắn kết DNA Protein

MAT α là thành phần hoạt hóa phiên mã kết hợp với protein MCM1 để nhận biết vùng

promoter của gen đích Trong đó, MAT1-2 là một yếu tố phiên mã chứa vùng HMG

(HMG domain) làm motip liên kết DNA, có khả năng cuộn gập và kích thích sự cuộn

gập của DNA [108] Locus giao phối MAT1-1 bao gồm MAT1-1-1 và MAT1-1-2, còn ở locus MAT1-2 thì chỉ có MAT1-2-1, trong đó 2 gen MAT1-1-1 và MAT1-2-1 được

xác định giữ vai trò quan trọng trong sự hình thành quả thể [122]

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm C militaris

Ảnh hưởng của môi trường đến quá trình nuôi trồng nấm:

Tại phòng thí nghiệm C militaris được nuôi trong môi trường lỏng (PDB) để

thu hoạch sợi và các dịch chiết từ nấm, đồng thời nuôi trên môi trường rắn (PDA) để

thu bào tử Để sản xuất quy mô công nghiệp số lượng quả thể nấm C militaris hiện

nay các xưởng sản xuất sử dụng môi trường rắn chứa các cơ chất nhân tạo hoặc môi trường rắn chứa côn trùng Tuy nhiên, việc nuôi trên côn trùng rất tốn kém, do đó

hiện nay chủ yếu nuôi nấm trên môi trường có thành phần chính là gạo C militaris

sinh trưởng tốt nhất trên cơ chất sử dụng nguồn ngũ cốc bổ sung một số thành phần dinh dưỡng như carbohydrate, nitrogen, muối khoáng (K+, Mg2+, Ca2+) và vitamin (B1, B12) [32, 57]

Ảnh hưởng của điều kiên nuôi cấy:

Nhiệt độ tối ưu để C militaris sinh trưởng tốt nhất trong khoảng 20-25°C, pH

thích hợp trong khoảng 6-7 Nhiệt độ trên 25°C, quá trình sinh trưởng bị ức chế và năng suất quả thể giảm mạnh; ở nhiệt độ cao trên 30°C, quả thể nấm không thể hình thành Trong điều kiện chắn sáng, việc tạo quả thể cũng bị ức chế Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng dao động tùy từng chủng nấm, tuy nhiên trong khoảng 500-1000 lux được xem là điều kiện thích hợp nhất [36, 92,

101]

1.1.5 Giá trị dược liệu của C militaris

Theo kết quả điều tra của công ty Công nghệ Baoli Laoning (Trung Quốc) cho thấ y thực phẩm chức năng từ nấm có tiềm năng rất lớn tại Trung Quốc đạt doanh thu 70 tỷ nhân dân tệ, Nhật Bản đạt 3,6 tỷ USD năm 1990, Mỹ đạt 3,5 tỷ USD năm 1990

[109] Các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ nấm Cordyceps militaris

chiếm thị trường rất lớn trên thế giới [6] Loài nấm này là một thực phẩm bổ sung dinh dưỡng đáp ứng được các quy định của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược

phẩm Hoa Kỳ (FDA), vì vậy Cordyceps trở thành một sản phẩm được nhiều quốc gia tin dùng [114] C militaris có đặc tính hạ đường huyết, chống viêm, chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và bảo vệ miễn dịch Hiện nay C militaris

được coi là loài đứng thứ hai trong số các loài được thương mại hóa nhiều nhất ở Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc [25]

Hình 4 Các thành phần có hoạt tính sinh học ở C militaris [8]

Bảng 1 Hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong hệ sợi và quả

Cordycepin được phân lập từ C militaris vào năm 1950 Trong tự nhiên, hàm lượng cordycepin trong quả thể C militaris là 2,65 mg/g mg cao hơn C sinensis với

hàm lượng là 1,64 mg/g [63] Trên cơ sở các nghiên cứu được thực hiện cho đến nay, cordycepin đã được xác nhận có các hoạt động sau: kích thích miễn dịch, chống viêm, kháng virus, chống ung thư, ergogen, hạ đường huyết và điều hòa quá trình tạo steroid Một số nghiên cứu đã chứng minh hoạt động chống oxy hóa của cordycepin Hoạt tính chống oxy hóa đã được giải thích trong các nghiên cứu khoa học dựa trên

cơ chế hoạt động sinh học của các phân đoạn polysaccharide có trong quả thể C

militaris Các thí nghiệm được tiến hành trên loài gặm nhấm đã chứng minh rằng hoạt

động kích thích miễn dịch của cordycepin là kết quả của khả năng tạo ra phản ứng miễn dịch tế bào và thể dịch Các nghiên cứu cho thấy sự gia tăng nồng độ của các cytokine IL-4, IL-10 và IL-12, Th1 và Th2, sự giảm nồng độ IL-2 và yếu tố tăng trưởng biến đổi-β (TGF-β) và tăng mật độ tế bào lympho T (CD4 và CD8) Một trong những cơ chế hoạt động của cordycepin là bổ sung năng lượng “được sản xuất” dưới dạng phân tử adenosine-5′-triphosphate (ATP) Cordycepin cũng có thể làm tăng nồng độ oxit nitric (NO), có tác dụng làm giãn các mạch máu để thúc đẩy lưu thông máu, giảm huyết áp, ngăn ngừa bệnh tim, và tăng cường các chức năng não bộ Hoạt động chống ung thư chủ yếu là do khả năng của cordycepin trong việc gây ra apoptosis, ngăn chặn chu kỳ tế bào và giảm di căn Là một chất đối kháng nucleoside, cordycepin ức chế sự tổng hợp RNA và các con đường polymerase poly (ADP-ribose) giúp sửa chữa DNA bị hư hỏng Nhờ những đặc tính sinh học

tiềm năng này của cordycepin mà C militaris trở thành một trong những loài nấm

dược liệu có giá trị cao phục vụ chăm sóc sức khỏe [88, 106, 111]

Quá trình sinh tổng hợp cordycepin

Năm 2017, Xia và cộng sự đã xác định được một cụm gen chịu trách nhiệm

sinh tổng hợp cordycepin, được đặt tên từ CNS1- CNS4 Trong đó CNS1 và CNS2 là không thể thiếu cho quá trình sinh tổng hợp cordycepin, CNS3 chịu trách nhiệm sản

xuất pentostatin (2′-deoxycoformycin, một chất tương tự adenosine khác) ngăn cản

sự deamine hóa, CNS4 góp phần vào quá trình sinh tổng hợp pentostatin liên hợp để

bảo vệ cordycepin khỏi quá trình khử amin và đây là một cơ chế tự giải độc của cordycepin được sử dụng để điều chỉnh việc sản xuất cordycepin quá mức [115] Các

protein được mã hóa bởi bốn gen này có các miền bảo tồn khác nhau CNS1 chứa

miền oxidoreductase/dehydrogenase, CNS2 chứa miền phosphohydrolase phụ thuộc kim loại và thuộc họ protein HDc, CNS3 chứa nucleoside/nucleotide kinase (NK) ở đầu N và miền HisG ở đầu C, CNS4 được giả thuyết là 1 cấu trúc vận chuyển phụ thuộc ATP (cấu trúc vận chuyển ABC) Con đường sinh tổng hợp cordycepin ở C

militaris được thể hiện như sau: CNS3 xúc tác quá trình phosphoryl hóa hydroxyl ở

vị trí 3′-OH trên adenosine để tạo ra 3′-AMP (adenosine-3′-monophosphate); sau đó, 3′-AMP bị khử phospho thành 2′-carbonyl-3′-deoxyadenosine (2′-C-3′-dA) được xúc

tác bởi CNS2, và cuối cùng, 2′-C-3′-dA được chuyển thành xúc tác COR bởi enzyme oxyoreductase CNS1 [110]

Hình 5 Cơ chế sinh tổng hợp cordycepin [115]

 Enzym phân giải fibrin

Huyết khối hình thành trong tĩnh mạch là kết quả của sự kết tụ fibrin (sợi huyết) Máu đông bất thường hoặc quá nhiều có thể dẫn đến một số bệnh đe dọa đến sức khỏe và tính mạng như nhồi máu cơ tim, đột quỵ, huyết khối tĩnh mạch sâu hay thuyên tắc động mạch phổi [47] Các enzym tiêu sợi huyết như các chất hoạt hóa tissue-type plasminogen (t-PA), chất hoạt hóa urokinase-type plasminogen (u-PA)

hay streptokinase có nguồn gốc từ vi khuẩn, … có thể loại bỏ huyết khối với hiệu quả cao bằng cách phân hủy trực tiếp fibrin Mặc dù được sử dụng rộng rãi, các loại thuốc này mang tác dụng phụ không mong muốn như gây chảy máu liên tục do làm giảm sự tái tạo của fibrinogen và plasminoge, độ đặc hiệu với fibrin thấp và giá thành cao [61] Do đó các nghiên cứu nhằm tìm kiếm các enzym tan huyết khối mới từ các nguồn tự nhiên khác đang được thúc đẩy Nhiều enzym tiêu sợi huyết mới từ các nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và tảo đang quan tâm nghiên cứu Các vi sinh vật thể hiện một vai trò quan trọng trong việc sản xuất hàng loạt các enzym tiêu sợi huyết với độ đặc hiệu cao [41, 54]

Trong C militaris có mang một gen mã hóa enzym phân giải fibrin, một enzym

ngoại bào, có tiềm năng rất lớn để ứng dụng trong sản xuất thuốc làm tan huyết khối

Gen mã hóa cho enzym phân giải fibrin được đặt tên là CmFE CmFE có một khung

đọc mở dài 759 bp mã hóa cho một “tiền protein” gồm 252 axit amin [47] Trung tâm hoạt động chứa bộ ba xúc tác His41, Asp83, Ser177 và trình tự bảo thủ của motif

GDSGG CmFE chứa sáu cystein bảo thủ tạo thành ba liên kết disulfua Enzyme này

hoạt động ở phổ pH khá rộng, từ 2 đến 10 với pH tối ưu là 7,4 Nhiệt độ hoạt động của enzym từ 20C đến 50C, nhiệt độ tối ưu là 37C Khi có mặt các ion kim loại như ion Mg2+ và Fe2+ hoạt động của enzym tăng lên, trong khi EDTA và Cu2+ ức chế hoạt động của enzym [49]

Cơ chế hoạt động của enzym được chia làm 2 cách: các enzym tiêu sợi huyết có thể được nhóm lại thành các chất kích hoạt plasminogen và các protease giống plasmin Các chất kích hoạt plasminogen kích hoạt plasminogen thành plasmin, trong khi các protease giống plasmin có thể trực tiếp làm suy giảm cục máu đông fibrin [61]

 Polysaccharide

C militaris chứa nhiều loại thành phần polysaccharide khác nhau là nội bào

hoặc ngoại bào, trọng lượng phân tử lớn Quả thể chứa khoảng 3-8% polysaccharide, đại diện cho các đại phân tử có hoạt tính sinh học đa dạng về cấu trúc với các đặc tính

hóa lý rộng Các polysaccharide thu được từ các loài Cordyceps rất quan trọng về mặt

y học và có thể đóng vai trò là một trong những thành phần chính trong công thức thuốc Các polysaccharide có nguồn gốc từ nấm dược liệu ăn được đã được chứng minh là có đặc tính chống ung thư và điều hòa miễn dịch Những polysaccharide này có thể kiểm soát hiệu quả lượng đường trong máu trong cơ thể cho thấy tác dụng chống di căn và chống ung thư đồng thời cũng có tác dụng chống cúm, bảo vệ miễn dịch và chống oxy hóa [24, 73, 125] Polysaccharide là một trong những ứng cử viên thích hợp để liên kết các thụ thể nhận dạng cấu trúc và có thể thay đổi khả năng miễn

dịch [94] Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm C militaris

có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose và galactose Các nghiên cứ u đã chứng minh được rằng, hai loa ̣i polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol và tác du ̣ng này tăng lên khi tăng liều dùng Yan cho rằ ng tác du ̣ng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide [116]

 Các hợp chất có hoạt tính sinh học khác trong C militaris

Carotenoid chịu trách nhiệm tạo ra màu vàng cam đậm của quả thể C

militaris Các xanthophyll chính có trong quả thể của C militaris là β-carotene,

lycopene, lutein và zeaxanthin [70] Các báo cáo khoa học trước đây đã chỉ ra rằng việc bổ sung sắc tố carotenoid giúp cải thiện chức năng nhận thức, giảm mức độ cortisol và các triệu chứng căng thẳng ở người trẻ và người trưởng thành, đồng thời

tạo ra tác dụng chống oxy hóa Hàm lượng β-carotene và lycopene ở C militaris lần

lượt là 0,328 mg/g và 0,277 mg/g [45]

Tổng hàm lượng axit amin trong quả thể của C militaris là 57,39 mg/g trọng

lượng khô Các axit amin tiêu biểu như: GABA (Gamma aminobutyric acid) và ergothioneine [20] Các axit amin này giúp điều chỉnh giấc ngủ, trí nhớ và quá trình học tập cũng như các quá trình cảm xúc như lo lắng và căng thẳng GABA cũng cho thấy các hoạt động chống co giật và giãn cơ [15]

Một nhóm hợp chất phenolic quan trọng có trong nấm là axit phenolic và

flavonoid Nồng độ axit phenolic trong quả thể của C militaris cũng được phân tích Nồng độ flavonoid được xác định trong dịch chiết quả thể của C militaris với lượng

1,56 mg/g Chúng cho thấy hoạt động chống oxy hóa mà còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi-rút và chống viêm [45, 71]

Lectin, được phát hiện trong thể quả của C militaris dựa trên cấu trúc hóa học

của chúng, là các phân tử protein có gắn các đoạn saccharide (glycoprotein) Lectin đã được chứng minh là có hoạt tính phân bào [97]

Pentostatin được phân lập từ quả thể của loài được mô tả là một chất tương tự của hypoxanthine gốc purine Hợp chất này thể hiện hoạt động ức chế enzyme adenine deaminase, chống ung thư và ức chế miễn dịch Pentostatin đã được đăng ký là thuốc thuộc nhóm hóa trị liệu, được chỉ định trong điều trị ung thư tại các khoa

bệnh viện ung thư và huyết học Một nhóm hợp chất khác được tìm thấy ở C militaris

là beauveriolide thể hiện hoạt tính chống xơ vữa động mạch và khả năng làm giảm nồng độ β-amyloid và militarinone là một nhóm hợp chất hóa học ít được biết đến có hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào [22, 105]

Quả thể nấm C militaris là nguồn cung cấp lovastatin quý giá thuộc nhóm hợp

chất được gọi là statin, thường được sử dụng làm thuốc giảm cholesterol Nồng độ

lovastatin trong sợi nấm C militaris được xác định trong khoảng từ 37,7 mg/kg đến

57,3 mg/kg trọng lượng khô [23]

Quả thể của C militaris chứa các vitamin tan trong nước (vitamin B2, vitamin

B3 và vitamin C) và các vitamin tan trong chất béo (vitamin A và vitamin E) [20]

1.2 Một số phương pháp chuyển gen ở nấm sợi 1.2.1 Phương pháp chuyển gen bằng xung điện

Chuyển gen bằng xung điện là một phương pháp đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả đối với nấm sợi Ở phương pháp này, kích thích xung điện giúp axit nucleic ngoại lai được truyền vào trong tế bào Khi được đặt trong điện trường, cấu trúc màng tế bào thay đổi do có sự chênh lệch điện thế màng, dẫn tới hình thành các lỗ nhỏ trên màng tế bào Qua đó, các đại phân tử có mặt trong chất lỏng bảo quản tế bào, bao gồm axit nucleic ngoại lai, có thể được truyền vào tế bào thông qua các lỗ Hiện nay, chuyển gen bằng xung điện hiếm khi được sử dụng cho các nghiên cứu về nấm Mặc dù phương pháp có hiệu quả cao nhưng đòi hỏi cần phải có các thiết bị đắt tiền Ngoài

ra, cần phải tối ưu nhiều yếu tố như cường độ dòng điện, nồng độ axit nucleic và thành phần đệm [58]

1.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần (PMT)

Phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần là phương pháp chuyển gen được sử dụng phổ biến nhất ở nấm Phương pháp dựa trên nguyên tắc sử dụng một số enzym thương mại để loại bỏ thành tế bào của nấm và tạo ra các tế bào trần Sau đó, một số hợp chất hóa học (như PEG) được sử dụng để thúc đẩy sự hấp thu axit nucleic ngoại lai vào tế bào trần Nhìn chung, PMT được sử dụng rộng rãi trong chuyển gen ở nhiều loại nấm sợi Tuy nhiên, phương pháp này mang đến một số khó khăn như sự hạn chế về enzym phân hủy thành tế bào, hiệu suất chuyển gen thấp và chi phí cao Để có thể đạt được thành công trong quá trình biến nạp, điều kiện nuôi cấy, thành phần đệm và enzym phân giải thành tế bào cần phải được tối ưu cho từng loài [58]

1.2.3 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

(ATMT)

Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn Gram âm có mặt trong môi trường đất A tumefaciens thuộc ngành Proteobacteria, lớp Alphaproteobacteria, bộ Rhizobiales,

họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium [66] Vi khuẩn A tumefaciens có khả năng gây

ra khối u ở thực vật bằng cách chuyển một phần DNA của nó (T-DNA) cho vật chủ

[68] Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens

(ATMT) là phương pháp triển vọng giúp điều tra vai trò và tìm hiểu chức năng của gen ở sinh vật nhân thực, đặc biệt là nấm Phương pháp này được giới thiệu lần đầu

vào năm 1995 trên nấm men S cerevisiae và được ứng dụng lần đầu tiên trên nấm

sợi vào năm 1998 Trong những năm tiếp theo, ứng dụng của phương pháp ATMT ngày càng trở nên phổ biến và được áp dụng rộng rãi [31]

Hình 6 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dưới kính hiển vi

Hệ gen của A tumefaciens có cấu trúc phức tạp bao gồm một mega - plasmid

rất lớn kích thước khoảng hơn 200 kb được gọi là Ti - plasmid (tumor inducing – plasmid) Ti - plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, nhận biết những tế bào chủ bị thương, cắt và vận chuyển T-DNA (transfer – DNA) T-DNA là một phần của Ti – plasmid, được chuyển vào tế bào vật chủ T- DNA bị giới hạn bởi hai vùng, bờ trái và bờ phải (LB: left border và RB: right border) Các vùng này gồm một trình tự lặp lại dài 24 bp là trình tự nhận biết cho việc cắt T - DNA T-DNA mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp auxin và cytokinin, chịu trách nhiệm hình thành khối u và các gen mã hóa cho opine, giữ vai trò là nguồn dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn Ngoài ra, Ti – plasmid còn có vùng độc lực

vir với ít nhất 7 locus chính (virA, virB, virD, virE, virF và virG) Các protein virA và virG là các chất điều hòa hai thành phần kích hoạt sự biểu hiện của các gen vir khác trên Ti – plasmid VirB, virC, virE và có thể có cả virF tham gia vào quá trình

xử lý, chuyển giao và tích hợp T - DNA vào tế bào vật chủ

Hình 7 Cấu trúc của Ti – plasmid [80, 90]

 Cơ chế chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens:

Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào,

chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào vật chủ [79]

Hình 8 Cơ chế chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Chỉ có T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ

Quá trình dẫn truyền do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định

mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA [26] Tuy nhiên, chuỗi DNA 24 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp

các gen vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào vật chủ

Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền Trước

hết, quá trình chuyển gen bắt đầu bằng phức hợp Chv.VirA được nhận kích thích từ acetosyringone (AS) Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen

virG Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại Gen VirC có khả năng bám vào vùng “overdrive” ở bên ngoài cùng biên phải và kích thích

sản xuất sợi T (sợi đơn của T-DNA) Khi gen virD được hoạt hoá, sản phẩm của nó

cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi Ti-plasmid thành các sợi đơn Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi áp suất

thẩm thấu của màng tế bào, màng tế bào vật chủ bị mềm ra và bị thủng Các sợi đơn

T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn VirF giúp bảo vệ T-DNA khi nó di chuyển trong tế bào đích, ức chế sự

phân hủy T-DNA của nuclease T-DNA được vận chuyển đến mục tiêu đích là nhân của tế bào chủ và được tích hợp ngẫu nhiên vào bộ gen [35, 120]

Không chỉ được áp dụng trên C militaris, phương pháp này còn áp dụng được

trên nhiều loài nấm sợi khác nhau và trở thành một công cụ hữu ích trong thí nghiệm

đột biến gen đích [31] Cơ chế chuyển gen của A tumefaciens đóng một vai trò quan

trọng trong việc tạo ra các thể biến nạp Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển

gen như chủng Agrobacterium, chủng nấm sử dụng, nồng độ acetosyringone, điều kiện

đồng nuôi cấy, nồng độ bào tử, Mỗi loài nấm khác nhau đòi hỏi các thông số tối ưu khác nhau để đạt được hiệu suất chuyển gen cao nhất Nói chung, phương pháp ATMT cho hiệu suất cao và ít tốn kém Phương pháp áp dụng được trên nhiều loài nấm sợi khác nhau và trở thành một công cụ hữu ích trong thí nghiệm đột biến gen đích Bên cạnh đó phương pháp ATMT còn thúc đẩy quá trình tái tổ hợp tương đồng và làm tăng hiệu suất xóa gen từ 3-6 lần so với phương pháp chuyển gen thông tế bào trần ở nấm sợi [68]

1.3 Marker chọn lọc dùng cho chuyển gen ở nấm

Marker chọn lọc là các gen mang đặc điểm thích hợp được đưa vào tế bào nhằm mục đích chọn lọc thể đột biến Chúng giúp nhận biết gen được quan tâm đã được đưa vào tế bào chủ hay chưa Các thí nghiệm chuyển gen sử dụng phương pháp ATMT chủ yếu sử dụng hai loại marker chọn lọc phổ biến: gen dinh dưỡng và gen kháng kháng sinh

Marker là gen kháng kháng sinh:

Kháng sinh là các chất có thể ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm Mỗi loại nấm sẽ có khả năng mẫn cảm với những loại kháng sinh và nồng độ kháng sinh nhất định Một số loại kháng sinh thường dùng trong chuyển gen đó là hygromycin B, nourseothricin, phleomycin…

Hygromycin B là kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, được tổng hợp bởi

xạ khuẩn Streptomyces hygroscopycus, gây ức chế quá trình dịch mã bằng cách cố

định phức hệ tRNA - ribosomal Vì thế, chúng có vai trò tiêu diệt vi khuẩn, nấm và các tế bào nhân chuẩn Gen kháng hygromycin B mã hóa hygromycin B phosphotransferases (hph), có tác dụng bất hoạt chất kháng sinh này nhờ quá trình phosphoryl hóa Vì thế, nếu nấm nhận được gen này thì chúng sẽ có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường bổ sung kháng sinh hygromycin Hiện nay, chuyển gen

ở C militaris nhờ ATMT với marker kháng hygromycin B đã được nghiên cứu, tuy

nhiên hiệu suất chuyển gen nhận được khá thấp, vào khoảng 30 – 600 thể chuyển gen/ 105 bào tử [86, 87, 123]

Nourseothricin, có tên thương mại là clonNAT, có nguồn gốc từ một số loài

xạ khuẩn của chi Streptomyces Kháng sinh này hoạt động bằng cách gây ra lỗi mã

hóa trong quá trình dịch mà, dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein

Nourseothricin N - acetyl tranferase (NAT) được tổng hợp ở Streptomyces noursei,

là một enzym xúc tác phản ứng acetyl hóa nhóm β - amino trong nhóm β - lysine làm bất hoạt kháng sinh nourseothricin [117]

Phleomycin là kháng sinh thuộc nhóm glycopeptide, có khả năng bám vào DNA và phá vỡ cấu trúc xoắn kép làm chết tế bào Kháng sinh này được phát hiện ở

xạ khuẩn Streptomyces verticillus, có hiệu quả chống lại hầu hết các loại vi khuẩn,

nấm và tế bào động, thực vật Gen kháng phleomycin được phân lập từ

Streptoalloteichus hindustanus và E coli, mã hóa cho protein có khả năng bám vào

phleomycin và bất hoạt nó [98]

Marker là gen trợ dưỡng:

Gen trợ dưỡng đóng vai trò giúp sinh vật tổng hợp hợp chất cần thiết cho sự sinh trưởng như amino axit, nucleotide, vitamin, Những sinh vật bị đột biến gây mất hay gây hỏng gen trợ dưỡng sẽ không thể sinh trưởng trên môi trường tối thiểu hay môi trường thiếu chất dinh dưỡng tương ứng Một số gen thường được sử dụng

làm marker trợ dưỡng như pyrG (mã hóa protein tham gia quá trình tổng hợp uridine/uracil), adeA (gen mã hóa enzym tham gia tổng hợp adenine), met (gen mã

hóa enzym tham gia tổng hợp methionine), trpC (gen mã hóa enzym tham gia quá trình tổng hợp tryptophan), argB (gen mã hóa enzym tham gia quá trình tổng hợp

arginine),…[43]

Gen pyrG mã hóa orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP

decarboxylase) cần cho sinh tổng hợp uridine (tiền chất của pyrimidine uracil) Các

chủng đột biến mất hoặc hỏng gen pyrG sẽ không thể sinh trưởng trên môi trường tối

thiểu không bổ sung uridine/uracil Việc bổ sung uridine và uracil vào môi trường là yếu tố cần thiết để nuôi cấy các chủng nấm khuyết dưỡng Ngoài ra, các chủng đột

biến pyrG có thể được chọn lọc nhờ đặc tính kháng axit 5-fluoroorotic (5-FOA) Ở

dạng nguyên bản hợp chất này không gây độc cho tế bào, tuy nhiên enzym OMP decarboxylase được tiết ra bởi các chủng nấm nguyên dưỡng sẽ chuyển hóa hợp chất 5- FOA thành một chất gây độc là 5-flourouracil và ức chế sự sinh trưởng của nấm

Chỉ các chủng bị hỏng hoặc mất gen pyrG, không có khả năng tiết ra enzym OMP

mới có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường bổ sung 5-FOA Kết hợp cả hai yếu tố là bổ sung uridine/uracil và 5-FOA giúp sàng lọc dễ dàng thể chuyển gen sử

dụng marker trợ dưỡng pyrG [107]

Hiện nay các nghiên cứu chuyển gen trên C militaris vẫn chủ yếu sử dụng

marker là gen kháng kháng sinh hoặc gen kháng chất diệt cỏ, điều này tiềm ẩn nhiều nguy cơ phát tán gen kháng kháng sinh ra môi trường và tình trạng đa kháng do truyền chéo, không đáp ứng được các tiêu chuẩn về an toàn trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm Do đó, chủng tái tổ hợp được tạo ra nhờ sử dụng vector mang gen trợ dưỡng

pyrG sẽ có tiềm năng cao để ứng dụng vào thực tiễn, đồng thời giúp loại bỏ việc sử

dụng các gen kháng thuốc

1.4 Một số promoter điều hòa biểu hiện gen ở nấm sợi

Các protein điều hòa còn gọi là yếu tố điều hòa (transcription factors, viết tắt là TFs) là các protein có khả năng liên kết với phân tử DNA tại các trình tự điều hòa

cis (cis-regulatory sequences, CRS) của gen đích Liên kết TF-CRS ngăn chặn hoặc

thúc đẩy quá trình phiên mã nhờ RNA polymerase Việc sửa đổi trình tự, bất hoạt, hoặc biểu hiện quá mức gen mã hóa protein điều hòa nhằm đánh giá chức năng của

các protein này có thể giúp làm sáng tỏ các cơ chế kiểm soát điều hòa biểu hiện gen

ở nấm sợi trong đó có C militaris [83] Có hai loại promoter là promoter không đặc

hiệu và promoter đặc hiệu Promoter không đặc hiệu tham gia điều khiển hoạt động của gen ở hầu như tất cả các loại mô, ở tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của sinh vật Promoter đặc hiệu quy định biểu hiện đặc hiệu của gen ở một hoặc một vài loại mô và ở một hoặc một vài giai đoạn phát triển, bao gồm promoter đặc hiệu tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển [3]

Gen rpb1 chứa thông tin mã hóa cho một protein tiểu đơn vị lớn nhất của

RNA polymerase II (gọi tắt là Pol II) Phần quan trọng của protein này là miền cuối cùng gọi là carboxy (CTD) đóng vai trò trung tâm trong việc điều hòa quá trình phiên mã [17, 28] CTD bao gồm một chuỗi heptapeptide được lặp lại nhiều lần, với số lần lặp lại khác nhau ở các loài, ví dụ như 26 lần ở nấm men và 52 lần ở người cũng như chuột, nó có vai trò thúc đẩy trong hoạt động của Pol II khi chuyển từ giai đoạn khởi đầu sang giai đoạn kéo dài Ngoài ra, vùng này cũng được cho là liên quan đến quá trình tăng cường phiên mã [78] Kết quả từ các thí

nghiệm đột biến rpb1 cho thấy rằng các thay đổi này có thể tác động lên độ chính

xác của việc chọn vị trí bắt đầu phiên mã [39]

Gen gpd1 mã hóa glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase – một enzym

có kích thước khoảng 37 kDa xúc tác bước thứ sáu của quá trình đường phân giúp quá trình phân hủy glucose Enzym này có vai trò quan trọng trong quá trình dị hóa của tế bào, tạo ra năng lượng ATP thông qua phản ứng phân giải NADH thành NAD+ và H+ [37] Sự biểu hiện của gen gpd ở Saccharomyces cerevisiae,

Aspergillus nidulans và các sinh vật nhân thực khác là rất cao, chiếm tới 5%

protein hòa tan trong tế bào, mRNA do gpd mã hóa cũng chiếm từ 2-5% tổng số mRNA ở nấm men [40] Sự phong phú của protein và mRNA từ gen gpd gợi ý

rằng gen này được điều hòa bởi một promoter biểu hiện mạnh [37]

Promoter Tef1 (translation elongation factor 1) được biết đến là một trong những protein hòa tan dồi dào nhất trong tế bào nhân thực Tef1 là một trong những

protein phong phú và bảo thủ nhất, chiếm 1-3% tổng số protein hòa tan của tế bào

Chức năng cổ điển của Tef1 có liên quan đến sự kéo dài chuỗi peptit nơi nó cung

cấp aminoacyl-tRNA tích điện đến vị trí ribosome A, theo cách phụ thuộc GTP

Dựa trên mức độ biểu hiện cao của nó, vùng promoter của Tef1 đã được sử dụng

để thúc đẩy sự biểu hiện của các protein cùng nguồn và khác nguồn ở nấm sợi,

nấm men Ở nấm sợi Aspergillus oryzae, Tef1 đã chứng minh là promoter có hoạt

động mạnh và đã được ứng dụng trong kích hoạt tăng cường biểu hiện các gen mã hóa enzym polygalacturonase [50] Do đó vùng promoter của gen này có thể có

khả năng kích hoạt tăng cường biểu hiện gen mạnh ở C militaris

1.5 Gen chỉ thị GFP và DsRed dùng trong chuyển gen ở nấm sợi

Các gen chỉ thị mã hóa protein phát huỳnh quang thường được sử dụng trong đánh giá hiệu quả chuyển gen hoặc dùng làm dấu hiệu sàng lọc các thể chuyển gen Sự có mặt của gen chỉ thị mã hóa protein huỳnh quang khiến các tế bào nấm có khả năng sinh tổng hợp các protein này và giúp chúng phát ra tín hiệu huỳnh quang đỏ

(gen DsRed) và màu xanh (gen GFP) dưới bước sóng ánh sáng thích hợp Khả năng

phát huỳnh quang sẽ giúp dễ dàng sàng lọc được các chủng đã chuyển gen thành công với chủng chưa nhận được gen cần chuyển Vì vậy, gen chỉ thị huỳnh quang rất hữu ích trong việc nghiên cứu xác định vị trí của protein hoặc đánh giá mức độ biểu hiện của gen Đồng thời, gen chỉ thị không gây ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như khả năng sinh trưởng của các thể chuyển gen và có thể được gắn liền với gen đích dưới sự biểu hiện của cùng một promoter [10]

Gen GFP có chiều dài 720 bp được phân lập lần đầu tiên vào năm 1962 từ một loài sứa có tên là Aequorea victoria Gen GFP đã được biểu hiện ở nhiều loài bao

gồm cả sinh vật nhân sơ, sinh vật nhân thực, đặc biệt ở nấm, gen này thường được sử dụng làm gen chỉ thị trong chuyển gen và biểu hiện gen [64] Protein GFP phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh lá mạnh nhất dưới sự kích thích của ánh sáng có bước

sóng 509 nm Vì có khả năng phát huỳnh quang như vậy nên gen GFP được sử dụng làm gen chỉ thị trong các nghiên cứu chuyển gen và biểu hiện gen Gen GFP đã được biểu hiện thành công ở nhiều loại nấm sợi như Aspergillus niger, Aspergillus

fumigatus và Aspergillus oryzae [72, 95]

Gen DsRed có kích thước 678 bp được phân lập từ một loài san hô thuộc chi

Discosoma Gen DsRed được đưa vào tế bào thông qua các kỹ thuật chuyển gen và

thường được sử dụng như một gen chỉ thị trong chuyển gen và biểu hiện gen Sự tích

hợp của gen DsRed vào hệ gen của tế bào bền vững qua các thế hệ Protein DsRed

phát huỳnh quang màu đỏ tươi dưới sự kích thích của ánh sáng có bước sóng 583 nm [13]

Hình 9 Gen phát huỳnh quang được biểu hiện ở nấm sợi [77] (A) Gen DsRed được biểu hiện ở nấm sợi A oryzae (B) Gen GFP được biểu hiện

ở nấm sợi A oryzae.

1.6 Tình hình nghiên cứu cải biến di truyền ở C militaris

Hiện nay, hướng nghiên cứu liên quan đến chỉnh sửa gen nhằm tăng cường

biểu hiện các chất có hoạt tính sinh học ở C militaris được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm Năm 2011, phương pháp ATMT được thực hiện lần đầu tiên trên C

militaris bởi Zheng và cộng sự, nghiên cứu đã xây dựng thành công một thư viện đột

biến, từ đó xác định được các gen liên quan đến sự thoái hóa quá trình hình thành quả

A

B

thể [123] Năm 2013, phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần đã được

Rachmawati và cộng sự áp dụng để chuyển thành công gen laeA dưới sự kiểm soát của promoter pGPD vào C militaris sử dụng marker là gen kháng benomyl [89] Năm 2018, hệ thống CRISPR-Cas9 lần đầu tiên được áp dụng thành công trên C

militaris bằng cách sử dụng Cas9 được tối ưu hóa codon (codon-optimized cas9) Hệ

thống có tiềm năng tạo ra một công cụ hiệu quả để xóa và chèn gen theo vị trí cụ thể, tuy nhiên phương pháp này yêu cầu chi phí cao, đòi hỏi kỹ thuật nên chưa được áp dụng rộng rãi [21]

Mặc dù nấm C militaris đã được nuôi trồng khá phổ biến ở nước ta trong những năm gần đây, nhưng cho đến này mới chỉ có một số ít nghiên cứu về C

militaris được thực hiện Các nghiên cứu này vẫn chủ yếu tập trung vào điều tra, đánh

giá điều kiện tối ưu cho nuôi trồng quả thể nấm, và xác định hoạt chất cordycepin từ sinh khối nấm [6] Chỉ có một số ít các nghiên cứu chuyên sâu về mức độ phân tử xác

định năng suất và hàm lượng cordycepin, gen giới tính MAT liên quan đến vấn đề thoái hóa giống của một số chủng nấm dược liệu Cordyceps militaris đang được nuôi

trồng tại Việt Nam [5] Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm góp phần phát triển hệ thống biểu hiện enzym/protein tái tổ hợp với hiệu suất cao ở nấm dược liệu

C militaris và đây cũng là xu hướng, trọng tâm của các nghiên cứu, có nhiều triển

vọng ứng dụng

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật và vector sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 2

Bảng 2 Các chủng vi sinh vật và các vector sử dụng trong nghiên cứu

1 Agrobacterium tumefaciens AGL1

Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội 2 Escherichia coli DH5α

3

Cordyceps militaris: NBRC

1009787 (N9787); C militaris NBRC 100741 (N19); C militaris H8; C militaris G4; C militaris G2;

N19ΔpyrG; C militaris H8ΔpyrG

Được tạo trong nghiên cứu này 6 pEX2-Tef1

7 CmpyrG - Tef1- DsRed

8 pEX2-Tef1 – CNS2

9 CmpyrG- Tef1 – CNS2

2.2 Thiết bị và hóa chất

Các trang thiết bị và hóa chất dùng trong các thí nghiệm được sử dụng tại Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Máy chuyển gen bằng xung điện Bio-Rad Mỹ

Kính hiển vi quang học Kruss Đức

Máy ly tâm lạnh Eppendorf Đức

Máy ly tâm thường Hettich Đức

Thiết bị khuấy từ IKA RET basic Đức Tủ giữ mẫu -30oC Sanyo Nhật Bản Tủ cấy vi sinh an toàn cấp 2 Nuaire Mỹ

Hóa chất

Các hóa chất dùng trong nuôi cấy vi sinh vật trong quá trình thực hiện các thí nghiệm được mua từ các hãng Biobasic, Himedia Các hóa chất và enzym dùng cho các thí nghiệm sinh học phân tử như agarose, ethanol tuyệt đối, isopropanol, RNase A, PhusionTM high-fidelity DNA polymerase, GoTaq® Green Mastermix, dNTPs, enzym giới hạn, kháng sinh, … được đặt mua từ các hãng uy tín Sigma, Thermo Scientific, Merck, Promega, Biobasic Kit PureHelix™ Gel Extraction giúp tinh sạch DNA từ gel agarose, kit PureHelix™ Total RNA Purification giúp tách chiết RNA tổng số được mua từ hãng NanoHelix, Hàn Quốc Kit SensiFAST™ cDNA Synthesis (Bioline, UK)

2.3 Môi trường nuôi cấy

Thành phần của các môi trường dùng cho nuôi cấy và chuyển gen:

Môi trường LB (Luria Bertani): nuôi vi khuẩn (1% peptone; 0,5% cao nấm men;

0,5% NaCl)

Môi trường Czapek Dox Agar (CD): nuôi, sàng lọc các chủng nấm sợi (3%

sucrose; 0,3% NaNO3; 0,1% KH2PO4; 0,05% KCl; 0,05% MgSO4.7H2O; 0,001% FeSO4.7H2O; 0,005% CuSO4.5H2O; 0,001% ZnSO4.7H2O; 2% agar; pH 5,5)

Môi trường CD + 0,1% uridine + 0,1% uracil: môi trường CD bổ sung thêm

0.1% uracil và 0.1% uridine

Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA): nuôi và thu bào tử các chủng nấm

sợi (2% glucose; 0,4% bột chiết xuất khoai tây; 2% agar)

Môi trường induction medium (IM) [16] - lỏng: cảm ứng (4 ml

2-(Nmorpholino)ethanesulfonic acid (MES) 1M; 40 ml MM salts 2,5X; 0,18 g46 glucose; 0,5 ml glycerol; 100 ml nước cất)

Dung dịch MM salts bao gồm 2,05g K2HPO4.3H2O; 1,45g KH2PO4; 0,15g NaCl; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,1g CaCl2.6H2O; 0,5g (NH4)2SO4; 0,0025g FeSO4.7H2O, 1000 ml nước cất dung dịch MES 1M gồm: 195,2 g/l MES pH = 5,3

Môi trường IM rắn + 0,01% uridine + 0,01% uracil: đồng nuôi cấy bào tử

nấm và vi khuẩn (4 ml MES 1M; 40 ml MM salts 2,5X; 0,09 g glucose; 0,5 ml glycerol; 1,5 g agar; 100 ml nước cất [16] – bổ sung thêm 0,01% uracil; 0,01% g uridine

Môi trường thạch + 1% sữa gầy: agar (2 g), sữa gầy (1g), bổ sung nước cất

tới 100 ml

2.4 Các mồi dùng cho PCR

Các cặp mồi (Bảng 3) được thiết kế bằng phần mềm Primer3 (https://primer3.ut.ee) Trình tự các cặp mồi được tổng hợp bởi Công ty Sinh hóa Phù Sa (Việt Nam) Mồi được pha trong nước khử ion vô trùng đến nồng độ sử dụng là 10 pmol/μl

Bảng 3 Danh sách các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

phẩm (kb)

0,550 [113]

0,457 [46] MAT1-1-1-R ATATACCTTCGCGATCATTGCCCAG

MAT1-2-1-F TGTTTTGT CGCGATGGTTCTGG

0,368 [46] MAT1-2-1-R CCTCTGGAGGTTCTGCATTCCA

CmpyrG-F(EcoRI) GGGGAATTCTGCCCACTGCATCATC

CT

Các chủng xóa gen lên băng 2,238 kb Chủng tự nhiên lên băng

2,622 kb

CmpyrG-R(HindIII) GGGAAGCTTGGCAACGTGAAGAAC

GATTT

0,899 AopyrG-orf-R TATTGCGCACCAACACG

CmFE-ORF-F (PmlI) GGGCACGTGATGAGAAACCAAC

TCGCCCTC

0,759 CmFE-ORF-R

(BamHI):

GGGGGATCCTCATCGATGCTGCGTG

CGG RT-Cmgpd1-F: CTCAGAACATCATCCCCTCCAG

0,148 RT-Cmgpd1-R: GCCTTCTCAAGACGAACAGTCA

RT-Cmrpb1-F: GACGGTGATGAGATGAACTTGC

0,151 RT-Cmrpb1-R: TGTAGCAACCAGCCAGAGAGTC

RT-CmBtub-F: GATCCCCAACAACATCCAGAAC

0,193 RT-CmBtub-R: GAACTCCATCTCGTCCATACCC