Đang tải... (xem toàn văn)
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA cổng nghệ sinh học KHÓA LUẬN TÓT nghiệp ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIỀU CẦU, DỊCH CHIẾT NGUYÊN BÀO SỢI ĐÉN KHẢ NÀNG TĂNG SINH VÀ DI cư CỦA TẾ BÀO GỐC BIÉU.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA cổng nghệ sinh học - KHÓA LUẬN TÓT nghiệp ĐÈ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIỀU CẦU, DỊCH CHIẾT NGUYÊN BÀO SỢI ĐÉN KHẢ NÀNG TĂNG SINH VÀ DI cư CỦA TẾ BÀO GỐC BIÉU MÔ MÀNG ÓI Giáo viên hướng dần : TS Đỗ Minh Trung Sinh viên thực : Nguyễn Văn Cường Lớp : YD.13 MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIÉT TẢT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BIẾU ĐỊ DẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Huyết tương giàu tiếu cầu 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cấu tạo chức tiêu cầu 1.1.2.1 Đặc điểm chức tiểu cầu 1.1.2.2 Tiều cầu trình làm lành vết thương 1.1.3 ửng dụng PRP điều trị 1.2 Nguyên bào sợi vai trò nguyên bào sợi liền vết thương 11 1.3 Te bào gốc tế bào gốc màng ối 13 1.3.1 Te bào gốc 13 1.3.2 Te bào gốc từ màng ối 16 1.3.3 ửng dụng TBG màng ối 19 PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tương nghiên cứu: 21 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, vật tư tiêu hao thiết bị nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.2 Báo quàn tế bào 23 2.2.3 Giải đông tế bào 23 2.2.4 Xác định mật độ tế bào 23 2.2.5 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu 24 2.2.6 Nuôi cấy chuẩn bị dịch chiết nguyên bào sợi 24 2.2.7 Phản ứng MTT đánh giá khả tăng sinh TBG biếu mô màng ối 24 PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết nuôi cấy tăng sinh TBG biểu mô màng ối 27 3.2 Ket quâ đánh giá tác dụng cùa PRP TBG biếu mô màng ối 29 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng PRP đến khả sinh thông qua số lượng TBG màng ối 29 3.2.2 Ket đo phàn ứng MTT đánh giá tác dụng PRP đến khả tăng sinh TBG màng ối 33 3.2.3 Ket quă đánh giá tác dụng PRP đến khả di cư cùa TBG biểu mô màng ối vết thương in vitro 37 3.3 Ket đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sợi TBG biếu mô màng ối 40 3.3.1 Kct đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sợi đến sinh thông qua số lượng TBG màng ối 40 3.3.2 Kết quà đo phản ứng MTT đánh giá tác dụng cúa dịch chiết nguyên bào sợi đến tăng sinh cúa TBG biếu mô màng ối 43 3.4 Kết quă so sánh đánh giá tác dụng PRP dịch chiết nguyên bào sợi TBG màng ối 47 KÉT LUẬN 51 KIÉN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BMNC DC DMEM DMSO ECGF EGF FBS FGF-2 PBS PDAF Be mặt nhãn cầu Đối chứng Dulbecco-Modifed Eagle Medium Dimethyl sulfoxide Epithelial Cell Growth Factor Yếu tố tăng trưởng tế bào biểu mô Epidermal growth factor Yếu tố tăng trường biểu bì Fetal bovine serum (Huyết bào thai bò) Fibroblast Growth Factor-2 Yeu to tăng trường nguyên bào sợi-2 Phosphate buffered saline (Dung dịch đệm photphat) Platelet-Derived Angiogenesis Factor Yếu tổ tăng sinh mạch nguồn gốc tiểu cầu PDEGF Platelet-Derivedendothelial Growth Factor Ycu tố tăng trướng nội mô nguồn gốc tiêu cầu PDGF PF4 PRP GM IGF Platelet-derived growth factor Platelet factor (Ycu tố tiểu cầu) Platelet Rich Plasma (Huyết tương giàu tiểu cầu) Giác mạc Insulin-Like Growth Factor Yếu tố tăng trướng giống Insulin KGF Keratinocyte Growth Factor Yếu tố tăng trướng keratinocyte MTT [3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] Tế bào gốc TBG TGF-P TSP-Í VEGF Transforming growth factorbeta Thrombospondin-1 Vascular endothelial growth factor Ycu tố tăng trưởng nội mô mạch máu DANH MỤC BẢNG Báng 3.1: số lượng tế bào sau 48 tiếp xúc PRP (n=8) .29 Bàng 3.2: số lượng tiling binh TBG màng ối tiếp xúc với PRP tỷ lệ pha loãng khác (n=8) .31 Bảng 3.3: Ket phân ứng MTT tế bào tiếp xúc PRP (n=8) 34 Bảng 3.4: Bàng giá trị OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế bào sau 48 nuôi cấy bổ sung với PRP (n=8) 36 Báng 3.5: số lượng TBG màng ối giếng nuôi cấy sau cho PRP tiếp xúc với vết thương in vitro (n=3) 38 Bâng 3.6: số lượng TBG màng ối sau 48 nuôi cấy bồ sung với dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 40 Báng 3.7: Bàng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết tỳ lệ pha loãng khác (n=8) .42 Báng 3.8: Kết phản ứng MTT tế bào tiếp xúc Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 44 Bảng 3.9: Bàng giá trị OD trung bình phản ứng MTT cúa mẫu tế bào sau 48 tiếp xúc với Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 46 Bàng 3.10: Báng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với mẫu PRP mẫu dịch chiết tý lệ pha loãng khác 47 Bâng 3.11: Kết giá trị OD trung bình cúa phản ứng MTT cúa TBG àng ối sau tiếp xúc PRP dịch nuôi cấy 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Tỷ lệ tế bào máu huyết tương giàu tiểu cầu Hình 1.2: cấu trúc tiếp cầu (Theo Neumuller) Hình 1.3: Nguồn gốc thu nhận TBG tiềm biệt hóa chúng tương ứng với giai đoạn phát triển cua 15 Hình 1.4: Bánh màng ối 17 Hình 2.1: Một số thiết bị nghiên cứu 22 Hình 3.1: Hình ảnh kết q ni cấy tăng sinh TBG từ màng ối 27 Hình 3.2: Hình ảnh TBG Biểu mơ màng ổi sau nhuộm gicmsa - 200X 28 Hình 3.3: Hình ảnh mật độ TBG biếu mô màng ối tạo tinh the formazan sau bổ sung MTT 33 Hình 3.4 vết rạch di cư cùa TBG biếu mơ màng ối 38 Hình 3.5: Hình ảnh TBG biểu mơ màng ối tạo tinh the Formazan sau bồ sung MTT 43 DANH MỤC BIẾU ĐÒ Biểu đồ 3.1: Kết sổ lượng TBG màng ối sau 48 tiếp xúc PRP 30 Biểu đồ 3.2: Số lượng trung binh TBG màng ối tiếp xúc với mẫu PRP tỷ lệ pha loãng khác 31 Biếu đồ 3: Kết đo OD phán úng MTT mầu TBG màng ối sau 48 nuôi cấy bổ sung PRP 35 Biếu đồ 3.4: Biếu đồ kết đo OD trung binh phán ứng MTT cùa mẫu tế bào sau 48 tiếp xúc PRP 36 Bicu đồ 3.5: Kết quà số lượng TBG màng ối sau 48 nuôi cấy bố sung với dịch chiết nguyên bào sợi 41 Biểu đồ 3.6: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết nguyên bào sợi tý lệ pha loãng khác 42 Biếu đồ 3.7:Kết quà đo OD phản ứng MTT mẫu TBG màng ối sau 48 tiếp xúc dịch chiết nguyên bào sợi 45 Biếu đồ 3.8: Giá trị kết đo OD trung bình phản ứng MTT TBG màng ối sau 48 tiếp xúc với dịch chiết nguyên bào sợi 46 Biếu đồ 3.9: Giá trị tiling bình số lượng tế bào sau tiếp xúc với PRP dịch nuôi cấy 47 Biếu đồ 3.10: Giá trị kết đo OD trung binh phán ứng MTT mầu tế bào sau 48 tiếp xúc với PRP dịch chiết nguyên bào sợi 48 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung DẬT VẤN ĐÈ Da quan lớn cùa thể, có vai trò bảo vệ thể trước tác động với mơi trường xung quanh, vết thương khó lành, vết thương mạn tính lt bàn chân đái tháo đường, loét tỳ đè, loét chi có xu hướng ngày gia tăng, làm ánh hường đến chất lượng sống gây nguy Cụ thể Mỹ với 260 triệu dân thi hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang vết thương mạn tính Riêng Đức có khống triệu người bị loét chi phí điều trị lên tới tỷ Euro Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn bịng [3], Có nhiều phương pháp điều trị chưa thực hiệu cao Những nghiên cứu gần cho thấy ứng dụng tế bào tế bào gốc, nguyên bào sợi, sản phẩm từ tế bào huyết tương giàu tiểu cầu có nhiều ưu điếm tiềm điều trị lớn đặc biệt điều trị vết thương vết bỏng, vết thương mạn tính lâu liền Te bào gốc (stem cells) tế bào chưa có chức chuyên biệt biệt hóa thành số loại tế bào khác Tế bào gốc nghiên cứu ứng dụng điều trị cho số bệnh thoái hoá khớp, chấn thương tế bào, chấn thương tuý sống, tổn thương mô bệnh tiếu đường, bóng nhiều bệnh khác Trong đó, tể bào gốc biếu mơ biệt hóa thành tế bào biếu mô, tế bào tham gia vào q trình liền vết thương di cư đến vùng tổn thương để thực nhiều khâu pha tăng sinh cùa trình liền vết thương, chúng bao quanh da, mặt cấu trúc rồng ruột, đường hô hấp Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) ghi nhận liệu pháp tiên tiến việc phục hồi chấn thương cấp tính mạn tính, sử dụng điều trị, sửa chừa, tái tạo mô thề thơng qua nhiều chế khác Đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng huyết tương giàu tiếu cầu, phát nuôi cấy tê bào có mặt huyết tương giàu tiểu SVTH: Nguyễn Văn Cường Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung cầu nồng độ nhân tố tăng trưởng cytokine cao nhiều lần so với trình ni cấy thơng thường Điều cho thấy huyết tương giàu tiếu cầu có khả kích thích tái tạo mơ lành hóa vết thương Ngun bào sợi (fibroblasts) tế bào tham gia vào trình làm lành vết thương, chúng tạo thành phần đệm gian bào làm cho trinh biểu mơ hố đe tế bào biểu mơ bám trượt giúp tăng nhanh trinh biếu mơ hố che phú vết thương Trong q trình sinh trướng phát triển nguyên bào sợi tiết môi trường thành phần ngoại tiết TGF-pi, PDGF,KGF, protein chất gồm collagen, fibronectin hyaluronan thúc đay liền vết thương in vitro thực nghiệm [6], Nhờ đặc điểm này, nguyên bào sợi sản phẩm nguyên bào sợi nghiên cứu ứng dụng điều trị số vết thương mạn tính lâu liền Sự tăng sinh di cư cúa tế bào tượng có lợi việc điều trị vết thương làm lành da, việc nghiên cứu tác động yếu tố PRP, dịch chiết nguyên bào sợi tới tế bào gốc biểu mô loại tế bào nằm da biệt hóa thành tế bào tạo nên cấu trúc da trình liền vết thương cho ta định hướng rõ rệt việc ứng dụng chế phẩm đế điều trị vết thương Xuất phát từ sờ khoa học tiềm ímg dụng cùa tế bào, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu đánh giá huyết tương giàu tiếu cầu, dịch chiết nguyên bào sợi den khả tăng sinh di cư tế bào gốc biếu mô màng ối” với mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: 1: Ni cấy tăng sinh dịng TBG biểu mơ từ màng ối 2: Đánh giá tác dụng huyết tương giàu tiếu cầu, dịch chiết nguyên bào sợi đến tăng sình lien vết thương in vitro TBG biếu mô màng ối SVTH: Nguyễn Văn Cường Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung PHẦN 1: TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Huyết tuông giàu tiếu cầu 1.1.1 Định nghĩa Huyết tương giàu tiếu cầu (Platelet rich plasma - PRP) chế phẩm chiết xuất từ máu toàn phần Chế phẩm bao gồm lượng huyết tương nhỏ có độ tập trung tiếu cầu cao Bình thường số lượng tiểu cầu máu khoáng từ 140,000 đến 400,000 tiếu cầu/pl máu (trung bình 200,000), số lượng tiều cầu PRP cao gấp nhiều lần, từ 2- lần, so với mức trung bình [29,34], Hình 1.1: Tỷ lệ tế hào máu huyết tương giàu tiểu cầu (a: tỷ lệ tế bào cục máu đông; b: tỷ lệ tế bào PRP) [16], Máu tổ chức tạo thành từ chất dịch yếu tố hữu hình Chất dịch bán cùa máu gọi huyết tương (plasma), thành phần lơ lững huyết tương, gồm loại hồng cầu (erythrocytes); bạch cầu (leukocytes) tiểu cầu (platelets) Hồng cầu chiếm khoảng 94% thành phần tế bào máu, chúng có nhiệm vụ vận chuyến phân phối oxy cho Bạch cầu chiếm khoảng 6% thành phần tế bào máu phần quan trọng cùa hệ miền dịch có nhiệm vụ tiêu diệt tác nhân gây nhiễm trùng phát động đáp ứng miễn dịch SVTH: Nguyễn Văn Cường Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Bang 3.7: Báng giá trị trung hình sổ tượng TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết tỷ lệ pha loãng khác (n=8) Tỷ lệ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 (50%) (25%) (12.5%) (6.25%) (3.12%) (1.56%) Số lượng tế bào 6,83 5,63 4,88 4,45 4,01 3,33 (n=8) (xio6tb/ml) ±1,01 ±0,70 ±0,64 ±0,69 ±0,68 ±0,60 ĐC (n=8) 3,03 3,06 3,10 2,94 3,03 3.15 (xio6tb/ml) ±0,06 ±0,63 ±0,30 ±0,57 ±0,72 ±0,26 8,00 ?7O0 Giá trị trung bình 613 —ĐC 5.Ệ3 4,88 ' 3,03 3,06 3,10 Ị i 1/2 1/4 < ° 5,00 i « ' 0.3,00 4.45 4,01 - ị -Ị - 2.00 1,00 1/8 1/16 1/32 1/64 Tỷ lệ pha loãng Biếu đồ 3.6: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc vói dịch chiết nguyên bào sợi tỷ lệ pha loãng khác (n=8) Tế bào nuôi cấy đĩa ban đầu 2,6x1 o6 tế bào/ml, 48 sau nuôi cấy đĩa 96 giếng kết cho thấy tất mẫu tế bào có bồ sung dịch chiết tỷ lệ pha lỗng khác có kích thích TBG tăng sinh: Ớ giếng có nồng độ dịch chiết cao (ở tỷ lệ 1/2 - 50% dịch chiết) cho kết tăng sinh mạnh Ó tỷ lệ Dịch chiết 1/64 (1,56% Dịch chiết) mầu Dịch chiết 2, Dịch chiết 4, Dịch chiết Dịch chiết kết có tế bào tăng sinh kết không cao mẫu đối chứng - nuôi điều kiện môi trường nuôi cấy thông thường không bố sung Dịch chiết So sánh kết số lượng tế bào trung bình cùa mẫu Dịch chiết, kết cho SVTH: Nguyễn Văn Cường 42 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung thay tỷ lệ Dịch chiết từ 1/2 đến 1/64 vần cao hon so với đối chứng (bảng 3.7 biều đồ 3.6) Từ kết quà cho thấy ni cấy TBG biểu mơ màng ối có bồ sung dịch chiết thi cho kết tế bào tăng sinh tốt so với điều kiện nuôi cấy thông thường, ni cấy TBG biểu mơ màng ối có bố sung dịch chiết nguyên bào sợi nồng độ khác khơng làm thay đối hình thái TBG biêu mô so với môi trường nuôi cấy thông thường (không bo sung FBS) Tốc độ tăng sinh TBG giảm dần theo tý lệ pha loãng từ 1/2 lần đến 1/64 lần, nhiên vần cao so với mẫu đối chứng môi trường không bô sung dịch chiết 3.3.2 Kết đo phản ứng MTT đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sọi đến khả tăng sinh TBG biểu mô màng ối Sau 48 ni cấy TBG màng ối có bổ sung dịch chiết nguyên bào sợi Tiến hành đo mật độ quang lượng tinh the formazan tạo thành sau tiếp xúc Kết q thề thơng qua hình 3.5, biểu đồ 3.7 báng 3.8 đây: pc o , Dịch chiết 1/2 Hình 3.5: Hình ảnh TBG biếu mô màng ối tạo tinh Formazan sau bổ sung MTT (n=8) (DC: mau đối chứng - Mau TBG màng ối ni cấy bình thường, Dịch chiết 1,2,3: mẫu TBG nuôi cay hố sung Dịch chiết nguyên hào sợi (ỈOOX) SVTH: Nguyễn Văn Cường 43 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Bang 3.8: Kết qua phan ứng MTT tế hào tiếp xúc Dịch chiết nguyên hào sợi (n=8) Dịch Dịch Dịch DỊch Dịch Dịch Dịch Dịch Tỷ lệ chiết chiết chiết chiết chiết chiết chiết chiết DC pha (OD) loãng (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) 1/2 0,146 0,123 0,123 0,123 0,103 0,184 0,148 0,173 0,065 1/4 0,116 0,096 0,116 0,121 0,101 0,145 0,116 0,131 0,065 1/8 0,100 0,089 0,107 0,095 0,094 0,131 0,102 0,109 0,066 1/16 0,091 0,090 0,101 0,083 0,088 0,122 0,093 0,100 0,061 1/32 0,081 0,089 0,096 0,075 0,070 0,110 0,083 0,069 0,061 1/64 0,065 0,078 0,067 0,060 0,058 0,089 0,066 0,060 0,061 SVTH: Nguyễn Văn Cường 44 Lớp 13.01 GVHD: TS Đơ Minh Trung Khóa luận tơt nghiệp Dịch chiết Dịch chiết Biếu đồ 3.7:Kết đo OD phán ứng MTT mẫu TBG màng ối sau 48 tiếp xúc dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) (DC; mau đối chứng; Dịch chiết: mẫu te bào có bơ sung Dịch chiết ngun bào sợi) SVTH: Nguyễn Văn Cường 45 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Bủng 3.9: Bủng giá trị OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế hào sau 48 tiếp xúc vói Dịch chiết nguyên hào sợi (n=8) Tỷ lệ pha 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 loãng (50%) (25%) (12.5%) (6.25%) (3.12%) (1.56%) Giá trị OD trung bình 0,140 0,118 0,104 0,096 0,084 0,068 ±0,028 ±0,016 ±0,013 ±0,012 ±0,014 ±0,010 (n=8) ĐC (OD) 0.065 0,065 0,066 0,061 0,061 0,061 (n=8) ±0,011 ±0,011 ±0,011 ±0,010 ±0,010 ±0,010 Tỷ lệ pha loãng Biểu đồ 3.8: Giá trị kết đo OD trung bình phán ứng MTT TBG màng ối sau 48 tiếp xúc với Dịch chiết nguyên bào sợi (N=8) Kết cho thấy TBG màng ối môi trường nuôi cấy có dịch chiết nguyên bào sợi có tăng mật độ tế bào so với số lượng cấy ban đầu mật độ tế bào quan sát nhiều so với nhóm chứng (hình 3.5), hay mơi trường ni cấy có dịch chiết ngun bào sợi, TBG màng ối có phân chia, tăng sinh Sự tăng mật độ phụ thuộc vào nồng độ pha loãng dịch chiết Ớ nồng độ cao (tý lệ pha loãng 1/2, 1/4), mật độ tế bào dày đặc hơn, đo hệ số OD phân ứng MTT cao nhóm chứng (bảng 3.8 băng 3.9) Như vậy, quan sát mật độ TBG thông qua khả tạo SVTH: Nguyễn Văn Cường 46 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung formazan, đo hệ số OD phản úng tạo mầu forrmazan nhận thấy dịch chiết nguyên bào sợi có tác dụng kích thích khả tăng sinh TBG màng ối 3.4 Kết so sánh đánh giá tác dụng PRP dịch chiết nguyên bào sọi TBG màng ối Đe so sánh tác dụng cùa PRP dịch nguyên bào sợi, tế bào nuôi cấy đĩa ban đầu có số lượng tương đồng 2,6x o6 tế bào/ml, sau 48 nuôi cấy đĩa 96 giếng tiến hành bố sung MTT đọc kết Kết đánh giá dựa số lượng tế bào kết đo giá trị OD phản ứng MTT Giá trị trung bình số lượng tế bào »ọ vỉ 1/4 1/2 1/8 1/16 1/32 1/64 Tỳ lệ pha loãng Riếu đồ 3.9: Giá trị trung bình so tượng tế bào sau tiếp xúc với PRP dịch nuôi cấy Bủng 3.10: Bảng giá trị trung bình so lượng TBG màng ối tiếp xúc với mẫu PRP vù mẫu dịch chiết tỷ lệ pha loãng khác Tỷ lệ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 (50%) (25%) (12.5%) (6.25%) (3.12%) (1.56%) Giá trị OD trung 8.21 7,44 6.51 5.29 4.08 3.38 bình (PRP) ±1,03 ±0,76 ±0,58 ±0,45 ±0,33 ±0,62 Giá trị OD trung 6.83 5.63 4.88 4.45 4.01 3.33 bình (Dịch chiết) ±1.01 ±0,70 ±0,64 ±0,69 ±0,68 ±0,60 ĐC (OD) 3.03 3.06 3.1 2.94 3.03 3.05 ±0,06 ±0,63 ±0,30 ±0,57 ±0,72 ±0,26 SVTH: Nguyễn Văn Cường 47 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Kết cho thấy tất cà mẫu tế bào có bổ sung PRP Dịch chiết tỷ lệ pha loãng khác có khả kích thích TBG tăng sinh: Ớ giếng có nồng độ PRP Dịch chiết cao (ở tý lệ 1/2 - 50% Dịch chiết) cho kết tăng sinh mạnh Dựa vào bicu đồ 3.9 bảng 3.10 kết giá trị trung số lượng tế bào sau tiếp xúc PRP dịch nuôi cấy ta thấy số lượng te bào sau tiếp xúc PRP Dịch chiết giảm từ nồng độ cao xuống nồng độ tấp nhiên cao so với đối chứng Giá trị trung bình KQ MTT 0,020 0,000 1/2 1/4 1/8 1/16 Tỳ lệ pha loãng 1/64 1/32 Biểu đồ 3.10: Giá trị kết qua đo OD trung hình phản ứng MTT mẫu tế hào sau 48 tiếp xúc với PRP Dịch chiết nguyên hào sợi Bang 3.11: Kết giả trị OD trung bình phản ứng MTT TBG àng ối sau tiếp xúc PRP dịch nuôi cấy Mầu PRP (OD) Dịch chiết (OD) DC (OD) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 (50%) (25%) (12.5%) (6.25%) (3.12%) (1.56%) 0,174 0,133 0,099 0,081 0,069 0,062 ±0,010 ±0,011 ±0,013 ±0,008 ±0,007 ±0,006 0,140 0,118 0,104 0,096 0,084 0,068 ±0,028 ±0,016 ±0,013 ±0,012 ±0,014 ±0,010 0,065 0,065 0,066 0,061 0,061 0,061 ±0,010 ±0,010 ±0,011 SVTH: Nguyễn Văn Cường ±0,01 ±0,011 48 ±0,010 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khi so sánh kết giá trị trung bình kết MTT tế bào sau tiếp xúc PRP Dịch chiết nguyên bào sợi ta thấy chi số đo OD cùa PRP Dịch chiết giám từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp cao hon so với đối chứng Chỉ sổ đo cao PRP có nồng độ cao 1/2 (0,l74±0,010) cao so với số đo Dịch chiết có nồng độ cao 1/2 (0,140±0,028) Tại nồng độ cao PRP (1/2 1/4 ) cho số đo OD cao so với nồng độ cao dịch chiết nguyên bào sợi (1/2 1/4) nồng độ lại PRP (1/8, 1/16, 1/32, 1/64) lại cho số đo OD thấp nồng độ tương ứng dịch chiết nguyên bào sợi, nhiên cao so với đối chứng (Biêu đồ 3.10 Băng 3.11) Điều chứng tó PRP nồng độ cao cho kết tăng sinh tế bào tốt so với dịch chiết nguyên bào sợi Sự tăng sinh di cư tế bào tượng có lợi việc điều trị vết thương làm lành da Do đó, việc nghiên cứu tác động cúa yếu tố tới TBG biểu mơ loại tế bào nằm da biệt hóa thành tế bào tạo nơn cấu trúc cùa da q trình liền vết thương cho ta định hướng rõ rệt việc ứng dụng chế phẩm để điều trị vết thương Trong nghiên cứu đế làm sáng tó ảnh hưởng PRP dịch chiết nguyên bào sợi tới liền vết thương, thứ nghiệm đánh giá tác động tế bào thông qua yếu tố Kết quà nghiên cứu, sau 24 ni cấy tế bào có khả bám dính bề mặt dụng cụ nuôi cấy Các mầu tế bào sau thay mơi trường 2-3 lần tuần vịng 10-15 ngày hầu hết mẫu tế bào đạt 80-90% độ chc phù thu hoạch quy trình sử dụng trypsin Khi quan sát kính hiến vi tế bào có hình dáng cúa TBG biếu mơ màng ối Quan sát từ thí nghiệm, chúng tơi thấy số lượng tế bào tăng sinh tốt, khả sống tế bào sau phân lập lớn tế bào noi với mảnh vỡ mô, chúng loại bỏ việc thay môi trường nuôi cấy sau 24-48 giờ, đạt mật độ che phú 70-80% sau 12 ngày nuôi cấy Thông qua nhuộm xanh trypan, chúng tơi thấy hình ảnh đặc chưng TBG biêu mơ SVTH: Nguyễn Văn Cường 49 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung màng ối có hình sao, bào tưomg trài rộng nhiều nhánh, nhân tế bào có hình trịn hình trứng, ranh giới bờ nhân rõ rệt, bắt màu đậm MTT ([3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ]) loại tetrazole có màu vàng Trong tế bào sống MTT chuyển hóa thành tinh the Formazan màu tím tác dụng enzym sucinate dehydrogenase cúa ty thề số lượng tế bào lớn tạo lượng formazan nhiều, giá trị OD dung dịch formazan cao Nhìn chung kết cùa chúng tơi cho hình ánh formazan có màu tím đặc chưng rõ rệt, quan sát kính hiển vi thấy có dõ rệt số lượng tinh tạo ra, số đo OD cúa cã PRP dịch chiết nguyên bào sợi giảm từ nồng độ cao đen nồng độ thấp nhiên chi số OD mẫu bố sung PRP cao so với dịch chiết, nên PRP có tác dụng kích thích tăng sinh tế bào mạnh so với dịch chiết Cũng có số cơng trình nghiên cứu đánh giá tác dụng cúa PRP cơng trình nghiên cứu cúa Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Thị Bích Phượng cộng Viện Bóng Quốc gia phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu y Dược học Quân sự, Học viện Quân y đánh giá tác dụng PRP đến khả tăng sinh di cư tế bào Tuy nhiên nghiên cứu cùa tác giá đánh giá dịng tế bào khác, ngun bào sợi Ket nghiên cứu tương đồng với kết nghiên cứu tác giã Kết q ni cấy TBG biểu mơ màng ối có bổ sung huyết tương giàu tiếu cầu nồng độ khác khơng làm thay đồi hình thái TBG so với môi trường nuôi cấy thông thường Tốc độ tăng sinh TBG biểu mô màng ối cao, giám dần theo tỷ lệ pha loãng từ 1/2 lần đến 1/64 lần, nhiên cao so với điều kiện môi trường không bố sung PRP cao tỷ lệ pha loãng 1/2 Các vết thương in vitro mơi trường bố sung PRP tỷ lệ pha lỗng 1/4 lần (tỷ lệ 25%) có te bào lan nhiên diện tích che phủ vần chưa cao Huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) chứa hồn hợp yếu tố tăng trướng nhiều tác giã chứng minh có hiệu vết thương mạn tính Đánh giá ảnh hưởng huyết tương giàu tiếu cầu tới TBG biếu mô màng ối nuôi cấy sớ cho phép tiến hành nghiên cứu bệnh nhân Đây kết tích cực cơng nghệ cấy ghép tế bào có nhiều tiềm ứng dụng điều trị lâm sàng SVTH: Nguyễn Văn Cường 50 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung KẾT LUẬN Dã ni cấy tăng sinh dịng TBG biểu mơ từ màng ối - Các mầu TBG màng ối sau giải đơng ni cấy mơi trường DMEM có bố sung thêm 10% FBS, 1% kháng sinh điều kiện 37°c, 5% co2 - Te bào có khả bám dính bề mặt đĩa ni cấy sau 24 Thời gian nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ 60-80% diện tích bề mặt đĩa ni cấy sau 12 ngày - Te bào có dạng hình đa giác đặc trưng cùa TBG biếu mô màng ối Đã đánh giá tác dụng huyết tương giàu tiểu cầu, Dịch chiết từ nguyên bào sọ’i đến khả tăng sinh liền vết thương in vitro TBG biểu mơ màng ối - Các mẫu có bố sung PRP kích thích TBG từ màng ối tăng sinh di cư: + nhóm bố sung PRP, tế bào tăng sinh mạnh, mật độ tế bào cao tỷ lệ pha loãng từ 1/2 đến 1/16 Ờ tỷ lệ pha loãng 1/32 1/64 tốc độ tăng sinh cùa TBG có xu hướng giảm dần cao so với nhóm chứng + Ớ tỳ lệ 25% (tỳ lệ pha loãng 1/4) Các mẫu bố sung PRP kích thích TBG màng ối di cư tốt so với nhóm chứng sau ngày ni cấy - Các mẫu có bổ sung dịch chiết nguyên bào sợi kích thích TBG từ màng ối tăng sinh: tế bào tăng sinh mạnh, mật độ tế bào cao tý lệ pha loãng từ 1/2 đến 1/16 Ở tỳ lệ pha loãng 1/32 1/64 tốc độ tăng sinh cùa TBG có xu hướng giám dần cao so với nhóm chứng SVTH: Nguyễn Văn Cường 51 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung KIẾN NGHỊ Mặc dù cố gắng dành thời gian tìm hiếu vấn đề thời gian điều kiện có hạn lĩnh vực y học tái tạo lĩnh vực cịn q Vì mong muốn thân tơi có điều kiện xin tiếp tục tìm hiếu nghiên cứu: Tiếp tục nghiên cứu đánh giá liền vết thương invitro với số lượng mẫu lớn Nghiên cứu thành phần yếu tố kích thích tăng sinh te bào PRP dịch chiết nguyên bào sợi SVTH: Nguyễn Văn Cường 52 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đinh Văn Hân, Trần Ngọc Diệp, Nguyễn Tien Dũng (2013) “Đánh giá tác dụng dung dịch chiết nguyên bào sợi da ni cấy điều trị vết thương mạn tính’’ Tạp chỉy học thám hoạ & Bóng, số 2, tr: 47 - 54 Vũ Thị Tuệ Khanh (2010) Phấu thuật ghép màng ối nhãn khoa Tạp chi nghiên cứuy học Việt Nam số 67 (2): 331-339 Nguyễn Viết Lượng (2009) “Tình hình bỏng Việt Nam năm 20052007 ” Tạp chỉy học thám hoạ & bòng, số 1, tr 26 Phan Kim Ngọc cs (2009) “Tạo vật liệu sinh học màng ối người phục vụ công nghệ tế bào động vật trị liệu” Đỗ Minh Trung, Phạm Văn Trân, Nguyễn Bảo Trân, Trần Hải Anh, Toshiko Yoshida, Toshio Nikaido (2012) Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy nhận biết TBG từ màng ối người Tạp chí Sinh ly học Việt Nam số 16(1), tr: 36-41 Chu Anh Tuấn cộng (2012) “Nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết ngoại bào nguyên bào sợi nuôi cấy từ da người ”, Tạp chí y học thám họa Bỏng Số 4,tr.32-7 Nguyễn Xuân Trường (2005).“ứng dụng phương pháp ghép màng ối đông khô điều trị loét giác mạc sâu khó lành” Tạp chi Y học TP.HCM Tập 9, phụ bán 1; 43-47 Tài liệu tiếng anh AL-Bayati A.H, R.N Al-Asadi, Mahdi A.L Al-Falahi N.H (2013) “Effects of Autologous Platelets Rich Plasma on Full-thickness Cutaneous Wounds Healing in Goats” Atiyeh B.s cộng (2007) “Cultured epithelial autograft (CEA) in burn treatment: three decades later” Burns 33 (4): 405-414 10 Beck LS, De Guzman L, Lee WP, Yvette XU, Siegel MW, Amento EP (1993) “One systemic administration of transforming growth factor-beta SVTH: Nguyễn Văn Cường 53 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung reverses age or glucocorticoid-impaired wound healing” J Clin Invest 92:2841-9 11 Bikfalvi A, Klein.s, Pintucci.G, Rifkin D.B (1997) Biological roles of fibroblast growth factor-2 Endocrine Reviews 18: 26-45 12 Boswell SG, Cole BJ, Sundman EA, Karas V, Fortier LA (2012): “Platelet- Rich plasma: a milieu of bioactive factors” 4r//n-a$copy.28(3):429-439 13 Cecdric Blanpain , 1, Valerie Horsley , and Elaine Fuchs (2007) “Epithelial Stem Cells: Turning over New Leaves”.Ce// Feb 9;128(3):445-458 14 De Vos RJ, Weir A, van Schie HT, Bierma-Zeinstra SM, Verhaar JA, Weinans H., and Tol JL (Jan 13, 2010) “Platelet-rich plasma injection for chronic Achilles tendinopathy: a randomized controlled trial” JAMA 303(2): 144-149 15 Dieudonne sc, Foo p, van Zoeken EJ, Burger EH (1991) “Inhibiting and stimulating effects of TGF-1 on osteoclastic bone resorption in fetal mouse bone organ cultures” J Bone Miner Res.6:479-87 16 Donna Aiderman, DO (2010) “The New Age of Prolotherapy” 17 Ferrari M, Zia s, Valbonesi M cộng (1987) “A new technique for hcmodi-lution, preparation of autologous platelet-rich plasma and intraoperative blood salvage in cardiac surgery” Int J Artif Org 10:47-50, 18 Goldring M.B (2000) “The role of the chondrocyte in osteoarthritis” ArthritisRheum, 43 (9), 1916-1926 19 Hajdu SI (1980) : “The Paradox of Sarcomas” Acta Cytol 24:373-383, 1980 20 Jamie Textor (2014) “Plate-Rich Plasma (PRP) as a Therapeutic Agent" Platelet Biology Growth Factors and a Review of the Literrature 21 Josef Neumuller A.E, Thomas Wagner (2015) “Transmission Electron Microscopy of Platelets FROM Apheresis and Buffy-Coat-Derived Platelet Concentrates, The Transmission Electron Microscope” Theory and Applications, Dr Khan Maaz (Ed.) 22 Kon E, Buda R, Filardo G, cộng (2010) “Platelet-rich plasma : Intra articular knee injections produced favorable results on degenerative cartilage lesions Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc“ 18:472-479 SVTH: Nguyễn Văn Cường 54 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung 23 Marck RE, Middclkoop E, Breederveld RS (2014) “Considerations on the use of platelet-rich plasma, specifically for bum treatment ” J Burn Care Res 35(3):219-27 24 Mishra, A and Pavelko T (2006) ‘‘Treatment of chronic elbow tendonosis with buffered platelet-rich plasma” American Journal of Sports Medicine 34(11): 1774-1778 25 Mohan s, Baylink DJ Bone (1991) “growth factors Clin Orthop Rei Res” ;263:30-43 26 O.B Mai, J.p Thiery, J Jouanneau (2000) “Molecules in focus Fibroblast growth factor2” The International Journal of Biochemistry & Cell Biology! 32, 263 - 267 27 Oz MC, Jeevanandam V, Smith CR, cộng (1992) “Autologous fibrin glue from intraoperatively collected platelet-rich plasma”M/w Thorac SurgSS-.5M-\ 28 Pencho Kossev Tsvetan Sokolov (2015) “Platelet-rich Plasm (PRP) in Orthopedics and Traumatology” 29 Pietrzak w.s and B L Eppley (2005) “Platelet rich plasma: biology and new technology” J Craniofac Surg, 16(6), 1043-1054 30 P.Rozman and Z.Bolta (2007) “Use of plate growth factor in treating wound and soft-tissue injuries” 31 Peter A.M Everts, EKP, ECCP (2006 Jun) ‘‘Platelet-Rich Plasma and Platelet Gel: A Review ” J Extra Corpor Technol 38(2): 174-187 32 Pro Finn Gottrup, Denmark (2015) “Clinical wound Assessment” 33 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss s, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, cộng (2004) “Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells”, Circulation, 109, 1292-8 34 Sampson s, M Gerhardt and B Mandelbaum (2008) “Platelet rich plasma injection grafts for musculoskeletal injuries: a review” Curr Rev Musculoskelet Med, (3-4), 165-174 SVTH: Nguyễn Văn Cường 55 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung 35 Scarpone M cộng (2013) “PRP as a treatment alternative for symptomatic rotator cuff tendinopathy for patients failing convervative treatments” Techniques in Orthopaedics 22(1): 26-33 36 Tawes RL, Sydorak GR, DuVall TB Autologous fibrin glue (1994) “The last step in operative hemostasis” AmJSurg 168:120-2 37 Weissman IL (2000) “Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution” Cell 100: 157-168 38 Yavuz Kececi, MD;Sibel Ozsu, MD; Oktay Bilgir, MD (2014) “A CostEffective Method for Obtaining Standard Platelet-Rich Plasma” SVTH: Nguyễn Văn Cường 56 Lớp 13.01 ... 7,9 2 1 0,1 0 8,7 1 9,2 0 7,0 5 7,5 0 7,5 9 7,5 9 3,0 3 1/4 7.50 7.70 8,2 5 8,7 0 6,4 5 7.10 6,8 9 6,8 9 3,0 6 1/8 6,7 5 6,6 0 7,5 0 6,7 5 6,0 1 6,3 9 6,5 5 5,5 2 3,1 0 1/16 5,5 0 4,4 0 5,5 5 5,5 5 4,9 5 5,2 1 5,8 6 5,2 7 2,9 4... tế bào, tiến hành nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu đánh giá huyết tương giàu tiếu cầu, dịch chiết nguyên bào sợi den khả tăng sinh di cư tế bào gốc biếu mô màng ối? ?? với mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: ... 0,1 00 0,1 30 0,1 14 0,1 26 0,1 19 0,1 09 0,1 33 0,1 21 0,0 65 1/8 0,0 80 0,1 02 0,0 90 0,0 89 0,0 94 0,0 86 0,1 18 0,1 10 0,0 66 1/16 0,0 78 0,0 98 0,0 86 0,0 87 0,0 90 0,0 82 0,0 73 0,0 76 0,0 61 1/32 0,0 68 0,0 85 0,0 75