Đánh giá tác dụng in vitro huyết tương giàu tiểu cầu trên tế bào gốc mô mỡ

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - rà«>o^[Q2lÃ*> - KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẼ TÀI: ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG IN VITRO HUYÉT TƯƠNG GIÀU TIỀU CÀU TRÊN TÉ BÀO GĨC MƠ MỠ Người hướng dần: TS Đỗ Minh Trung Sinh viên thực hiện: Bill Thị Ngọc Anh Lớp: YD- 13.02 HÀ NỘI-2017 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i MỤC LỤC ii DANH MỤC VIẾT TẲT iv DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC BIẾU ĐÒ vi DANH MỤC HÌNH vi DẠT VÁN ĐỀ PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỚNG QUAN VÈ HUYẾT TUƠNG GIÀU TIẾU CẦU 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cấu tạo, chức cùa tiểu cầu hạt a 1.1.3 Vai trị c tiều cầu q trình làm lành vết thương 1.1.4 Tạo huyết tương giàu tiểu cầu 1.1.5 ửng dụng PRP điều trị 1.2 TÉ BÀO GỐC VÀ TẾ BÀO GĨC TÙ MƠ MƠ 15 1.2.1 Tế bào gốc .15 1.2.2 Phân loại tế bào gốc 17 1.2.3 Te bào gốc mô mỡ 21 1.2.4 ứng dụng tế bào gốc 23 1.2.5 ứng dụng tế bào gốc mô mỡ 25 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN củu sủ DỤNG PRP TỤ THÂN TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH THỐI HĨA KHỚP 27 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 27 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 28 PHẦN 11: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 29 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN củu 29 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh ii GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 29 2.2.1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào 29 2.2.2 Báo quản tế bào 30 2.2.3 Giãi đông tế bào 30 2.2.4 Xác định mật độ tế bào 30 2.2.5 Chuẩn bị huyết tương giàu tiếu cầu 31 2.2.6 Phân ứng MTT đánh giá khả tăng sinh TBG mô mỡ 31 2.2.7 Đánh giá tạo cụm tế bào (CFU-F) 32 2.2.8 Xử lý số liệu 32 2.2.9 Địa điếm nghiên cứu 32 PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 KÉT QUẢ NI CẤY TĂNG SINH TÉ BÀO GĨC MƠ MỠ 33 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA PRP TRÊN TÉ BÀO GỚC MÔ MỠ 35 3.2.1 Kct đánh giá tác dụng PRP đến tăng sinh cúa TBG mô mỡ 35 3.2.2 Kết quà tác dụng PRP đến khả tạo cụm tế bào (CFU-F) TBG mô mỡ 40 KÉT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh iii GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC VIẾT TẮT TBG Tế bào gốc ADSCs Adipose derived stem cells (Te bào gốc mô mỡ) PRP Platelet rich plasma (Huyết tương giàu tiều cầu) TBG trung mô Mesenchymal stem cell (Te bào goc tiling mô) EGF Epidermal growth factor (Yeu tổ tăng trưởng biếu bì) VEGF Vascular endothelial growth factor (Yeu to tăng trưởng nội mô mạch máu) FGF TGF-0 Ycu tổ tăng trưởng nguyên bào sợi Transforming growth factor-beta (Ycu tố tăng trường chuyến dạng beta) PDGP Platelet derived growth factor (Yeu tố tăng trưởng có nguồn gốc) PDEGF Platelet derived endothcrial growth factor (Yếu tố tăng trưởng nội mô nguồn gốc tiểu cầu) PDAF Platelet derived angiogenesis factor (Yeu tố tăng sinh mạch nguồn gốc tiểu cầu) ECGF Epithelial cell growth factor (Yeu tố tăng trướng tế bào biểu mô) IGF Insulin-like growth factor (Yếu tố tăng trường giống Insulin) SVF Stromal - Vascular fraction (Tố bào mạch máu) PBS Phosphat Buffer Saline CFU-F Colony-forming unit fibroblast (Dung dịch đệm Phosphat) SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh iv GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Báng 3.1: Kết số lượng TBG mô mỡ sau nuôi cấy bố sung PRP 35 Báng 3.2: Kết giá trị đo OD cùa phán ứng MTT 39 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Kỹ thuật ly tâm hai lần lần (theo Ehrenfest cộng sự) [7] Hình 2.2: Te bào gốc toàn năng, vạn đa 18 Hình 2.3: Các nguồn tế bào gốc 20 Hình 3.1 Hình ảnh kết q ni cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ 33 Hình 3.2 Hình ảnh nhuộm TBG mơ mỡ gicmsa 34 Hình 3.3: Ket hình ánh tạo tinh the formazan cùa TBG mơ mờ sau tiếp xúc với PRP tỷ lệ pha loãng 1/2 37 Hình 3.4: Kct hình ảnh tạo tinh the formazan TBG mô mỡ sau tiếp xúc với PRP tý lệ pha loãngl/64 37 Hình 3.5: Hình ảnh tạo cụm tế bào (CFU-F) TBG mô mỡ (CFU-PRP1, CFU-DC3: 41 DANH MỤC BIÉU ĐÒ Biếu đồ 3.1: Ket số lượng TBG mô mỡ sau nuôi cay bo sung PRP 36 Biểu đồ 3.2: Kết so sánh giá trị đo OD phàn ứng MTT (n=l 1) 39 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh vi GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Te bào máu gồm 93% hồng cầu, 1% bạch cầu 6% tiếu cầu Trong tiếu cầu có vai trị thúc đầy q trình liền vết thương làm đơng máu thơng qua việc giải phóng yếu tổ tăng trưởng (Growth factor) Huyết tương giàu tiêu cầu (Platelet rich plasma - PRP) chế phấm chiết xuất từ máu toàn phần PRP tách chiết cách ly tâm thơng qua kít chun dụng Chế phẩm PRP thu bao gồm lượng huyết tương nhở có độ tập trung tiều cầu cao gấp nhiều lần PRP có chứa nhiều yếu tố yếu tố tăng trưởng bao gồm cá yếu tố tăng trưởng bicu bì(EGF), yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu(VEGF), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi(FGF), yếu tố tăng trưởng giống Insulin yếu tổ tăng trưởng kcratinocytc Các yếu tố tăng trướng có vai trị quan trọng việc làm lành vết thương, tái tạo mơ, kích thích hình thành mạch máu, tăng cường tổng họp collagen, làm đông máu thương, chống viêm cịn có tác dụng điều hịa trình sinh tồng hợp sụn khớp PRP biết đến từ lâu ứng dụng điều trị nói chung sứ dụng PRP tự thân điều trị thối hóa khóp nói riêng mớ hướng điều trị Gần nhiều nghiên cứu giới đánh giá hiệu cùa liệu pháp điều trị bệnh thối hóa khóp cho kết tốt so sánh với liệu pháp dùng dịch khớp nhân tạo Những nghiên cứu gần cho thấy việc sử dụng tế bào gốc (TBG) trưởng thành có nhiều tiềm điều trị lớn Te bào gốc từ mô mỡ (Adipose tissue Stem cells) quần thề tế bào gốc vạn thu nhận từ mơ mỡ, chúng có thề biệt hóa thành loại tế bào khác Mô mờ loại mơ có sằn người với số lượng lớn dề dàng thu nhận nên nguồn cung cấp tế bào gốc đầy hứa hẹn cho y học tái tạo Có thể sử dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân tế bào gốc từ mô mỡ hoạt hóa, kích hoạt huyết tương giàu tiếu cầu đế điều trị thối hóa khớp gối khớp háng cho thấy biện pháp điều trị an tồn bước đầu có hiệu q tốt cho người SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh I GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp bệnh Huyết tương giàu tiếu cầu có hoạt tính tác dụng hay không, vi cần phải đánh giá hoạt tính huyết tương giàu tiểu cầu tế bào gốc mô mỡ Xuất phát từ sờ khoa học thực tiễn trên, em tiến hành nghiên cứu đồ tài: "Nghiên cứu đánh giá hoạt tính huyết tương giàu tiếu cầu tế bào gốc mô mở” với mục tiêu sau: Mục tiêu: Nuôi cay tăng sinh tế bào gốc mô mỡ tạo nguồn tế bào làm mơ hình để đánh giả Đảnh giá hoạt tính huyết tương giàu tiếu cầu (PRP) tế bào gốc mô mỡ SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I: TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỐNG QUAN VÈ HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIẾU CÀU 1.1.1 Định nghĩa Huyết tương giàu tiểu cầu (PRP- Platelet rich plasma) huyết tương có nồng độ tiều cầu cao gấp nhiều lần máu Bình thường số lượng tiểu cầu máu khoáng từ 140.000 đến 400.000 tiểu cầu/ pl máu (trung bình 200.000), số lượng tiều cầu PRP cao gấp nhiều lần, từ 2- lần, so với mức trung binh [3, 4], 1.1.2 Cấu tạo, chức tiếu cầu hạt a Tiểu cầu phân mảnh mầu tiếu cầu (megakaryocyte), loại tế bào bạch cầu sinh tủy xương Tiểu cầu tế bào nhò tế bào máu, có hình trịn hình bầu dục với đường kính xấp xi pm (1,2- 2,3 pm) Tiểu cầu trú ngụ mạch máu có nồng độ cao lách Bình thường số lượng tiểu cầu máu từ 140.000 đến 400.000/mm (pl) Đời sống trung bình cùa tiểu cầu 10 ngày trước bị thực bào đại thực bào hệ thống lưới nội mô cấu tạo, bên tiểu cầu siêu cấu trúc phức tạp, yếu gồm hệ thống vi quán ngoại vi, hệ thống ống dày đặc, ti lạp thể, nhiều hạt (alpha- a, delta- ỗ, lambda- Ấ) hệ thống kênh mớ Trong tiếu cầu, hạt a có số lượng từ 50 đến 80 hạt hình thành trình trưởng thành cùa mẫu tiều cầu Hạt có đường kính khoảng 200- 500 nm, bao quanh lóp màng chứa khoảng 30 loại protein có hoạt tính sinh học khác nhau, ke đến protein yếu tố tiểu cầu, yếu to von Willebrand, fibrinogen, thrombospondin, protein s, yếu tố XIII yếu to quan trọng tham gia vào q trình đơng cầm máu cúa tiếu cầu Hạt chứa nhiều protein bao gồm nhiều yếu tố tăng trưởng có chức quan trọng trình làm lành vết thương SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Chức cùa tiêu cầu: tiều cầu có chức tham gia vào q trình đơng- cầm máu khởi đầu q trình làm lành vết thương 1.1.3 Vai trị cuả tiểu cầu trình làm lành vết thuong Khi tiểu cầu hoạt hóa dẫn đến trinh ly giãi hạt a cúa tiểu cầu, từ giải phóng nhiều loại protein có vai trị quan trọng q trình làm lành vết thương hay tơn thương [3, 4], Một so protein quan trọng: - Platelet-derived growth factor (PDGF- aa, pp, aP): yeu to tăng trường có nguồn gốc từ tiểu cầu có tác dụng hóa ứng động đại thực bào- thu hút đại thực bào tới nơi tổn thương; phối họp PDGF với TGF-p, IGF có tác dụng thúc tăng trưởng mạch máu, phân chia TB, hình thành da, chất cãn bán xương, tổng họp collagen - Transforming growth-factor-beta (TGF-P: pi, P2): yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta có tác dụng thúc đẩy TB gốc nguồn gốc trung mô (sụn, xương, cơ, sợi ) nguyên bào xương phân bào; thúc q trình khống hóa xương (khi phối họp với PDGF) Các yếu tố tăng trướng TGF-P phối họp với IGF-1 BMPs tham gia vào trình tổng họp chất bán cùa sụn khớp [5] - Vascular endothelial growth factor (VEGF): yếu tố tăng trướng nội mạc mạch máu, thúc hình thành mạch máu - Epidermal growth factor (EGF): yeu tố tăng trưởng biểu bì, thúc đẩy tăng trưởng tế bào biệt hóa, hình thành mạch máu, hình thành collagen - PDEGF (platelet-derived endothelial growth factor): yeu to tăng trưởng nội mô nguồn gốc tiểu cầu - PDAF (platelet-derived angiogenesis factor): yếu tố tăng sinh mạch nguồn gốc tiểu cầu - ECGF (epithelial cell growth factor): yếu tố tăng trưởng tế bào biểu mô SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KÉT QUẢ NUÔI CẤY TĂNG SINH TÉ BÀO GỐC MƠ MÕ Các mẫu tế bào ni cấy mẫu tế bào giãi đông nuôi cấy đến đạt mật độ khống 80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy, tiến hành cấy chuyến, phần tế bào nuôi cấy tiếp, phần báo quản Kết sau nuôi cấy tăng sinh quan sát kính hiển vi cố định nhuộm tế bào, kết quà hình 3.1 hình 3.2 Hình 3.1 Hình ảnh kết nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mõ’ (A; giờ; B: sau 24 nuôi cấy; C: sau ngày nuôi cấy, D: sau 10 ngày nuôi cấy, 200X) SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 33 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.2 Hình ảnh nhuộm TBG mơ mở giemsa (A: tê hào sau 24 nuôi cấy; B: tê hào sau 10 ngày nuôi cấy -200X) Kết hỉnh 3.1 hình 3.2 cho thấy tế bào sau giải đơng cấy chuyến, tế bào có dạng hình trịn lơ lừng mơi trường ni cấy (hình 3.1 A) Sau 24 nuôi cấy tế bào bắt đầu bám dính bề mặt đĩa ni cấy, tế bào có dạng hình thoi (hình 3.1 B, hình 3.2 A) Sau tế bào tăng sinh mạnh (hình 3.1 C), sau 10 ngày nuôi cấy, tê bào đạt mật độ chc phủ khoảng 80% diện tích bề mặt đĩa ni cấy Đây thời điểm cấy chuyển tăng sinh bảo quán tế bào để sử dụng cho nghiên cứu (hình 3.1 D hình 3.2 B) Đế xác định rõ hình dạng đặc trưng cùa TBG màng ối, tế bào sau nuôi cấy cố định nhuộm với thuốc giemsa Ket cho thấy tế bào có dạng hình thoi giổng nguyên bào sợi, hình dạng đặc trưng cùa TBG tiling mơ từ mơ mỡ (hình 3.2) Đe đánh giá việc bảo quàn tế bào tốt, tế bào báo quán nitơ lòng tiến hành giải đông, nuôi cấy phục hoi Ket tế bào phát triển trở lại binh thường Như vậy, việc nuôi cấy ổn định lưu giữ bảo quản dòng tế gổc từ mô mỡ thực thành công SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 34 GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Ni cấy tăng sinh TBG bước khới đầu cùa cơng nghệ TBG Các kết q có ý nghĩa việc tạo nguồn TBG làm nguyên liệu để cung cấp cho nghiên cứu ứng dụng Các tế bào đạt yêu cầu đú số lượng đế sứ dụng cho nghiên cứu đế làm mơ hình đánh giá hoạt tính cùa huyết tưong giàu tiểu cầu 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA PRP TRÊN TÉ BÀO GỐC MÔ MỠ 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng PRP đến khả tăng sinh TBG mô mỡ Đe đánh giá tác dụng PRP đến tăng sinh cùa TBG mô mỡ mầu PRP bô sung vào giếng ni cấy có tế bào gốc mơ mỡ với nồng độ khác theo tý lệ pha loãng giảm dần từ 1/2 đen 1/64 Sau 48 nuôi cấy kết đánh giá thể thơng qua chí tiêu: số lượng tế bào, hình ảnh mật độ tế bào khả tạo tinh the formazan đo OD phán ứng MTT Kết số lượng tế bào: ❖ Tế bào gốc từ mô mỡ cấy chuyền nuôi cấy đĩa 96 giếng Sau 48 nuôi cấy, mẫu nghiên cứu đếm đế xác định mật độ tế bào Hiệu PRP đến tăng sinh TBG mô mỡ đánh giá thông qua số lượng tế bào, kết báng 3.1 biếu đồ 3.1 Báng 3.1: Kết số lượng TBG mô mở sau nuôi cấy bổ sung PRP (n=ll) (xl(ftb/ml) Tỷ lệ pha loãng PRP PRP PRP PRP PRP PRP PRP PRP PRP PRP 10 PRP 11 ĐC 1/2 16 18 15 16 17 15 18 19 18 16 17 1/4 14 15 13 14 15 13 16 17 16 14 15 4 1/8 13 13 10 13 12 10 12 14 13 10 11 1/16 11 10 9 11 11 10 1/32 8 6 1/64 7 5 4 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 35 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Biếu đồ 3.1: Kết số lượng TBG mô mỡ sau nuôi cấy bồ sung PRP (n=ll) ❖ Kết đánh giá khả tăng sinh TBG mô mỡ phản ứng MTT: Trong nghiên cứu chọn phưong pháp thử nghiệm MTT để đánh giá khà tăng sinh cùa tế bào đế đánh giá PRP Kết thu được hình 3.3 3.4, bảng 3.2, biểu đồ 3.2 sau: SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 36 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.3: Kết hình ảnh tạo tinh thếformazan TBG mơ mõ’ sau tiếp xúc với PRP tỷ lệ pha lỗng 1/2 (ĐC: mẫu TBG ni cấy khơng hổ sung PRP; PRPỈ, PRP2, PRP3: mầu TBG nuôi bô sung PRP tỳ lệ pha lỗng ỉ/2) Hình 3.4: Kết hình ảnh tạo tinh thếformazan TBG mơ mõ’sau tiếp xúc với PRP tỷ lệ pha lỗngl/64 (ĐC: mẫu TBG ni cấy khơng bổ sung PRP; PRP1, PRP2, PRP3: mẫu TBG nuôi cấy bo sung PRP tỷ lệ pha loãng 1/64) SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 37 GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Ket q hình 3.3 hình 3.4 cho thấy, mẫu đối chứng (ĐC): mầu tế bào ni cấy bình thường khơng bổ sung PRP Sau 48 (2 ngày) nuôi cấy, mật độ tế bào thưa thớt tương ứng với hình ánh tinh formazan rải rác Hình ánh mẫu PRP1, PRP2, PRP3 mẫu tế bào gốc từ mô mỡ nuôi cấy bố sung PRP Sau 48 nuôi cấy mật đô tế bào nhiều mầu đối chứng tương ứng tinh the formazan tạo nhiều Tiến hành đo mật độ quang (OD) mức độ tạo formazan Kết báng 3.2 biếu đo 3.2 đây: Kết nghiên cứu sau sử dụng PRP cùa 11 mẫu khác ký hiệu từ PRP 1-11, sau pha lỗng nồng độ giảm dần từ 1/2 đến 1/64 dùng để thử hoạt tính tế bào gốc mô mỡ Kết cà 11 mầu PRP thử nghiệm tế bào gốc cho kết quà tốt so với nhóm đối chứng Kết phân ứng MTT: hệ số đo OD mẫu PRP4, PRP5, PRP6, PRP 7, PRP 8, PRP9, PRP10 PRP11 cho kết cao Ở mẫu PRPI, PRP2 PRP kết đo OD mẫu so sánh với kết đếm tế bào có chênh lệch, giai đoạn đầu triền khai qui trình giai đoạn khảo sát tối ưu nên kết quà thử nghiệm có the bị ánh hưởng Tuy nhiên kết cũa mẫu cao so với nhóm chứng Ở mẫu bố sung từ PRP4 đến PRP11 tế bào tăng sinh mạnh Mật độ TB cao tỷ lệ pha loãng từ 1/2 đến 1/16 Ở tỷ lệ pha loãng 1/32 1/64 tốc độ tăng sinh cùa TBG có xu hướng giám dần vần cao so với mẫu đối chứng SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 38 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Bủng 3.2: Kết giá trị đo OD phan ứng MTT (n=JJ) Tỷ lệ pha loãn g 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 PRP PRP PRP PRP PRP PRP PRP PRP 0,196 0,191 0,224 0,261 0,293 0,310 0,255 0,245 0,302 0,302 0,352 0,338 0,212 0,302 0.343 0,330 0,416 0,395 0,394 0,376 0,340 0,331 0,356 0,331 0,305 0,332 0,314 0,303 0,253 0.187 0.165 0,449 0,427 0.414 0.387 0,361 0,331 0,339 0.321 0,314 0,313 0,305 0,313 0,312 0,284 0,277 PRP 0,461 0,329 0,258 0,248 0,34 0,262 0,291 0,210 PRP 10 PRP 11 ĐC 0,373 0,340 0,295 0,274 0,243 0,226 0,255 0,230 0,229 0.165 0.142 0.131 0.163 0,217 0,200 0,189 0.152 0.130 KÉT QUẢ PHẢN ỦNG MTT TỶ LẸ PHA LOÃNG Biếu đồ 3.2: Kết so sánh giá trị đo OD phản ứng MTT (n=ll) SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 39 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính tác dụng cùa PRP tế bào cơng trình nghiên cứu cúa Krasna M cộng sự, nghiên cứu đánh giá hiệu cúa gel platelet thành phần kích hoạt tăng sinh nguyên bào sợi người in vitro, kết cho thấy, nồng độ PRP khác (0%, 0.2%, 2%, 10% 20%) kiếm tra để xác định tác dụng kích thích mạnh tăng sinh nguyên bào sợi Ớ mơi trường ni cấy có bố xung nồng độ 20% PRP chứng minh có ánh hướng mạnh nhất, 0.2% khơng có hiệu tăng sinh tất mẫu Tất cá nguyên bào sợi tự nhiên giữ hình dáng bình thường Sau chi ngày, nguyên bào sợi hoàn toàn bao phủ bề mặt giếng, tạo thành lớp dầy đặc tế bào [24], Hầu hết phương pháp để đánh giá thử nghiệm hoạt tính chất tác động hay ánh hướng đến tế bào dựa hai thơng số đặc tính hoạt động trao đối chất tính nguyên vẹn màng tế bào te bào nguyên vẹn Trong nghiên cứu em sử dụng TBG từ mô mỡ làm mô hình đánh giá hoạt tính cùa PRP điều trị thối hóa khớp có sử dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân tự mô mỡ hoạt hóa, kích hoạt huyết tương giàu tiểu cầu để điều trị thối hóa khớp gối Tuy nhiên huyết tương giàu tiếu cầu có hoạt tính tác dụng hay khơng, cần phải đánh giá hoạt tính huyết tương giàu tiểu cầu tế bào gốc mô mỡ Ket cứa em phù hợp với tác giá khác công bố sau ni cấy TBG mơ mỡ có bổ sung PRP, TBG giữ hình dạng bình thường, PRP có tác dụng kích thích TBG tăng sinh 3.2.2 Kết tác dụng PRP đến khả tạo cụm tế bào (CFU-F) TBG mơ mõ’ Một đặc tính tế bào gốc trung mô tạo cụm tế bào (CFU-F) chi tiêu để xác định tính gốc tế bào Nghiên cứu tiến hành ni cấy TBG có bố sung PRP, kết sau SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 40 GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 14 ngày đánh giá tạo CFU-F Ket thê hình 3.5 Hình 3.5: Hình ảnh khả tạo cụm tế bào (CFU-F) TBG mô mõ’ (CFU-PRP1, CFU-DC3: mẫu tế bào ni cấy có bố sung PRP; CFU-DC1, CFU-DC3: mẫu đối chứng TBG nuôi cấy không bổ sung PRP, 40X) Các kết cho thấy hoạt hóa tế bào PRP cho hiệu thúc hoạt động cùa TBG, có hoạt động tăng sinh tạo cụm te bào SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 41 GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp mạnh hơn, nhiều kích thước CFU lớn so với tế bào khơng hoạt hóa PRP PRP phát có khả hoạt hóa kích thích TBG mơ mỡ biệt hóa, tái tạo sụn thúc tăng sinh cùa TBG mô mỡ in Vitro Nghiên cứu đánh giá PRP in vitro cho thấy sở khách quan tác dụng cùa PRP tới liền vết thương việc sứ dụng PRP phối hợp với tế bào có tác dụng kích thích tăng sinh tế bào, giúp tái tạo liền vết thương nhanh Chính chúng tơi đánh giá hoạt tính PRP tế bào gốc từ mô mờ Ket cho thấy mẫu tế bào ni cấy có bổ sung PRP có kích thích tế bào tăng sinh tạo cụm tế bào tốt SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 42 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN / Đã nuôi cấy tăng sinh tế hào gốc mô mỡ: Nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ môi trường TBG trung mô bố sung 10% FBS, 1% kháng sinh, nuôi cấy nhiệt độ 37°c, 5% co2 Sau 24 nuôi cấy, tế bào có bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, sau ngày tế bào tăng sinh mạnh, sau 10 ngày tế bào đạt mật độ khoảng 80% diện tích bề mặt đĩa ni cấy Tế bào có dạng hình thoi giống ngun bào sợi, có xu hướng mọc thành đám sau tạo lớp tế bào đơn bề mặt đìa ni cấy Kết nuôi cấy tăng sinh đạt yêu cầu việc tạo nguồn tế bào làm nguyên liệu để cung cấp cho việc tạo mơ hình đánh giá tác dụng PRP Đã đánh giá hoạt tính PRP tế bào gốc mô mỡ: - Các mẫu có bồ sung PRP kích thích TBG từ mơ mỡ tăng sinh: Mật độ tế bào cao tỷ lệ pha loãng PRP từ 1/2 đến 1/16 Ớ tỷ lệ pha loãng 1/32 1/64 tốc độ tăng sinh TBG có xu hướng giảm dần cao so với nhóm chứng - PRP cho hiệu thúc đẩy hoạt động TBG, có hoạt động tăng sinh tạo cụm tế bào mạnh hơn, nhiều kích thước CFU F lớn so với tế bào khơng hoạt hóa bàng PRP SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 43 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội KIẾN NGHỊ - Đề tài nuôi cấy tăng sinh TBG từ mô mỡ đánh giá tác dụng cùa 11 mầu huyết tương giàu tiểu cầu mơ hình tế bào Do điều kiện thời gian có hạn, đề tài cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mầu lớn so sánh tác dụng cúa PRP in vitro in vivo SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 44 GVHD: Đồ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Đỗ Minh Trung, Tạ Việt Hưng, Phạm Văn Trân, Lê Văn Đơng, Đồn Văn Đệ, Nguyễn Thị Phi Nga, Trần Viết Tiến (2015) Đặc điểm phân lập, nuôi cấy, hoạt hóa tế bào gốc mơ mỡ bệnh nhân điều trị thối hóa khóp Bệnh viện Qn y 103 - Học viện Quân y Tạp Y học Việt Nam Số 429, tr: 294-300 Đỗ Minh Trung (2013) Nghiên cứu hiệt hóa tế hào gốc trung mô màng dãy rốn thành te hào dạng tạo xương Luận án tiến sĩ Tài liệu tiếng anh: Pietrzak w.s and B L Eppley (2005) Platelet rich plasma: biology and new technology J Craniofac Surg, 16 (6), 1043-1054 Sampson s, M Gerhardt and B Mandelbaum (2008) Platelet rich plasma injection grafts for musculoskeletal injuries: a review Curr Rev Musculoskelet Med, (3-4), 165-174 Goldring M.B (2000) The role of the chondrocyte in osteoarthritis Arthritis Rheum, 43 (9), 1916-1926 A R a Development (2009) Autologous Conditioned Plasma Double Syringe System All rights reserved, LB0810C, https://www.arthrcx.com/myarthrcx/whitcpapcrs/ Biomechanical Testing Ehrenfest D.M.D, L Rasmusson and T Albrektsson (2008) Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P- PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF) Trends in Biotechnology, Vol.27 (No.3), 158-167 Graziani F, s Ivanovskiy s Cei et al (2006) The in vitro effect of different PRP concentrations on osteoblasts and fibroblasts Clin Oral Implants Res, 17 (2), 212-219 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 45 GVHD: Do Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Pierce GF Inflammation in nonhealing diabetic wounds: The space time continuun does matter, Am J Pathol 2011 10 Eppley BL & cs 2004: Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing 11 Bui Hong Thien Khanh, Triet Dinh Duong, Nhan Thanh Nguyen et al (2014) Symptomatic knee osteoarthritis treatment using autologous adipose derived stem cells and platelet-rich plasma: a clinical study Biomedical Research and Therapy, 1(1), 2-8 12 p Rozman and z Bolta: “Use of platelet growth factor in treating wounds and soft-tissue injuries.” 13 Sanchez M, Anitua E, Orive G, Mujika I, Andia I Platelet-rich therapies in the treatment of orthopaedic sport injuries Sports Med 2009;39(5):345-54 14 Mahnaz Banihashemi MD, Solmaz Nakhaeizadeh Md: An introduction to application Ò platelet plasma (PRP) on skin rejuvenation 2014; (2):38- 43 15 Hyoju Kim, Kyuseok Choi, Oh-Kyeong Kweon, Wan Hee Kim (2012), “Enhanced wound healing effect of canine adipose-derived mesenchymal stem cells with low-level laser therapy in athymic mice”, Journal of Dermatological Science, 68, pp 149-156 16 Sheng-Ping Huang, Chun-Hsiang Huang, Jia-Fwu Shyu, HerngSheng Lee4, Shyi-Gen Chen, James Yi-Hsin Chan and Shih-Ming Huang (2013), “Promotion of wound healing using adipose-derived stem cells in radiation ulcer of a rat model”, Journal of Biomedical Science, pp 20-51 17 Reckhenrich A.K, Kirsch B.M, Wahl E.A, Schenck T.L, Rezaeian F, et al (2014), “Surgical Sutures Filled with Adipose-Derived Stem Cells Promote Wound Healing”, PLoS ONE 9(3): e9U69 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 46 GVHD: Đồ Minh Trung Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 18 Tobita M, Orbay H, Mizuno H Adipose-derived stem cells: current findings and future perspectives Discov Med 2011; 11 :160-170 19 Erickson GR, Gimble JM, Franklin DM, Rice HE, Awad H, Guilak F Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo Biochcm Biophys Res Commun 2002; 290 :763-769 20 Safford KM, Hicok KC, Safford SD, Halvorsen YD, Wilkison wo, Gimble JM, Rice HE Neurogenic differentiation of murine and human cells Biochem stromal adipose-derived Res Biophys Commun 2002;294 :371-379 21 Taupin p Adult ncurogcncsis, neural stem cells and Alzheimer's disease: developments, limitations, problems and promises Curr Alzheimer Res 2009;6:461-470 22 Ehrcnfest D.M.D, L Rasmusson and T Albrektsson (2008) Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P- PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF) Trends in Biotechnology, Vol.27 (No.3), 158-167 23 David c and E Peter (2008) Platelet Rich Plasma (PRP) matrix grafts Practical Management, January/ February 8(1), 12-26 24 Akhundov K, Pietramaggiori G, Waselle L, Dar- wiche s, Guerid s, Scaletta c, Hirt-Burri N, Applegate LA and Raffoul wv Development of a cost-effective method for platelet-rich plasma (PRP) preparation for topical wound healing Ann Bums Fire Disasters 2012; 25: 20713 SVTH: Bùi Thị Ngọc Anh 47 GVHD: Đồ Minh Trung ... ứng dụng Các tế bào đạt yêu cầu đú số lượng đế sứ dụng cho nghiên cứu đế làm mô hình đánh giá hoạt tính cùa huyết tưong giàu tiểu cầu 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA PRP TRÊN TÉ BÀO GỐC MÔ MỠ... hoạt huyết tương giàu tiểu cầu để điều trị thoái hóa khớp gối Tuy nhiên huyết tương giàu tiếu cầu có hoạt tính tác dụng hay khơng, cần phải đánh giá hoạt tính huyết tương giàu tiểu cầu tế bào gốc. .. adiponectin, resistin, angiotensin Thành phần tế bào cùa mô mờ bao gồm tế bào mỡ trướng thành, tế bào tiền tạo mỡ, nguyên bào sợi, tế bào trơn mạch máu, tế bào nội mô mạch máu, tế bào quanh