Nghiên cứu chế tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ và mảng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp trên mô hình thô tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MƠ HÌNH THỎ Ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2022 Cơng trình hoàn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Công Toại PGS.TS Ngô Quốc Đạt Phản biện 1: …………………………………………… Phản biện ……………………………………………… Phản biện 3: …………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN a Lý tính cần thiết nghiên cứu: Tỷ lệ mắc bệnh lý khớp ngày tăng Trên giới có khoảng 263 triệu người gặp tình trạng thối hóa khớp khoảng 20% người trưởng thành từ 45 tuổi Mỹ chẩn đoán X-quang Tại Việt Nam, tỷ lệ lưu hành bệnh thoái hóa khớp gối Xquang 44,6% người 40 tuổi Các phương pháp điều trị bệnh chủ yếu điều trị triệu chứng, trường hợp tổn thương nặng phẫu thuật thay khớp thường lựa chọn Tuy nhiên phương pháp không giúp tái tạo, phục hồi lớp mô sụn bề mặt khớp bị tổn thương Vì nhóm nghiên cứu định thực đề tài “Nghiên cứu chế tạo tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ màng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp mơ hình thỏ” b Mục tiêu nghiên cứu: Mục tiêu tổng quát: Đánh giá tiềm tái tạo mô sụn tế bào sụn mơ hình thỏ Mục tiêu chun biệt:  Thiết lập quy trình phân lập, ni cấy định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ  Thiết lập quy trình tạo tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô từ mỡ thỏ màng chân bì  Xây dựng mơ hình đánh giá hiệu phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp in vivo tế bào sụn mơ hình thỏ c Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đây nghiên cứu thực nghiệm mơ tả (mỗi thí nghiệm lập lại lần) Đối tượng nghiên cứu màng chân bì da thu nhận từ da người hiến tế bào gốc trung mô (TBGTM) thu nhận từ mơ mỡ thỏ d Những đóng góp nghiên cứu mặt lý luận thực tiễn: Ở Việt Nam có cơng trình nghiên cứu liên quan đến TBGTM thu nhận từ mô mỡ chuột, mô mỡ người Những nghiên cứu ban đầu điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp chủ yếu sử dụng phương pháp ghép mơ tự thân Sau ứng dụng tế bào gốc tiêm tế bào gốc trực tiếp vùng bề mặt sụn bị tổn thương Tuy nhiên, việc sử dụng đơn tế bào gốc để điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp chưa cho thấy hiệu mong đợi tế bào gốc lắp đầy vùng tổn thương tái tạo vùng sụn bị tổn thương Đã có nghiên cứu tiến hành thu nhận TBGTM từ mô mỡ người, thu nhận giá thể màng chân bì da người tạo tế bào sụn công nghệ in vitro Đây cơng trình nghiên cứu in vivo đánh giá hiệu tái tạo mô sụn bề mặt khớp bị tổn thương tế bào sụn mơ hình động vật Kết thu từ nghiên cứu tiền đề để tạo hướng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp người nhằm giúp tái tạo phục hồi lớp mô sụn bị tổn thương e Bố cục luận án: Luận án có 92 trang, gồm phần: Mở đầu (3 trang), Tổng quan tài liệu (29 trang), Đối tượng phương pháp nghiên cứu (15 trang), Kết (27 trang), Bàn luận (15 trang), Kết luận (3 trang), Kiến nghị (1 trang) Luận án có 27 hình, 10 bảng 182 tài liệu tham khảo bao gồm tài liệu tiếng Việt tiếng Anh TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Công nghệ mô sụn: Các thành phần để tạo tế bào sụn dựa tảng cơng nghệ mơ gồm có yếu tố tế bào, giá thể yếu tố hoạt hóa sinh học để hỗ trợ trình tạo sụn Trong đó, giá thể kết hợp với yếu tố hoạt hóa sinh học tạo môi trường thuận lợi giúp cho tăng trưởng biệt hóa tế bào, đồng thời giá thể cịn giúp tạo tồn vẹn học cấy ghép in vivo Sự tăng sinh, hoạt động biến dưỡng biệt hóa tế bào định hướng thông qua tác động yếu tố tăng trưởng Nguồn tế bào sử dụng công nghệ mô sụn nghiên cứu ứng dụng nhiều TBGTM, cho lựa chọn phù hợp thay cho tế bào sụn việc tái tạo mô Không khắc phục nhược điểm cấy ghép tế bào sụn, TBGTM cịn có khả điều biến miễn dịch giúp hạn chế trình viêm cấy ghép khả biệt hóa thành tế bào sụn 2.2 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ: TBGTM từ mô mỡ nguồn thay tế bào gốc trưởng thành tự thân, thu nhận nhiều lần với số lượng lớn mà khơng ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân Khi phân tích so sánh TBGTM từ tủy xương, từ mô mỡ cuống rốn, ghi nhận TBGTM từ mơ mỡ khơng có nhiều khác biệt mặt hình thái, kiểu hình miễn dịch tiềm biệt hóa Đồng thời tỉ lệ TBGTM mô mỡ cao tủy xương, so với TBGTM từ tủy xương TBGTM từ mơ mỡ ni cấy dễ dàng với tốc độ tăng trưởng nhanh thời gian nuôi cấy lâu trước trở nên già cỗi Bên cạnh đó, khả biệt hóa TBGTM từ mơ mỡ chịu ảnh hưởng tuổi người hiến mô 2.3 Giá thể sử dụng công nghệ mô sụn: Giá thể sinh học sử dụng để sửa chữa sụn không cung cấp hỗ trợ học cho khiếm khuyết sụn mà cung cấp chất hỗ trợ cho phát triển, khuếch tán biệt hóa tế bào gốc Giá thể màng chân bì da người ghép đồng loại phần chân bì thu nhận từ da người hiến xử lý để loại bỏ phần thượng bì hạ bì, giữ lại phần chân bì Các tế bào thuộc mơ liên kết phần chân bì tế bào cịn sót phần thượng bì hạ bì loại bỏ tác dụng tia gamma Giá thể thu khơng cịn diện thành phần gây đáp ứng miễn dịch gây thải loại ghép Sự liên kết xếp sợi collagen bên giá thể giúp tế bào thấm nhập bám dính vào giá thể 2.4 Mơ hình động vật đánh giá vật liệu ghép: Lựa chọn mơ hình động vật ngồi việc tn thủ tiêu chuẩn chung cần phải xem xét đến tiêu chí có liên quan đến tế bào cần cấy ghép, giá thể ghép yếu tố hoạt hóa sinh học hỗ trợ sử dụng để nuôi cấy tế bào Chuột thỏ có sẵn nên sử dụng nhiều cho nghiên cứu thực nghiệm in vivo để đánh giá tiềm sửa chữa sụn tế bào mơ người Các mơ hình động vật lớn với sụn khớp cứng cho phép nghiên cứu độ dày phần sửa chữa toàn bề dày sụn sửa chữa xương sụn Thỏ loài động vật thường sử dụng cho nhiều nghiên cứu y học đặc biệt lĩnh vực xương khớp Do thỏ có khớp lớn có kích thước tốt để dễ dàng tiến hành phẫu thuật xử lý mẫu Thỏ có độ dày sụn khớp từ 0,25 mm-0,75 mm, có kích thước thể thuận tiện cho việc phẫu thuật ghép chăm sóc sau ghép Ngồi ra, thể thỏ đạt đến trưởng thành mô sụn xương thời gian ngắn vào khoảng tháng tuổi, điều phù hợp để triển khai nghiên cứu liên quan xương khớp chờ đợi lâu để thu thập kết 2.5 Các phương pháp đánh giá q trình lành thương mơ sụn: Sụn tồn nhiều hình dạng kích cỡ khác nhau, chưa có tiêu chuẩn thiết lập để đánh giá q trình phục hồi mơ sụn Trong nghiên cứu mơ hình động vật chụp X quang khơng có giá trị theo dõi đánh giá phục hồi mô sụn mà chủ yếu dựa vào quan sát hình ảnh đại thể kết phân tích đánh giá mơ học 2.6 Các nghiên cứu liên quan: Các nghiên cứu giới: Tháng 7/2012, Penny Hogg cộng phát triển quy trình tạo màng chân bì da phương pháp đánh giá màng chân bì da thử nghiệm in vitro, in vivo Santos Martinez-Diaz cộng (2010) tiến hành đánh giá in vivo mơ hình thỏ Năm 2016, nhóm nghiên cứu tác giả Ken Ye cộng công bố kết chứng minh khả tạo mô ghép sụn ứng dụng tái tạo sụn kết hợp TBGTM từ mỡ xương bánh chè người với màng chân bì chuột mơ hình in vitro Năm 2018, tác giả Ken Ye cộng thực ghép màng chân bì vào khuyết sụn thỏ cho thấy màng chân bì giá thể có tiềm sử dụng sửa chữa sụn Các nghiên cứu Việt Nam: Năm 2013, tác giả Huỳnh Duy Thảo tiến hành thu nhận thu nhận TBGTM từ mô mỡ người, kết cho thấy quần thể tế bào thu nhận mang đặc tính TBGTM theo tiêu chuẩn Hiệp hội tế bào gốc Hoa Kỳ Cũng năm 2016 tác giả thử nghiệm thành công nuôi cấy TBGTM từ mỡ người giá thể sinh học Gelatin-Alginate khung Fibrin Năm 2014, tác giả Hồng Kc Hương thiết lập thành cơng quy trình thu nhận giá thể collagen từ màng chân bì da người Năm 2017, tác giả Đào Thị Thanh Thủy phân lập thành công TBGTM từ tủy xương thỏ biệt hóa thành tế bào sụn, kết hợp với giá thể polycaprolactone tạo nên mô sụn công nghệ mơ in vitro Nhóm nghiên cứu tác giả Đặng Thị Hà Thanh tạo thành công tế bào sụn từ giá thể collagen thu nhận từ da người kết hợp với TBGTM từ mô mỡ người Cả mô sụn tạo từ công nghệ mơ nghiên cứu có diện tế bào sụn chất sụn đặc trưng, cho thấy tiềm ứng dụng lâm sàng cao Hiện tại, chưa có nghiên cứu in vivo đánh giá hiệu tế bào sụn từ TBGTM từ mơ mỡ màng chân bì da ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thiết kế nghiên cứu: Thực nghiệm mơ tả (mỗi thí nghiệm lập lại lần) 3.2 Đối tượng nghiên cứu: - Màng chân bì da thu nhận từ da người hiến Bệnh viện EMCAS TP Hồ Chí Minh Tiêu chuẩn chọn mẫu: Mẫu da thu nhận theo đồng ý người hiến: • Âm tính với xét nghiệm: HIV, HBV, HCV, VDRL • Mẫu da cịn ngun vẹn, khơng bị dập nát Tiêu chuẩn loại trừ: • Khơng cho phép người hiến • Để lâu (trên tiếng nhiệt độ bình thường) - Thỏ giống New Zealands cung cấp Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 3.3 Quy trình nghiên cứu: 3.3.1 Quy trình phân lập, ni cấy định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ Mẫu mô mỡ cắt thành mảnh nhỏ ủ dung dịch enzyme Collagenase-Dispase nhiệt độ 37oC Dịch tế bào thu nhận quay ly tâm 3000 vòng/phút phút Thu phần cặn tế bào, bổ sung 5ml mơi trường ni DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS, huyền phù lọc qua phễu lọc có đường kính 70 µM Dịch tế bào sau thu nhận mang quay ly tâm 3000 vòng/phút phút Thu nhận cặn tế bào chuyển vào chai nuôi 25 cm2 nuôi ủ tủ ấm 37oC, 5% CO2 Môi trường nuôi cấy thay ngày Định danh TBGTM phương pháp kết hợp theo thông lệ quốc tế (ISCT) là: - Quan sát đặc tính bám dính TBGTM (nhuộm Giemsa để quan sát hình thái tế bào) - Đánh giá khả biệt hóa thành tế bào sụn, tế bào xương tế bào mỡ điều kiện in vitro: Quần thể tế bào sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa nhuộm đặc hiệu với Acian blue, Alizarin red Oil red O - Đánh giá dấu ấn chuyên biệt TBGTM: Chúng sử dụng RT-PCR để khuếch đại DNA mục tiêu với đoạn mồi đặc hiệu cho gien CD14, CD34, CD45, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106 glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase (GADPH) 3.3.2 Quy trình tạo tế bào sụn từ TBGTM mỡ thỏ màng chân bì Khảo sát biểu gien tạo sụn: TBGTM sau cảm ứng tạo sụn 7, 14, 21 ngày đánh giá biểu gien sox9, col2a1, col1a2, col X, acan, runx2 phương 11 KẾT QUẢ 4.1 Kết phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ 4.1.1 Kết phân lập, nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ thỏ: Trong suốt q trình nghiên cứu, mẫu mơ mỡ thu nhận Số lượng tế bào thu gam mơ mỡ lấy trung bình từ mẫu mô thu nhận vào khoảng 4,6 x 105 tế bào Đánh giá tăng trưởng TBGTM từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ ba cho thấy sau cấy chuyền, từ ngày đến ngày tế bào bắt đầu tăng sinh nhanh đạt cao vào ngày 6, sau giảm dần ngày thứ 14 (Hình 3.2) Sự tăng trưởng tế bào thu nhận từ mô mỡ Mật độ tế bào (x10^4 tế bào/ml) 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Ngày 12 Ngày 14 Ngày Trung bình Hình 3.2 Đồ thị tăng trưởng TBGTM từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ ba 4.1.2 Kết định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ: Quan sát kính hiển vi đảo ngược ghi nhận quần thể tế bào thu nhận 12 từ mô mỡ thỏ bám dính bề mặt chai ni, có hình thái giống với nguyên bào sợi (Hình 3.3) Kết nghiên cứu cho thấy quần thể TBGTM thu nhận có có khả biệt hóa thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn tế bào mỡ (Hình 3.4) Kết khảo sát biểu dấu ấn bề mặt cho thấy quần thể tế bào thu nhận có biểu dương tính với CD14, CD44, CD73, CD105 CD106 Biểu âm tính với CD34, CD45 CD90 (Hình 3.5) Hình 3.3 Tế bào gốc bám dính bề mặt chai nuôi Tế bào nhuộm Giemsa quan sát kính hiển vi đảo ngược độ phóng đại x40 (A), x100 (B) x400 (C) (D) Kết thu nhận TBGTM từ mỡ thỏ tác giả Tirpáková 13 Hình 3.4 Kết biệt hóa TBGTM từ mô mỡ thỏ in vitro (A) TBGTM biệt hóa tạo nguyên bào xương nhuộm Alizarin Red (x20) (B) TBGTM biệt hóa tạo tế bào mỡ nhuộm Oil Red O (x20) (C) TBGTM biệt hóa tạo nguyên bào sụn nhuộm Alcian Blue (x20) (E), (F) (G) TBGTM mẫu chứng tương ứng khơng biệt hóa (×20) Hình 3.5 Đánh giá biểu dấu ấn bề mặt tế bào gốc từ mô mỡ thỏ 14 4.2 Kết tạo tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ màng chân bì 4.2.1 Kết khảo sát biểu gien tạo sụn qRT-PCR: Trong suốt q trình cảm ứng biệt hóa tạo sụn, TBGTM có thay đổi biểu gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 sau 7, 14 21 ngày cảm ứng biệt hóa (Hình 3.6) Hình 3.6 Sự biểu gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 cảm ứng biệt hóa tạo sụn 15 4.2.2 Kết thu nhận giá thể màng chân bì da người: Quan sát hình ảnh mơ học ghi nhận giá thể màng chân bì hồn tồn khơng cịn diện lớp tế bào phần thượng bì Bên cạnh phần chất chân bì có nhiều khoảng trống, cấu trúc collagen có nhiều lỗ hổng tạo cấu trúc dạng xốp (Hình 3.7) Sau đưa giá thể vào chai ni có chứa TBGTM, quan sát hình ảnh mơ học ghi nhận TBGTM bám dính tăng trưởng giá thể (Hình 3.9) A B D C E 16 Hình 3.7 Kết thu nhận giá thể màng chân bì da người (A) Mẫu da người nhuộm H-SG (×10), trước xử lý để thu nhận giá thể màng chân bì (B) (C) Kết loại bỏ phần thượng bì, thu nhận phần chân bì, nhuộm H-SG, chụp vật kính (×10) (×20) (D) (E) Giá thể màng chân bì sau hồn tất quy trình, nhuộm H-SG, chụp vật kính (×10) (×20) A B B C C Hình 3.9 Kết ni cấy TBGTM màng chân bì (A) (B) Kết nuôi cấy TBGTM màng chân bì nhuộm H-SG quan sát độ phóng đại ×100 ×200 (C) Ở độ phóng đại ×400 quan sát thấy ác TBGTM diện màng chân bì bắt màu hồng đậm (mũi tên đỏ) 17 4.2.3 Kết tạo tế bào sụn từ kết hợp TBGTM màng chân bì: Kết nghiên cứu cho thấy, tế bào sụn bám dính tăng trưởng tốt màng chân bì Quan sát kính hiển vi đảo ngược thấy tế bào diện xung quanh xâm nhập vào bên kết cấu collagen màng chân bì (Hình 3.11) A B Hình 3.11 Kết chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 14 sau biệt hóa tạo sụn (A) Màng chân bì sau cuộn lần lớp TBGTM biệt hóa sụn ngày thứ 14 (độ phóng đại x100), (B) Lớp TBGTM diện xung quanh xâm nhập vào bên kết cấu collagen màng chân bì (độ phóng đại x100), (C) Lớp TBGTM bám phía ngồi rìa màng chân bì (độ phóng đại x400) 4.2.4 Kết đánh giá số đặc điểm tế bào sụn tạo mô học SEM: Trên tiêu nhuộm H&E nhuộm Safranin – O cho thấy có diện tế bào (Hình 3.14), hình thái tế bào thay đổi từ thon dài chuyển sang đa diện xung quanh tế bào bắt đầu hình thành hốc trống giống hình thái tế bào sụn mơ sụn Ngoài ra, sử dụng kỹ thuật chụp SEM để đánh giá kết tạo tế bào sụn cho C 18 thấy, tế bào sụn bám dính lan tỏa tốt bề mặt màng chân bì (hình 3.15) A B C D Hình 3.14 Cấu trúc mơ học nhuộm H&E Safranin O tế bào sụn sau chuyển TBGTM lần (A), (B) Tấm tế bào sụn nhuộm HE độ phóng đại x200 x400 cho thấy bên xuất nhiều tế bào sụn (mũi tên màu đen) (C), (D) Tấm tế bào sụn nhuộm Safranin O độ phóng đại x200 x400, kết nhuộm cho thấy tế bào sụn bắt màu đỏ cam sáng màu (mũi tên màu xanh) 4.3 Kết đánh giá tiềm tái tạo mô sụn in vivo mảnh ghép tế bào sụn mơ hình thỏ: Tổng số thỏ ghép thành công đạt tiêu thời gian nghiên cứu 18 thỏ Trong trình thực nghiên cứu loại bỏ thỏ (chiếm khoảng 14% tổng số thỏ ghép) vết mổ bị nhiễm 19 trùng, khớp đầu gối bị sưng phù, cứng bất động Nguyên nhân dẫn đến kết ghép thất bại chủ yếu khâu kỹ thuật mổ ghép chăm sóc hậu phẫu sau ghép Hình 3.15 Tấm tế bào sụn quan sát KHV điện tử quét (SEM) (A) Giá thể màng chân bì (chứng âm), khơng có ni tế bào (B) Kết tạo tế bào sụn, tế bào sụn phát triển tăng trưởng nhiều bám vào khung collagen giá thể (x200) (C), (D) Kết chụp (x500) (x1000), tế bào bám dính tăng trưởng bề mặt giá thể (mũi tên) 20 Hình 3.17 Hình ảnh thu nhận mẫu ghép để đánh giá mô học (A) Vùng tổn thương sụn không ghép mảnh ghép sau tháng; (B) Vùng tổn thương sụn có ghép mảnh ghép sau tháng; (C) Tấm tế bào sụn sau tháng cố định phẫu thuật dính với vùng mô sụn chủ xung quanh; (D) Mảnh ghép cắt mỏng để xử lý mơ học, vị trí mảnh ghép xác định rõ (mũi tên đỏ) so với vùng mô xung quanh Ở kết ghép ghi nhận sau ghép tháng khơng có cải thiện đáng kể liên quan đến khả tái sinh nội nhóm đối chứng Ở nhóm thấy xuất lớp mô chứa tế bào giống tế bào trung mô tế bào sụn vị trí tiếp xúc với vùng mơ xương lớp sụn Riêng nhóm ghép tế bào sụn thấy lớp mơ sụn tân sinh hình thành rõ có gắn kết với mơ sụn chủ, cấu trúc mơ học hình thái tế bào tương đồng với vùng mơ sụn thỏ xung quanh (Hình 3.20) Kết nhuộm Safranin O cho thấy có diện chất sụn 21 hình thành mảnh ghép tế bào sụn tương đồng với vùng sụn thỏ kế cận (Hình 3.21) A D B E C F Hình 3.20 Kết khảo sát mơ học tế bào sụn thỏ sau tháng (A), (B), (C) kết đánh giá mô học nhuộm H&E vùng tổn thương sụn gối trái không ghép (A), nhóm ghép màng chân bì (B) nhóm ghép tế bào sụn (C) (D), (E), (F) 22 kết đánh giá mô học nhuộm Trichrome vùng tổn thương sụn gối trái không ghép (D), nhóm ghép màng chân bì (E) nhóm ghép tế bào sụn (F), (phóng đại x100) B A Hình 3.21 Kết nhuộm Safranin O tế bào sụn thỏ (A) vùng sụn bình thường thỏ (x40), tế bào sụn bắt màu cam nhạt chất sụn quan sát độ phóng đại x100 (B) x200 (C) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận: Đã thiết lập quy trình phân lập, nuôi cấy định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ cách hiệu  Tế bào thu gam mơ mỡ lấy trung bình từ mẫu mô thu nhận vào khoảng 4,6 x 105 tế bào  Quần thể tế bào thu nhận có đường cong tăng trưởng đạt đỉnh vào ngày thứ sau ni cấy, sau giảm dần đến ngày thứ 14 C 23  Nguồn tế bào thu nhận thỏa tiêu chí TBGTM ISCT: hình thái giống ngun bào sợi, khả bám dính bề mặt chai ni có tiềm biệt hóa thành nguyên bào xương, nguyên bào sụn tế bào mỡ  Đánh giá biểu dấu ấn bề mặt TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ ghi nhận dương tính với CD14, CD73, CD105, CD106, CD44 âm tính với CD34, CD45, CD90 hệ thứ Đã thiết lập quy trình tạo tế bào sụn từ TBGTM mô mỡ thỏ màng chân bì da người  Thu nhận thành cơng giá thể màng chân bì da người, thỏa điều kiện giá thể đáp ứng tiêu chí sinh học độ vô khuẩn không gây độc cho tế bào, phù hợp cho tế bào bám dính tăng sinh  Quần thể TBGTM thu nhận từ mỡ thỏ sau cảm ứng biệt hóa tạo sụn với mốc thời gian 7, 14 21 ngày có biểu rõ ràng với gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2  Đã thiết lập quy trình tạo tế bào sụn từ TBGTM từ mô mỡ thỏ màng chân bì Lớp TBGTM cảm ứng tạo sụn bám dính phát triển giá thể màng chân bì Đánh giá số đặc điểm tế bào sụn tạo mô học (nhuộm H&E Safranin O) SEM cho thấy tế bào sụn có đặc tính mang tế bào tương đồng với mô sụn, TBGTM tăng trưởng cấu trúc màng chân bì biệt hóa tiết chất sụn đặc trưng 24 Đã xây dựng thành cơng mơ hình đánh giá hiệu tế bào sụn phục hồi tổn thương bề mặt sụn khớp mơ hình thỏ đánh giá kết mảnh ghép với mốc theo dõi tháng, tháng tháng  Thực ghép thành cơng 18 thỏ, có thỏ mang mảnh ghép tế bào sụn thỏ mang mảnh ghép màng chân bì khơng có tế bào với thời gian theo dõi tháng, tháng tháng  Kết đánh giá dựa vào hình ảnh mơ học (Nhuộm H&E, Trichrome Safranin O) cho thấy tế bào sụn tạo từ TBGTM từ mơ mỡ thỏ màng chân bì da người có hiệu tái tạo mơ sụn tốt so với nhóm chứng khơng ghép nhóm ghép màng chân bì khơng mang tế bào Nhóm ghép tế bào sụn quan sát thấy phục hồi lớp mô sụn bị tổn thương tốt mảnh ghép gắn kết chặt chẽ có đặc tính mô học tương đồng với vùng mô sụn chủ 5.2 Kiến nghị: - Thực thêm đánh giá biệt hóa in vivo tế bào sụn nhuộm hóa mơ miễn dịch với protein chất đặc trưng cho mô sụn - Khảo sát biểu gien tạo sụn tế bào sụn in vitro in vivo - Tiến hành ghép thực nghiệm mơ hình động vật lớn có cấu trúc khớp tương đồng với người DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN Dang, Q.T., et al., Human Chondrocytes from Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Seeded on a Dermal-Derived Collagen Matrix Sheet: Our Preliminary Results for a Ready to Go Biotechnological Cartilage Graft in Clinical Practice Stem Cells International, 2021 Đặng Trần Quân cộng sự, Thiết lập quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ Y Học TP Hồ Chí Minh, 2021 25(1) Đặng Trần Quân cộng sự, Điều trị tổn thương sụn khớp mảnh ghép tế bào gốc mơ hình động vật Y Học TP Hồ Chí Minh, 2021 25(4) ... biện 3: …………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc... e Bố cục luận án: Luận án có 92 trang, gồm phần: Mở đầu (3 trang), Tổng quan tài liệu (29 trang), Đối tượng phương pháp nghiên cứu (15 trang), Kết (27 trang), Bàn luận (15 trang), Kết luận (3... mốc thời gian tháng, tháng tháng, mốc thời gian số thí nghiệm lặp lại lần Mỗi giai đoạn 1, tháng tiến hành thu nhận mảnh ghép để làm mô học (nhuộm H&E, Trichrome Safranin O) nhằm đánh giá kết ghép