Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetycholinesterase của các phân đoạn dịch chiết thân cây Hoàng liên (Mahinia nepalenis DC. Berberidaceae)

NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TÔNG KÉT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÁP SỞ NÀM 2020 - 2021 Tên đề tài: Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết thân Hoàng liên (Mahonia nepalensis DC Berberidaceae) Số hợp đồng: Chú nhiệm đề tài: Nguyễn Đăng Khoa Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: 2020 - 2021 TP Hồ Chỉ Minh, ngày 04 tháng 08 năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐÀU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Độ hấp thụ (Absorbance) ACh Acetylcholin AChE Enzym actylcholinesterase ACTI Acetylthiocholine iodid BuOH Butanol cv Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HC1 Acid hydro clorid HPLC Sac ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) MeOH Methanol NXB Nhà xuất pH Chỉ số đo hoạt động ion hidro (Hydrogen power) RSD Độ lệch chuẩn tuơng đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) STT Số thứ tự TCL Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Giá trị trung bình uv Tia tử ngoại (Ultraviolet) DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Trang STT Tên bảng Bảng 3.1 Thành phần hồn hợp phản ứng Hình 1.1 Hồng liên Hình 1.2 Công thức cấu tạo số chất thân Hồng liên Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên Hình 2.2 Quá trình phản ứng diễn phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE cùa Berberin clorid TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN cúư STT Kết quà đạt Công việc thực Chiết xuất phân đoạn Các phân đoạn Hoàng liên có độ Hồng liên có độ phân cực phân cực khác khác Đánh giá tác dụng ức chế Phân đoạn có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase enzym acetylcholinesterase phân đoạn Hoàng liên STT Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Ọuy trình chiết xuất cao thân Quy trình chiết xuất cao thân cây Hoàng liên Hoàng liên Ọuy trình đánh giá tác dụng ức Quy trình đánh giá tác dụng ức che enzym acetylcholinesterase chế enzym acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết phân đoạn dịch chiết thân thân Hoàng liên Hoàng liên Bài báo khoa học cấp trường Bài báo khoa học cấp trường Thời gian thực hiện: 2020 - 2021 Thời gian nộp báo cáo: Tháng 08/2021 MỞ ĐẦU Cuộc sống đại ngày phát triển với gia tăng bệnh suy giảm trí nhớ - đặc biệt Alzheimer khơng nguời cao tuổi mà chí người trẻ tuổi mắc phải Năm 2012, Tổ chức y tế giới cảnh báo mối lo ngại bệnh gây đưa bệnh Alzheimer vào vấn đề sức khỏe cộng đồng cần ưu tiên [11] Nghiên cứu cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, thống kê châu Á có khoảng gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 số có the tăng lên đến 62,8 triệu người Việt Nam có khoảng hon triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng điển hình Alzheimer Đây coi bệnh nặng nhóm bệnh sa sút trí tuệ, mối quan tâm hàng đầu nhà lão khoa toàn giới nước ta tuổi thọ trung bình ngày cao, số người mắc bệnh ngày nhiều [6] Bệnh nhân bị Alzheimer sè bị giảm khả xét đốn, định hướng khơng gian thời gian, ngôn ngữ, tư nhận thức hành động ảnh hưởng nặng nề đến chức chất lượng sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình xã hội Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm thuốc ức chế cholinesterase, thuốc kháng thụ the N-methyl - D - Aspartat, thuốc tăng cường hoạt tính serotonin Ba nhóm thuốc đa số thuốc tân dược, giá thành tương đổi cao có nhiều tác dụng phụ khơng mong muốn Do nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đế hồ trợ điều trị Alzheimer cần thiết Acetylcholinesterase (AChE) enzym có mặt khe synap hệ thần kinh trung ương có vai trị trì ổn định nồng độ chất dần truyền thần kinh Acetylcholin [8] Với việc Whitehouse lần đưa giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer vào năm 1982, AChE xác định đích phân tử đoi với bệnh Trên sở đó, vài phương pháp thử ỉn vitro xây dựng Trong đó, phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman sử dụng phố biến nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE ỉn vitro Đây hướng quan trọng nhận nhiều quan tâm nhà khoa học giới nước, đặc biệt thuốc có nguồn gốc dược liệu Theo Y học cố truyền Trung Quốc, Hoàng liên thân rễ phơi khơ nhiều loại Hồng liên như: Coptỉs chỉnensỉs Franch, Coptis teeta Wall, Coptỉs teetoides C.Y Cheng, Coptis deltoỉdea C.Y Cheng et Hsisao, Coptis quỉnquesecta thuộc họ Hoàng liên biết đen với nhiều công dụng kháng khuấn, chổng virus, chổng viêm Ớ Việt Nam, Hoàng liên dùng phố biến thuốc với nhiều tác dụng tốt Gần đây, số nghiên cứu cho thấy hợp chất berberin so alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm ức chế enzym AChE cao mở hướng điều trị bệnh Alzheimer Nhận thấy, dịch chiết Hồng liên có chứa lượng lớn alkaloid đặc biệt berberin có tiềm lớn nghiên cứu phát triến thuốc từ dược liệu để phòng điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ - Alzheimer Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết thân Hoàng liên (Mahonia nepalensis DC Berberidaceae)” với mục tiêu: - Mục tiêu 1: Chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hồng liên có độ phân cực khác - Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên CHƯƠNG TĨNG QUAN TÀI LIỆU Hiện có nhiều loài Hoàng liên đưa vào sử dụng nghiên cứu Coptis chỉnensỉs Franch, Coptỉs teeta Wall, Coptis deltoỉdea C.Y.Cheng et Hsiao, Coptỉs quỉnqueseeta Họ Hoàng liên Hoàng liên: Mahonỉa nepaỉensis DC Berberidaceae thuốc thuộc loại quý với nhiều tác dụng dùng nhiều thuốc Việt Nam Tên khác: Hoàng liên chân gà, Xun liên, Phàng lình (H’Mơng) [9] Read Coptis (Anh), Coptis Savoyard (Pháp) [2,9], Gia liên (Trung Quốc) [9], Hoàng liên: Mahonỉa nepaỉensỉs DC Berberidaceae thân thảo, sống nhiều năm, cao 10-25 cm Thân rễ có màu vàng thường phân nhánh, có cuống dài mọc tập trung gốc, dài mảnh chia thành thùy Mép khía khơng đều, thùy gần giống tam giác cân xẻ thùy hình dạng lơng chim, khơng Hai thùy bên giống có cuống ngắn thùy Lá có màu xanh lục, nhằn bóng, cụm hoa gồm 3-5 hoa mọc tụ cuống chung dài khoảng 25 cm Hoa nhỏ có màu vàng, bắc nhỏ, bao hoa màu lục Năm đài có hình mác, cánh hoa thon dài, hoa có khoảng 20 nhị Lá noãn rời khoảng 8-12 noãn Cây hoa từ tháng 10 - 12 Quả có màu đen từ tháng 12 đen tháng năm sau, nhỏ, dài - cm, có cuống ngắn Vào mùa xuân con, chồi tái sinh từ thân rễ [2,4,5,7,9] Hình 1.1 Hồng liên Thân Hồng liên chứa hầu hết alkaloid (5 - 8%), chủ yếu berberin, worenin, jatrorrhizin, palmatin, coptisin, columbamin Ngồi cịn có alkaloid có nhân phenol, alkaloid khơng có nhân phenol Phưong pháp sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp quang phổ tử ngoại dùng đế xác định berberin hydrochlorid, palmatin clorid, jatrorrhizin hydrochlorid, epiberberin, coptisin, columbamin magnoílorin Berberin tinh khiết dạng tinh thể kết tinh màu vàng, điểm nóng chảy 145 °C, tan nhiều nước 20 °C, tan ethanol, tan clorofom, benzen, không tan ether ethylic UVmax 265, 243 nm Hàm lượng berberin Hoàng liên đạt - 6% có tới 9% [9], Theo quy định 10 Dược điển Việt Nam V, Dược liệu phải chứa 3,5 % beberin (C20H18NO4 HC1) 0,5% (C21H22NO4 HC1) palmatin tính theo dược liệu khơ kiệt [3] 11 ❖ Tiên hành đo quang theo phương pháp đo quang Ellman Hồn hợp phản ứng bao gồm 700 pl dung dịch đệm natri phosphate (pH = 8); 100 pl dung dịch thử nồng độ khác 100 pl dung dịch enzym AChE 0,25 lư/ml Trộn cuvet cm đem ủ 15 phút 25 °C Các dịch chiết thử chất chuẩn dương (Berberin chlorid) hịa tan methanol Sau đó, thêm 50 pl DTNB 2,5 mM 50 pl ACTI 2,5 mM trộn Tiếp tục ủ hồn họp 10 phút 25 °C Sau đó, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Tất thí nghiệm lặp lại lần ❖ Ket đảnh giá tác dụng ức chế AChE Ket tác dụng ức che enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà berberin clorid trình bày bảng 3.2 hình 3.1, hình 3.2 Bảng 3.2 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên Berberin clorid Mầu thử IC50 (gg/ml) EtOH 15,62 ±0,26 n- hexan 57,86 ±0,86 EtOAc 105,83 ± 1,95 n-BuOH 10,44 ±0,16 Berberin clorid 0,282 ± 0,03 26 1.0 1.5 2.5 2.0 3.0 3.5 Log (Nồng độ) (ụg/ml) Hình 3.1 Đồ thị biểu diền khả ức chế hoạt độ enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên Giá trị IC50 cùa phân đoạn dịch chiết tính dựa vào đồ thị chuyển từ log [pg/ml] sang Ịig/ml 110 100 ■ 90 80 70 60 Berberin clorid 50 40 30 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 Log (Nơng độ) (ng/mL) 27 0.5 1.0 Hình 3.2 Đồ thị biếu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE Berberin clorid Giá trị ICsoBerberin clorid tính dựa vào đồ thị chuyến từ log [pg/ml] sang pg/ml Nhận xét: Ket bảng 3.2 cho thấy tất mẫu cắn có tác dụng ức chế AChE mức độ khác Tác dụng ức chế AChE phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp với IC50 105,83 ± 1,95 pg/ml hoạt tính cịn yếu hoạt tính mẫu tồn phần EtOH Phân đoạn dịch chiết n- BuOH dịch chiết tong EtOH cho thấy có tác dụng ức che enzym AChE cao với IC50 10,44 ± 0,16 15,62 ± 0,26 pg/ml Tiếp phân đoạn n- Hexan có tác dụng ức chế enzym AChE với IC50 57,86 ± 0,86 pg/ml Tuy nhiên, hoạt tính phân đoạn n-BuOH EtOH yếu hoạt tính chuẩn dương berberin clorid với giá trị IC50 0,282 ± 0,03 pg/ml Với tác dụng ức chế mạnh AChE nồng độ thấp, phân đoạn dịch chiết n-BuOH lựa Hình 3.1 3.2 the mối tương quan giừa giá trị Log nồng độ mẫu thử Berberin clorid so với phần trăm tác dụng ức che enzym AChE 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thu kết sau: - Đã chiết xuất phân lập phân đoạn dịch chiết Hoàng liên: EtOH, n- Hexan, EtOAc n-BuOH - Đã đánh giá tác dụng ức chế AChE phân đoạn dịch chiết Hồng liên có độ phân cực khác nhau: + Phương pháp đo quang Ellman sử dụng + Các phân đoạn dịch chiết khảo sát nồng độ 1000 pg/ml; 500 pg/ml; 250 pg/ml; 125 pg/ml; 62,5 pg/ml; 31,25 pg/ml; 15,625 pg/ml; 7,8125 pg/ml có so sánh đối chứng với mầu berberin clorid chuẩn + Phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho tác dụng ức chế mạnh với IC50 10,44 ±0,16 pg/ml Kiến nghị - Đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE phân đoạn dịch chiết nBuOH Hoàng liên - Tiếp tục nghiên cứu tinh chế họp chất tinh khiết phân đoạn dịch chiết Hoàng liên - Thử tác dụng ức chế AChE chất phân lập - Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE Hoàng liên in vivo nghiên cứu lâm sàng Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Phạm Thị Phương Anh (2001), “Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chế biến vị thuốc Hoàng liên (Coptis chinensỉs Franch) đến thành phần hóa học tác dụng sinh học”, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội [2] Bộ Khoa học Công nghệ (1996), Sách Đỏ Việt Nam Phần thực vật (Red data book of Việt Nam voỉum plants), NXB Khoa Học Kĩ Thuật, 100 [3] Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam, NXB Y học [4] VÕ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học,565 [5] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam tập 1, NXB Trẻ,325 [6] Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất Y học [7] Đồ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 189 [8] Đào Văn Phan, Nguyền Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học, NXB Giáo dục Việt Nam,(l):69-71 [9] Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kì Thuật,497 TIẾNG ANH [10] Adsersen A., Gauguin B Gudiksen L et al (2006), “Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory Acetylcholinesterase inhibitory activity”, Journal of dysfunction for ethnopharmacology, 104:418-422 [11] Alzheimer's A (2012), "2012 Alzheimer’s disease facts and figures", Alzheimer's & Dementia, 8(2): 131-168 [12] Chen L, Wang L, Zhang Ọ, Zhang s, Ye w (2012), “Non-alkaloid chemical constituents from Coptis chinensis”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, May;37(9): 1241-4 [13] Cullar Mj, Giner R.M et al (2001), “Topical anti inflammatory activity of some Asian medical plants used in dermatological disorders”, Fitoterapia (Milano),72(3):22V229 [14] Department of pharmacy, National University of Singapore (1993), “Displacement of bilirubin from albumin by berberin”, Biol-Neonate, 63(4):2018 [15] Di Giovanni s., Borloz A Urbain A et al (2008), “Z/7 vitro screening assays to identify natural or synthetic Acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods”, European journal of pharmaceutical sciences, 33:109-119 [16] Dongqing Jiang, Dianhui Wang, Xianghua Zhuang, Zhanqing Wang, Yihong Ni, Shihong Chen, Fudun Sun (2016), “Berberine increases adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes through the AMPK pathway”, Lipids in Health and Disease, Dec 9;15(1):214 [17] Dorothea Kaufmann, Anudeep Kaur Dogra, Ahmad Tahrani, Florian Herrmann, Michael Wink (2016), “Extracts from Traditional Chinese Medicinal Plants Inhibit Acetylcholinesterase, A Known Alzheimer’s Disease Target”, Molecules, Aug 31 ;21 (9) [18] Ellman G L., Courtney K D., Andres V et al (1961), “A new and rapid colorimetric determination of Acetylcholinesterase activity”, Biochemical pharmacology ,(7):88-95 [19] Enhui Cui, Xiaoyan Zhi, Ying Chen, Yuanyuan Gao, Yunpeng Fan, Weimin Zhang, Wuren Ma, Weifeng Hou, Chao Guo, and Xiaoping Song (2014), “Coptis chinensis and Myrobalan (Terminalia chebulà) Can Synergistically Inhibit Inflammatory Response In Vitro and In Vivo", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014:510157 [20] Eunhee Kim, Sejin Ahn, Hae-ik Rhee, Deug-chan Lee (2016), “Coptis chinensis Franch extract up-regulate type I helper T-cell cytokine through MAPK activation in MOLT-4 T cell”, Journal of Ethnopharmacology, Aug 2;189:126-31 [21] Fan Jia, Gang Zou, Jingjing Fan, Zhiming Yuan (2010), “Indentification of palmatine as an inhibitor of West Nile virus”, Archives of Virology, Aug; 155(8): 1325-9 [22] Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK (1999), "The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress", Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66(2): 137-147 [23] George T Grossberg (2003), “Cholinesterase Inhibitors for the Treatment of Alzheimer’s Disease: Getting On and Staying On”, Current Therapeutic Research, 64:216-235 [24] Hang Ma, Yinran Hu, Zongyao Zou, Min Feng, Xiaoli Ye, Xuegang Li (2016), “Antihyperglycemia and Antihyperlipidemia Effect of Protoberberine Alkaloids From Rhizoma Coptidis in HepG2 Cell and Diabetic KK-Ay Mice”, Drug Development Research, Jun;77(4): 163-70 [25] Hawkins, K.I and C.E Knittie (1972), "Comparison of Acetylcholinesterase determinations by the Michel and Ellman methods" Analytical chemistry 44(2): p 416-417 32 PHỤ LỤC 3: MINH CHỨNG ĐI KÈM SẢN PHẢM DẠNG (hình ảnh sản phẩm đạt ) SẢN PHẦM DẠNG 2: (quy trình, sơ đồ, bảng vẽ, sở liệu ) SẢN PHẦM DẠNG 3: (toàn văn báo, sách chuyên khảo ) SẢN PHẢM ĐÀO TẠO: gồm hồ sơ sau - Quyết định hướng dần sinh viên (hoặc giấy xác nhận Ban chù nhiệm Khoa) - Biên họp hội đong luận văn sinh viên (có the tên sinh viên, giảng viên hướng dần, tên đe tài, kết quả) 33 MINH CHỨNG BÀI BÁO Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết thân Hoàng liên (Mahonia nepalensis DC Berberidaceae) Nguyễn Đăng Khoa, Đoàn Phú Quý, Đỗ Quốc Lộc ĐẬT VẤN ĐÈ Cuộc sống đại ngày phát triến với gia tăng bệnh suy giám trí nhớ - đặc biệt Alzheimer khơng chi người cao tuối mà chí người trẻ tuối mắc phải Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm thuốc ức che cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl - D - Aspartat, thuốc tâng cường hoạt tính serotonin Ba nhóm thuốc đa số thuốc tân dược, giá thành cịn tương đối cao có nhiều tác dụng phụ khơng mong muốn Do nhu cầu nghiên cứu phát triền thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đế hỗ trợ điều trị Alzheimer cần thiết Hoàng liên biết đen với nhiều công dụng kháng khuấn, chống virus, chống viêm Ớ Việt Nam, Hoàng liên dùng phố biến thuốc với nhiều tác dụng tốt Gần đây, số nghiên cứu cho thay hợp chất berberin so alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm nãng ức chế enzym AChE cao mỡ hướng điều trị bệnh Alzheimer Nhận thấy, dịch chiết Hồng liên có chứa lượng lớn alkaloid đặc biệt berberin có tiềm lớn nghiên cứu phát triền thuốc từ dược liệu đế phòng điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ - Alzheimer Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đe tài “Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết thân Hồng liên (Mahonia nepalensìs DC Berberidaceae)” NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu Nguyên vật liệu Thân phơi khơ cùa Hồng liên Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp AChE (Sigma, Singapore) Acetylthiocholine (ACTI) (Sigma, Singapore) Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) (Sigma, Singapore) Tris-HCl berberin clorid chuẩn (Sigma, Singapore) HCI (Merck) Hệ thống máy cô quay Máy đo quang uv Aligent technologies Cary 60 UV-Vis (Mỹ) thiết bị dụng cụ cần thiết khác Phưoiig pháp nghiên cứu Phương pháp chiết xuất phân đoạn dịch chiết Đế đánh giá tác dụng ức chế AChE, đầu tiên, tiến hành chiết xuất dược liệu thân rễ Hồng liên khơ thu ethanol (EtOH) dịch EtOH chứa thành phần alkaloid Dịch chiết EtOH sau chiết bang dung mơi n-Hexan, Ethyl acetat n-Buthanol thu phân đoạn dịch chiết Cách tiếp cận Phương pháp đo quang in vitro dùng đế đánh giá tác dụng ức chế AChE xây dựng sử dụng nghiên cứu phố biến Nguyên tắc cùa phương pháp sau [18]: Cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI) bị thùy phân nhờ xúc tác AChE tạo thiocholin Sán phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chat acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng Lượng hợp chất màu tạo thành tỳ lệ thuận với hoạt độ AChE Dựa vào xác định độ hấp thụ cúa mầu thứ 412 nm đế đánh giá hoạt tính AChE Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế A ChE in vitro Tiến hành pha đệm natri phosphat pH = 8, pha enzym dạng đông khô đệm tris-HCl, mẫu thử, mẫu chứng nồng độ thí nghiệm Thêm dung dịch gồm: dung dịch đệm natri phosphat pH = 8, dung dịch mẫu thừ mầu chứng dung dịch enzym vào cuvet cm Hỗn hợp dung dịch trộn ù 25°c 15 phút Sau đỏ, dung dịch 34 thuốc thử DTNB dung dịch chất ACTI thêm vào hỗn hợp trộn Tiếp tục ủ hỗn hợp 10 phút 25 °C, sau đó, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Mồi thử nghiệm lặp lặp lại lần Phần trăm ức che hoạt độ enzym AChE (% 1) tính theo cơng thức: Ac - At X 100 %I= Ac - Ao %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế Trong đó: Ac: độ hấp thu cùa mẫu chứng (không chứa lOOpl dung dịch thừ) At: độ hấp thu cùa mẫu thừ Ao: độ hấp thu cùa mẫu trang (1000 pL dung dịch đệm natri phosphat) Từ giá trị 1% xác định được, tiến hành tính giá trị ICso (nồng độ mẫu ức chế 50% hoạt tính enzym) mẫu thừ sau: Pha dãy nồng độ cúa mẫu thừ, xác định 1% nồng độ mẫu thử Với mẫu thử có tương quan tuyến tính giá trị 1% nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.x + b, đó, y giá trị % tác dụng ức che enzym X nồng độ mẫu thử Với mẫu khơng có tương quan tuyến tính 1% nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.log(x) + b Thay giá trị y = 50% vào phương trinh tuyến tính xây dựng từ tính giá trị nồng độ X Giá trị tim giá trị IC50 Đế cỏ sở đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro mẫu nghiên cứu, berberin clorid sử dụng làm mẫu chứng dương Hợp chất nghiên cứu chứng minh tác dụng ức chế AChE mạnh sừ dụng làm mẫu chứng dương nhiều nghiên cứu [17,26] KÉT QUẢ VÀ THÁO LUẬN 50 gam dược liệu (hàm ấm 10%) chiết với 500 ml dung môi EtOH 90 % bang phương pháp siêu âm ngấm kiệt; chiết lặp lại lần Gộp dịch chiết lọc qua giấy lọc; tiến hành cô quay chân khơng dịch chiết bình cầu 1,5 lít thu g can ethanol Hòa cắn với 100 ml nước cất am khuấy Thêm 100 ml dung môi n-Hexan, khuấy hồn hợp thời gian 20 phút Đế yên cho dung môi phân lớp Gạn lấy lớp dung mơi n-Hexan Lớp nước bình thêm tiếp 100 ml n-Hexan Tiến hành lặp lại lần Sau thu dịch chiết n-Hexan tiến hành quay thu cắn n-Hexan Tiếp theo, tiến hành với dung môi Ethyl acetat (EtOAc) vaf n-BuOH Ket quà tác động ức chế AChE phân đoạn Lựa chọn điều kiện thích hợp cho phương pháp đánh giá tác dụng ức che AChE in vitro sau: Bàng 3.1 Thành phần hồn hợp phàn ứng Mấu thừ (pl) STT Thành phần Mấu trăng mẫu thừ (pl) Mẩu chứng dương (pl) Mẩu trăng mầu chứng dương (pl) Đệm natri phosphat 700 800 700 800 100 100 0 pH = Mầu thử Berberin clorid AChE 0,25 lU/ml DTNB 2,5 rnM 0 100 100 100 100 50 50 50 50 35 ACTI 2,5 mM Tống thể tích (ụl) 50 50 1000 1000 36 50 50 1000 1000 Hồn hợp phản ứng bao gồm 700 pl dung dịch đệm natri phosphate (pH = 8); 100 III dung dịch thừ nồng độ khác 100 ui dung dịch enzym AChE 0,25 lư/ml Trộn cuvet cm đem ú 15 phút 25 °C Các dịch chiết thừ chất chuẩn dương (Berberin chlorid) hòa tan methanol Sau đó, thêm 50 J11 DTNB 2,5 mM 50 Lil ACTI 2,5 mM trộn Tiếp tục ù hổn hợp 10 phút 25 °C Sau đó, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Tất thí nghiệm lặp lại lần *♦* Kết đánh giá tác dụng ức chế AChE Ket quà tác dụng ức chế enzym AChE cùa phân đoạn dịch chiết Hoàng liên berberin clorid trinh bày bảng 3.2 hình 3.1, hình 3.2 Bàng 3.2 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên Berberin clorid Mau thử IC?0 (gg/ml) EtOH 15,62 ±0,26 n- hexan 57,86 ± 0,86 EtOAc 105,83 ± 1,95 n-BuOH 10,44 ±0,16 Berberin clorid 0,282 ± 0,03 37 100 Log (Nồng độ) (pg/ml) Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ức chế hoạt độ enxym AChE cùa phân đoạn dịch chiết Hoàng liên Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết tính dựa vào đồ thị chuyển từ log [pg/ml] sang pg/ml 11Ơ ♦ 100 90 s 80 I 70 • Berberin clorid 60- 50 40 30 -1.5 -1.0 0.0 -0.5 0.5 1.0 Log (Nồng độ) (ng/mL) Hình 3.2 Đồ thị biếu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE cùa Berberin clorid Giá trị ICsoBerberin clorid tính dựa vào đồ thị chuyến từ log [pg/ml] sang pg'ml Nhộn xét: Ket quà bảng 3.2 cho thay tất cà mầu cắn cỏ tác dụng ức chế AChE mức độ khác Tác dụng ức chế AChE 38 phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp với IC50 105,83 ± 1,95 pg/ml hoạt tinh cịn yếu cà hoạt tính cũa mẫu toàn phần EtOH Phân đoạn dịch chiết nBuOH dịch chiết tống EtOH cho thay có tác dụng ức chế enzym AChE cao với IC50 10,44 ± 0,16 15,62 ± 0,26 pg/ml Tiếp phân đoạn n- Hexan có tác dụng ức che enzym AChE với IC50 57,86 ± 0,86 pg/ml Tuy nhiên, hoạt tính phân đoạn n-BuOH EtOH cịn yếu hoạt tính chuẩn dương berberin clorid với giá trị IC50 0,282 ± 0,03 pg/ml Vớitác dụng ức chế mạnh AChE nồng độ thấp, phân đoạn dịch chiết n-BuOH lựa Hỉnh 3.1 3.2 mối tương quan giá trị Log nồng độ mẫu thừ Berberin clorid so với phan trăm tác dụng ức chế enzym AChE KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thu ket quà sau: - Đã chiết xuất phân lập phân đoạn dịch chiết Hoàng liên: EtOH, n-Hexan, EtOAc n-BuOH - Đã đánh giá tác dụng ức che AChE phân đoạn dịch chiết Hồng liên có độ phân cực khác nhau: + Phương pháp đo quang Ellman sử dụng + Các phân đoạn dịch chiết khảo sát nồng độ 1000 pg/ml; 500 Ịig/ml; 250 Ịig/ml; 125 pg/ml; 62,5 pg/ml; 31,25 pg/ml; 15,625 pg/ml; 7,8125 pg/ml có so sánh đối chứng với mầu berberin clorid chuẩn + Phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho tác dụng ức chế mạnh với IC50 10,44 ±0,16 pg/ml Kiến nghị - Đánh giá đặc điềm động học ức chế AChE phân đoạn dịch chiết n-BuOH Hoàng liên - Tiếp tục nghiên cứu tinh chế hợp chất tinh khiết phân đoạn dịch chiết Hoàng liên - Thử tác dụng ức chế AChE chất phân lập - Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE Hoàng liên in vivo nghiên cứu lâm sàng ÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Thị Phương Anh (2001), “Nghiên cứu ánh hường phương pháp chế biến vị thuốc Hoàng liên (Coptis chinensis French) đen thành phần hóa học tác dụng sinh học”, Luận vãn Thạc Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội [2] Bộ Khoa học Cơng nghệ (1996), Sách Đó Việt Nam Phẩn thực vật (Red data book of Việt Nam volum plants), NXB Khoa Học Kì Thuật, 100 [3] Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam, NXB Y học [4] Võ Văn Chi (1997), Từ điền thuốc Việt Nam, NXB Y học,565 [5] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cò Việt Nam tập 1, NXB Trẻ,325 [6] Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất bán Y học [7] Đồ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 189 [8] Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học, NXB Giáo dục Việt Nam,(l):69- 71 [9] Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kĩ Thuật,497 [10] Adsersen A., Gauguin B Gudiksen L et al (2006), “Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for Acetylcholinesterase inhibitory activity”, Journal of ethnopharmacology, 104:418-422 [11] Alzheimer's A (2012), "2012 Alzheimer’s disease facts and figures", Alzheimer's & Dementia 8(2): 131-168 [12] Chen L, Wang L, Zhang Q, Zhang s, Ye w (2012), “Non-alkaloid chemical constituents from Coptis chinensis”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, May;37(9):1241-4 [13] Cullar Mj, Giner R.M et al (2001), “Topical anti inflammatory activity of some Asian medical plants used in dermatological disorders”, Fitoterapia (Milano),12(3):221-229 [14] Department of pharmacy, National University of Singapore (1993), “Displacement of bilirubin from albumin by berberin’’ Biol-Neonate, 63(4):201-8 [15] Di Giovanni s., Borloz A Urbain A et al (2008), “In vitro screening assays to identify natural or synthetic Acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods’’, European journal of pharmaceutical sciences, 33:109-119 [16] Dongqing Jiang, Dianhui Wang, Xianghua Zhuang, Zhanqing Wang, Yihong Ni, Shihong Chen, Fudun Sun (2016), “Berberine increases adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes through the AMPK pathway”, Lipids in Health and Disease, Dec 9; 15( ):214 [17] Dorothea Kaufmann, Anudeep Kaur Dogra, Ahmad Tahrani, Florian Herrmann, Michael Wink (2016), “Extracts from Traditional Chinese Medicinal Plants Inhibit Acetylcholinesterase, A Known Alzheimer’s Disease Target”, Molecules, Aug 31 ;21 (9) [18] Ellman G L., Courtney K D., Andres V et al (1961), “A new and rapid colorimetric determination of Acetylcholinesterase activity”, Biochemical pharmacology,(7):88-95 [19] Enhui Cui, Xiaoyan Zhi, Ying Chen, Yuanyuan Gao, Yunpeng Fan, Weimin Zhang, Wuren Ma, Weifeng Hou, Chao Guo, and Xiaoping Song (2014), "Coptis chinensis and Myrobalan (Terminalia chebula) Can Synergistically Inhibit Inflammatory Response In Vitro and In Vivo”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014:510157 [20] Eunhee Kim, Sejin Ahn, Hae-ik Rhee, Deug-chan Lee (2016), “Coptis chinensis Franch extract up-regulate type I helper T-cell cytokine through MAPK activation in MOLT-4 T cell”, Journal of Ethnopharmacology’, Aug 2; 189:12631 [21] Fan Jia, Gang Zou, Jingjing Fan, Zhiming Yuan (2010), “Indentification of palmatine as an inhibitor of West Nile virus” Archives of Virology, Aug; 155(8): 1325-9 ... việc thực Chiết xuất phân đoạn Các phân đoạn Hoàng liên có độ Hồng liên có độ phân cực phân cực khác khác Đánh giá tác dụng ức chế Phân đoạn có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase enzym acetylcholinesterase... acetylcholinesterase phân đoạn Hoàng liên STT Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Ọuy trình chiết xuất cao thân Quy trình chiết xuất cao thân cây Hoàng liên Hoàng liên Ọuy trình đánh giá tác dụng ức Quy trình đánh giá. .. dụng ức Quy trình đánh giá tác dụng ức che enzym acetylcholinesterase chế enzym acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết phân đoạn dịch chiết thân thân Hoàng liên Hoàng liên Bài báo khoa học cấp