Đánh giá tác dụng cao chiết ethanol nấm vân chi (Coriolopsis aspera) trong điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp trên chuột Swiss albino.pdf

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH …… 0o0…… BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Đánh giá tác dụng cao chiết ethanol nấm vân chi (Coriolopsis aspera) điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp chuột Swiss albino Mã số đề tài: 21/1SHTPSV15 Chủ nhiệm đề tài: Quảng Trần Phương Tuyên Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, tháng 9/2022 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài “Đánh giá tác dụng cao chiết ethanol nấm vân chi (Coriolopsis aspera) điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp chuột Swiss albino”, nhóm chúng em nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, trường Đại học Công nghiệp TP.HCM, đặc biệt ThS Trần Thị Phương Nhung – người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ kiến thức, tài liệu phương pháp thực Chúng em xin chân thành cảm ơn hỗ trợ tận tình thầy Xin cảm ơn Trung tâm xét nghiệm Huyết học, khoa Mô bệnh học thuộc bệnh viện Quân Y 175 TP HCM, Viện Pauster TP HCM giúp đỡ nhóm chúng em suốt trình thực đề tài nghiên cứu khoa học Cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí cho đề tài chúng em, đồng thời cảm ơn nhà trường tổ chức thi Khoa học Eureka cấp trường Hội nghị Khoa học trẻ lần thứ 4, tạo môi trường điều kiện cho chúng em học tập trình bày kết nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè bên cạnh, động viên, cổ vũ tinh thần suốt trình thực đề tài Một lần nhóm chúng em xin chân thành cảm ơn tất người bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi giúp cho nhóm chúng em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu khoa học Chúng em xin chân thành cảm ơn! PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Đánh giá tác dụng cao chiết etanol nấm vân chi (Coriolopsis aspera) điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp chuột Swiss albino 1.2 Mã số: 21/1SHTPSV15 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Quảng Trần Phương Tuyên Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm Tô Minh Quân Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm Trần Hồi Ninh Viện Cơng nghệ Sinh học – Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài Thành viên Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2021 đến tháng năm 2022 1.5.2 Gia hạn (nếu có): tháng năm 2022 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2021 đến tháng năm 2022 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu: Thay đổi liều lượng điều trị EtCA từ 100, 200, 300 mg/kg b.w xuống 50, 75, 100 mg/kg b.w 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề 1.1 Tổng quan 1.1.1 Giới thiệu viêm khớp Viêm khớp dạng thấp (RA) dạng rối loạn viêm mãn tính khớp, đặc trưng tình trạng viêm ăn mòn phá hủy chất hoạt dịch, sụn khớp [1] Các biểu lâm sàng liên quan đến khớp đối xứng bao gồm đau khớp dội, sưng, phá hủy sụn xương dẫn đến suy giảm chức khớp [3] RA gây nhiều biến chứng gây tàn tật, tử vong sớm, gánh nặng toàn xã hội [5] Các chất bổ trợ Freund thành phần gây cảm ứng viêm khớp nhiều mơ hình động vật thí nghiệm bệnh tự miễn Viêm khớp gây CFA phát triển theo hai giai đoạn: viêm quanh nhu động cấp tính liên quan đến xương [7] Tiêm chất bổ trợ hoàn chỉnh Freund (CFA) vào chân sau chuột gây viêm cục 12h viêm mãn tính - tuần 1.1.2 Giới thiệu nấm vân chi Nấm vân chi (Coriolopsis aspera) loài nấm Polyporales C aspera chứa polysaccharit gồm chất gắn với protein (protein-bound) PSP; B-1,3; B-1,4 glucan, lanostane loại triterpenoit sterol ergosta-7,22, dien-3β-ol, mushisterol β-sitosterol [12] Mũ nấm dẹt, mặt có múi đồng tâm, thịt dày 1–3 mm, có vân, màu nâu, đen xanh, nắp phẳng, diện tích x x 0,5 cm, hình tam giác hình trịn [3] 1.1.3 Tác dụng nấm vân chi Trong y học cổ truyền châu Á Đông Âu nấm dược liệu sử dụng để điều trị bệnh Chúng đánh giá cao việc hỗ trợ kéo dài tuổi thọ, điều trị bệnh truyền nhiễm, ung thư tăng cường sức khỏe [4] Nấm vân chi (Coriolopsis spp.) lên năm gần không nguồn thuốc, chất bổ trợ cho liệu pháp hóa, xạ trị để tăng cường hiệu lực, giảm tác dụng phụ [5] Coriolopsis spp Còn chứa polysaccharit, hoạt chất có tính chống ung thư [14] Ngồi ra, nấm vân chi cịn có tác dụng tăng cường miễn dịch [17] 1.2 Sự cần thiết đề tài Dược liệu dân gian có tiềm lớn việc chữa trị loại bệnh [18] Dược liệu dân gian dễ trồng, dễ chiết xuất, có tính kháng viêm phổ biến Do đó, chiết xuất dược liệu trở thành nguồn vật liệu vô giá cho việc phát triển loại thuốc Thành phần chiết xuất C aspera Việt Nam có chứa hợp chất có khả chống oxy hóa, chống ung thư kháng viêm [13] hứa hẹn loại thảo dược hữu hiệu điều trị bệnh 1.3 Một số nghiên cứu ứng dụng thực tiễn 1.3.1 Việt Nam Nấm vân chi (Coriolopsis spp.) loại nấm dược liệu quý sử dụng Trung Quốc từ cách 2000 năm Các nhà khoa học tìm thấy Coriolopsis spp hợp chất PSK PSP có tác dụng ức chế tế bào ung thư, nâng cao hoạt tính miễn dịch thể Vì vậy, Coriolopsis spp hỗ trợ tăng sức đề kháng, ngăn ngừa xâm nhập virus, vi trùng, giảm tác dụng phụ hoá trị, xạ trị, hỗ trợ kích thích hệ miễn dịch, hỗ trợ ức chế phát triển tế bào ung thư Các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng người bệnh chứng minh tác dụng quý giá hoạt chất Coriolopsis spp [25] 1.3.2 Thế giới Chiết xuất nước nấm vân chi (Coriolopsis spp.) thành phần có chứa axit gallic, p coumaric, caffeic, flavonoit baicalein, quercetin có tác dụng kháng khuẩn, chống oxy hóa, chất ức chế AChE, điều trị bệnh Alzheimer PSP PSK tăng cường miễn dịch, giải phóng cytokine, kích hoạt tế bào tiêu diệt tự nhiên [29] Chiết xuất thu từ Coriolopsis spp kích thích tế bào miễn dịch, ức chế phát triển ung thư [30] Mục tiêu 2.1 Mục tiêu tổng quát: Đánh giá tác dụng chiết xuất etanol nấm vân chi (C aspera) (EtCA) điều trị viêm khớp dạng thấp CFA gây chuột Swiss albino 2.2 Mục tiêu cụ thể Đánh giá hiệu CFA (Freund’s Complete Adjuvant) gây bệnh viêm khớp dạng thấp (RA) chuột Đánh giá tác dụng EtCA điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp CFA chuột Phương pháp nghiên cứu 3.1 Thu nhận cao chiết nấm vân chi (EtCA) Phương pháp tạo cao chiết nấm vân: Sử dụng bột khơ có nguồn gốc từ thể nấm (5,25 g) ngâm etanol 70% (65 mL) 10 nhiệt độ phòng Huyền phù lọc lọc cellulose định tính Whatman (Whatman, Maidstone, Anh) cô đặc đến 50 mL điều kiện chân khơng; sau dịch chiết bảo quản -20°C để phân tích thêm 3.2 Bố trí thí nghiệm 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm Chuột Swiss albino sử dụng để thí nghiệm chuột đực khỏe mạnh ni thích nghi làm quen với mơi trường sống điều kiện kiểm soát cho ăn thức ăn viên [38] Chuột nuôi nhốt chuồng làm kính, chuồng lót mùn dăm gỗ thay đổi theo chu kỳ [31] 3.2.2 Phân nhóm chuột thí nghiệm Các chuột phân biệt bút đánh dấu vĩnh viễn màu xanh đen [40] 3.2.3 Bố trí mơ hình thí nghiệm Thí nghiệm thực để đánh giá tác dụng EtCA điều trị bệnh RA chuột Swiss albino (thuốc tham chiếu Mobic) Nghiên cứu tiến hành với giai đoạn: giai đoạn gây bệnh giai đoạn điều trị bệnh Giai đoạn gây bệnh: Chuột chia thành nhóm, nhóm (ĐC1): Đối chứng bình thường, chuột tiêm nước cất Nhóm (TN1): chuột gây bệnh RA cách tiêm CFA [32] Sau theo dõi quan sát Giai đoạn điều trị bệnh: Nhóm đối chứng âm (ĐC2) chuột cho uống nước bình thường, nhóm đối chứng dương (ĐC3) chuột điều trị thuốc tiêu chuẩn mobic [42] phương pháp sử dụng ống thông thực quản đưa thuốc vào dày Các nhóm điều trị với EtCA (TN2, TN3, TN4) chuột điều trị EtCA với nồng độ 50, 75 100mg/kg, EtCA cho uống ống thông thực quản đưa thảo dược vào dày [35] Thời gian quan sát theo dõi đến ngày thứ 28 q trình thí nghiệm Trong q trình thí nghiệm, vật đo chu vi, đường kính, thể tích khớp; đo trước sau tiêm CFA, sau tiếp tục đo đến kết thúc thí nghiệm; số điểm số viêm khớp, độ sưng phồng bàn chân đo sau tiêm CFA Cân nặng, nhiệt độ thể thể bàn chân ghi lại từ ngày thí nghiệm, sau cách ngày đo lần Vào ngày cuối trình thí nghiệm, vật nhóm chuột thí nghiệm thu nhận máu [5] để kiểm tra thơng số huyết học sinh hóa huyết [17] Các vật kiểm tra sức khỏe sau gây chết tiến hành giải phẫu, quan sát đại thể quan nội tạng Lá lách, tuyến ức lấy cân khối lượng tuyệt đối Q trình phân tích mơ học thực vào thời điểm kết thúc thí nghiệm 3.3 Khối lượng thể Khối lượng thể chuột theo dõi cẩn thận trước bắt đầu nghiên cứu, tuần lần suốt trình nghiên cứu Sử dụng cân kỹ thuật Sartorius 600g (d= 0,01g) (Nhật Bản) % thay đổi khối lượng thể (WG %) tính theo cơng thức: WG (%) = Khối lượng thể vào tuần cụ thể (g)– Khối lượng thể ban đầu(g) Khối lượng thể ban đầu (g) 𝑥 100 [36] 3.4 Đường kính chu vi khớp Những thay đổi đường kính chu vi khớp chuột thí nghiệm kiểm tra vào ngày 0, 7, 14, 21 20 cách sử dụng thước cặp Vernier kỹ thuật số (Mitutoyo 200mm) (Nhật Bản) Các phép đo thực hàng tuần trước sau chuột tiêm CFA Chu vi khớp xác định cách đo hai đường kính vng góc khớp đường kính bên trước-sau Cơng thức tính chu vi: Chu vi (cm) = 2√(a2 + b )/2 Trong đó: a – đường kính bên, b – đường kính trước-sau [37] 3.5 Chỉ số khớp Chỉ số khớp (AI %) xác định theo phương pháp mô tả Coelho cộng (2004) [30] AI tính theo cơng thức: AI (%) = Đường kính chân sau vào ngày "X" (𝑐𝑚3 )−Đường kính chân sau vào ngày "0" (𝑐𝑚3 ) Đường kính chân sau vào ngày 0(𝑐𝑚3 ) 𝑥 100 [27] Chỉ số khớp đo ngày/lần 3.6 Điểm viêm khớp Tình trạng viêm chân tất chuột vào ngày khảo sát theo mức độ ban đỏ phù nề khớp người phân loại [48], sử dụng tiêu chí chân bình thường = 0, sưng nhẹ ban đỏ chữ số = 1, sưng vừa phải ban đỏ chữ số = 2, sưng nặng ban đỏ cho chữ số = 3, biến dạng nặng sử dụng chân tay = Điểm viêm khớp chuột vào ngày xác định Điểm cho chân sau thêm vào để có tổng điểm Do đó, điểm tối đa có cho 16 [39] Thời điểm đánh giá điểm số: Vào ngày 0-7 giai đoạn gây bệnh ngày đo lần giai đoạn chữa bệnh 3.7 Nhiệt độ thể bàn chân Sử dụng máy đo hồng ngoại (SATIR S280, GSAT INC) để theo dõi nhiệt độ thể nhiệt độ bàn da bàn chân (phản ứng viêm cục bàn chân sau), tuần lần suốt trình nghiên cứu Đo nhiệt độ thể: Đặt chuột bám vào bề mặt có cạnh thẳng, giúp chuột kéo căng phần thể để lộ bụng Áp chuột vào cạnh nhiệt kế cho nhiệt kế chạm vào bụng chuột điểm cảm biến hồng ngoại Giữ kích hoạt ghi nhận nhiệt độ thể chuột hiển thị đồng hồ nhiệt kế Đo nhiệt độ da bàn chân: Nhắm súng nhiệt kế hồng ngoại vào phần da bàn chân chuột, ghi nhận nhiệt độ thể chuột hiển thị đồng hồ nhiệt kế [40] 3.8 Huyết học sinh hóa máu Vào ngày cuối q trình thí nghiệm, máu thu nhận phương pháp lấy máu tĩnh mạch đuôi sau gây mê sâu chloroform [41] Máu đựng ống có chứa máu EDTA heparin [51] Các thơng số huyết học khảo sát bao gồm hàm lượng hemoglobin (HGB), tổng số lượng hồng cầu (RBC), tổng số lượng bạch cầu (WBC) loại bạch cầu [bạch cầu lympho – LYM, bạch cầu mono – MON, bạch cầu ưa axit (EOS), bạch cầu ưa kiềm (BASO), bạch cầu trung tính (NEU) Chỉ số sinh hóa khảo sát gồm AST, ALT, ALP, RF, CRP, ESR 3.9 Khối lượng quan Vào ngày cuối trình thí nghiệm tất chuột giải phẫu để quan sát quan nội tạng [57] Khối lượng quan tương đối (ROW %) tính theo cơng thức: ROW (%) = Khối lượng nội tạng tuyệt đối (g) Khối lượng thể chuột vào ngày gây chết (g) 𝑥 100 [47] 3.10 Mơ bệnh khớp Q trình phân tích mơ học thực vào thời điểm kết thúc thí nghiệm Chuột giải phẫu thu nhận khớp chân sau, sau mơ khớp cố định formalin 10% đệm trung tính 72 khử trùng dung dịch khử hóa chất A (7% w/v AlCl36H2O, axit fomic 5% HCl 8,5%) 72 Các mẫu mơ khớp sau được nhuộm riêng biệt với hematoxylin eosin (H&E) quan sát kính hiển vi quang học để kiểm tra sụn khớp, màng hoạt dịch, khoang khớp bao khớp [48] Ghi nhận lại kết mô học 3.11 Xử lí số liệu thống kê ̅ ± SD Dữ liệu phân tích thống kê Các kết thực nghiệm biểu diễn dạng X cách phân tích ANOVA Tiến hành thực kiểm tra so sánh Tukey phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XVIII Mức ý nghĩa sử dụng để kiểm định sai khác nghiệm thức p