thí nghiệm công nghệ protein và enzyme bài 2 thu nhận và tinh sạch enzyme urease từ đậu nành

16 4.3 Tua enzyme urease bang acetone ...c.cccccceseseseesesesescesestetsseseseneeeeens 17 4.3.1 Xác định hàm lượng protein theo phuong phap Bradford... cece 11 Hình 4.1 Xác định hàm lượ

TỎNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THÁNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

rat THI NGHIEM CONG NGHE PROTEIN VA ENZYME

BAI 2: THU NHAN VA TINH SACH ENZYME UREASE TU DAU NANH

Giảng viên hướng dân: TS NGUYÊN THỊ CÂM VỊ

TỎNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THÁNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

rat THI NGHIEM CONG NGHE PROTEIN VA ENZYME

BAI 2: THU NHAN VA TINH SACH ENZYME UREASE TU DAU NANH

Người hướng dân: TS NGUYÊN THỊ CÂM VỊ

MỤC LỤC

MỤC LỤC HÌNH ẢNH G2 1221212121211 21511018111112812122181811 1kg Vv MUC LUC BANG 000o.o.ccccccccccccecesecccssesesesseteteesuseecassssteecasstsasststesensatieeessnenens vii 1_ TỎNG QUAN 0 1 1212121211211 121811121211111111 0101811181811 re 1

2 GIOT THIEU 2000 cccccccccc cece ceseseceecececeseteteecesaeeesesssenereastessitttereneeeteen 1

2.1 ENZYME UCASC oo dđ4L:.(< eeeeeeeeeeeeeeneeee eee 2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm c5 S St series 3

3 QUY TRINH THU NHAN VA TINH SACH ENZYME UREASE TU DAU NÀNH ST 2221212221212 0210121111211 212111111111 re 4

3.1 Quy trinh trích ly enzyme urease thô .-Q S2 che 4

3.1.1 Chuân bị nguyên liệu - 5 222212121 S3 3S 2121511511215 sxkU 4

KG c na 7 5 3.1.3 Dịch urease thô . .- c2 2n SH ky ch nh chien 6 3.2 Quy trình kết tủa enzym urease 5: 225222222323 EE3E 2 E22 xe rred 7 3.2.1 Tua (NH4)2S04 20% bao hOa ccccccccceeeceeeeceeeeeeeeeeteteeeeeeetees 7 3.2.2 Ly tâm thu dịch - cece cece ceeeeceeeeceneeceeeeeeeeccneeeeeeseeeeeteneas 8 3.2.3 Tua (NH4)2SO4 55% DAO HOA ee ccc ect tee ee cnet ee ttseeeeenaeees 8

3.2.4 Hoa tan ta cece ceeeecececeeeerceneeaaeeeaceeeceeeceeceeceeeeeeeesceeeeeeeeeseeeeetegs 9

4_ PHÂN TÍCH CHẾ PHÁM 5: St 22t tre 11

4.1 Dịch enzyme urease thô . S2 xxx kh 11 4.1.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 11 4.1.2 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler 13

4.2 Phân tích chế phẩm urease khi thực hiện tủa phân đoạn băng ammonia sulfate 14

4.2.1 Xac dinh ham lvong protein theo phuong phap Bradford 14 4.2.2 Xac dinh hoat tinh urease theo phuong phap Nessler 16 4.3 Tua enzyme urease bang acetone .c.cccccceseseseesesesescesestetsseseseneeeeens 17 4.3.1 Xác định hàm lượng protein theo phuong phap Bradford 17 4.3.2 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler 19

5.1 Kết quả thu được của nhóm 2222 S221 +2 EEEE2EEE 2121k 21 5.2 So sánh và biện luận kết quả giữa phương pháp kết tủa phân đoạn và kết tủa bằng acetone + c2: 2.2111 111121112111 11151 1111111211111 101110111 211111818 rra 21

6_ PHỤ LỤC - 2222211222212 2t H112 rrerereree 22

6.1 Bảng chuyền đổi nồng độ bão hòa của (NH4)zSO2¿ ở nhiệt độ 20 °C 22

6.2 Dung đường chuẩn NessÏer ¿2 22222 312222121 EEEsrcsre 22 6.3 Dựng đường chuẩn Bradford :- 2 2 +cs c3 E2 Esxsksrrerree 24

MỤC LỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Phương trình urease xúc tác thủy phân urea - che 2 Hinh 3.1 Quy trinh trich ly enzyme urease thÔ L S2 2n nnnS HH nhe 4 Hình 3.2 Đậu nành đã tách béo ccccceeeee cece ecceeeceeeeaeeaeteeeeeeeeeeeeeateeeeeeeeeeneaaaas 5 00h cu 0 0 — - 4 6 Hình 3.4 Dịch trích ly thô sau khi ly tâm - TQ 222 2n HH HH HH SH ng ky 6 Hình 3.5 Quy trình kết tủa Enzyme urease từ dịch trích ly thô 7 Hình 3.6 Urease thô sau khi ly tâm LQ L1 2n 2n SH TH TT ng TH KT kh ket 8

Hình 3.7 Kết tủa sau khi tủa bằng (NH4)2SO4 55% bão hòa . 5-5-5: 9

Hình 3.8 Tua sau khi được hòa tan bởi đệm - LL c1 22222 nnnS SH nen 10

Hình 3.9 Quá trình thâm tích Urease .- : 5:22 222222 2 2221821221221 10

Hình 3.10 Do luong Urease thu duec sau khi tham tich 0.0.00 cece 11 Hình 4.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối với mẫu trăng

vi

Hình 4.11 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đối với mẫu trăng 19 Hình 4.12 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đối với mẫu tủa bằng ce-i0- 1m .ồŠÖẦ iiiố.ố 19 Hình 5.1 Hiệu suất tủa protein của các loại anions và cations -‹ -s: 22

Hình 6.1 Các ống có nồng độ NH3 khác nhau -2- 5 2222222222232 2EzEsxzxed 23 Hình 6.2 Đường chuân Nessler - - G2 212121211323 1512151121011111 121511218111 y6 23

Hình 6.3 Đường chuân Albumin thu duoc từ phương pháp Bradford 27

vii

MUC LUC BANG

Bảng 2.1 Đặc tính của Enzyme ureaSe 0 Q00 2 HH n TH TH KT nen khay 2 Bang 2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm - S1 2S 1231232112322 1E EEEEerrree 3 Bang 4.1 Xác định hàm lượng protein theo phương phap Bradford déi voi mau thé

Bảng 4.2 Xác định hoạt tính Urease theo phương pháp Nessler đối với mẫu thô 13 Bang 4.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối với mẫu sau

010810000 4 15

Bảng 4.4 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler với mẫu sau thâm tích

Bang 4.5 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối với mẫu tua

bằng acefone - 1 222212121 111111111211212111101110112111 101010101111 11 2110101111101 18 ng 18

Bang 4.6 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đối với mẫu tủa bang ce-i0- 1m .ồŠÖẦ iiiố.ố 19 Bang 5.1 So sánh thông số giữa hai phương pháp tủa enzyme urease 21 Bang 6.1 Bảng chuyền đôi nồng độ bão hòa của (NHa)aSO¿ ở nhiệt độ 20 °C 22

Bảng 6.2 Các hóa chát trong ống nghiệm thực hiện đường chuẩn Nessler 23

Bang 6.3 Cac giá trị thu được từ phương pháp Bradford ccccc+csccsss2 26 Bang 6.4 Cac giá trị thu được từ phương pháp Bradford cccccSc s2 26

1 TONG QUAN

Urease la enzyme xtc tac cho phan img tuy phan urea tao thanh khi carbonic

và amomiac Qua đó, việc thu nhận enzyme urease thô từ đậu nành trải qua các bước gồm xay nhỏ, trich ly loai lipid, trich ly urease, ly tam dé thu dich thô Sau đó từ dịch thô để thu được urease tinh khiết có 2 phương pháp là kết tủa phân đoạn bằng

ammonia sulfate hoặc bằng acetone Khi thu được urease tính khiết tiến hành phân

tích xác định hàm lượng protein theo Bradford và xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler So sánh hiệu sắt thu hồi và độ tính sạch của phương pháp tủa phân đoạn bằng muối (ammonia sulfate) cho kết quả cao hơn so với tủa bằng hợp chất hữu cơ (acetone)

2_ GIỚI THIỆU

2.1 Enzyme urease

Urease là enzyme thuộc nhóm enzyme thuy phan (hydrolase), phan nhém amidase Urease có số hiệu phân loại quốc tế là EC 3.5.1.5 Tên hệ thông là Carbamate amide hydrolase

-_ Số hiệu phân loại quốc tế của Urease là EC 3.5.1.5

-_ Số 5 chỉ số thứ tự của Urease trong phân nhóm phụ

Bang 2.1 Dac tinh cva Enzyme urease

Dac tinh Gia tri

Trọng lượng phân tử

Số trung tâm hoạt động/ 1 phan tử

Phân tử lượng mỗi trung tâm hoạt động

14 000 dalton 6.4— 7.6 (tuỳ loại đậu)

|

WV wn

NỈ!

45 - 50°C Kim loai nang (Ag*, Cu**, Hg**), borate, H2O2, acid ascorbic

Enzyme urease còn có nhiều trong các cây bậc cao, đặc biệt là các cây thuộc

họ đậu nhu dau rua (Canavalia ensiformis, jack bean), déu nanh (Glycine hispida) Urease xuc tac cho phan img thuy phan urea, tao thanh khi carbonic va amomiac theo phương trình sau:

H,N H,N

urease

bC=O + ,H,O — ~ CO, + ¿NH,

Hình 2.1 Phương rriình urease xúc tác thy phân urea

Lợi dụng tính chất đặc hiệu của urease, người ta ứng dụng Uur@aSe€ trong việc nhận biết sự có mặt của urea trong thực phẩm, nước giải khát lên men và trong sữa

- Muỗng cân hóa chất: |

- Quả bóp cao su: |

- Ông hút nhỏ giọt nhựa: 2

- Dung dich Ba(OH)2 2%

- Dung dich Cystein 5.10°M, EDTA 5.10"

°M pha trong dém phosphate 1/15M pH 7

- Dung dich NH4CI chứa I0ug NH:/mL

- Thuốc thử Nessler (Merek)

- Dung dich urea 2% pha trong đệm phosphate 1/15M pH 7

3 QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ TÌNH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH

3.1 Quy trình trích ly enzyme urease thô

Ly tam (5000 vong/phut, 10°) hoặc lọc chân không Ba

'

Dịch enzyme urease thô

Hình 3.1 Quy trình trích ly enzyme urease thô

3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Chuẩn bị bột đậu nành xay nhỏ, sau đó đem đi cân đúng tỷ lệ đề tiễn hành tách

béo

Lưu ý: khi trích ly để loại bỏ lipid ra khỏi đó thì tỷ lệ bột: dung dịch trích ly (ether dầu hỏa) là 12g : 100mL

Hình 3.2 Đậu nành đã tách béo 3.1.2 Trich ly urease

Thực hiện cân 84 g bột đậu nành đã tách béo rồi cho vào cốc 1000 mL Sau đó

thêm vào 700 mL dung dịch đệm phosphate chứa Cystein 5.10-3 M và EDTA 5.10- 3M Khuấy đều lên sau đó đậy giấy bạc hoặc đậy kín bằng màng bọc thực phẩm, rồi đặt vào tủ hút Trong điều kiện pH 7, 12 giờ đó enzyme đạt trạng thái có hoạt tính tốt

nhất và giúp bảo vệ urease khỏi bị biến tính

Vi dac tinh enzyme urease co chat kiém ham 1a cac kim loai nang (Ag+, Cu2+, Hg2+) nén khi cho dung dich EDTA 5.10-3 M vao thi no sé lién kết với các ion kim loại nhăm ngăn sự kiểm hãm hoặc gây biến tính của chúng đối với urease

Còn dung dịch Cystein 5.10-3 M thì sẽ chuyền hydro cho cầu nối (-S-S-) Vì sau khi trích ly, nhóm SH ở trung tâm hoạt động bị oxy hóa và hình thành nên cầu nối (-S-S-) gây mắt khả năng liên kết với cơ chất của enzyme urease Sử dụng Cystein

5.10-3 M phản ứng chuyển hydro với cầu nối (-S-S-) để phục hồi nhóm SH

Hình 3.3 Trích ly urease 3.1.3 Dich urease thô

Khoang 12 gié sau trích ly, lây mẫu ra và cho vào ống falcon, điều chỉnh khối lượng cho 2 falcon bằng nhau (có thể chênh lệch ở số thập phân thứ hai 2 — 4 đơn vị)

dé dem di ly tâm mẫu 5000 vòng/phút, 10 phút để bã lắng xuống dưới tạo thuận lợi cho việc bỏ bã tách dịch chiết

Nếu sau khi ly tâm, mẫu vẫn còn nhiều cặn thì nên lọc lại băng giấy lọc Tiếp

đó loại bỏ bã và thu dịch Lấy khoảng 1-2 mL dịch urease thô được pha loãng khoảng

50 lần để phân tích hàm lượng protein và hoạt tính urease Phần dịch urease còn lại

sẽ được đong thể tích và thực hiện kết tủa urease Các quá trình đều đều phải được

thực hiện ở nhiệt độ lạnh, thấp hơn 4 °C

3.2 Quy trình kết tủa enzym urease

Dịch urease

| Tủa (NH+)zSO¿ 20% bão hòa]

Dé yén 30’, t° phòng

Ly tam thu dich

| Tủa (NH¿)›SO¿ 55% bão hòa|

Nồng độ muối ban đầu là 0% và nồng độ muối lúc sau là 20%, dung dịch có

thé tích 30 mL, thì khối lượng muối cần thêm (mì) là:

30x114

m= —““=3429 1000

Cân chính xác 3,42 g muối ammonia sulfate cho vào 30 mL dịch urease thô,

đề yên 30 phút ở nhiệt độ phòng Đây là quá trình kết tủa âm bằng (NH4)aSOa 20%

bão hòa, đề kết tủa tạp chất Sau đó, tiến hành ly tâm thu địch với 5000 vòng, 10 phút,

ở 49

3.2.2 Ly tâm thu dịch

Hình 3.6 Urease thé sau khi ly tam

Sau khi thu dich urease do lai thé tích được 31,5 mL, cân chính xác 7,08 g ammonia sulfate cho vao dich urease, dé yén 30 phut, 6 nhiét độ phòng

3.2.3 Tua (NH4)2504 55% bao hoa

Quá trình kết tủa dirong bang (NH4)2S04 55% bao hoa, dé kết tủa enzyme Sau

đó, tiền hành ly tâm thu tủa với 5000 vòng, 10 phút, ở 4°C

Lượng (NHa)aSO¿ tính bằng g, cần bô sung vào một lít dung dịch (NHa)aSO4

có nồng độ ban đầu đã biết để thu dung dịch có nồng độ (NH4)aSOa mong muốn ở 20°C

Nông độ muối ban đầu là 20% và nồng độ muối lúc sau là 55%, dung dịch có

thé tich 31,5 mL, thì khối lượng muối cần thêm (m2) là:

315x225 —_

Hình 3.7 Kết ta sau khi ta bằng (NH4)2SO4 55% bão hòa

3.2.4 Hòa tan tủa

Hòa tan tủa vừa thu được với đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa cystein va EDTA 5x10° M, cho vao tui cellophane

10

Hình 3.8 Ta sau kh được hòa tan bởi đệm 3.2.5 Thắm tích

Quá trình thâm tích được thực hiện trong dung dịch đệm phosphate 1/15M pH

7 chứa cystein và EDTA 5x 103 M Thay đệm mỗi ngày 2 lần vào buôi sáng và chiều trong 2 ngày Sau quá trình thâm tích thu được 9 mL địch enzyme, trước khi phân tích hàm lượng protein và hoạt tính, dịch enzyme được pha loãng 50 lần bởi đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa cystein và EDTA 5x103 M Trong quá trình thâm tích, muối khuếch tán từ trong màng cellophane đi ra dung dịch đệm một cách tự nhiên, theo cơ chế từ nơi có nồng độ muối cao đến nơi có nồng độ muối thấp, đến khi nồng

độ muôi trong và ngoài băng nhau

Hình 3.9 Quá trình thẩm tích Urease

11

Tủa sau khi được hòa tan thì cho vào túi cellophane Cho túi vào cốc và cho thêm dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 có chứa EDTA và Cystein vào cốc đến khi vượt qua mức nước trong túi Đề cốc vào tủ lạnh 4 °C, thay đệm mỗi 24 giờ

Hình 3.10 Do wong Urease zz được sau khi thẩm tích

4 PHAN TICH CHE PHAM

4.1 Dich enzyme urease thô

4.1.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

với máu trắng

12

Hình 4.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đỗ

với máu thô

Báng 4.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối với mẫu thô

= > — 0,0012 x x 107° x 50 = 16,15 (mg/ml) 0,1 Ham lượng protein tông trong dung dịch urease thô:

P., = 16,15 x 35 = 565,25 (mg)

Hình 4.4 Xác định hoạt tính Urease /heo phương pháp Nessler đối với mâu trắng

Default Mail /2///111/(010/1121217 22 48- Datault metho 93.50 Detautt Method 03.48

14

Hoạt tính riêng:

Ap = ob p= B= Teg © 493 UU ing) = Pw 4,33 (IU

4.2 Phan tich chế phẩm urease khi thực hiện tủa phan doan bang ammonia

sulfate 4.2.1 Xac dinh ham lwong protein theo phuong phap Bradford

Default Method

0efaalt wie

187" - 595.0 595.0

Hình 4 6 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đó

với máu sau thđm tích