Thí nghiệm công nghệ protein và enzyme báo cáo thí nghiệm công nghệ protein và enzyme

THU NHẬN CHẾ PHẨM CASEIN VÀ WHEY PROTEIN TỪ SỮA BÒ

Tổng quan

1.1.1 Giới thiệu về casein trong sữa

Sữa có chứa hàng trăm loại protein nhưng hầu hết trong số này chỉ chiếm một lượng rất nhỏ Protein có thể được phân loại theo nhiều cách dựa vào tính chất hóa học hay vật lý, và chức năng sinh học của chúng Thông thường, người ta phân loại protein sữa thành casein (không hòa tan) , whey protein (hòa tan) và các protein thiểu số.

Trong sữa bò casein chiếm gần 80% tổng số protein (khoảng 26 g trong 1 lít sữa) Casein được chia làm bốn nhóm phụ: α , α , β và κ-casein Cả bốn nhóm nàys1 s2 đều có cấu trúc không đồng nhất.

Hình 1.1 Casein Điểm chung giữa casein α và β là các amino acid được este hóa bởi phosphoric acid Acid phosphoric này liên kết với calci (có chứa nhiều trong sữa) để hình thành các liên kết nội phân tử và ngoại phân tử Điều này khiến casein dễ dàng tạo chuỗi polymer có chứa một vài loại casein giống hay khác nhau.

Do có nhiều nhóm phosphate và những nhóm kỵ nước trong phân tử casein, các phân tử polymer được hình thành từ casein rất đặc biệt và bền Những phân tử này được cấu tạo từ hàng trăm và hàng nghìn những phân tử đơn lẻ và hình thành nên dung dịch keo, tạo nên màu trắng của sữa Những phức chất này được gọi là các micelle casein.

1.1.2 Các dạng chế phẩm protein

Protein concentrate là một loại chế phẩm protein có hàm lượng protein tối thiểu là 65% Chế phẩm chứa nhiều chất xơ, giàu protein và amino acid được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như là thực phẩm chức năng, bổ sung trong các lọai ngũ cốc, bánh ngọt, sản phẩm ăn chay, thức ăn gia súc làm gia tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm.

Protein concentrate có nhiều dạng: hạt, sệt, hoặc bột mịn.

Giống chế phẩm trên nhưng chứa hàm lượng protein thực vật rất cao 90% Nó chứa hầu hết các amino acid cần thiết cho sự phát triển mặt khác nó chứa lượng chất béo rất thấp, giúp ngăn ngừa chứng loãng xương, ung thư, các triệu chứng thời kì mãn kinh.

So sánh giữa casein và whey protein trong sữa.

Casein và whey là hai loại protein có trong sữa bò, chiếm lần lượt 80% và 20% protein từ sữa Cả hai đều là protein chất lượng cao, vì có chứa tất cả các axit amin thiết yếu, mà cơ thể không thể tự sản xuất Ngoài ra, hai loại protein này còn được cho là dễ tiêu hóa và hấp thu trong hệ tiêu hóa của cơ thể người.

Ngoài ra, cả casein và whey đều là sản phẩm phụ của sản xuất phô mai.

Trong quá trình làm phô mai, các enzyme hoặc axit đặc biệt được thêm vào sữa nóng Các enzyme hoặc axit này làm cho casein trong sữa đông lại, hoặc chuyển sang trạng thái rắn, tách ra khỏi chất lỏng.

Chất lỏng này là protein whey, sau đó được rửa và sấy khô thành dạng bột để sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm hoặc thực phẩm bổ sung Phần sữa đông casein có thể được rửa và sấy khô để tạo ra bột protein hoặc thêm vào các sản phẩm sữa, chẳng hạn như phô mai.

Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey protein từ sữa bò tươi

1.2.1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey protein từ sữa bò tươi

Hình 1.2 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm protein casein và whey protein từ sữa bò tươi

1.2.2.1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm protein casein từ sữa bò tươi Bảng 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm protein casein từ sữa bò tươi

Các bước thực hiện Hình ảnh

Bước 1 Chuẩn bị nguyên liệu

- Lấy 100 ml sữa bò tươi cho vào becher đã label và bọc màng bọc thực phẩm.

Hình 1.3 100 ml sữa bò tươi

- Gia nhiệt đến 40 C trong bể o điều nhiệt.

- Dùng dung dịch Acetic acid

10% để điều chỉnh pH sữa đến pI casein (pH = 4.6) để casein kết tủa và để yên 5 phút.

- Đổ sữa đã chỉnh pH vào 2 ống falcon, điều chỉnh cho khối lượng bằng nhau.

- Cho vào máy ly tâm.

- Ly tâm 6000 rpm trong 7 phút.

Lưu ý: Label falcon cả ống và nắp, sau đó đi cân trước đi cho sữa vào để biết khối lượng falcon ban đầu.

Hình 1.8 Đổ sữa ra falcon đã label

Hình 1.7 Cân khối lượng sữa + falcon

- Sau khi ly tâm xong, đổ dịch whey (phần lỏng bên trên) vào 2 falcon mới đã rửa sạch và label.

- Đem cất 2 falcon chứa dịch whey vào tủ lạnh ngăn mát.

Hình 1.11 Sau ly Hình 1.10 Cho whey tâm ra falcon khác

Hình 1.9 Lưu trữ trong tủ mát

- Đem phần casein kết tủa bên dưới falcon đi rửa tủa.

- Rửa lần lượt với nước, ethanol 95% và ether ethylic.

+ Rửa lần 1 với nước: cho nước vào falcon và đem đi ly tâm 6000 rpm – 7 phút.

96%: làm tương tự như rửa với nước.

+ Rửa lần 3 với ether ethylic: làm tương tự như rửa với nước.

Lưu ý: Sau mỗi lần ly tâm đều đổ bỏ phần lỏng bên trên rồi mới cho chất rửa tủa mới vào.

Hình 1.12 Rửa tủa bằng nước

Hình 1.14 Rửa tủa bằng ethanol 96%

Hình 1.13 Rửa tủa bằng ether ethylic

- Đổ phần casein đã kết tủa sau 3 lần rửa tủa ra đĩa petri.

- Dùng đũa thủy tinh làm nhuyễn casein.

- Đem cân lấy khối lượng trước sấy.

- Đưa đĩa petri chứa casein vào tủ sấy vào sấy ở nhiệt độ

- Sau 4 tiếng, đem ra cân lấy khối lượng sau sấy.

Hình 1.18 Dùng đũa làm nhuyễn casein

Hình 1.16 Casein trước khi sấy

Hình 1.15 Khối lượng sau khi sấy

1.2.2.2 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm lactose serum

Bảng 1.2 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm lactose serum

Bước 1 Lấy lactose serum ra khỏi tủ lạnh

- Lấy ra và xác định thể tích bằng ống đong.

Hình 1.19 Lấy lactose serum ra khỏi tủ lạnh

- Hút 2 ml whey cho vào bình định mức.

- Định mức lên 100 ml bằng nước cất.

Bước 3 Dựng đường chuẩn theo phương pháp Bradford

Kết quả – Bàn luận

1.3.1 Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm whey protein bằng phương pháp Bradford.

1.3.1.1 Xây dựng đường chuẩn Bradford.

Sử dụng dung dịch protein chuẩn là albumin tinh khiết đã biết trước nồng độ và thuốc thử Bradford, đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.

Bảng 1.3 OD của đường chuẩn Bradford Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5

Hình 1.23 Phương trình đường chuẩn Bradford

Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.003x + 0.0066 R = 0.9857 2

1.3.1.2 Xác định hàm lượng whey protein trong mẫu.

Hút 0.1 mL dung dịch mẫu whey protein sau khi pha loãng 50 lần trong bình định mức vào ống nghiệm, thêm nước cất để được 1 mL Sau đó thêm 5 mL thuốc thử Bradford, lắc đều, để ổn định 15 phút Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm Làm tương tự với 3 mẫu và tính giá trị trung bình.

Hình 1.24 OD của whey protein

Bảng 1.4 Kết quả OD của whey protein Ống nghiệm Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3

- Giá trị OD trung bình của mẫu: 0.6326

-Giá trị ∆OD trung bình của mẫu: ∆OD = OD - 0.6326 = 0.05360

-Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.003x + 0.0066

- Hàm lượng protein có trong 100 mL sữa tươi lý thuyết: 3,1g

- Hàm lượng whey có trong 100 mL sữa tươi lý thuyết: 3,1 x 20% x 1000 = 620 mg

Kết luận: chế phẩm whey protein thu được thuộc loại isolate.

1.3.2 Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm casein bằng phương pháp Kjehdahl.

- Cho mẫu vào bình Kjeldahl: cân 0.3g mẫu Thêm 10 mL H2SO4 đđ và 0,5 g xúc tác.

- Đặt bình Kjeldahl vào máy vô cơ hóa, sau khoảng 2 giờ 30 phút gia nhiệt và 30 phút làm nguội, đem mẫu vào hệ thống cất đạm.

- Trước khi cất đạm điều chỉnh chế độ làm sạch để vệ sinh hệ thống, sau đó tiến hành cất đạm.

- Lấy vào erlen 10 mL dung dịch H2SO4 0,1 N thêm 3 giọt Phenolphthalein, lắp vào hệ thống.

- Lắp bình chứa dung dịch đã vô cơ hoá vào hệ thống cất đạm Kiểm tra lượng NaOH trong bình, mở sinh hàn nước, khởi động quá trình cất đạm Quá trình cất đạm kết thúc sau khoảng 15 phút.

Hình 1.26 Hệ thống cất đạm

- Tráng vòi bằng nước cất và lấy erlen chứa H2SO4 0,1 N thừa ra, thay vào một erlen trống Bật chế độ rửa hệ thống.

- Định phân lượng H2SO4 0,1N thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.

- Thực hiện tương tự với mẫu trắng thay H2SO4 bằng nước cất vào erlen và thay bình Kjeldahl trống, chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N để trừ hao tính acid của nước cất ở phòng thí nghiệm.

Kết quả thu được: - Mẫu trắng: 0.2 mL NaOH

- Mẫu cất đạm: 10.1 mL NaOH

1.3.2.3 Tính hệ số hiệu chuẩn F của dung dịch NaOH.

- Dung dịch NaOH nếu để một thời gian dài tiếp xúc với không khí sẽ hấp thụ CO2, tạo thành Na2CO3, làm giảm đi nồng độ của NaOH nên cần phải tính hệ số hiệu chuẩn.

- Lấy 10 mL H2SO4 0,1 N chuẩn cho vào erlen, định phân bằng NaOH 0,1 N Thực hiện ba lần và tính giá trị trung bình.

- Tính nồng độ thực tế của dung dịch NaOH đem định phân.

- F là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ lý thuyết của NaOH.

Kết quả: Cả ba lần đều tốn 10,4 mL dung dịch NaOH 0,1 N.

1.3.2.4 Xác định hàm lượng N trong mẫu.

Hàm lượng N trong mẫu được tính theo công thức:

X: hàm lượng N (%) a: số mL H2SO4 đem hấp thụ NH3 b: số mL NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa m: số gram mẫu đem vô cơ hoá

0,0014: lượng gram nitơ ứng với 1 mL H2SO4 0,1 N

F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dd NaOH 0,1 N

1.3.2.5 Hàm lượng protein tổng có trong mẫu chế phẩm casein.

THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH 19 2.1 Tổng quan

Giới thiệu về enzyme urease

Urease là enzyme thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (hydrolase), phân nhóm amidase Urease có số hiệu phân loại quốc tế là EC 3.5.1.5 Tên hệ thống là: Carbamate amide hydrolase Trong đó: số 3 chỉ nhóm chính – hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C - N khác liên kết peptide, số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amide thẳng (amide hyrolase), số 5 chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ.

Bảng 2.1 Các đặc tính enzyme urease

Trong tự nhiên có hơn 200 loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme urease như

H pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Bacillus pasterurii, Escherchia coli… Enzyme urease cũng có ở dịch tiêu hoá của các động vật như trâu, bò, dê, chó.

Enzyme urease còn có nhiều trong các cây bậc cao, đặc biệt là các cây thuộc họ đậu như đậu rựa (Canavalia ensiformis, jack bean), đậu nành (Glycine hispida)…

Urease xúc tác cho phản ứng thuỷ phân urea, tạo thành khí carbonic và amoniac theo phương trình sau:

Lợi dụng tính chất đặc hiệu của urease, người ta ứng dụng urease trong việc nhận biết sự có mặt của ure trong thực phẩm, nước giải khát lên men và trong sữa.

Hóa chất – Dụng cụ thí nghiệm

- Dung dịch NH Cl chứa 10 μg NH3/mL: cân 78,7 mg NH Cl định mức đến 50 ml 4 4 bằng nước cất, sau đó lấy 2ml dung dịch này định mức lên 100ml.

- Cách pha thuốc thử Nessler:

KI: 35 g pha trong 100 ml nước cất.

HgCl2: 17 g pha trong 300 ml nước cất.

Dung dịch NaOH 20%: 200g pha trong 1000 ml nước cất.

Cho KI vào bình định mức 1000 ml, đổ từ từ HgCl vào đến khi kết tủa không2 tan hết thì dừng, dùng dung dịch NaOH 20% định mức đến 1000 ml, cho tiếp 1-2 ml giọt HgCl tạo kết tủa đỏ Cho dung dịch vào một lọ màu tối, để dung dịch lắng trong2 qua đêm, rồi đem lọc qua bông thủy tinh, bảo quản trong lọ tối.

11.866 g Na2HPO4.2H O định mức đến 1l bằng nước cất (A).2

9.1993 g NaH2PO H O định mức đến 1l bằng nước cất (B).4 2

Trộn 305 ml A và 195 ml B, rồi định mức đến 1000 mL bằng nước cất.

Sơ đồ quy trình công nghệ

2.2.1 Trích ly enzyme urease thô.

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình công nghệ Trích ly enzyme urease thô

Bảng 2.2 Thuyết minh quy trình công nghệ

- Chuẩn bị bột đậu nành xay nhỏ, trích ly loại lipid bằng Ete dầu hỏa với tỉ lệ 1g bột: 2mL Ete, để khô.

Hình 2.2 Bột đậu nành xay để khô

Cystein 5.10 M cho -3 vào bột đậu nành đã loại lipid để trích ly urease Tỷ lệ bột và dung dịch trích ly là

12g : 100mL và để 12 giờ trong tủ hút.

- Sau 12 giờ trích ly, lấy mẫu ra và cho vào

2 falcon, điều chỉnh khối lượng cho 2 falcon bằng nhau (có thể chênh lệch ở số thập phân thứ hai 2 –

4 đơn vị) để khi ly tâm không xảy ra sự cố.

Hình 2.4 Mẫu sau trích ly

- Đem mẫu đi ly tâm

(5000 ngàn vòng/phút, 10 phút), để bã lắng xuống dưới tạo thuận lợi cho việc bỏ bã tách dịch chiết.

- Sau ly tâm, loại bỏ bã và thu dung dịch, phân chia 50 mL dịch vào cốc và 2 mL để pha loãng 50 lần trong bình định mức

Hình 2.6 Bỏ bã và thu dịch

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình kết tủa enzyme urease

Bảng 2.3 Thuyết minh quy trình công nghệ tạo kết tủa urease

(NH SO4)2 4 cho vào cốc chứa

50 mL dịch urease thô để tủa

(NH SO4)2 4 20% bão hòa, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.

- Lưu ý cho muối vào từ từ và khuấy nhẹ để làm tan muối vì Hình 2.8 Cân muối enzyme rất nhạy cảm với tác động mạnh.

- Bước này giúp kết tủa tạp chất còn được gọi là kết tủa âm.

- Đem mẫu cho vào 2 falcon, cân bằng khối lượng sau đó ly tâm, thu dịch và bỏ tủa, thể tích dung dịch thu được lúc này là

52 mL vì có cho thêm lượng muối.

Hình 2.9 Ly tâm thu dịch bỏ tủa

- Tiếp tục làm tủa mẫu bằng

(NH SO4)2 4 55% bão hòa bằng cách cân chính xác 11,7g muối, cho từ từ vào mẫu và khuấy nhẹ, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng Bước này giúp kết tủa enzyme urease Hình 2.10 Tủa mẫu bằng (NH4)2SO4 55%

- Cho mẫu và 2 falcon, cân bằng khối lượng và đem đi ly tâm Sau khi ly tâm xong bỏ dịch và thu tủa urease.

- Hòa tan tủa: sử dụng một lượng nhỏ dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 có chứa EDTA và Cystein để hòa tan tủa urease.

- Thẩm tích: tủa sau khi được hòa tan thì cho vào túi cellophane Cho túi vào cốc và cho thêm dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 có chứa EDTA và Cystein vào cốc đến khi vượt qua mức nước trong túi Để cốc vào tủ lạnh 4 C, thay đệm sau mỗi 1 o giờ và thực hiện thay 2 lần.

- Đo thể tích thu được sau thẩm tích là 5 mL, lấy 2 mL pha loãng 50 lần và phân tích hàm lượng protein của mẫu.

2.3.1.2 Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp Nessler

Lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 0 – 5 Cho vào mỗi ống thí nghiệm các dung dịch theo bảng sau.

Bảng 2.4 Dựng đường chuẩn theo phương pháp Nessler Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5

Thể tích NH Cl (mL) 4 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Sau khi cho hết các dung dịch vào các ống nghiệm thì lần lượt lắc nhẹ cho đều và đợi 15 phút Sau 15 phút sẽ đem đi đo mật độ quang tại bước sóng 490 nm.

Bảng 2.5 Kết quả đo OD Ống nghiệm số OD

2.3.1.4 Dựng đường chuẩn trên máy tính được

Hình 2.14 Kết quả dựng đường chuẩn Nessler

Nên R 2 = 0.9915 được chấp nhận với y = 0.0821x – 0.1078

Lấy 6 ống nghiệm sạch và khô, đánh số và tiến hành hút các dung dịch như sau: (thực hiện ở nhiệt độ phòng).

Bảng 2.6 Hoạt tính của Urease Các hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (3 mẫu)

Lưu ý: đối với mẫu thật sau khi cho dung dịch Urease vào thì phải canh đúng

10 phút để hiện tượng xảy ra giữa các mẫu không thay đổi số liệu đáng kể Nên việc cho dung dịch Urease vào phải canh cách nhau 30s.

Sau đó, lấy một thể tích nhất định của hỗn hợp phản ứng của từng mẫu thí nghiệm và mẫu trắng (khoảng 0,5mL) cho vào lần lượt 6 ống nghiệm khác Bổ sung nước cất để được thể tích là 5.5 mL, thêm 0.5 mL thuốc thử Nessler, lắc đều, để ổn định màu trong 15 phút Đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm trên máy UV – Vis.

𝟑 ΔOD= OD mtn - OD = 1.145 - 1.054 = 0.091 mt

2.3.3 Cân muối (NH 4 ) 2 SO 4 để bảo hòa

2.3.3.1 (NH 4 ) 2 SO 4 20% bão hòa với 50 mL dịch Urease thô

Dựa vào bảng thì từ 0% lên 20% thì nồng độ cuối, 20% là 114

2.3.3.2 (NH 4 ) 2 SO 4 55% bão hòa với 52 mL dịch Urease thô

Dựa vào bảng ở trên thì ta tính từ 20% lên 55% thì nồng độ cuối, 55% là 225

2.3.4 Hoạt tính urease Đơn vị hoạt độ của enzyme urease được tính theo đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) là lượng enzyme urease cú khả năng xỳc tỏc để chuyển húa ure tạo thành 1 àmol NH3 sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.

Từ phương trình đường chuẩn NH , xác định được các giá trị sau:3

V: thể tích sau khi hòa tan bột enzyme thành dịch. m: khối lượng bột enzyme cân để xác định hoạt tính (mg). mt: tổng khối lượng bột (mg).

Vt: tổng thể tích dịch (mL)

Phương trình đường chuẩn Bradford: y= 0,003x + 0,0066

Phương trình đường chuẩn NH : y= 0.0821x – 0.1078 3

THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA

Tổng quan

3.1.1 Bromelain có trong dứa là gì ?

Bromelain là một hỗn hợp các enzyme có trong quả dứa (quả thơm), hợp chất này thường được sử dụng dưới dạng thực phẩm bổ sung và tốt cho sức khỏe.

Bromelain là một enzyme thuộc lớp enzyme thủy phân (hydrolase), phân giải protein Mã số của bromelain: EC.3.4.4.24 Bromelain được tìm thấy trong mô thực vật của cây họ Dứa (họ Bromeliaceae).

Hiện tại, bromelain có nhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm. Trong ngành thực phẩm, bromelain được sử dụng làm mềm thịt, thủy phân protein… Trong ngành dược phẩm, bromelain được sử dụng trong các loại thuốc kháng viêm, kháng sinh… Ngoài ra, bromelain còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp khác.

3.1.2 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp anson

Nguyên tắc của phương pháp Anson là cho protease tác dụng với cơ chất casein hoặc hemoglobin, sau đó kết tủa protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm được tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme.Một đơn vị hoạt độ Anson là lượng enzyme trong 1 phút ở 30 C phân giải được o một lượng protein tương đương với 1 μmol tyrosine.

Ly tâm Pha loãng 50 lần

Lấy 50 mL dung dịch Dứa (lạnh 4°C)

Lấy 30 mL dung dịch Dứa (lạnh 4°C)

Xay nhuyễn Nước tỉ lệ 1 : 1

Ly tâm hoặc lọc chân Bã không

Lấy 30 mL dung dịch Dứa cho vào tủ lạnhLấy 2 mL dung dịch Dứa còn lạiLấy 50 mL dung dịch Dứa

Làm khô bằng việc bỏ tủ lạnh 2 tiến

Bromelain bán tinh sạch Dịch

Thẩm tích (1 tiếng thay đệm 1 lần )

Sơ đồ quy trình công nghệ

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ

Chờ 30 phút và để kết tủa enzyme

3.2.2 Thuyết minh quy trình thu nhận enzyme bromelain

Bảng 3.1 Sơ đồ quy trình công nghệ

- Cắt và cân khoảng 150g dứa.

- Cho dứa vào máy xay và cho thêm nước cất với tỉ lệ

- Xay cho đến khi dứa nhuyễn hoàn toàn.

- Đổ ra khăn (hoặc lưới) và bóp lấy dịch, bỏ bã.

- Đem dịch dứa đi lọc chân không (hoặc ly tâm) để thu dịch trong hoàn toàn.

Bước 4 Chia làm 3 thể tích khác nhau.

- Cho dịch dứa vào ống đong để xác định tổng thể tích ban đầu Sau đó chia làm 3 phần:

+ Lấy 30 ml: kết tủa bằng ethanol 96 o

+ Lấy 50 ml: kết tủa bằng muối amoni sulphate.

+ Lấy 2 ml trong phần dịch dứa còn lại pha loãng 50 lần: xác định hàm lượng protein, hoạt tính protease và thu nhận enzyme bromelain.

- Dịch dứa được bảo quản trong tủ mát với nhiệt độ

Tính lượng cồn 96 cần bổ sung để kết tủa 30 ml dịch enzyme bromelain để đạt nồng o độ 80 o

Bảng 3.2 Kết tủa bằng ethanol 96 o

Bước 1 Kết tủa bằng ethanol

- Cho 30 ml dịch dứa vào tủ mát

- Lấy 150 ml ethanol 96 cho vào o tủ mát 4 C trong 30 phút o

- Sau đó lấy cả dịch dứa và ethanol ra rồi trộn đều với nhau.

Rồi đưa lại vào tủ mát thêm 30 phút để kết tủa dịch dứa.

Hình 3.8 Kết tủa bằng ethanol

Bước 2 Ly tâm bỏ dịch

- Chia đều hỗn hợp dung dịch trên vào các ống falcon, label và chuẩn khối lượng.

- Đem ly tâm 6000 rpm trong 10 phút.

Hình 3.9 Ly tâm bỏ dịch

- Lấy nhẹ nhàng tủa trong falcon ra đĩa petri rồi đem cân

- Sau đó đi phơi tủa cho bay hơi hết ethanol Có thể phơi bằng quạt hoặc trong tủ mát, 2 tiếng Hình 3.10 Phơi tủa

Bước 4 Tủa bromelain kết tủa từ ethanol

- Sau khi bay hết ethanol, khô lại bằng dạng bột.

- Cân lượng bột bromelain thu được.

Hình 3.11 Tủa bromelain kết tủa từ ethanol

Bước 5 Xác định hàm lượng và hoạt tính

- Đem hòa tan bột bromelain vừa thu được với 10 ml đệm pH 7.

- Đem dịch đi xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain.

3.2.2.2 Kết tủa bằng muối sulfate amon 70%

Tính lượng muối amoni sulfate bổ sung: Tính lượng muối sulfate amon cho vào

50 mL dịch dứa dựa trên bảng phụ lục 1.

Nồng độ sulphate amon ban đầu là 0, nồng độ cuối cần là 70% do đó cần 472 g muối cho vào 1000 mL dịch, nhưng lượng dịch của mình là 50 mL nên:

Vậy cần cho 23.6 g muối amoni sufate vào 50 mL dịch bromelain.

Bảng 3 3 Kết tủa bằng muối sulfate amon 70%

- Cân lượng muối sulfate amon đã tính trên.

- Cho vào 50 ml dịch dứa, hòa tan.

- Vừa cho vừa khuấy để dung dịch đạt nồng độ ammonium sulfate

- Để yên hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.

Hình 3.13 Kết tủa bằng muối sulfate amon 70%

- Ly tâm hỗn hợp 6000 rpm trong 5 phút.

Hình 3.14 Ly tâm thu tủa

- Cho tủa vào túi cellophane để thẩm tích.

- Thẩm tích trong đệm pH 7 đã chuẩn bị sẵn trong tủ mát.

- Thay đệm sau mỗi giờ cho đến khi hết muối trong tủa.

- Lấy 2 ml dịch dứa còn lại pha loãng 50 lần bằng bình định mức.

- Dùng dịch này tiến hành xác định protein và hàm lượng bromelain.

3.2.3 Tinh sạch protein bằng sắc ký rây phân tử

Bảng 3.4 Tinh sạch protein bằng sắc ký rây phân tử

- Cân 1.5g Sephadex G-50 ngâm trong 40 mL nước cất trong nhiệt độ phòng Thỉnh thoảng khuấy nhẹ.

- Ngâm trong 2-3h, cho độ nở đạt 15 lần.

- Cho gel vào phểu lọc chân không.

- Rửa bằng HCl 0.5M 3 lần Mỗi lần

- Rửa lại bằng nước cất 10 lần.

- Rửa tiếp bằng NaOH 0.5M 3 lần.

Mỗi lần sử dụng 50 mL.

- Rửa lại bằng nước cất cho đến khi dịch qua lọc chân không không có ra màu hồng với chỉ thị phenolphtalein.

- Cho miếng bông gòn vào đáy cột.

- Sau đó cho thêm miếng giấy lọc vào Cho từ từ nước cất vào để rửa cột Sau khi rửa xong cho nước cất vào nữa cột và cho nhẹ tránh tạo bọt khí.

- Tiếp theo cho Gel vào từ từ tránh gây nức Gel, cho đến khi Gel được nén chặt và cách đầu cột 5mm.

* Lưu ý: cho Gel vào 3 lần thì cho thêm 1 lần nước cất để tránh tình trạng gel bị khô gây vỡ gel.

- Sau khi gel đạt mong muốn thì cho thêm vào một miếng giấy lọc.

- Label 10 ống nghiệm tương đương với chạy sắc ký 10 lần.

- Ống 1: Hút 2 ml enzyme bromelain sau thẩm tích cho vào cột.

- Ống 2 – 10: Hút 2 ml đệm pH 7 cho vào cột chạy sắc ký lần lượt từ ống 2 đến ống 10.

- Quan sát bằng mắt thường, chọn những ống có màu sắc khác biệt nhất hoặc những ống kế ống có màu sắc khác biệt để đem đo OD (thường chỉ đo tầm 2-3 ống).

- Nhập số lên máy để tạo đồ thị.

3.3.1.1 Xác định hàm lượng protein theo Bradford

Sử dụng đường chuẩn được xây dựng từ bài 1 y = 0.003x + 0.0066 R = 0.9857 2

- Hút 0.1 mL dịch dứa thô sau khi pha loãng 50 lần trong bình định mức vào ống nghiệm, thêm nước cất để được 1 mL Sau đó thêm 5 mL thuốc thử Bradford, lắc đều, để ổn định 15 phút Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm Làm tương tự với 3 mẫu thật và 3 mẫu trắng, tính giá trị trung bình. Ống nghiệm Mẫu thật 1 Mẫu thật 2 Mẫu thật 3

(OD-595nm) 0.769 0.770 0.774 Ống nghiệm Mẫu trắng 1 Mẫu trắng 2 Mẫu trắng 3

- Giá trị ∆OD trung bình của mẫu: ∆OD = 0.027

Hàm lượng protein có trong dịch dứa thô

Tổng thể tích dịch dứa thô thu được: 188 mL

Hàm lượng protein tổng có trong 188 ml dịch dứa thô

3.3.1.2 Xác định hoạt tính protease theo Anson

Xõy dựng đường chuẩn Tyrosine: sử dụng Tyrosine chuẩn 1àmol/mL, thuốc thử folin cùng với HCl 0.2N, NaOH 0.5N trong 6 ống nghiệm và đo mật độ quang ở bước sóng 690nm để dựng đường chuẩn. Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5

Phương trình đường chuẩn Tyrosine: y = 1.3791x + 0.019 R = 0.992 2

3.3.1.3 Xác định hoạt tính enzyme trong dịch dứa thô

- Chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch, tiến hành như sau:

Hóa chất (mL) Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (3 mẫu)

Lắc đều - Để đúng 10 phút

Lắc đều - Để các ống nghiệm 15 phút rồi lọc.

- Lấy 1mL dịch lọc ở mỗi ống, thêm 2mL NaOH 0.5N + 0.6mL thuốc thử Folin (đã pha loãng), lắc đều, để yên 10 phút rồi đo mật độ quang ở bước sóng 690nm. Ống nghiệm Mẫu thật 1 Mẫu thật 2 Mẫu thật 3

Hoạt tính protease trong mẫu dịch dứa thô

Hoạt tính protease tổng trong 188 mL dịch dứa thô

3.3.2 Tủa enzyme bằng (NH 4 ) SO 2 4 70%

- Thể tích dịch enzyme sau thẩm tích: 10mL

- Lấy 2mL pha loãng 50 lần bằng bình định mức

Hàm lượng protein có trong mẫu enzyme tủa bằng (NH 4 ) SO 2 4 70%

Hàm lượng protein tổng có trong mẫu enzyme tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 70%

Thực hiện 3 mẫu thật và 3 mẫu trắng như ở dịch dứa thô. Ống nghiệm Mẫu thật 1 Mẫu thật 2 Mẫu thật 3

Hoạt tính protease trong mẫu enzyme tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 70%

Hoạt tính protease tổng trong mẫu enzyme tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 70%

- Sau khi sấy khô thu được 0.0832 g tủa.

- Lấy 14.4 mg tủa pha với 10 mL đệm pH 7.

Hàm lượng protein có trong mẫu enzyme tủa bằng ethanol

Hàm lượng protein tổng có trong mẫu enzyme tủa bằng ethanol

Thực hiện 3 mẫu thật và 3 mẫu trắng như ở hai phần trên. Ống nghiệm Mẫu thật 1 Mẫu thật 2 Mẫu thật 3

Hoạt tính protease trong mẫu enzyme tủa bằng ethanol

Hoạt tính protease tổng trong mẫu enzyme tủa bằng ethanol

3.3.4.1 Tủa enzyme bằng (NH 4 ) SO 2 4 70%

3.3.5 Hiệu suất thu hồi enzyme

Hiệu suất thu hồi enzyme của mẫu tủa bằng (NH 4 ) SO 2 4 70%

Hiệu suất thu hồi enzyme của mẫu tủa bằng ethanol

Kết luận: Phương pháp kết tủa bằng (NH4) SO2 4 70% có hiệu suất cao hơn phương pháp kết tủa bằng ethanol 96 o

3.3.6 Kết quả chạy sắc ký

* Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford.

Hình ảnh Kết quả đo OD phương pháp Bradford của sắc ký

Như vậy theo biểu đồ ta thấy hoạt tính Protease biểu hiện nhiều nhất ở ống phân đoạn 5,6,8 Nên ta sẽ lấy 3 ống đi xác định hoạt tính protease bằng Anson ở 3.4.2.

- Phương trình đường chuẩn Bradford: y = 0.003x + 0.0066 R = 0.9857 2

- Hàm lượng protein ở các ống 5,6,8 lần lượt như sau:

Xác định hoạt tính protease của sắc ký bromelain kết tủa bằng muối amonium sulfate bằng phương pháp Anson.

Dựa vào kết quả đo và đồ thị tiến hành lấy phân đoạn 5,6,8 để đem xác đinh hoạt tính protease bằng phương pháp Anson. Đo mật độ quang của mẫu thí nghiệm và mẫu trắng ở bước sóng 690nm thu được kết quả.

Giá trị OD Ống 5 Ống 6 Ống 8

-0.0725 (Không có hoạt tính enzyme)

- Phương trình đường chuẩn Anson : y = 0.0821x – 0.1078 R 2 = 99.15

- Hoạt tính protease ở lần lượt các phân đoạn 5,6

Tổng quan

Invertase là một enzyme thủy phân liên kết α-1,2-glycosidic của saccharose, còn được gọi là β-fructofuranocidase (E.C.3.2.1.26) Invertase có nhiều ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo, nước giải khát, bánh và dược phẩm Invertase được dùng nhiều nhất trong sản xuất syrup đường nghịch đảo - hỗn hợp fructose và glucose tỷ lệ 1:1 từ sucrose.

Invertase được sản xuất từ Saccharomyces cerevisiae thường hoạt động ở môi trường acid nhẹ đến trung tính (3.0-7.0), và trong khoảng nhiệt độ khoảng 30 C đến o

4.2.1 Dụng cụ và hóa chất

Hình 4.1 Dụng cụ và hóa chất

Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Thu nhận và kết tủa enzyme

Quy trình công nghệ

Hình 4.2 Quy trình công nghệ

-Cấy chuyền nấm men: cấy chuyền nấm men trên môi trường Hansen nghiêng

(Glucose: 50 g; Peptone: 10 g; KH2PO4: 3 g; MgSO4.7H2O: 2 g; Agar: 20 g; Nước:

-Nhân giống cấp 1: nhân giống nấm men với môi trường Hansen lỏng, lắc trong 24h ở nhiệt độ phòng.

-Nhân giống cấp 2: chuyển giống cấp 1 sang môi trường nhân giống cấp 2 (thay glucose trong môi trường Hansen bằng saccharose), lắc trong 24h ở nhiệt độ phòng.Sau khi nhân giống cấp 2, dịch men giống được ly tâm tách nước thu sinh khối Lưu ý: môi trường cần được hấp khử trùng trước khi cấy chuyền và nhân giống.

-Thu nhận và kết tủa enzyme invertase từ sinh khối nấm men:

+ Phá vỡ tế bào nấm men và trích ly invertase:

Phương pháp nghiền: 5-10 g sinh khối nấm men được cho vào cối, thêm H O 2

(tỷ lệ 1:1) và một ít cát sạch Hỗn hợp được nghiền kỹ để phá vỡ tế bào nấm men Sau khi nghiền, tiếp tục thêm nước (tỷ lệ 9:1 so với khối lượng NM) vào cối, khuấy đều, ly tâm thu dịch enzyme.

Phương pháp siêu âm: 20-30g sinh khối nấm men được cho vào becker (250mL), thêm 50 mL nước cất Thực hiện siêu âm hỗn hợp trên trong 3 phút (siêu âm 30s, dừng 5s) Trong quá trình siêu âm cần giữ lạnh hỗn hợp nấm men Kết thúc quá trình ly tâm, tiếp tục thêm nước (tỷ lệ 9:1 so với khối lượng NM) vào cốc, khuấy đều, ly tâm thu dịch enzyme.

+ Dịch enzyme được bổ sung acetone tuyệt đối với tỷ lệ thể tích 1 enzyme: 3 acetone, khuấy nhẹ, để yên 15 phút sau đó ly tâm thu tủa invertase Tủa enzyme được bảo quản ở nhiệt độ < 4 C.

Lưu ý: do vấn đề giới hạn về thời gian nên không thể nuôi cấy nấm men và tách chiết enzyme invertase, cho nên sẽ dùng mẫu enzyme đã được chuẩn bị sẵn để phân tích.

Kết quả

4.3.1 Xây dựng đường chuẩn DNS

Chuẩn bị 5 ống nghiệm, bổ sung các hóa chất sau:

Bảng 4.1 Xây dựng đường chuẩn DNS Ống nghiệm 1 2 3 4 5

Nồng độ đường (àmol/mL) 0 2.5 5.0 7.5 10

Dung dịch đường chuẩn (mL) 0 0.25 0.5 0.75 1

DNS (mL) 1 1 1 1 1 Đậy nắp, đun cách thủy ở 100 C trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh dung dịch về nhiệt độ phòng.

Lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp Sau đó lấy 5 ống nghiệm trên đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm, xác nhận giá trị

∆OD và lập đường chuẩn.

Bảng 4.2 Kết quả OD đường chuẩn DNS Ống nghiệm số 1 2 3 4 5

Mật độ quang (OD 540 nm) 0.007 0.171 0.385 0.571 0.732

Nồng độ đường (àmol/mL) 0 2.5 5 7.5 10

Phương trình đường chuẩn DNS: y = 0.074x – 0.0038 R = 0.9978 2

4.3.2 Ảnh hưởng của yếu tố pH đến hoạt tính enzyme invertase

- Chuẩn bị 200mL đệm 0,1 M pH từ 1-12 theo hướng dẫn sau:

Bảng 4.3 Cách pha đệm pH pH 1.98 2.87 4.10 5.02 6.09 7.00 7.96 8.95 9.91 10.88

- Chuẩn bị dịch enzyme được pha tương ứng với 10 loại pH trên.

- Lấy ống nghiệm sạch và khô, đánh số, tiến hành như sau:

Bảng 4.4 Cách tiến hành xác định hoạt tính invertase

Hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (3 mẫu)

Dung dịch sucrose 0,3 M (mL) 1 1 Đệm 0,1M của 10 loại pH (mL) 1.9 2

Dung dịch enzyme invertase (mL) 0.1 0

- Sau đó, hút 1 mL hỗn hợp phản ứng của từng mẫu thí nghiệm và mẫu trắng cho vào lần lượt 6 ống nghiệm chứa sẵn 1mL DNS, đun cách thủy ở 100 C trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh dung dịch về nhiệt độ phòng Bổ sung vào mỗi ống nghiệm 10 mL nước cất, lắc đều đến khi dung dịch không còn phân lớp Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.

Bảng 4.5 Kết quả OD 540 nm xác định hoạt tính invertase theo pH pH Thật 1 Thật 2 Thật 3 Trắng 1 Trắng 2 Trắng 3 ∆OD

Hoạt tính invertase theo từng loại pH được tính theo công thức sau:

Phương trình đường chuẩn DNS: y = 0.074x – 0.0038 Độ pha loãng F = 1 (mẫu enzyme không pha loãng)

Bảng 4.6 Kết quả hoạt tính enzyme invertase pH 1.98 2.87 4.10 5.02 6.09 7.00 7.96 8.95 9.91 10.88

Hình 4.4 Đồ thị hoạt tính invertase biến thiên theo pH

Kết luận

Sau quá trình thí nghiệm và phân tích, có thể thấy enzyme invertase hoạt động tốt nhất ở pH 4.10 đến 6.09 và có hoạt tính cao nhất ở pH 5.02, sau đó hoạt tính giảm dần ở các pH khác.

XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME INVERTASE 67 5.1 Tổng quan

Giới thiệu về invertase

Invertase là một enzyme thủy phân saccharose thành glucose và fructose Bài giảng Enzyme Inverstase giúp người học nắm được các khái niệm, phân loại, động học invertase, cấu trúc invertase, trình tự invertase, gen mã hóa invertase, ức chế invertase.

Hình 5.1 Cấu trúc hóa học

Invertase là enzymev xúc tác phản ứng thủy phân liên kết glycoside có trong saccharose để tạo thành D-glucose và D-fructose , một quy trình rất quan trọng trong công nghệ thực phẩm để tạo ra một hỗn hợp gọi là sirup đường nghịch đảo Invertase có nguồn gốc từ thực vật, động vật và VSV, hiện nay được sản xuất chủ yếu nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae.

Các vật liệu chuẩn bị

Cốc 250mL 1 Đũa khuấy 1 Ống nhỏ giọt 1 pipette 10mL 1 pipette 5 mL 1

Enzyme invertase Dung dịch đường chuẩn glucose – fructose (1:1) 10 àmol/mL

Saccharose 4 g/L trong đệm acetate pH 4.7. Đệm acetate 0.1M pH 4.7Dung dịch DNS

Sơ đồ quy trình công nghệ và thuyết minh các bước thực hiện thực tế

Bảng 5.1 Thuyết minh các bước thực hiện

+ Bật bể điều nhiệt đến 95°C

Hình 5.2 Chuẩn bị Nguyên liệu

- Chuẩn bị 4 ống nghiệm như sau:

+ Ống 1: 3ml saccharose 4 g/L trong đệm acetate pH 4.7 (nồng độ 4 g/L)

+ Ống 2: 3ml saccharose 4 g/L + 3ml đệm acetate pH 4.7 (nồng độ 2 g/L)

+ Ống 3: 3ml từ ống 2 cho vào ống 3

+ 3 ml đệm pH 4.7 (nồng độ 1 g/L)

+ Ống 4: 3ml từ ống 3 cho vào ống 4

+ 3ml đệm pH 4.7 (nồng độ 0.5 g/L).

Hút 3ml từ ống 4 bỏ đi.

Hình 5.3 Chuẩn bị 4 ống nghiệm

- Cho vào tất cả các ống 3ml dung dịch E có nồng độ pha loãng thích hợp (10 IU/mL).

- Cứ sau 5, 10, 15, 30 phút lấy nhanh từ mỗi ống 1ml cho vào ống nghiệm đã đánh số tương ứng và có chứa sẵn

- Sau đó, đem đun cách thủy ở 100 C trong 5 phút, sau đó làm nguội nhanh dung dịch về nhiệt độ phòng bằng nước.

- Bổ sung vào mỗi ống nghiệm 10 mL nước cất, lắc đều đến 30 khi dung dịch không còn phân lớp.

- Đồng thời thực hiện mẫu trắng, trong đó hỗn hợp phản ứng được thay bằng nước.

- Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm Tính: ∆OD = ODmẫu –

Kết quả - Biện luận

* Kết quả đo OD Mẫu

Bảng 5.2 Kết quả đo OD Mẫu

OD Mẫu Ống 5 phút Ống 10 phút Ống 15 phút Ống 30 phút

Bảng 5.3 Kết quả OD trắng

Bảng 5.4 Kết quả Nồng độ

Thời gian Ống 5 phút Ống 10 phút Ống 15 phút Ống 30 phút

* Phương trình đường chuẩn DNS: y = 0.074x – 0.0038 với R 2 = 0.9978

* Công thức tính khối lượng đường khử chuyển đổi đơn vị đường từ micromol sang mg.

Bảng 5.5 Bảng khối lượng sản phẩm Glucose và Fructose tạo thành

Thời gian Ống 5 phút Ống 10 phút Ống 15 phút Ống 30 phút

Bảng 5.6 Viết phương trình nồng độ 4 g/L

Thời gian ( phút ) Khối lượng sản phẩm (mg)

Phương trình đa thức bậc 3

Bảng 5.9 Viết phương trình nồng độ 0.5 g/L

Tiêu đề	Thí nghiệm công nghệ protein và enzyme
Tác giả	Nguyễn Đỗ Hoàng Dung, Huỳnh Võ Trường Giang, Võ Đông Hải
Người hướng dẫn	TS Nguyễn Thị Cẩm Vi
Trường học	Trường Đại Học Tôn Đức Thắng
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh học
Thể loại	Báo cáo thí nghiệm
Năm xuất bản	2023
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	26,25 MB