Đề tài Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BỘ MƠN TỐN-TIN HỌC NGƠ TUẤN NGỌC TÀI LIỆU BÀI GIẢNG PHẦN TIN HỌC VĂN PHÒNG NÂNG CAO CHUYÊN KHOA KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2021 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ TUẤN NGỌC TÀI LIỆU BÀI GIẢNG PHẦN TIN HỌC VĂN PHỊNG NÂNG CAO CHUN KHOA KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Trần Văn A ThS Nguyễn Thị D Nơi thực hiện: Bộ môn X Công ty dược phẩm Y HÀ NỘI - 2020 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu 1.2 Enzyme 1.3 Enzyme Bromelain CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN 11 2.1 Ứng dụng y dược 11 2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang 12 2.1.2 Bromelain làm liền sẹo 12 2.1.3 Bromelain giảm đau nhức hư khớp 12 2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch 13 2.1.5 Bromelain bệnh hen suyễn 13 2.1.6 2.2 Bromelain HIV 13 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 14 2.2.1 Bromelain làm mềm thịt 14 2.2.2 Bromelain sử dụng trình đông tụ sữa 14 2.2.3 Bromelain chế biến thủy sản 14 2.3 Ứng dụng công nghiệp dệt may 14 2.4 Ứng dụng công nghiệp thuộc da 15 2.5 Bromelain dùng để thu nhận chất ức chế protease 15 2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức 15 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN 16 3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain 16 3.1.1 Phương pháp siêu lọc 16 Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ 3.1.2 Phương pháp kết tủa 19 3.1.3 Phương pháp hấp phụ 21 3.2 Các phương pháp tinh enzyme Bromelain 21 3.2.1 Phương pháp thẩm tích 21 3.2.2 Phương pháp lọc Sephades G-50 21 3.2.3 Phương pháp sắc ký 22 KẾT LUẬN 23 Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình 1: Cấu trúc sợi hydrate carbon Hình 2: Lọc cross - flow 17 Hình 3: Kiểu bước 17 Hình 4: Kiểu lộ 18 Hình 5: Kiểu thể tích khơng đổi 18 Hình 6: Cấu tạo kaolin 21 Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Những tính chất vật lý Bromelain thân Bảng 2: Hoạt tính phân giải casein Bromelain Bảng 3: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) Bromelain DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Sự ảnh hưởng pH đến hoạt tính bromelain Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ LỜI CẢM ƠN Lời xin cám ơn cô, ThS.Nguyễn Thị D– người trực tiếp tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy, Cô Khoa bảo, khuyến khích hỗ trợ tơi suốt bốn năm học tập Trường Đại học M Đây khoảng thời gian tiếp thu nhiều kiến thức kỹ cần thiết để trang bị cho tương lai phía trước Tơi xin cám ơn gia đình bạn bè bên cạnh, động viên, hỗ trợ, cho tơi lời khun bổ ích để tơi có ngày hơm Tuy nhiên, thời gian khả có hạn nên khóa luận khơng tránh thiếu sót, tơi mong nhận góp ý chân thành Thầy Cơ bạn để khóa luận trở nên hồn chỉnh Tôi xin chân thành cám ơn ! Tp Hà Nội, ngày dd tháng mm năm 20xx Sinh viên Bùi Hải Anh Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày với tiến phát triển không ngừng khoa học nhu cầu sản phẩm Khoa học Công nghệ ngày cao, đặc biệt công nghệ enzyme từ nguồn động, thực vật vi sinh vật có vai trị quan trọng áp dụng nhiều lĩnh vực khác công nghiệp đời sống, đặc biệt giúp cải tiến nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá giá thành sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu an tồn sinh học, khơng gây bệnh người Một enzyme quan trọng sống enzyme Bromelain Nó ứng dụng cơng nghiệp, thực phẩm quan trọng y dược Với đặc điểm tầm quan trọng enzyme Bromelain Đề tài “Tìm hiểu Bromelain enzyme, chiết suất ứng dụng” thực nhằm ly trích giúp hiểu tầm quan trọng enzyme Bromelain sống Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu Dứa ăn nhiệt đới, có nguồn gốc Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), vùng tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại Hiện giới, dứa trồng hầu hết nước trừ Châu Âu Các nơi trồng nhiều như: Hawaii, Brazil, Philippines, Thailand… Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng nước khoảng 40.000 với sản lượng khoảng 500.000 tấn, đến 90% khu vực phía Nam Các atỉnh trồng dứa miền Nam Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau… miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ… miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam… Trên giới có khoảng 60 - 70 giống dứa chia thành nhóm, có nhóm trồng phổ biến nhóm Cayenne, nhóm Queen nhóm Spanish - Nhóm Cayenne nhóm dứa trồng phổ biến giới, chiếm khoảng 80% diện tích Ở nước ta trồng số nơi Vĩnh Phúc, Nghệ An Dứa thuộc nhóm có lớn nhất, mắt phẳng nông Thịt vàng, nhiều nước, thơm dứa Queen - Nhóm Queen cịn gọi dứa Hồng Hậu, dứa hoa, dứa tây Đây nhóm dứa trồng phổ biến nước ta nay, với giống dứa tây, giống dứa Na Hoa phía Bắc, giống Queen Long An, Kiên Giang tỉnh Đồng sông Cửu Long (cịn gọi khóm Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ thơm) Dứa thuộc nhóm có tương đối nhỏ, mắt lồi Thịt vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua lâu Nhóm có chất lượng cao nhất, giới thường dùng để ăn tươi - Nhóm Spanish cịn gọi dứa Tây Ban Nha, dứa ta Nhóm trồng Thailand, Cuba Quả dứa thuộc nhóm lớn dứa Queen, mắt sâu Thịt vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua thơm nhiều nước dứa hoa Dứa nhóm chịu bóng râm, dập nát vận chuyển hàm lượng đường thấp nên không phát triển 1.2 Enzyme Trong thể sống (các tế bào) ln xảy q trình trao đổi chất Sự trao đổi chất mà ngừng lại sống khơng cịn tồn Q trình trao đổi chất tập hợp nhiều phản ứng hóa học phức tạp Enzyme hợp chất protein xúc tác cho phản ứng hóa học Chúng có khả xúc tác đặc hiệu phản ứng hóa học định đảm bảo cho phản ứng xảy theo chiều hướng định với tốc độ nhịp nhàng thể sống Enzyme có hầu hết loại tế bào thể sống Chính tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme gọi chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với chất xúc tác hóa học Chúng chất xúc tác sinh học khơng có vai trị quan trọng q trình sinh trưởng, phát triển sinh vật mà cịn giữ vai trị quan trọng lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, kỹ thuật phân tích, cơng nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 10 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khả phân giải bromelain mạnh papain gấp lần, có chất casein hoạt tính bromelain tương tự papain Đối với chất tổng hợp BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) khả thuỷ giải bromelain yếu hon papain ➢ Ảnh hưởng nhiệt độ: nhiệt độ phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố: thời gian tác dụng dài nhiệt độ nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, nồng độ chất, dạng tồn enzyme Ví dụ: Ở dịch chiết dứa (pH= 3.5) tăng nhiệt độ lên đến 60°C bromelain cịn hoạt tính tăng cao q bromelain hoạt tính Ở 5°C, pH= - 10 enzyme giữ hoạt tính tối đa casein 24h Ở 55°C, pH = 6.1 enzyme 50% hoạt tính vịng 20 phút ➢ Ảnh hưởng ion kim loại: ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme chúng gắn vào trung tâm hoạt động enzyme Chẳng hạn muối thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain mức độ kìm hãm tuỳ thuộc vào nồng độ muối Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 11 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN - Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme loại phát triển mạnh mẽ qui mô công nghiệp Thực tế có hàng ngàn chế phẩm enzyme bán thị trường giới, chế phẩm khai thác tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến nhu amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase - Chế phẩm enzyme không ứng dụng y học mà ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau, công nghiệp thực phẩm, dệt may, thuộc da 2.1 Ứng dụng y dược - Enzyme có vị trí quan trọng y học Đặc biệt phương pháp định lượng định tính enzyme hóa học lâm sàng phịng thí nghiệm chẩn đốn Do đó, y học xuất lĩnh vực gọi chẩn đốn enzyme, có nhiệm vụ: • Phân tích xác định nồng độ chất glucose, ure, cholesterol với hỗ trợ enzyme • Xác định hoạt tính xúc tác enzyme mẫu sinh vật * Xác định nồng độ chất với hỗ trợ thuốc thử enzyme đánh dấu - Ngồi cịn dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần loại thuốc Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 12 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ dùng da liễu mỹ phẩm - Trong y học protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất kháng sinh, chất kháng độc Ngoài người ta cịn dùng enzyme protease để đặc tinh chế huyết kháng độc để chữa bệnh 2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang - Ở Đức, trẻ em bị viêm xoang thường chữa trị bromelain chiết xuất từ dứa, thấy cho kết tốt, làm giảm thời gian trị bệnh (từ ngày xuống ngày) - Bromelain dùng làm thuốc tẩy giun, loại giun nhỏ thường gặp trẻ em Qua nghiên cứu Hordegen.P bromelain cho kết tốt pyratel 2.1.2 Bromelain làm liền sẹo Enzyme Bromelain có tác dụng làm mau lành vết thương da hay vết Một số thí nghiệm cho thấy, chuột bị phịng, chất chiết xuất bromelain từ dứa giúp tiến trình làm vết thương sau 4h, lấy vật lạ mơ chết để khơng cịn trở ngại cho trình làm lành vết thương 2.1.3 Bromelain giảm đau nhức hư khớp - Ở Đức, thị trường có sản phẩm chứa 90mg bromelain, 48mg trysin (enzyme nguồn động vật) 100mg Putin (một flavonoid bảo vệ mao mạch) - Thử nghiệm nhằm so sánh sản phẩm tuần 90 người bị hư khớp háng với diclofenac (100mg/ngày) Và kết điều trị tốt diclofenac đau nhức hư khớp, khơng có tác dụng phụ Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 13 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ 2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp cho người bị ung thư phổi, bàng quang, vú, buồng trứng ) giảm tượng di Đồng thời bromelain cịn ức chế q trình viêm, làm giảm tượng phù nề tụ huyết, giảm đau nhức Do đó, chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain chất làm giảm đau, kháng viêm kháng sưng Hiệu bromelain làm giảm lượng prostaglandin thể gây đau, viêm ngăn cản thấm chất dinh dưỡng qua mô cách ngăn cản tiền chất gây viêm 2.1.5 Bromelain bệnh hen suyễn Bromelain phối hợp với thuốc kháng sinh điều trị số bệnh nhiễm khuẩn làm tăng hiệu kháng sinh, phối hợp với số thuốc điều trị hen (theophyllin, ephedrin ) làm tăng tác dụng chống hen Mới đây, số nghiên cứu đăng tạp chí y học Anh cho biết, qua thử nghiệm chuột, nhà khoa học nhận thấy bromelain làm giảm 50% dấu hiệu viêm phổi bệnh hen 2.1.6 Bromelain HIV Trong trình sinh sản tế bào người bệnh, virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV) cần enzyme hoạt hóa protease (proteindigesting enzymes) để chép ngược để cô đọng nhân protein để nhân bội virus Thuốc điều trị HIV/AIDS theo chế ức chế proteindigesting enzymes gọi protease inhibitor hay anti-protease hữu hiệu đắc tiền gây nhiều phản ứng phụ Các nhà khoa học tập trung nghiên cứu hợp chất thiên nhiên có khả ức chế protease HIV tìm thấy 19 hợp chất thiên nhiên có tác dụng tương tự thuốc anti protease, Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 14 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ bromelain dứa coi có giá trị ăn, uống để điều trị HIV/AIDS 2.2 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 2.2.1 Bromelain làm mềm thịt Enzyme Bromelain: có tác dụng thủy phân chất đạm, nghĩa phân cắt protein thành acid amin dễ tiêu hóa Để cho thịt bị, thịt trâu trở nên mềm thường phải nấu sôi hàng Nhưng trước nấu ta ướp (trộn) thịt với thơm bằm (hay đu đủ bằm) độ 20-30 phút cần nấu lửa riu riu sôi lên thịt mềm dễ tiêu hóa hấp thu 2.2.2 Bromelain sử dụng q trình đơng tụ sữa Để chế biến sản phẩm từ sữa người ta thường dùng renin Renin enzyme làm đông tụ sữa truyền thống Tuy nhiên, lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ nhu cầu sản xuất sữa Gần người ta sử dụng enzyme thực vật vào chế biến sữa nghiên cứu Trong đó, enzyme Bromelain quan tâm với mục đích 2.2.3 Bromelain chế biến thủy sản Trong sản xuất nước mắm thời gian chế biến thường dài hiệu suất thủy phân độ đạm không cao nên người ta ý đến qui trình sản xuất nước mắm ngắn ngày có enzyme Bromelain giúp thời gian sản xuất nước mắm giảm bớt cải thiện hương vị nước mắm 2.3 Ứng dụng công nghiệp dệt may Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sợi tơ Với công đoạn xử lý enzyme sau xử lý dung dịch xà phịng giúp lụa có tính đàn hồi tốt, bắt màu đồng dễ trang trí lụa Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 15 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ 2.4 Ứng dụng công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp da, enzyme dùng để làm mềm da, làm da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường Việc xử lý tiến hành cách ngâm da dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da Enzyme tách chất nhờn làm đứt số liên kết phân tử collagen làm cho da mềm Thực tế cho thấy xử lý da chế phẩm protease từ vi sinh vật rút ngắn thời gian làm mềm tách lông xuống nhiều lần Điều quan trọng chất lượng lông tốt cắt 2.5 Bromelain dùng để thu nhận chất ức chế protease Bromelain dùng để thu nhận chất ức chế protein có chứa nhóm –SH Các chất ức chế sử dụng nhiều công nghiệp y tế 2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức Bromelain kết hợp với Curcumin (chiết suất từ củ nghệ vàng) điều chế thành thực phẩm chức an toàn Brocurma CLB có tác dụng tăng cường miễn dịch khảng đề kháng thể, tăng khả phòng số bệnh đồng thời hỗ trợ điều trị bệnh nan y, hiểm nghèo nhờ hoạt tính sinh học cộng hưởng Curcumin-Bromelain Sản phẩm đặc hiệu bệnh viêm dày, đại tràng Có chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số: 919/2006/YT-CNTC Cục An Toàn vệ sinh thực phẩm – Bộ Y Tế cấp ngày 05/4/2006 Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 16 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN 3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain 3.1.1 Phương pháp siêu lọc - Siêu lọc trình dung dịch lỏng chảy qua màng lọc áp suất để tách phân đoạn thành phẩm chất lỏng Sự phân chia phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ màng tùy theo trọng lượng phân tử chất thấm qua Tùy theo kích thước lỗ màng mà sau thực trình siêu lọc thu nước chất có phân tử nhỏ cịn chất có phân tử lớn bị giữ lại màng - Dung dịch enzyme thu từ nguyên liệu thực vật có chứa tạp chất có trọng lượng phân tử khác Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loại trừ chất bẩn Sau chuyển sang phương pháp siêu lọc loại chất có trọng lượng phân tử thấp protein, enzyme đồng thời cô đặc enzyme - Màng siêu lọc cấu tạo sợi rỗng Trong sợi rỗng lại có nhiều lỗ rỗng xếp song song gắn chặt với lớp tạo thành lỗ để chất thấm qua Các sợi chế tạo từ loại polime bền fluoropolime (FS: Fluorosurfactant), Cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR) Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng lọai màng thích hợp Ví dụ: cô đặc protein (dùng màng FS, GR); Cô đặc enzyme (dùng màng GR) Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 17 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Hình 2: Lọc cross - flow a Các yếu tố ảnh hưởng đến trình siêu lọc - Nhiệt độ: Nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm loại màng sử dụng Khi chọn nhiệt độ sử dụng cần lưu ý đến khả kết tủa protein tăng nhiệt độ tình siêu lọc trình làm kín màng - Áp suất: Thường tốc độ dịng chảy (số lít chất lỏng qua 1m” màng 1h) tăng với gia tăng áp suất đạt đến giá trị (tốc độ) cực đại Nếu áp suất tăng lên cao dịng chảy giảm Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh từ - lít/phút, tương ứng với hiệu suất PIN - PI khoảng 0.5 - 3bar Áp suất dòng vào lớn (PImax) 7bar (tương đương 102Psi), áp suất dòng nhỏ (PI min) 0.5bar (tương đương 7.25Psi) b Các kiểu siêu lọc : có ba kiểu hệ thống siêu lọc - Kiểu bước (single pas operation) Hình 3: Kiểu bước Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 18 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ - Kiểu lộ (batch operation): Chất lỏng tuần hoàn qua màng đến nồng độ dịch cổ đặc chậu chưa đạt yêu cầu Hình 4: Kiểu lộ - Kiểu thể tích khơng đổi (constant volume operation): Dòng chất lỏng cung cấp liên tục để thể tích chậu chứa khơng thay đổi chất lỏng tuần hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô đặc chậu chứa đạt u cầu Hình 5: Kiểu thể tích khơng đổi c Những thuận lợi phương pháp siêu lọc - Có thể lựa chọn màng thích hợp với mục đích cụ thể - Đối với enzyme: enzyme có đặc 25 lần mà khơng bị hoạt tính - Q trình siêu lọc vừa làm đặc, vừa tinh enzyme Trong Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 19 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ trình thực thêm nước vào độ tinh enzyme cao - Trong trình siêu lọc, nhiệt độ cao làm hoạt tính enzyme, nhiệt độ 10 - 20°C xem khoảng nhiệt độ thích hợp cho suất cao mà khơng làm hoạt tính enzyme Q trình siêu lọc thực tốt nhiệt độ thấp (5 C) 3.1.2 Phương pháp kết tủa - Nguyên tắc: Dựa tinh hoà tan Điểm đẳng điện đa số protein thấp hơm pH=7 điều kiện sinh lý, phân tử protein có thừa điện tích âm kết hợp với đầu mang điện tích dương phân tử nước lưỡng cực, ion dương khác có dung dịch Sự kết hợp với nước tạo lớp nước bao quanh phân tử protein cản trở kết tủa chúng để kết tủa enzyme ta thiết phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử cách bổ sung vào dung dịch dung môi hố chất ưa nước có lực mạnh protein để lơi kéo nước khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống - Heinicker Gortner dùng acetone để kết tủa bromelain Bromelain dung dịch nước nhạy cảm với dung môi hữu cơ, để kết tủa đạt hiệu cao thường tiến hành điều kiện lạnh Như dịch dứa phải làm lạnh 0°C đến 4C acetone tinh khiết - 20°C Ethanol sử dụng để làm kết tủa bromelain phải giữ nhiệt độ thấp Sau thu kết tủa, tủa bromelain phải rửa acetone làm khô thật nhanh để bromelain khơng bị biến tính - Thơng thường yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 20 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ chất lượng chế phẩm enzyme là: • Nồng độ tác nhân kết tủa • pH dịch chiết • Nhiệt độ kết tủa • Thời gian tiếp xúc tác nhân dịch chiết - Ngồi ra, ta cịn sử dụng ammonium sulfate Sự kết tủa với tác nhân q trình thuận nghịch thực nhiệt độ thường Do có ưu điểm nên tác nhân ammonium sulfate thường dùng để kết tủa bromelain thu chế phẩm enzyme thô - Hiện người ta kết tủa enzyme bromelain CMC (carboxyl methyl cellulose) enzyme thu có độ tinh khiết cao, thời gian đợi kết tủa ngắn tiến hành thuận lợi - Quá trình tạo CMC[4] Mô tả sơ đồ : Thận, chồi trái dứa rửa sau tiến hành đem xay nhuyễn phần thu hệ huyền phù Đem lọc thu dịch ép, sau ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút 15 phút thu dịch ly tâm, cho tác nhân kết tủa (acetone tinh khiết -20°C, ethanol -4°C ammonium sulfate 70% bão hòa) vào dung dịch để làm kết tủa enzyme Bromelain với thời gian 30 phút tiến hành ly tâm lạnh 6000 vòng/phút 20 phút thu kết tủa enzyme cuối đem sấy đông khô enzyme Bromelain thô Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 21 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ 3.1.3 Phương pháp hấp phụ Có nhiều chất sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme kaolin hay bentonite để hấp phụ bromelain Kaolin chất có tính hấp phụ tốt, kích thước hạt nhỏ 1ụm diện tích tiếp xúc hạt kaolin chất bị hấp phụ tăng lên nhiều Một lí khác dẫn đến khả hấp phụ vật chất kaolin cao bề mặt kaolin có nhiều ion OH 0°, ion có khả liên kết tương đối bền vững với chất bị hấp phụ Hình 6: Cấu tạo kaolin 3.2 Các phương pháp tinh enzyme Bromelain 3.2.1 Phương pháp thẩm tích Tiến hành: - Cân 1g enzyme thủ - Dung dịch đệm sử dụng 10ml dung dịch NaPO4 0,03M có pH=7.2 - Cho protein vào túi cellophane tiến hành thẩm tích 6h sau 2h thay dung dịch đệm bên lần Dung dịch đệm phía ngồi túi khuấy liên tục máy khuấy từ, cuối thu enzyme túi 3.2.2 Phương pháp lọc Sephades G-50 Ta đem cân 100mg enzyme thủ hòa tan vào 1ml dung dịch đệm Na3PO4 0,03M, pH = 7.2 Khi enzyme hồ tan hồn tồn cho hỗn hợp enzyme Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 22 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ từ từ vào cột Cho dung môi phân ly enzyme qua cột điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml phút Loại bỏ 5ml bắt đầu thu dịch enzyme Dịch enzyme thu đến dùng Ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 thấy có xuất kết tủa trắng ngừng trình thu dịch enzyme Dịch enzyme thu nhận làm đơng khơ Q trình lọc enzyme qua sephalex G-50 nên tiến hành điều kiện nhiệt độ thấp để giảm thiểu biến tính protein, thời gian tiến hành lọc khoảng 1h 3.2.3 Phương pháp sắc ký - Bromelain thân cho chạy sắc ký Duolite Cs101 pH= 6.05 cho hai phân đoạn khác điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein glucagons - Sắc ký bromelain thân Bio Rex pH= 6.1 thu phân đoạn khác thành phần amino axit Khi sắc ký Sephalex G-75 pH=7 nhận thành phần có hoạt tính enzyme - Bromelain thân bromelain thơ cho chạy sắc ký gel sephalex G-75 sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion sulfoethyl sephalex cho phân đoạn đơn có hoạt tính phân giải protein Nếu sắc ký hốn vị gel pH=7 sau sắc ký sulfoethyl sephalex cho thấy có diện hai protease riêng biệt đặt tên bromelain II bromelain III, hai protease có tốc độ di chuyển khác điện polyacrylamide pH=9.5 - Bromelain thân dùng sắc kí gel sephades G-50 sắc kí trao đổi ion DEAE-cellulose thấy có thành phần thành phần phụ - Bromelain dùng sắc kí DEAE-cellulose sulfoethyl sephalex thấy có thành phần thành phần phụ Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 23 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ KẾT LUẬN Sau hoàn thành báo cáo chuyên đề với đề tài “Tìm hiểu Bromelain Enzyme, chiết suất ứng dụng nhóm bổ sung nhiều kiến thức như: - Hiểu tính chất đặc điểm enzyme Bromelain - Nắm ứng dụng to lớn enzyme Bromelain công nghiệp đời sống - Giúp hiểu phần qui trình thu nhận phương pháp tinh enzyme Bromelain Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh 24 Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ - TÀI LIỆU THAM KHẢO Dương Thị Hương Giang Giáo trình thực tập cơng nghệ enzyme, 2005, Trường Đại Học Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng Công nghệ enzyme, 2004, NXB Đại Học Quốc Gia Lê Thị Thanh Mai Nghiên cứu enzym bromelin đường ứng dụng chúng, 1997, Trường Đại Học Tự Nhiên Trần Xuân Ngạch Công nghệ enzim, 2004, NXB Đại Học Đà Nẵng Lê Ngọc Tú Hóa sinh công nghiệp, 2002, NXB khoa học kĩ thuật HEINICKE, R.M.; GORTNER, W.H Stem Bromeline: New proteose from pineapple plant, 1957 http://thucphamchucnang24h.vn/gioi-thieu.3ts, truy cập ngày 06.06.2011 Sinh viên thực hiện: Bùi Hải Anh ... 1.3 Enzyme Bromelain CHƯƠNG 2: NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN 11 2.1 Ứng dụng y dược 11 2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang 12 2.1.2 Bromelain làm liền sẹo... phân giải casein Bromelain Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Cơ Chất Bromelain thân Casein Bromelain xanh 7.4 Bromelain chín 4.0 3.0 Đối với chất casein, hoạt tính phân giải bromelain thân cao... chất nhân tạo bromelain Bảng 3: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) Bromelain Cơ Chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg) Bromelain thân Casein 3.7 Bromelain xanh 9.1 Bromelain chín