TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VỀ ENZYME CYLANASE

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA - - TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VỀ ENZYME CYLANASE GVHD: TS.NGUYỄN HOÀNG MINH SVTH : TRƯƠNG CHÂU GIANG NGUYỄN THỊ LỆ HÀ QUÁCH THANH HỒNG PHẠM THỊ ANH THƯ NGUYỄN THỊ MỸ UYÊN DƯƠNG NGUYỄN ÁI XUÂN LỚP : 17SH Đà Nẵng, 3/2021 TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC HÌNH .II DANH MỤC BẢNG .III LỜI MỞ ĐẦU 1 XYLAN 1.1 Xylan 1.2 Cấu trúc Xylan .2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN – XYLANASE 2.1 Khái niệm 2.2 Phân loại cấu trúc Xylanase 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Cấu trúc 2.3 Nguồn phân lập enzyme xylanases 2.3.1 Các lồi có khả sinh enzyme xylanase nghiên cứu .4 2.3.2 Thành phần môi trường để phân lập chủng vi sinh vật nấm có tiềm sinh enzym xylanase .5 2.4 Cơ chế hoạt động enzyme Xylanase 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme Xylanase .7 2.6 Ứng dụng enzyme xylanase 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 12 I GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cấu trúc hóa học Xylan2 .3 Hình Cấu trúc không gian Xylanse phân lập từ Bacillus subtilis .5 Hình 2 Phương thức hoạt động Xylanase Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động xynalase6 Hình Ảnh hưởng độ pH đến hoạt động xynalase6 .10 Hình Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hoạt tính xylanase6 .10 Hình Ảnh hưởng ion kiêm loại đến hoạt tính xylanase .11 II GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần môi trường phân lập sơ cấp6 Bảng 2.2 Thành phần môi trường phân lập thứ cấp III GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE LỜI MỞ ĐẦU Sản xuất enzyme lĩnh vực ngày phát triển, hướng hàng đầu ngành công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm Nhu cầu sử dụng loại enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày tăng cao, có enzyme xylanase Xylanase loại enzyme sử dụng nhiều ngành sản xuất toàn giới Trong sinh giới, động vật thực vật khơng có khả tự sinh xylanase, vai trò thủy phân xylan phụ thuộc chủ yếu vào nguồn vi sinh vật, đặc biệt quan trọng nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn nấm Bên cạnh đó, lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase ứng dụng loại enzyme quan tâm Chính tầm quan trọng ứng dụng thiết thực enzyme xylanase ngành công nghiệp nên tiểu luận nhóm đề cập vấn đề tổng quan enzyme xylanase vấn đề liên quan GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE XYLAN 1.1 Xylan Xylan thành phần hemicellulose thực vật, polysaccharide phổ biến thứ hai tự nhiên sau cellulose tìm thấy thành tế bào thực vật Là phức hợp polysaccharide gồm: xylan, xylanglucan, glucomannan, galactoglucomannan arabinogalactan Phức hợp với cellulose lignin hình thành nên thành phần polymer vách tế bào thực vật Xylan tham gia vào cấu trúc giúp lignocellulose bền hơn1 1.2 Cấu trúc Xylan Xylan polysaccharide không đồng nhất, bao gồm gốc D-xylose liên kết với liên kết β-1,4-xylanosidic (β-1,4- D-xylopyranosyl) đường xylopyranose với acetyl, arabinosyl glucuronysy (Sao cách q đáng v) Hình 1 Cấu trúc hóa học Xylan2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN – XYLANASE 2.1 Khái niệm Xylanase glycosidase ( O -glycoside hydrolase, EC 3.2.1.x) xúc tác q trình thủy phân endohydro hóa các liên kết 1,4-β- D -xylosidic xylan, polysaccharide không đông nhất. Chúng phức hệ enzyme cần thiết, tham gia vào việc sản xuất xylose, nguồn cacbon cho q trình trao đổi chất tế bào trình GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE lây nhiễm tế bào thực vật mầm bệnh thực vật, tạo nhiều sinh vật bao gồm vi khuẩn, tảo, nấm, động vật nguyên sinh, động vật chân bụng nhân trắc Phát xylanase báo cáo lần vào năm 1955, ban đầu chúng gọi pentosanase Liên minh Hóa sinh Sinh học Phân tử Quốc tế (IUBMB) công nhận vào năm 1961 chúng gán mã enzym EC 3.2.1.8. Tên thức chúng endo-1,4-β-xylanase, thuật ngữ đồng nghĩa thường sử dụng bao gồm xylanase, endoxylanase, 1,4-β- D -xylan-xylanohydrolase, endo-1,4-β- D -xylanase, β- 1,4-xylanase β-xylanase3 2.2 Phân loại cấu trúc Xylanase 2.2.1 Phân loại Enzyme xylanase thường tìm thấy thực vật vi sinh vật Xylanase chủ yếu phân loại thành GH10 (Glycoside hydrolase họ 10) 11 dựa phân tích cụm kỵ nước miền xúc tác tương đồng trình tự axit amin Xylanase từ họ GH10 (hoặc họ G) có khối lượng phân tử thấp với pI từ 8-9,5: Glycoside hydrolase họ 10 bao gồm endo-1,4-β-xylanase endo-1,3-β-xylanase, có cấu trúc α/β gấp cuộn lần thủy phân liên kết glycoside giữ hình thể nguyên vẹn Xylanase từ họ GH11 (hoặc họ F) có khối lượng phân tử cao giá trị pI thấp hơn: Có độ chọn lọc chất hiệu suất xúc tác cao, kích thước nhỏ nhiều giá trị pH nhiệt độ tối ưu, làm cho chúng phù hợp điều kiện khác nhiều ứng dụng 2.2.2 Cấu trúc GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE Hình Cấu trúc khơng gian Xylanse phân lập từ Bacillus subtilis Cấu trúc điển hình hầu hết Xylanase G11 chứa hai β xoắn tạo thành nếp gấp trơng giống bàn tay phải, sợi β riêng lẻ luồn qua lại để tạo thành "ngón tay" miền "lịng bàn tay" (được hiển thị vùng F P) Một vòng mở rộng tạo thành miền "ngón tay cái" (được hiển thị dạng T), mở đóng vị trí hoạt động, điều chỉnh tiếp cận chất đến vùng xúc tác enzym Lùi dơ 2.3 Nguồn phân lập enzyme xylanases 2.3.1 Các lồi có khả sinh enzyme xylanase nghiên cứu Enzyme xylanase tìm thấy nhiều sinh vật sống khác như: vi sinh vật, động vật nguyên sinh, động vật thân mềm cỏ động vật nhai lại.Tuy nhiên quy mô công nghiệp, xylanase chủ yếu sản xuất vi sinh vật vi khuẩn, nấm xạ khuẩn Một số vi khuẩn có khả sinh xylanase kể đến số chủng vi khuẩn Bacillus sp báo cáo sinh enzyme có độ phân giải xylano mạnh nhất: B.halodurans, B.pumilus, B.subtilis, B.amyloliquefacials, B.circulans B.stearotherphilus Xylanase với tính bền nhiệt cao, ổn định kiềm/axit thích ứng với nhiệt độ lạnh phân lập từ nhiều loại vi khuẩn tìm thấy mơi trường khắc nghiệt Xylanase chất làm mát hoạt động nhiệt độ từ 60-70 độ C phân lập từ Bacillus Halodurans TSEV1, Closditrium thermocellum, Rhodothermus marinus, Streptomyces sp., Stenotrophomonas maltophila, Thermotoga GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE thermarum Một số xylanase bền kiềm phân lập từ số vi khuẩn như: Clostridium sp PXLY1, Flavobacterium frigidarium, Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3A5 Nguồn xylanase từ nấm ưa nhiệt kể đến thuộc chi Aspergillus Trichoderma loài sản xuất xylanase mạnh áp dụng rộng rãi để sản xuất thương mại Một số chủng có khả sản xuất xylanase siêu ưa nhiệt kể đến như: Thielavia terrestris, Talaromyces thermophilus, Paecilomyces thermophile, Rhizomucor pusillus, Rasamsonia emersonii, Melanocarpus albomyces Aspergillus oryzae LC1 Một số xylanase bền kiềm thu nhận từ chủng nấm khác như: Paenbacillus barcinonensis, Aspergillus fumigatus MA28, Cladosporium oxysporum Aspergillus oryzae LC15 2.3.2 Thành phần môi trường để phân lập chủng vi sinh vật nấm có tiềm sinh enzym xylanase Mặc dù xylanase phát từ nhiều loài vi khuẩn nấm sợi tùy vào mục đích sử dụng khác mà chủng vi khuẩn sinh enzyme xylanase chọn phân lập từ nguồn tương ứng khác Mẫu vi sinh vật dùng để phân lập lấy từ mẫu đất, đất rừng, phân, mẫu giống cũ, kho giống, Thành phần môi trường dùng để phân lập chủng vi sinh vật nấm có khả sinh enzyme xylanase: Bảng Thành phần môi trường phân lập sơ cấp6 Thành phần NH4NO3 KH2PO4 NaCl MgSO4 Hàm lượng (1000ml dung dịch) 1,5g 2,5g 1g 1,5g MnSO4 FeSO4 CaCl2 Xylan Agar 0,01g 0,005g 0,05g 0,1g 20g GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE pH môi trường điều chỉnh tới 5,0 khử trùng nhiệt độ 121°C với áp suất 15 lb 20 phút Sau môi trường đổ vào đĩa petri khử trùng Môi trường lỏng dùng để phân lập vi nấm có thành phần tương tự khơng có agar Lùi dô *Các bước để phân lập chủng vi khuẩn sinh enzyme xylanase  Thu thập mẫu đưa vào thùng vô trùng bảo quản 4°C cần dùng tiếp  Pha loãng mẫu với nước cất theo thứ tự tới có độ pha lỗng cao 10 5/0,1 mL sau cấy trải giàu hemicellulose Nếu cần chủng chịu kiềm chỉnh ph môi trường lên 9,0 dung dịch Na2CO3 10%  Ủ ngày để phát triển vi sinh vật phong phú (ủ nhiệt độ 50°C để lựa chọn giống có khả chịu nhiệt)  Các vi sinh vật thu sau bước sàng lọc sơ thu khuẩn lạc đơn tiếp tục Bảng 2.2 Thành phần môi trường phân lập thứ cấp6 nuôi cấy Hàm lượng (w/v) Thành phần môi Xylan 0,5% trường Cao sinh khối nấm 0.5% thạch men xylan 0.2 % Pepton bước sàng 0.02% lọc MgSO4.7H2O thứ cấp K2HPO 4 0.1% Agar 2% GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE Sau ủ ngày, kiểm tra khả xylanase ngoại bào thuốc thử Congo đỏ Đặt dung dịch Congo đỏ 1% giữ vòng 10-15 phút Sau khử dung dịch NaCl 1M để nhìn thấy vùng thủy phân Chọn chủng có vịng thủy phân rộng nhất, ni cấy thử nghiệm tính hiệu suất giống 2.4 Cơ chế hoạt động enzyme Xylanase Xylanase phân giải polysaccharide xylan mạch thẳng thành xylose cách xúc tác trình thủy phân liên kết glycosidic(β-1,4) xyloside thành phần hemicellulose,làm phá vỡ hemicellulose thành phần thành tế bào7 Trong trung tâm hoạt động xylanase, axit amin định hoạt động enzyme axit glutamic Sự thủy phân xylan đòi hỏi hỗ trợ hoạt động thành phần hệ thống enzyme xylanolytic GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE Hình 2 Phương thức hoạt động Xylanase 2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme Xylanase Hoạt động xúc tác enzyme bị ảnh hưởng nhiều yếu tố  Yếu tố số 1: Nhiệt độ Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động xynalase8 Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xylanase phát 60 ° C. Tương tự, nghiên cứu khác thực với Trichoderma sp.  kết luận nhiệt độ tối ưu thay đổi khoảng từ 45 đến 60 ° C (Dekker, 1983; Gomes cộng sự, 1992). Ngoài ra, nấm xylanase, nhiệt độ tối ưu 60 ° C (Chandra Chandra, 1995; Chandra Chandra, 1996; Gandhi cộng sự, 1994)  Yếu tố số 2: Độ pH GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE Hình Ảnh hưởng độ pH đến hoạt động xynalase8 Các nghiên cứu Ghanem cộng cho thấy hoạt động xylanase tối đa khoảng pH Trong nghiên cứu thực với Trichoderma sp., người ta kết luận giá trị pH thích hợp cho hoạt động xylanase (Dekker, 1983; Gomes cộng sự, 1992; Royer Nakkas, 1991). PH tối ưu khoảng thí nghiệm tương tự xylanase nấm (Milagres cộng sự, 1993; Gandhi cộng sự, 1994; Sigoillot cộng sự, 2002). Trong số nghiên cứu khác, để xác định hoạt tính xylanase, pH thường giữ khoảng (Bailey cộng sự, 1992). Nhưng giá trị pH tối ưu phát nghiên cứu thực với T reesei Rut C-30 (Couchon LeDuyt, 1985). Kết thí nghiệm tương tự cho thấy pH tối ưu cho xylanase vi khuẩn nói chung cao chút so với pH tối ưu xylanase nấm, (Pham cộng sự, 1998; Subramaniyan cộng sự, 2000; SáPereira cộng sự, 2002)  Yếu tố số 3: Thời gian phản ứng Hình Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hoạt tính xylanase8 Khi ảnh hưởng thời gian phản ứng khảo sát, người ta quan sát thấy hoạt động xylanase tối đa 50 phút. Khi thời gian tương tác chất enzyme tăng lên, lượng sản phẩm GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE tăng lên đến thời điểm định. Có báo cáo thay đổi thời gian ủ để xác định hoạt tính xylanase. Điều vi sinh vật nguồn xylan khác (Royer Nakas, 1991; Deschamps Huet, 1985; Atev cộng sự, 1987; Dekker, 1983; Gomes cộng sự, 1993)  Yếu tố số 4: Ảnh hưởng ion kim loại Đề cập đến việc sử dụng tiềm enzyme xylanase ngành công nghiệp giấy bột giấy, số ion kim loại xuất bột giấy đưa vào nghiên cứu này. Trong số ion kim loại đó, Mn 2+ , Ca 2+ và Zn 2+ tăng cường hoạt tính xylanase K 2+ làm giảm hoạt tính. Mg 2+ và Cu 2+ khơng có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính Hình Ảnh hưởng ion kiêm loại đến hoạt tính xylanase8 kim loại cập nhật lại tên hình Tương tự phát kết thực nghiệm Ghanem et al. đối với Aspergillus terreus (Ghanem cộng sự, 2000) Cesar Mrsa đối với T lanuginosus (Cesar Mrsa, 1996) cho thấy Ca 2+ tăng cường hoạt động xylanase. Các ion Mn 2+ và Zn 2+ cũng có ảnh hưởng tích cực đến hoạt động xylanase (Castro cộng sự, 1997; Cesar Mrsa, 1996) 2.6 Ứng dụng enzyme xylanase Từ lâu xylanase ứng dụng nhiều lĩnh vực khác  Một ứng dụng phổ biến biết đến xylanse dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi - Xylanase giúp phá vỡ cấu trúc arabinoxylan thành phần thức ăn làm giảm độ nhớt nguyên liệu tươi - Bổ sung xylanase vào thức ăn gia súc làm tăng khả hấp thu dưỡng chất hệ tiêu hóa, giúp q trình sử dụng thức ăn hiệu  Xylanase ứng dụng nhiều cơng nghiệp sản xuất bánh mì, thức ăn đồ uống 10 GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE - Bổ sung xylanase vào bột bánh mì làm phá vỡ cấu trúc hemicellulose bột bánh mì làm cho bột dễ nhào nở to, xốp - Tương tự thành phần ngun liệu tươi xylanse cịn giúp giảm độ nhớt hoa giúp trình ép dễ phù hợp ngành sản xuất nước hoa - Ngoài ra, việc bổ sung xylanase làm giảm độ đục bia dịch  Xylanase có vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp sản xuất giấy bột giấy Đối với ngành công nghiệp giấy, việc sử dụng lượng lớn hóa chất gốc clo natri hydrosulfit gây tình trạng nhiễm vấn đề nước thải, việc sử dụng enzyme xylanse để tẩy trắng giấy cách phân hủy lignin có thành phần giấy dường mang lại hiệu tốt đảm bảo an tồn mơi trường  Ứng dụng chuyển hóa sinh học chất lignocellulose: Thành phần phụ phẩm nông nghiệp chủ yếu hemicellulose đường  và lượng nhỏ axit hữu Việc phân giải xylan hemicellulose dẫn đến phá hủy cấu trúc tổ hợp lignocellulose tạo thành loại đường làm chất  cho trình lên men sản phẩm cơng nghiệp khác 2.6 Tình hình sản xuất enzyme xylanase: Từ lâu xylanase sản xuất quy mô công nghiệp từ Aspergillus spp.và Trichoderma Hầu hết nhà sản xuất sản xuất xylanase kỹ thuật lên men chìm từ số học vi khuẩn Bacillus, Streptomyces Ngoài cấp độ sinh học phân tử xylanase sản xuất nhân tạo kỹ thuật DNA tái tổ hợp với đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Escherichia coli, nấm men Saccharosemyces cerevisae, nấm sợi P.griseofulvum 11 GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE TÀI LIỆU THAM KHẢO Xylanases - tổng quan | Chủ đề ScienceDirect https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biologicalsciences/xylanases Accessed March 13, 2021 Xylan – Wikipedia tiếng Việt https://vi.wikipedia.org/wiki/Xylan Accessed March 14, 2021 Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases | FEMS Microbiology Reviews | Oxford Academic https://academic.oup.com/femsre/article/29/1/3/584031? login=true&fbclid=IwAR2AptnsVa7ivoAVJYLlXTrpBK2ESOPHJ67dEQnO85JirHBvz61il6XBKA#90530939 Accessed March 14, 2021 Xylanase structure https://sites.ffclrp.usp.br/pbbg/english/research/xylanase/xylanase_structure.htm Accessed March 14, 2021 Optimization of Xylanase Production through Response Surface Methodology by Fusarium sp BVKT R2 Isolated from Forest Soil and Its Application in Saccharification https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5032753/? fbclid=IwAR1qshWYz_uEv98-AjhyUpjbvikBLc4MLXDDPZBXr0qSxqHvEoYatqU9_k Accessed March 14, 2021 Isolation, Identification and Partial Optimization of Novel Xylanolytic Bacterial Isolates from Bhilai-Durg Region, Chhattisgarh, India https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6697829/? fbclid=IwAR2mmxcdyw1p9qpWhOWdLvi4crT8KEZqZjAqyNUOwul268W3L3JXlKtGRg Accessed March 14, 2021 Xylanase - an overview | ScienceDirect Topics https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecularbiology/xylanase Accessed March 13, 2021 (PDF) Factors affecting xylanase functionality in the degradation of arabinoxylans https://www.researchgate.net/publication/5532428_Factors_affecting_xylanase_fun 12 GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE ctionality_in_the_degradation_of_arabinoxylans Accessed March 14, 2021 Nguyễn Thị Hiền; Công nghệ sản xuất enzyme,protein ứng dụng; Nhà xuất Giáo Dục; 2012 13 GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH ... vực liên quan đến enzyme xylanase ứng dụng loại enzyme quan tâm Chính tầm quan trọng ứng dụng thiết thực enzyme xylanase ngành cơng nghiệp nên tiểu luận nhóm đề cập vấn đề tổng quan enzyme xylanase... TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần môi trường phân lập sơ cấp6 Bảng 2.2 Thành phần môi trường phân lập thứ cấp III GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME. .. tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme Xylanase .7 2.6 Ứng dụng enzyme xylanase 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 12 I GVHD: TS NGUYỄN HOÀNG MINH TỔNG QUAN VỀ ENZYME XYLANASE DANH MỤC HÌNH