Giáo trình thí nghiệm công nghệ protein enzyme

hí nghiệm thể hiện tính chất của enzyme đối với tính bột và Saccharose Ống số 1 (tính bột) do amylase thủy phân tinh bột thành glucose, khối protein đơn bào, quy trình tách chiết, thu nhận enzyme từ thực vật, động vật và vi sinh vật và phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MƠN CNSH   GIÁO TRÌNH THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME TÀI LIỆU LƯU HÀNH NỘI BỘ YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN HỌC THÍ NGHIỆM Tuân thủ nội quy PTN Sinh viên phải có mặt đủ buổi thí nghiệm Nếu nghỉ học có lý đáng sinh viên phải xin phép giáo viên xếp cho làm thí nghiệm bù Thiếu thí nghiệm coi chưa hồn tất chương trình Tuy nhiên hạn chế bù, muốn bù phải có giấy xin phép trước đồng ý giáo viên kí xác nhận ngày bù phải đem giấy xin phép theo vào lớp (chỉ giải cho trường hợp bệnh tật, trường hợp khác bị trừ điểm) Sinh viên phải đọc kỹ, nắm vững nội dung thí nghiệm chuẩn bị sẵn báo cáo kết trước đến phịng thí nghiệm Trước buổi thí nghiệm giáo viên hướng dẫn kiểm tra việc chuẩn bị sinh viên Đạt yêu cầu, sinh viên làm thí nghiệm Áp dụng điểm trừ thí nghiệm: khơng chuẩn bị trước; khơng có áo blouse; trễ 15 phút; không giữ trật tự, tác phong không nghiêm túc; vi phạm nội qui PTN; thao tác cẩu thả không cẩn thận; chép báo cáo nhau; viết báo cáo không mẫu qui định; nộp báo cáo khơng qui định Trong phịng thí nghiệm phải mặc áo blouse, thận trọng sử dụng dung mơi dễ cháy nổ hóa chất độc hại Khi làm thí nghiệm phải trật tự, cẩn thận, giữ nơi làm thí nghiệm, tiết kiệm hóa chất Làm vỡ, gây hư hỏng dụng cụ, thiết bị phải bồi thường Khơng tự ý xê dịch máy móc thiết bị khơng sử dụng chưa có hướng dẫn giáo viên Sau thí nghiệm, sinh viên phải rửa dụng cụ xà phòng – tráng lại nước cất, xếp lại dụng cụ - hóa chất chỗ, lau bàn thí nghiệm bàn giao cho cán phịng thí nghiệm Mỗi buổi thí nghiệm lớp cử tổ trực nhật Tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở bạn giữ vệ sinh chung làm phịng thí nghiệm sau thí nghiệm Cuối buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp báo cáo kết thí nghiệm kết tính tóan cho giáo viên hướng dẫn Viết nộp báo cáo thí nghiệm theo mẫu theo thời gian quy định SV tự trang bị ổ khóa học thí nghiệm để đảm bảo an toàn tài sản cho SV sử dụng tủ chứa túi xách mục đích MỤC LỤC Đánh giá môn học quy định viết báo cáo Bài 1: Thu nhận chế phẩm casein whey protein từ sữa bò Bài 2: Thu nhận tinh enzyme urease từ đậu nành 10 Bài 3: Thu nhận tinh enzyme bromelain từ dứa 16 Bài 4: Thu nhận tinh enzyme invertase từ nấm men 21 Bài 5: Xác định thông số động học enzyme invertase 25 Bài 6: Điện di protein 30 Phụ lục 1: CÁCH TÍNH NỒNG ĐỘ (NH4)2SO4 BỔ SUNG 34 Phụ lục 2: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRAFORD 35 Phụ lục 3: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE THEO PP ANSON CẢI TIẾN 37 Phụ lục 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH UREASE THEO PHƯƠNG PHÁP NESSLER 39 Phụ lục 5: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJENDAHL 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Bố trí thí nghiệm 45 ĐÁNH GIÁ MÔN HỌC - Kiểm tra đầu + Bài báo cáo + thái độ học tập: 50% - Thi cuối kì: 50% QUY ĐỊNH VIẾT BÁO CÁO - Mỗi nhóm viết báo cáo cho thí nghiệm, đánh máy, khổ A4, chữ rõ ràng, sẽ, trình bày ngắn gọn đầy đủ Tên file : Bài thí nghiệm – nhóm SV – nhóm lớp - Các báo cáo phải ghi rõ mã số SV họ tên thành viên nhóm, mã số nhóm nộp vào buổi học thí nghiệm - Bài báo cáo gồm phần : I Tổng quan: đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu; II Sơ đồ quy trình cơng nghệ thuyết minh bước thực thực tế III Kết – Bàn luận Trình bày ngắn gọn kết phân tích tính tốn kết thu Bàn luận kết thu phương pháp làm thí nghiệm, ý kiến đóng góp để TN hồn thiện hơn… BÀI THU NHẬN CHẾ PHẨM CASEIN VÀ WHEY PROTEIN TỪ SỮA BỊ 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CASEIN SỮA Sữa có chứa hàng trăm loại protein hầu hết số chiếm lượng nhỏ Protein phân loại theo nhiều cách dựa vào tính chất hóa học hay vật lý, chức sinh học chúng Thông thường, người ta phân loại protein sữa thành casein (khơng hịa tan) , whey protein (hịa tan) protein thiểu số Trong sữa bò casein chiếm gần 80% tổng số protein (khoảng 26 g lít sữa) Casein chia làm bốn nhóm phụ: αs1, α s2 , β κ-casein Cả bốn nhóm có cấu trúc khơng đồng Điểm chung casein α β amino acid este hóa phosphoric acid Acid phosphoric liên kết với calci (có chứa nhiều sữa) để hình thành liên kết nội phân tử ngoại phân tử Điều khiến casein dễ dàng tạo chuỗi polymer có chứa vài loại casein giống hay khác Do có nhiều nhóm phosphate nhóm kỵ nước phân tử casein, phân tử polymer hình thành từ casein đặc biệt bền Những phân tử cấu tạo từ hàng trăm hàng nghìn phân tử đơn lẻ hình thành nên dung dịch keo, tạo nên màu trắng sữa Những phức chất gọi micelle casein Hình cho thấy micelle casein bao gồm phức hợp sub-micelle, có đường kính từ 10 đến 15 nm Một micelle casein với kích thước trung bình có tới 400 đến 500 sub-micelle có kích thước lớn tới 0.4 µm 1.2 CÁC DẠNG CHẾ PHẨM PROTEIN: Protein concentrate Protein concentrate loại chế phẩm protein có hàm lượng protein tối thiểu 65% Chế phẩm chứa nhiều chất xơ, giàu protein amino acid sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thực phẩm chức năng, bổ sung lọai ngũ cốc, bánh ngọt, sản phẩm ăn chay, thức ăn gia súc làm gia tăng giá trị dinh dưỡng sản phẩm Protein concentrate có nhiều dạng: hạt, sệt, bột mịn Protein isolate Giống chế phẩm chứa hàm lượng protein thực vật cao 90% Nó chứa hầu hết amino acid cần thiết cho phát triển mặt khác chứa lượng chất béo thấp, giúp ngăn ngừa chứng loãng xương, ung thư, triệu chứng thời kì mãn kinh 1.3 DỤNG CỤ – HÓA CHẤT (cho nhóm 4SV) Dụng cụ - thiết bị: Nguyên liệu – Hóa chất Máy lọc chân khơng Sữa tươi trùng 100 mL Bể điều nhiệt Acetic acid 10% 100mL Tủ sấy Ethanol 95% 200mL Máy UV-Vis Ether ethylic 200mL Cốc 250mL Nước cất Đũa khuấy Hóa chất PP Kjeldahl: Ống nhỏ giọt H2SO4 đđ pipette 10mL H2SO4 0,1N pipette mL NaOH 40% Micropipette 1000 μL + đầu tip NaOH 0,1N Micropipette 100 μL + đầu tip Xúc tác (CuSO4:K2SO4:Se) Ống nghiệm 10 Phenolphthalein Erlen 250 mL Hóa chất PP Bradford: Bình vơ hóa Albumin 0,1 mg/mL Giấy lọc Thuốc thử Bradford 1.4 THỰC HÀNH: 1.4.1 Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm protein casein whey protein từ sữa bò: Sữa bò tươi Gia nhiệt đến 40 C Acetic acid 10% Kết tủa casein Lọc chân không Nước Ethanol 95% Ether ethylic Rửa tủa Whey Kết tủa Whey protein (pH 4, hours, 70 C) Sấy khô Lọc chân không Casein Sấy khơ Whey protein Hình 1.1 Sơ đồ QTCN sản xuất chế phẩm casein whey protein từ sữa bò Giải thích:  Gia nhiệt: cho becher chứa khoảng 100 mL sữa vào bể điều nhiệt sữa đạt 40 C  Kết tủa casein: dùng dung dịch acetic acid 10% điều chỉnh pH sữa đến pI casein (pH = 4,6) để casein kết tủa, để yên phút  Lọc chân không: Thu tủa thiết bị lọc chân không Lưu ý cần cân giấy lọc trước bỏ vào máy lọc để tính lượng tủa  Rửa tủa: rửa tủa máy lọc chân không lần lược bằng: nước cất C, ethanol 95% ether ethylic để loại béo  Sấy khô: sấy giấy lọc casein đến khối lượng không đổi, cân giấy lọc casein từ tính lượng casein thu nhận  Kết tủa whey protein: whey ủ bể điều nhiệt đến 70 C, dùng dung dịch acetic acid 10% điều chỉnh pH whey đến 4,0, để yên 2h tùa protein xuất Tiến hành bước thu tủa 1.4.2 PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM PROTEIN CASEIN VÀ WHEY PROTEIN a Xác định độ ẩm chế phẩm protein máy đo độ ẩm tự động (Phụ lục 5) b Xác định hàm lượng protein chế phẩm phương pháp Bradford (phụ lục 2) theo phương pháp Kjeldahl (phụ lục 6) c Tính hiệu suất thu nhận protein Và cho biết chế phẩm protein thu thuộc loại isolate hay concentrate BÀI THU NHẬN VÀ TÌNH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH 2.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME UREASE: Urease enzyme thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (hydrolase), phân nhóm amidase Urease có số hiệu phân loại quốc tế EC 3.5.1.5 Tên hệ thống là: Carbamate amide hydrolase Trong đó: số nhóm – hydrolase, số nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C - N khác liên kết peptide, số phân nhóm phụ cắt amide thẳng (amide hyrolase), số số thứ tự urease phân nhóm phụ Bảng 3.1: Các đặc tính enzyme urease Đặc tính Giá trị Trọng lượng phân tử 483.000 dalton Số trung tâm hoạt động/ phân tử 3-4 Phân tử lượng trung tâm hoạt động 14 000 dalton pHopt 6,4 – 7,6 (tuỳ loại đậu) pI – 5,1 Coenzyme Ni2+ Topt 45 - 50oC Chất kiềm hãm Kim loại nặng (Ag+, Cu2+, Hg2+), borate, H2O2, acid ascorbic… Cơ chất Urea, hydroxyurea Tính đặc hiệu Đặc hiệu chất tuyệt đối Trong tự nhiên có 200 lồi vi khuẩn có khả tổng hợp enzyme urease H pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Bacillus pasterurii, Escherchia coli… Enzyme urease có dịch tiêu hố động vật trâu, bị, dê, chó Enzyme urease cịn có nhiều bậc cao, đặc biệt thuộc họ đậu đậu rựa (Canavalia ensiformis, jack bean), đậu nành (Glycine hispida)… Urease xúc tác cho phản ứng thuỷ phân urea, tạo thành khí carbonic amoniac theo phương trình sau: Dung dịch đệm Tris-HCl 0.5 M pH 6.8: 6.05 g Tris-base pha 30 ml nước cất, thêm HCl 6N pH 6.8 Thêm nước cho đủ 100 ml b Đệm điện di Tris-glycine pH 8.3 (5X) Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8.3 (5X): 15.1 g Tris-base, 94 g glycine g SDS 1000 ml với nước cất Khi dùng pha loãng lần Khi chạy điện di xác định trọng lượng phân tử protein nguyên thể không sử dụng SDS đệm điện di c Đệm mẫu Dung dịch đệm mẫu: 0.5 ml nước cất, 0.125 ml đệm Tris-HCl 0.5 M pH 6.8, 0.1 ml glycerol bromophenol blue, sử dụng cho điện di xác định trọng lượng phân tử protein nguyên thể Khi chuẩn bị mẫu để chạy điện di xác định trọng lượng chuỗi tiểu đơn vị cần bổ sung vào đệm mẫu 0.05 ml -mercaptoethanol 0,5 ml SDS 10% Hoặc DTT (dithiotritol) để cắt cầu disulfit liên kết yếu phân tử protein d Dung dịch nhuộm A Dung dịch nhuộm A: 250 ml isopropanol 100 ml acid acetic định mức đến 1000 ml nước cất e Dung dịch nhuộm B Dung dịch nhuộm B: 0.6 g Coomassie G-250 100 ml acid acetic Định mức đến 1000 ml nước cất f Dung dịch giải nhuộm Dung dịch giải nhuộm: 70 ml acid acetic đậm đặc, định mức đến 1000 ml nước cất g Chất để gắn khuôn: agar 0,05% 6.2.3 Dụng cụ: -Bộ điện di đứng: khuôn, hệ thống chạy điện di, nguồn, bơm chân khơng, bình tam giác 25ml có nút ống thông -Pipet 6.3 CÁCH TIẾN HÀNH: 6.3.1 Chuẩn bị khuôn tạo gel: chuẩn bị đỗ gel poliacrylamide kích thước 100x100x 0.75mm có nồng độ acrylamide 10%, 7.5% hoặc5% 33 A Gel phân tách: chuẩn bị dung dịch gel phân tách có tổng thể tích 10ml có thành phần bổ sung theo thứ tự vào erlen: Acylamide percentage 6% 8% 10% 12% H2O 5.2ml 4.6ml 3.8ml 3.2ml Acrylamide/Bis2ml 2.6ml 3.4ml 4ml acrylamide (30%/0.8% w/v) Tris HCl 1.5M pH 8.8 2.6ml 2.6ml 2.6ml 2.6ml 10% (w/v)SDS 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 10% (w/v) ammonium 100μl 100μl 100μl 100μl persulfate (AP) TEMED 10μl 10μl 10μl 10μl Note: AP and TEMED must be added right before each use 15% 2.2ml 5ml 2.6ml 0.1ml 100μl 10μl Gel phân tách cho vào khuôn đỗ gel cho mức dung dịch gel cao cm (tránh tạo bọt khí khn gel) Sau đó, cho lớp nước cất lên lớp gel vừa đổ để trình polimer hóa xảy Chờ gel đơng khoảng 20-30 phút B Gel gom: chuẩn bị dung dịch gel gom tổng thể ml có thành phần bổ sung theo thứ tự sau : Stacking gel Thành phần (acrylamide 5%) H2O 2.975 ml Tris-HCl 0.5M pH 6.8 1.25 ml Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 0.67 10% (w/v)SDS 0.05 10% (w/v) ammonium persulfate (AP) 0.05 6TEMED 0.005 Note: AP and TEMED must be added right before each use Sau gel phân tách trùng ngưng hoàn toàn, đỗ bên Tiến hành đỗ lớp gel gom, đồng thời đưa lược vào gel để tạo giếng mẫu (tránh tạo bọt khí khn gel) Sau gel trùng ngưng, lấy lược ra, tháo phận bịt đáy khuôn gel Lắp đĩa gel vào điện di Cho dung dịch đệm điện di vào máy 6.3.2 Chuẩn bị mẫu chạy điện di: 34 Xử lý mẫu: mẫu bổ sung dung dịch đệm mẫu đun sôi cách thủy phút Mẫu xử lý bảo quản -20oC, sử dụng sau tháng Khi điện di dùng micropipet hút vào giếng mẫu, giếng 10 µl Tiến hành chạy điện di: ổn định dòng 2mA/giếng mẫu Theo dõi điện di thông qua vệt màu chuẩn 6.3.3 Nhuộm giải nhuộm: Sau điện di, tiến hành nhuộm gel với dung dịch nhuộm nhanh A B Thời gian nhuộm A khoảng 30 phút, thời gian nhuộm B khoảng vài Sau tiến hành giải nhuộm cách ngâm gel dung dịch giải nhuộm gel trở nên suốt không màu Thay dung dịch giải nhuộm dung dịch có màu tương đương với màu gel 6.3.4 Đọc kết - Thu điện di đồ có vạch rõ ràng - Tính phân tử lượng enzyme urease có dãy protein chuẩn 35 PHỤ LỤC CÁCH TÍNH NỒNG ĐỘ (NH4)2SO4 BỔ SUNG Lượng (NH4)2SO4 tính g, cần bổ sung vào lít dung dịch (NH4)2SO4 có nồng độ ban đầu biết để thu dung dịch có nồng độ (NH4)2SO4 mong muốn 20C Nồng độ (NH4)2SO4 cuối, % 10 20 Nồng độ (NH4)2SO4 ban đầu 25 30 33 35 10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 694 29 59 79 91 123 155 189 225 262 300 330 382 424 520 619 30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583 19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522 31 63 94 129 16 200 238 278 319 411 506 31 63 97 132 168 205 245 285 375 469 31 65 99 134 171 210 250 339 431 33 66 101 137 176 240 302 392 33 67 103 141 179 264 353 34 69 105 143 227 314 34 70 107 190 275 35 72 153 237 36 115 198 77 157 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 79 100 36 PHỤ LỤC ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BRADFORD Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào thay đổi màu cho Coomassie Brilliant Blue – G 250 liên kết với protein môi trường acid Thuốc nhuộm tạo liên kết với protein, tương tác với nhóm kỵ nước nhóm mang điện dương phân tử protein thành phức chất có màu xanh dương, có độ hấp thu cực đại bước sóng 595 nm Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng protein, nên xác định hàm lượng protein phương pháp so màu So với phương pháp xác định protein khác phương pháp có độ nhạy cao xác định tới µg protein, hóa chất đơn giản, tốn thời gian Một ưu điểm lớn phương pháp bị cản trở hóa chất sử dụng nghiên cứu protein, ammonium sulfate Hoá chất: - Dung dịch protein chuẩn: dung dịch albumin có 0.1 mg/mL - Dung dịch thuốc thử Bradford có thành phần sau: + Coomassie Brillian Blue G-250: 0.05 g + Ethanol tuyệt đối: 47 g + Phosphoric acid: 85 g Coomassie Brillian Blue G-250 hoà tan ethanol, bổ sumg acid phosphoric định mức đến 1000 mL nước cất Lọc chân không, cho vào chai tối, giữ C Dụng cụ: Máy UV-VIS Ống nghiệm 10 Giá ống nghiệm Pipet 1mL 37 Pipet 5mL Cốc thủy tinh 100 mL Thực hành a Xây dựng đường chuẩn: Sử dụng dung dịch protein chuẩn albumin tinh khiết biết trước nồng độ Lấy ống nghiệm đánh số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5.Bổ sung thành phần vào ống nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm số Nước cất (mL) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Albumin 0.1 mg/mL (mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Thuốc thử Bradford (mL) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Hàm lượng albumin (μg) 10 20 30 40 50 Lắc ống nghiệm, để yên 15 phút, đo mật độ quang bước sóng 595 nm máy UV – Vis Lập đường chuẩn với trục tung hiệu mật độ quang ∆OD (A), truc hoành lượng albumin chuẩn (µg) b Xác định protein mẫu: Cân xác vài mg chế phẩm hịa vào 5-10mL nước cất Pha loãng mẫu cần Hút 0.1 mL dung dịch mẫu protein vào ống nghiệm, thêm nước cất để mL Sau thêm mL thuốc thử Bradford, lắc đều, để ổn định 15 phút Đo mật độ quang mẫu thí nghiệm ODx mẫu trắng ODo (thay nước cất) bước sóng 595nm Tính giá trị: ∆OD = ODx - ODo Nếu giá trị đo mẫu không lọt vào khoảng tin cậy đường chuẩn tự điều chỉnh thể tích mẫu hay độ pha lỗng phân tích cho thích hợp c Tính tốn: Dựa vào phương trình đường chuẩn protein theo phương pháp Bradford xác định hàm lượng protein có mẫu 38 PHỤ LỤC XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE THEO PHƯƠNG PHÁP ANSON Nguyên tắc: Nguyên tắc phương pháp Anson cho protease tác dụng với chất casein hemoglobin, sau kết tủa protein dư thừa TCA, xác định sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân tác dụng enzyme Một đơn vị hoạt độ Anson lượng enzym phút 30oC phân giải lượng protein tương đương với 1mol tyrosine Hóa chất Dd tyrosine chuẩn 1mol/mL: cân xác 18,118mg tyrosine hịa trong100mL HCl 0,2N Dung dịch chất [S]: dung dịch casein 2% pha đệm phosphate pH7 TCA 5% Thuốc thử Folin-Ciocalteu pha loãng lần Dung dịch NaOH 0,5N Dung dịch HCl 0,2N Dụng cụ Máy UV Ống nghiệm Pipet 2mL 20 Pipet 5mL 1 Pipet 10mL Pipet 1mL Bercher 100mL Cách tiến hành: a Dựng đường chuẩn Tyrosine: Chuẩn bị ống nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm Tyrosine chuẩn 1mol/mL (mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HCl 0.2N (mL) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 NaOH 0.5N (mL) 2 2 2 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 Thuốc thử Folin (mL) Đo OD bước sóng 690nm Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (OD) bước sóng 690nm theo nồng độ Tyrosin chuẩn b Xác định hoạt tính mẫu enzyme 39 Chuẩn bị dịch [E]: với mẫu enzyme lỏng pha lỗng, với mẫu enzyme rắn cân lượng xác chế phẩm enzyme hịa tan định mức đến thể tích định (vd: 0.1g/100mL) Chuẩn bị ống nghiệm sạch, tiến hành sau Hóa chất (mL) Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (3 mẫu) Dịch chất [S] 30C 5 Dịch [E] 30C Lắc - Để 10phút TCA 5% 5 Dịch [E] 30C Lắc - Để ống nghiệm 15 phút lọc Lấy 1mL dịch lọc ống, thêm 2mL NaOH 0.5N + 0.6mL thuốc thử Folin (đã pha loãng), lắc đều, để yên 10 phút đo mật độ quang bước sóng 690nm d Tính kết quả: - Lấy hiệu số OD mẫu thật mẫu trắng (OD) - Từ OD dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng tyrosin tương ứng từ tính hoạt tính protease Mẫu enzyme lỏng: A (IU/mL) = [(OD – b)/a]*(11/10)*K Mẫu enzyme rắn: A (IU/g) = [(OD – b)/a]*(11/10)*(V/m) Trong đó: - a, b hệ số phương trình đường chuẩn - K hệ số pha lỗng chế phẩm enzyme lỏng; - V: thể tích sau hòa tan enzyme rắn; - m: số gam chế phẩm enzyme cân để xác định hoạt tính - Hệ số: 11 tổng thể tích hỗn hợp phản ứng (mL), 10 : tổng thời gian phản ứng (phút) e Xác định hoạt tính riêng chế phẩm Đối với chế phẩm enzyme, đại lượng đặc trưng cho độ tinh chế phẩm enzyme hoạt tính riêng Hoạt tính riêng chế phẩm biểu diễn số đơn vị hoạt động 1mg protein chế phẩm Hoạt tính riêng tính sau: AP = A/ P = At / Pt (IU/mgprotein) 38 PHỤ LỤC XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH UREASE THEO PHƯƠNG PHÁP NESSLER Nguyên tắc: Urease xúc tác phản ứng thủy phân ure tạo thành NH3 CO2 Amoniac phản ứng với thuốc thử Nessler tạo phức màu vàng, cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ NH3 Phức có độ hấp thu cực đại bước sóng 490 nm Cường độ màu tỉ lệ thuận với mật độ quang Bằng phương pháp so màu, xác định hoạt tính urease sau khoảng thời gian định (NH2)2CO + H2O urease 2NH3 + CO2 OHg2NH2+Cl + KCl + NaCl +3 H2O Màu vàng NH3 + 2K2HgCl + NaOH Hóa chất: - Dung dịch NH4Cl chứa 10 µg NH3/mL - Thuốc thử Nessler (Merck) - Dd urea 2%: cân 1g ure định mức đến 50 mL đệm phosphate 1/15M pH - Đệm phosphate 1/15M pH Dụng cụ: Máy đo màu Pipet 5mL Ống nghiệm 20 Pipet 10mL Pipet 1mL Bình định mức 100mL Pipet 2mL Cốc thủy tinh 100 mL Cách tiến hành: a Xây dựng đường chuẩn NH3: Lấy ống nghiệm, đánh số thứ tự từ – Cho vào ống nghiệm dung dịch theo trình tự sau: Ớng nghiệm số Thể tích NH4Cl (mL) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Lượng NH3 (µg) 10 15 20 25 Thể tích nước (mL) 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 Thể tích Nessler (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Các ống đo mật độ quang bước sóng 490 nm Vẽ đồ thị NH3 chuẩn với trục tung hiệu mật độ quang, trục hoành hàm lượng NH3 39 b Xác định hoạt tính urease Lấy ống nghiệm khô, đánh số, tiến hành sau (thực ỏ 30C) Các hóa chất cho vào Mẫu thật (3 mẫu) Mẫu trắng (3 mẫu) Nước cất (mL) 0,4 0,4 Dd ure 2% (mL) 0,5 0,5 Dd HCl 1N (mL) 0,5 Dd Urease (mL) 0,1 0,1 Lắc - Để 10 phút Dd HCl 1N (mL) 0,5 Sau đó, lấy thể tích định hỗn hợp phản ứng mẫu thí nghiệm mẫu trắng (khoảng 0,5mL) cho vào ống nghiệm khác Bổ sung nước cất để thể tích 5.5 mL, thêm 0.5 mL thuốc thử Nessler, lắc đều, để ổn định màu 15 phút Đo mật độ quang bước sóng 490 nm máy UV – Vis Tính: ∆OD = ODmtn – ODmt Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định lượng amoniac tạo thành c Tính tốn hoạt tính urease Đơn vị hoạt độ enzyme urease tính theo đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) lượng enzyme urease có khả xúc tác để chuyển hóa ure tạo thành µmol NH3 sau phút điều kiện tiêu chuẩn Từ phương trình đường chuẩn NH3, xác định giá trị sau: - Hoạt tính urease A Mẫu enzyme lỏng: A  A Mẫu enzyme rắn: - y  b 1.5 1 * * * *F a 0.5 0.1 17 *10 y  b 1.5 1 V * * * * *F a 0.5 0.1 17*10 m (IU/mL) (IU/mg bột) Tổng hoạt tính At = A*Vt At = A*mt (IU) Trong đó: F: độ pha lỗng V: thể tích sau hịa tan bột enzyme thành dịch m: khối lượng bột enzyme cân để xác định hoạt tính (mg) mt: tổng khối lượng bột (mg) Vt: tổng thể tích dịch (mL) 40 PHỤ LỤC ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL A DỤNG CỤ – HÓA CHẤT I Dụng cụ : Bình Kjeldahl 50mL Pipette vạch 10 mL Cốc 250mL Bộ cất đạm Bình định mức 100mL Cốc 100nl Ống đong 50mL Phễu thuỷ tinh Erlen 100mL Pipette bầu 10 mL Ống đong 50mL Bóp cao su + Đầu típ Pipette bầu 1mL Buret 25mL II Hóa chất Nước mắm NaOH 40% H2SO4 đđ NaOH 0,1N H2SO4 0,1N Xúc tác (CuSO4:K2SO4:Se) Phenolphthalein B THỰC HÀNH I Nguyên tắc Qua giai đoạn Giai đoạn vơ hóa:[3] Nitơ tổng số tất dạng nitơ có mẫu Khi đốt nóng mẫu cần phân tích với H2SO4 đậm đặc có mặt chất xúc tác, tất dạng đạm có mẫu biến thành dạng vơ (NH4)2SO4 tan dung dịch Giai đoạn cất đạm: [3] Sau vơ vơ hóa, đuổi NH3 khỏi dung dịch NaOH 30-40% Lượng NH3 lôi máy Parnas dẫn đến erlen có chứa lượng thừa H 2SO4 biết xác nồng độ Định lượng H2SO4 cịn lại NaOH, qua tính lượng nitơ có mẫu II Tiến hành 41 THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN & ENZYME Bộ mơn CNSH Vơ hóa : Cho mẫu vào bình Kjeldahl: cân khoảng 0,2-0,5g mẫu Thêm 10 mL H2SO4 đđ 0,5 g xúc tác Chất xúc tác dùng hỗn hợp sau : 1/ K2SO4 : CuSO4 : Se (100 : 10 : 1) 2/ CuSO4 : K2SO4 (1:3) 3/ Se kim loại (0,05g) Sau thêm xúc tác đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi trào đun mạnh hỗn hợp hoàn tồn chuyển sang dịch lỏng Trong q trình đun lắc nhẹ, tráng khéo léo cho khơng cịn vết đen mẫu nguyên liệu chưa bị phân hủy cịn sót lại thành bình Đun dung dịch bình hồn tồn trắng Cất đạm: Máy cất đạm - Lấy vào erlen 10 mL dung dịch H2SO4 0,1 N thêm giọt Phenolphthalein, lắp vào hệ thống - Lắp bình chứa dung dịch vơ hố vào hệ thống cất đạm Kiểm tra lượng NaOH bình, mở sinh hàn nước, khởi động trình cất đạm Quá trình cất đạm kết thúc sau khoảng 15 phút Có thể kiểm tra xem NH3 cất hoàn toàn chưa cách lấy erlen chứa H2SO4 0,1 N ra, đưa mẫu giấy quỳ vào đầu ống xem có đổi màu khơng khơng coi NH3 cất hồn tồn - Tráng vịi nước cất lấy erlen chứa H2SO4 0,1 N thừa ra, thay vào mộ erlen trống Bật chế độ rửa hệ thống - Định phân lượng H2SO4 0,1N thừa dung dịch chuẩn NaOH 0,1 N xuất màu hồng nhạt Tính kết 3.1 Tính hệ số hiệu chuẩn F dung dịch NaOH - Lấy 10 mL H2SO4 0,1 N chuẩn cho vào erlen, định phân NaOH 0,1 N - Tính nồng độ thực tế dung dịch NaOH đem định phân - F tỉ số nồng độ thực tế nồng độ lý thuyết NaOH 42 THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN & ENZYME Bộ mơn CNSH 3.2 Tính hàm lượng N: Hàm lượng N mẫu tính theo cơng thức: X = (a – b*F)*0,0014*100/m Trong X : hàm lượng N (%) a : số mL H2SO4 đem hấp thụ NH3 b : số mL NaOH 0,1 N tiêu tốn chuẩn độ H2SO4 thừa m : số gram mẫu đem vơ hố 0,0014 : lượng gram nitơ ứng với mL H2SO4 0,1 N F : hệ số hiệu chỉnh nồng độ dd NaOH 0,1 N 3.3 Tính hàm lượng protein thơ thơng qua hàm lượng N tổng N nguyên liệu sinh học chủ yếu N protein ngồi cịn có lượng nhỏ nitơ thành phần khác gọi nitơ phi protein N tổng = N protein + N phi protein Hàm lượng protein vật liệu sinh học tính cách nhân hàm lượng N protein với hệ số chuyển đổi xác định hàm lượng N có tỷ lệ ổn định từ 15 đến 18% protein Trong nguyên vật liệu sinh học hàm lượng N phi protein nhỏ việc tách riêng phức tạp nên hàm lượng protein tính theo theo hàm lượng N tổng đuợc gọi protein thơ hay protein tổng Cơng thức tính hàm lượng phần trăm protein thơ có đại đa số ngun liệu là: Protein (%) = N (%) x 6,25 Một số nguyên liệu khác có hệ số chuyển đổi riêng, ví dụ CF (conversion factor) đậu nành 5,71, CF sữa 6,38 43 THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN & ENZYME Bộ môn CNSH TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Trọng Cẩn - Công nghệ Enzyme - NXB Nông nghiệp, TP HCM, 1998 Nguyễn Đức Lượng (cb) - Công nghệ Enzyme –NXB Đại học Quốc Gia TP HCM, 2004 Nguyễn Văn Mùi – Thực hành hoá sinh học- NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2001 Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nhu Thuận – Kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm, ĐH BK Hà Nội, 1991 Lê Ngọc Tú – Hố sinh học cơng nghiệp – NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội,1998 Gary Walsh - Protein biochemistry and biotechnology –Wiley, 2002 S.M Robert, N.J Turner, A.J Willetts, M.K Turner - Introduction to biocatalysis using Enzyme and microorganisms – Cambridge, 1995 Amna A A Aburigal, Elamin A Elkhalifa, Abdel Moneim E Sulieman, Hassan B Elamin - Extraction and Partial Kinetic Properties of Invertase from Schizosaccharomyces pombe - International Journal of Food Science and Nutrition Engineering, 2014 Michele Vitolo - Extraction of invertase from Saccharomyces cerevisiae: Effect of Rheological Parameters - World Journal of Pharmaceutical Research, Vol 8, Issue 6, 2019 44 THÍ NGHIỆM CƠNG NGHỆ PROTEIN & ENZYME Bộ mơn CNSH BỚ TRÍ THÍ NGHIỆM Tuần Nội dung Bài Thu nhận chế phẩm casein whey protein từ sữa Bài Xác định hàm lượng protein chế phẩm casein whey protein Phân công SV chuẩn bị bột đậu nành tách béo trước cho Bài Thu nhận urease từ đậu nành - Xây dựng đường chuẩn bradford Nessler - Trích ly lượng nhỏ dịch đậu nành để xác định hàm lượng protein hoạt tính urease Bài Thu nhận urease từ đậu nành (tt) - Kết tủa urease - Xác định hàm lượng protein hoạt tính urease tủa Bài 3: Thu nhận bromelain từ dịch dứa - Thu dịch bromelain thô kết tủa bromelain - Xác định hàm lượng protein hoạt tính protease tủa Bài Phân tích chế phẩm bromelain - Tinh bromelain sắc ký rây phân tử - Xác định hàm lượng protein hoạt tính protease ống sau sắc ký Bài Thu nhận invertase từ nấm men - Pha môi trường, nuôi cấy nấm men - Xây dựng đường chuẩn DNS - Giảng thêm Điện di protein Bài Thu nhận invertase từ nấm men (tt) - Phá vỡ tế bào nấm men, trích ly invertase, kết tủa invertase - Xác định hàm lượng protein hoạt tính invertase dịch trích ly tủa Bài Xác định thông số động học invertase 10 Thi thực hành + tự luận Lưu ý: GV linh động để phù hợp với tình hình học tập lớp 45