Báo cáo thí nghiệm công nghệ protein – enzyme

Ngâm : trong phương pháp xay ướt, hạt đậu phải qua giai đoạn ngâm, nhăm mực đích .Làm cho hạt hút nước trương lên , nước tác động lên các phân tử trong hạt  Xảy ra quá trình solvat  L

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài 1 SẢN XUẤT ĐẬU PHỤ

I Giới thiệu

Đậu phụ (tiếng Trung : 荳腐 - đậu hũ) là một món ăn dân dã của người dân một

số quốc gia Đông Á như Trung Hoa , Nhật Bản, Hàn Quốc và Đông Nam Á như Việt Nam Đậu phụ có nguồn gốc từ Trung Quố c Món này có nhiều cách gọi: đậu khuôn ở miền Trung và đậu hũ ở miền Nam Đậu phụ là món ăn có thể giúp

phòng chống xơ vữa động mạch, cũng thường được làm món ăn chay cho những người theo đạo Phật

Nguyên liệu làm đậu phụ là hạt đậu nành , được xay lên rồi ngâm vào nước Tinh bột chảy vào nước thành hình dáng theo người làm tự tạo, bả được lọc ra ngoài Các hình dáng thường thấy là hình vuông, tròn hay chữ nhật dài

Khi sản phẩm hoàn thành thì có thể sao chế thêm, như cắt thành hình chữ nhật rán với dầu Thành một màu vàng bọc ngoài thêm gia vị thếm, là thành một bữa Nếu không rán thì có thể cắt lát làm thêm phần phụ trong nồi canh rau hay cá

Giá trị dinh dưỡng cho mỗi 100 g (3,5 oz)

[[ Năng lượng ]] 318 kJ (76 kcal)

II Thực hành

Đậu hũ có thể sản xuất bằng phương pháp xay ướt hoặc xay khô

1 Quy trình công nghệ của phương pháp xay ướt

2 Thuyết minh quy trình

a Nguyên liệu: lựa chọn đậu vàng hạt, to đều , không có sâu bọ, tạp chất

b Ngâm : trong phương pháp xay ướt, hạt đậu phải qua giai đoạn ngâm, nhăm mực đích Làm cho hạt hút nước trương lên , nước tác động lên các phân tử trong hạt

 Xảy ra quá trình solvat  Liên kết trong đậu bị phá vở ( hình thành lớp áo nước giửa các tế bào )

 Chuyển sang thể keo linh động nằm trong các tế bào hạt đậu

Có 3 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ngaamlaf thời gian, lượng nước, nhiệt độ ngâm

 Tỉ lệ ngâm với nước là 1 : 2.5

Yếu tố quan trọng trong giai đoạn này là lượng nước

Tủ lệ là 1:6

Trong quá trình xay saponin sẽ tạo bọt và gây ảnh hưởng tới quá trình sản xuất

 Chiếm diện tích

 Gây hại cho sản phẩm

 Va đâp vào thành thiết bị

 Giảm hiệu suất

Sử dụng chất phá bọt 0.05% so với lượng đậu

d Lọc : lọc qua vải nhiều lần để loại bỏ triệt để bã

e Gia nhiệt

Sử dụng nhiệt để phá các enzyme kháng trypxin và độc tố afltoxin Diệt

vi sinh vật , khử mùi tanh của đậu nành phá vỡ lớp solvat ( màng áo nước bên ngoài tế bào)

Thời gian gia nhiệt càng nhanh càng tốt thời gian trong phạm vi từ

5-10 phút là tốt nhất kết hợp khuấy đảo liên tục chống khét

Dùng nước chua: PH nước chua 4-4.5 lượng nước chua chiếm 22% lượng sữa cần kết tủa

Kết tủa sau khi lọc Đậu hũ thành phẩm

Nhận xét cảm quan

Đánh giá của nhóm thực hành

Màu : màu trắng ngà

Vị : hơi chát và chua nhẹ ( do còn ảnh của giấm và võ hạt ) Hơi béo

Mùi :thơm của sữa không có mùi khét

Trạng thái : khối đậu chắc vết cắt hơi thô Không có lỗ khí không mịn lắm

3.2 Xác định hàm lƣợng chất khô

Tiến hành sử dụng máy đo độ ẩm

Đồ ẩm ban đầu của máy là 100%

độ ẩm sau của máy là 38%

Vậy độ ẩm của sản phẩm đậu hũ là

Tất cả các dạng nito có trong cơ thể hay các mô được gọi là nito tổng số Nito

có trong thành phần amino acid của protein là nito protein Nito không có trong thành phần protein như của các muối vơ cơ, acid nitric, các amino acid

tự do, các peptid,ure và các dẫn xuất ure, purin và pirimidin… là nito phi protein

Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bị phân huỷ và oxy hoá đến CO2 và H2O còn nito chuyển thành amoniac (NH3)

và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat Quá trình được thực hiện theo các bước sau:

Bước 1: Vô cơ hoá nguyên liệu

Gọi b là số NaOH 0.1 N tiêu tốn khi chuẩn điị H2SO4 thừa

V là số ml mẫu đem vô cơ hóa

0.0014 là lượng gam nitow ứng với 1ml H2SO4 0.1 N

Protein (%)= N(%) x 5.7 = 2.25 x 5.7 = 12.85 (%)

Nhận xét Hàm lượng protein trong đậu hủ tương đối cao

Sai số tương đối lương do quá trình thao tác và sai số dụng cụ

3.3 xác đinh hàm lượng chất béo theo phương pháp soxhlet

c : trọng lượng giấy lọc +mẫu trước khi chiết (g)

d: trọng lượng giấy lọc + mẫu sai khi chiết (g)

Nhận xét lượng lipid rất cao trong đậu hũ

Có sai số cao do quá trình xấy mẩu chưa tuyệt đối sai số thiết bị

và đáp ứng đủ nhu cầu cho người sử dụng

Nhưng trong thực tế , với kinh nghiệm nhà nghề và kỹ thuật làm đậu hũ lâu năm của các hộ sản xuất và danh nghiệp thì thành phần dinh dưởng còn cao

hơn và cảm quan cũng tốt hơn rất nhiều người việc đáp ứng nhu cầu dinh dưởng cho người sử dụng thì còn có giá trị cảm quan cao hơn

Bài 2:

THU NHẬN CHẾ PHẨM PROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM

GIỚI THIỆU CHUNG

Tôm và phế liệu tôm

Tôm là nhóm động vật thuộc giáp sát mười chân( Deccapoda) sống trong môi trường nước, phần lớn có kích thước lớn, phần đầu và ngực bọc trong vỏ giáp( giáp đầu ngực) có 3 đoi chân hàm, 5 đôi chân ngực( một số đôi đàu tiên biến thành càng) và 6 đôi chân bụng Cơ thể gồm phần đầu ngực,bụng và tận cùng là telson

Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và các mảnh vỏ, ngoài ra còn kể đến phần thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận và một số tôm bị biến màu

Phế liệu tôm chứa nhiều chất dinh dưỡng, chủ yếu là các acid amin và các nucleotide

Đến nay người ta thường dùng phế liệu tôm làm thức ăn gia súc, hoặc tách chiết chitin/chitosan từ vỏ nhưng không thể nào giải quyết hết lượng phế thải tôm khổng lồ này; Một trong những hướng tận thu phế liệu tôm là thu nhận chế phẩm

Ly tâm 4000v/7p

Tách béo, cặn

Ngiền Sấy ở 50oC

Chế phẩm protein

Bộ tôm

xác định nito tổng theo phương pháp Kjendahl

Hàm lượng nitơ trong mẫu được tính theo công thức:

X= ( ) =( )

= 0,0827(g/g mẫu) Trong đó: X : hàm lượng nitơ tính bằng g/l

a= 10 : số ml đem hấp thụ b= 6,5 : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ thừa V: số ml mẫu đem vô cơ hóa ( mẫu rắn nên thay bằng khối lượng m= 0,0827g)

0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml thừa F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0,1N

Nguyên liệu

Ứng dụng bột tôm sản suất bánh phồng tôm

Đánh giá cảm quan bánh có màu ngả vàng và mùi thơ đặc trưng

Cân nguyên liệu

Khuyâý trộn bột bánh

Cắt bánh-Phơi sấy (dày 1.5-2mm) Làm nguội và làm lạnh

Hấp bánh cách thủy (30-45 phút ) Gói bánh( túi PE)

Rán hoặc nướng ở 150-165oC Bánh thành

phẩm

Bánh giòn tuy nhiên độ phồng ít chưa đạt do sau khi cân nguyên liệu và khuấy trộn bánh bột bị nhão và phải thêm một lượng lớn bột mì khiến tỉ lệ phối trộn nguyên liệu bị sai lệch

H1 Bánh phồng tôm sau khi hấp chín và cắt lát

H2 Bánh phồng tôm sau khi sấy

H3 Sản phẩm bánh phồng tôm sau khi chiên

Xốp đều không chai cứng

Mùi vị Đặc trưng bánh phồng

tôm, không có mùi lạ

Mùi thơm đặc trưng bánh phồng tôm, không có mùi lạ Màu sắc Trắng đục đến trắng ngà,

cho phép có màu gia vị phớt hồng

Màu vàng, cho phép có màu gia vị phớt hồng

Tạp chất Không có tạp chất Không có tạp chất

BÀI 3:

THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ Aspergillus oryzae

1 Tổng Quan Về Enzyme Protease

- Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit NH-)n trong phân tử protein, thành các polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

(-CO-Hình 1: Cấu tạo hình học của enzyme trypsin – một enzyme protease

Enzym cathepsin quan trọng nhất là cathepsin D tham gia vào quá trình thủy phân protein nội tại của tế bào tạo thành peptide

Sau đó peptide tiếp tục bị phân hủy dưới tác dụng của cathepsin A, B và C

Hình 2: Bốn loại enzyme Cathepsin

- Enzym cathepsin có vai trò chính trong quá trình tự chín của cá ở pH thấp và nồng độ muối thấp Đều này giải thích lí do tại sao khi cá chết thịt cá co cứng sau

đó mềm nhũn, nguyên chính là do khi cá chết do oxi không còn cung cấp cho cơ thể làm cho các cơ thịt hô hấp yếm khí sinh ra acid lactic từ đó pH giảm, tạo điều kiện cho cathepsin hoạt động phân giải protein cơ thể làm cho thịt cá trở nên mềm lại, nhưng enzym cathepsin bị ức chế hoạt động ở nồng độ muối 5%

Enzyme Calpain:

Đối với quá trình tự phân giải cơ thịt cá được tìm thấy trong thịt, các loài cá có vây và giáp xác và điều này cho thấy enzym này chỉ hoạt động mạnh khi thủy sản chết và những loài mà hàm lượng canxi bên trong chúng nhiều như các loài nhuyễn thể, … Ngoài ra, các enzym calpain tham gia vào quá trình làm gãy và tiêu hủy protein trong sợi cơ

Hình 3: Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme Calpain

3 Vai Trò

- Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

- Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng

độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae được dùng để

thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng

- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…

- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm,…

4 Nấm Mốc Aspergillus oryzae

- Asp.Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes

( nang khuẩn ) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn, chia thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào)

- Từ những sợi nằm ngang sẽ hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử

- Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại

bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Hình 4: Nấm mốc Asp Oryzea ở dạng mô phỏng và dạng thực tế

II QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM

1 Thu Nhận Chế Phẩm Protein Thô

Môi trường cám gạo

Hấp khử trùng (1atm,30 phút)

Đổ 5ml dịch bào tử vào môi trường cám gạo (lắc đều)

Nuôi ở nhiệt độ phòng (30- 36 giờ)

Chế phẩm thô

Cho 5ml nước cất vào ống giống A.oryae (khuất nhẹ)

2 Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Bán Tinh Khiết

- Cân 50g chế phẩm protein thô, xay nhuyễn hòa trong 200ml nước

- Khuấy đều và giũ ở nhiệt độ 3 – 50C trong 40- 45ph

- Lọc qua vải thưa

- Ly tâm 5000 v/ph trong 5ph

- Chiết lấy dịch enzyme chứa protease

- Bảo quản dịch lọc trong tủ đông ở 40C

- Lấy ethanol lạnh (98%) đổ từ từ dọc theo thành cốc chứa dịch enzyme đã làm lạnh theo tỉ lệ 1dịch enzyme : 3 ethanol lạnh khuấy rất nhẹ để ethanol hòa đều trong dịch enzyme Sau dó để hỗn hợp này vào tủ lạnh

- Để yên trong 30ph ở 3-40C

- Gạn thu tủa, lấy tủa đem ly tâm với tốc độ 5000v/ph trong 15ph

- Thu tủa vừa ly tâm

- Bảo quản trong tủ đá cho những thí nghiệm tiếp theo

1 Xác Định Hàm Lượng Protein Bằng Phương Pháp Bradford

Xây dựng phương trình đường chuẩn protein

Từ kết quả trên ta tính được phương trình đường chuẩn protein là : y = 0.005x – 0.0117

ODmẫu = 0.829 ΔODmẫu = 0.212

Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có:

2 Xác Định Hoạt Tính Của Chế Phẩm Enzyme Theo PP Anson Cải Tiến

Xây dựng phương trình đường chuẩn

DD TYROSIN CHUẨN

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Từ kết quả trên ta tính được phương trình đường chuẩn protein là

ΔOD = OD mẫu thử TB - OD mẫu trắng TB = 1.441 – 1.237 = 0.204

Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có:

0.204 = 1.2723x + 0.0404

X=(0.204 - 0.0404) / 1.2723 = 0.129 (µmol tyrosin)

Từ đó ta tính được hàm lượng tyrosin trong 1ml mẫu là 0.129 µmol tyrosin

Hàm lượng tyrosin trong 0.1g chế phẩm enzyme (pha trong 100ml nước cất) là 0.129*100 = 12.9 (µmol tyrosin)

Số đơn vị hoạt độ proteotylic trong 1ml dung dịch enzyme

=

(UI/ml)

Trong đó:

- A : là số đơn vị hoạt tính enzyme trong 1ml dung dịch enzyme

- V: là thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng ( 5ml dd casein + 1ml enzyme + 5ml TCA)

- t: là tổng thời gian xảy ra phản ứng thủy phân (10ph)

Hoạt tính tổng của chế phẩm enzyme

(UI/mg protein)

Vậy :

Số đơn vị hoạt độ proteotylic trong 1ml dung dịch enzyme là 0.1419 (UI/ml) Hoạt tính tổng của chế phẩm enzyme là 14.19 (UI/mg CP)

Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme là 3.171 (UI/ mg protein)

Hiệu suất thu hồi chế phẩm enzyme bán tin khiết

Trong đó:

- He: hiệu suất thu hồi enzyme

- At1: hoạt tính tổng của enzyme ở công đoạn 1

- Ati: hoạt tính tổng của enzyme ở công đoạn i

Độ tinh sạch enzyme:

Trong đó:

- : độ tinh sạch enzyme

- Ap1: hoạt tính riêng của enzyme ở công đoạn 1

- Api: hoạt tính riêng của enzyme ở công đoạn i

Ƣu điểm của pp Bradford:

- Hóa chất đơn giản ,ít tốn thời gian

- Có độ nhạy cao có thể xác định được tới 1µg protein Nhạy hơn pp Lowry gấp 4 lần

- Ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein

Nhƣợc điểm của pp Bradford

- Phụ thuộc nhiều vào việc xây dựng đường chuẩn Dẫn đến nếu đường chuẩn sai thì kết quả thí nghiệm sai

- Phụ thuộc vào máy đo OD Nếu trong cuvet có chứa tạp chất sẽ ảnh hưởng đến việc đo mật độ quang

Kết quả thí nghiệm có sự sai khác lớn khi sử dụng các phương pháp xác để xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyem Nguyên nhân:

Hai nhóm phương pháp xác định hoạt tính enzyme:

- Đo lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành trong một đơn vị thời gian nhất định ứng với nồng độ enzyme xác định

- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định

- Sau khi có chế phẩm enzyme bán tinh khiết người ta có thể tinh sạch enzyme bằng sắc kí lọc gel để có chế phẩm enzyme tinh khiết

- Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE

Một số phương pháp xác định hàm lượng protein khác:

- Phương pháp Kjendal

- Phương pháp Biuret

- Phương pháp Lowry

Ngoài thu nhận protease từ vi sinh vật, người ta còn có thể thu nhận từ

- Vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) : protease, amylase,cellulase,pectinase,…

- Thực vật (đu đủ, dứa…) : papain, bromalin, urease,

- Động vật (gan, dạ dày bê…) : tripsin,pepsin,tripsinogen,…

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

- Tỉ lệ nước dùng để trích ly : gấp 2-3,5 lần so với lượng chế phẩm

- Thời gian trích ly: thời gian càng lâu thì dịch chiết càng chứa nhiều tạp chất thông thường khoảng 40 -45ph là thích hợp nhất

- Dung môi trích ly: lựa chọn dung môi thích hợp với chất cần trích ly

MỤC LỤC HÌNH ẢNH