báo cáo thí nghiệm công nghệ protein enzyme thu nhận chế phẩm casein và whey protein từ sữa bò

CHUONG 1 TONG QUAN Sữa là một thực phẩm phở biến trong đời sống, hàm lượng protein của sữa cũng đáng quan tâm.. Trong bài này, nhóm thực hiện tinh chế tạo ra chế phẩm Casein và whey pro

TONG LIEN DOAN LAO DONG VIET NAM

TRUONG DAI HOC TON DUC THANG

KHOA KHOA HOC UNG DUNG

BAO CAO THI NGHIEM

CONG NGHE PROTEIN - ENZYME

CHƯƠNG 3 THỰC HÀNH THÍ NGHIỆM - 5+5 S252S2Svxvxecrxexerrrrea 7

4.1 Xây dựng đường chuẩn hàm lượng Protein bằng Albumin 17

4.2 Hiệu chuẩn dung dịch NaOH ¿22+ 2222222232 SE 2E 2E 11x Ekrrke 21

4.3 Tính toán các thông số của Casein 222 S St S SE x2 1E rrrrrve 22

4.4 Kết quá thu được khi tach chiét Whey protein . 5552552 ss5+ 23

4.4.1 Dịch Whey PTO€IN SH ng tk kh 23 4.4.2 Bột Whey PTOfGIN ng kh 24

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN - 2: S212 S2 2121181211111 1821 181512111 101810111111 E11 xe 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO

MUC LUC HINH ANH

Hình 2.1: Thành phần sữa nguyên liệu ¿252 S222 E22 E+Eetsecrrrrrsee 1

Hình 2.2: Cấu trúc Casein .cecccececeeceseeees nsec nee TH 1 1 iu 3 Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm . -¿- ¿+5 222252 S322 2E EEErxeEsrkrrresree 8

Hình 3.2 Gia nhiét Stra ccc cccccceeccceecceceeeececeeeeeeaeceeaueeeeaeeseecsneeessseteageesanaeeessaeeeea 9

Hinh 3.3 May pH khi két tha Casein .c.cccccccceccseccscecesseeseceesessseacecassesseeeaeseseetees 9

Hinh 3.4 Thue hién ly tam sta .cccccceeceeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeaeaeaaaeeesseeeeeeeeeeeeeeees 11 Hình 3.5 Thực hiện rửa tỦa . c7 QQ TQ TS HH HH nh nen sen ry 12 Hình 3.6 Tủa Casein thu Ổược . SS Q2 SH nh cv ca 13 Hình 3.7 Chế phẩm Casein sau khi sấy khô - - +22 52s stse 2e £Evxexsezereed 14 Hình 3.8 Whey CaSG1T LH ng ng kh 14

MUC LUC BANG

Bang 2 Thanh phan Whey .0 ccccccccccssscsssssssssasecessesesesasecssessecatscetsesesecassessteaeeaes

Báng 3 I Hóa chất cho vào đề lập đường chuẩn ¿5+ 222222 cxzxsxseseca 18 Báng 4 Kết quả sau khi đo đường chuẩn .- 25:22 222222 xsErxserrrrrrea 20 Bảng 5 Kết quả 3 chuẩn độ để hiệu chuẩn NaONH - 2522 2222 2x+zcsee2 21 Bảng 6 Kết quả đo OD nồng độ dịch Whey protein . 55c se cscsesxsea 23

Bảng 7 Kết quả đo nồng OD bột Whey profein c2 S server 24

CHUONG 1 TONG QUAN

Sữa là một thực phẩm phở biến trong đời sống, hàm lượng protein của sữa cũng đáng quan tâm Sữa cũng có những chế phẩm để phục vụ với những mục đích sức khỏe, làm thực phẩm bồ sung, phục vụ con người do đó chúng ta có phương pháp thực

hiện tính chế những chế phâm đó Trong bài này, nhóm thực hiện tinh chế tạo ra chế

phẩm Casein và whey proten từ , sữa nguyên liệu là sữa tươi tiệt trùng Vinamilk 1L Đồng thời, nhóm cũng phân tích và đánh giá sản phẩm bằng phương pháp Bradford, Kjeldahl

CHUONG 2 GIOI THIEU

2.1 Tổng quan về nguyên liệu sữa

Sữa được sử dụng trong bài này là sữa tươi tiệt tùng Vinamilk IL có những thành phần như sau:

Hàm lượng protein trong sữa bò xấp xỉ 3,5% trọng lượng, tương đương với 36 g/L Protein là thành phần dinh dưỡng quan trọng, chiếm khoảng 38% tổng hàm lượng chất rắn không béo trong sữa và 21% năng lượng của sữa nguyên chất

Giá trị dinh dưỡng trung bình trong 100 ml*

Nutrition facts per 100 ml

Thanh phan/ Ingredients: Sifa tir 100% sifa tuoi (99,7%)/ Fresh milk (99.7%), chất ổn định (471, 460(i), 407, 466), vitamin (A, D3), khoang chat/ | mineral (natri selenit/ sodium selenite)

Hinh 2.1: Thanh phan sita nguyén liệu

2.2 Tổng quan về casein

Casein là thành phần protein chính trong sữa bò, chiếm khoảng 80% tông số protein Trong sữa bò, casein được chia thành bốn nhóm phụ: œ:¡-casein, œs2-casein, B- casein và K-Cas€In

Các nhóm casein này đều có cấu trúc không đồng nhất, nghĩa là chúng có thành phần axit amin khác nhau Tuy nhiên, điểm chung giữa casein ơ và Ð là các axit amin này được este hóa bởi axit phosphoric Axít phosphoric này liên kết với canxi có trong sữa đề hình thành các liên kết nội phân tử và ngoại phân tử Điều này khiến casein dễ dang tạo thành chuỗi polymer có chứa một vài loại casein giông nhau hoặc khác nhau

Do có nhiều nhóm phosphate và các nhóm ky nước trong phân tử casein, các phân tử polymer được hình thành tu casein rất đặc biệt và bên Những phân tử này được cầu tạo từ hàng trăm và hàng nghìn phân tử đơn lẻ và hình thành nên dung dịch keo, tạo nên màu trăng của sữa Những phức chât này được gọi là các micelle casem

Micelle casein bao gồm một phức hợp các sub-micelle, có đường kính từ 10 đến

15 nm Một micelle casein với kích thước trung bình có tới 400 đến 500 sub-micelle và

có thể có kích thước lớn tới 0,4 um.

Calcium phosphate Ca,(PO,),

2.3 Tổng quan về Whey

Whey là một thành phần của sữa, chiếm khoảng 80-90% tông thể tích sữa Whey là một chất lỏng trong, màu vàng nhạt, có vị ngọt Whey chứa khoảng 50% chất dinh dưỡng có nguồn góc từ sữa nguyên chất, bao gồm: protein hòa tan, lactose, vitamin và khoáng chất

Đối với cầu tric: Whey protein là một tập hợp các protein hình cầu có cầu trúc xoắn ơ cao Các axit amin ky nước - ưa nước trong whey protein được phân bố ở dạng khá cân bằng Điều này giúp whey protein có khả năng hòa tan tốt trong nước và dễ dàng hấp thụ vào cơ thê

Whey protein là một nguồn protein chất lượng cao, cung cấp đầy đủ 9 loại axit amin thiết yếu cho co thé Whey protein co nhiéu tác dụng đối với sức khỏe, bao gồm:

Hỗ trợ tăng cơ bắp: Whey protein là một nguồn protein lý tưởng cho những người tập thê hình, thê thao Whey protein giúp cơ thê tổng hợp protein nhanh chóng, từ đó giúp tăng cơ bắp hiệu quả

Giảm cân: Whey protein có thể giúp bạn cảm thấy no lâu hơn, từ đó giúp giảm lượng calo nap vao co thé Whey protein cũng có thê giúp tăng cường trao

đổi chất, từ đó giúp giảm cân hiệu quả

Cải thiện sức khỏe tim mạch: Whey protein có thể giúp giảm cholesterol xấu (LDL) và tăng cholesterol tốt (HDL), từ đó giúp cải thiện sức khỏe tim mạch

Giúp xương chắc khỏe: Whey protein có chứa nhiều canxi, một khoáng chat quan trọng cho sức khỏe xương Whey protein có thê giúp tăng cường hấp thu canxi, từ đó giúp xương chắc khỏe hơn

Bang 2 Thanh phan Whey

Số lượng dư

2.4 Giới thiệu phương pháp Bradford đề phân tích hàm lượng protein Phương pháp dựa vào sự thay đôi màu khi cho Coomassie Brilliant Blue - G

250 liên kết với protein trong môi trường acid Thuốc nhuộm nảy sẽ tạo các liên kết với protein, tuong tác với các nhóm ky nước và các nhóm mang điện dương trên phân tử protein thành một phức chất có màu xanh dương, có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm

Thanh phan của Coomassie Brilliant Blue - G 250 như sau:

e Coomassie Brillian Blue G-250: 0.05 g

e Ethanol tuyét doi: 47 g

e Phosphoric acid: 85 g

Cường độ mau nay tỉ lệ thuận với hàm lượng protein, nên có thể xác định được hàm lượng protein bằng phương pháp so màu

CHUONG 3 THUC HANH THI NGHIEM

3.1 CHUAN BI

3.1.1 DUNG CU, HOA CHAT

Bang 3 Dung cu chuẩn bị

Dụng cụ - thiết bị: Nguyên liệu - Hóa chất

Máy lọc chân không Sữa tươi thanh trùng 100 mL

Bề điều nhiệt Acetic acid 10% 100mL

Micropipette 1000 L + dau tip 1 NaOH 0.IN

Micropipette 100 uL + đầu tịp 1 Xúc tác (CuSOx:KzSOs:Se)

Ông nghiệm 10 Phenolphthalein

Erlen 250 mL : H6a chat PP Bradford:

Bình vô cơ hóa Ị Albumin 0,1 mg/mL

Giấy lọc 4 Thuốc thử Bradford

1 Nước

2 Ethanol 95% _— Kết tủa Whey protein

3 Ether ethylic (pH 4, 2 hours, 70 °C)

Whey protein

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm

3.2 Thực hiện tách chiết casein

3.2.1 Gia nhiệt

Lấy 100 mL sữa bò tươi cho vào becher và tiễn hành bọc màng bọc thực phẩm

Các bước thực hiện

1 Cho sữa vào bình becher khoảng 100 mL

2 Đặt bình becher vào bê điều nhiệt.

3 Diéu chính nhiệt độ của bề điều nhiệt đến 40 độ C

4 Khuấy đều sữa trong quá trình gia nhiệt đê sữa phân tán đều

5 Duy tri nhiệt độ ở 40 độ C trong khoảng 15 phút

Ngoài ra, việc đun dung dịch sữa lên 40 °C và khuấy đều còn có thê giúp hệ phân phán sữa trong nước phân tán tốt hơn thành các hạt đồng đều hơn Điều này sẽ giúp quá trình kết tủa casein diễn ra đồng đều hơn

10

Trong sữa, pH tự nhiên của sữa là khoảng 6,6 Do do, casein trong stra mang điện tích âm Đê kết tủa casein, cân điêu chỉnh pH của sữa xuông thâp hơn điêm đăng điện của casem, tức là xuông 4,6

Acid acetic la chất thường được sử dụng đề điều chỉnh pH của sữa Acid acetic có tính axit nhẹ, dễ dàng hòa tan trong nước và có thê điều chỉnh pH của dung dịch một cách chính xác

Việc thiểu acid acetic sẽ khiến pH của sữa không đủ thấp, dẫn đến casein không kết tủa hoàn toàn Điều này sẽ làm giảm hiệu suất thu được Việc

dư acid acetic sẽ khiến pH của sữa quá thấp, dẫn đến nhiều tạp chat két tinh theo Ngoài ra, acid quá nhiều cũng khiến việc lọc, rửa casein trở nên khó khăn hơn

Ngoài acid acetic, acid hydrochlorie (HC]) và acid sulfuric (H2SO4) cũng có thê được sử dụng để kết tủa casein Tuy nhiên, việc sử dụng các acid này sẽ khó khăn hơn trong việc điều chỉnh pH của dung dịch

Ca-caseinate + 2H” —› casein + Ca?”

Khi thêm acid vào, tăng nồng độ acid, pH giảm, các điện tích âm trên bề mat micelle cua Ca-caseinate được trung hòa bởi sự proton hóa các nhóm phosphate Ca-caseinate được đưa về điểm đẳng điện va tao ra protein trung tinh — casein

II

3 Ly tâm ở tốc độ 6000 rpm trong 10 phút ở nhiệt độ 4 °C

4 Sau khi ly tâm, dịch sữa sẽ ở phía trên, tủa casein sẽ ở phía dưới

5 Dung phéu lay tủa casein ra khỏi ống falcon

Hình 3.4 Thực hiện ly tâm sữa 3.2.4 Rứa túa

Rửa tủa casein là quá trình loại bỏ các tạp chất, bao gồm béo, lactose, acid, để thu được tủa casein tinh khiết

Thực hiện như sau:

12

Cho tua casein vao 6ng falcon

1 Rửa lần l với nước cất:

o_ Cho nước cất vào ông falcon sao cho ngập tủa

o_ Ly tâm ở tốc độ 6000 rpm trong 10 phút

o_ Đồ bỏ dịch lỏng bên trên

2 Rửa lần 2 với ethanol 96%:

o_ Cho ethanol 96% vào ống falcon sao cho ngập tủa

o_ Ly tâm ở tốc độ 6000 rpm trong 10 phút

o_ Đồ bỏ dịch lỏng bên trên

3 Rửa lần 3 với ether ethylic:

o_ Cho ether ethylic vào ống falcon sao cho ngập tủa

Dùng đũa thủy tinh làm nhuyễn tủa casein

Cho giấy lọc và tủa casein vào tủ say

Sấy ở nhiệt độ 50 °C

Lấy giấy lọc và tủa casein ra khỏi tủ sấy Thời gian sấy tùy thuộc vao độ âm của Casein, sây đên khi khôi lượng không đối, ở đây là sau 2 ngày

14

6 Cân giấy lọc và tủa casein đề tính ra lượng casein thu nhận

Tlm32Ché phẩm Casein sau khi sấy khô

3.3 Thực hiện tách chiết Whey

15

Tổng dịch Whey thu được là 70mL, tiễn hành giữ lại 5mL để phân tích hàm lượng protein và 50mL dịch Whey để tỉnh chế tạo chế phẩm Whey 3.3.2 Kết tủa Whey

Bước này có mục đích là tạo điều kiện và thực iện kết tủa Whey Protein

từ dịch thu được ở trên

Các bước thực hiện

1 Trích 50 mL dịch whey

2 Ú dịch whey trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 70 °C Ở bước này,

các phân tử whey protein sẽ bị biến tính, làm giảm độ hòa tan của chúng

3 Dung acetic acid 10% điều chỉnh pH dịch whey xuống pH 4.0 Khi nay whey protein sẽ trung hòa điện, giữa những whey protein không có lực đây nhau ra và xuất hiện tương tác ky nước

4 Đề yên dịch whey trong 2 giờ

Hình 3.9 pH kết tua Whey

16

3.3.3 Ly tâm

Mục tiêu bước này là thu nhận chế phẩm bột whey là quá trình thu nhận

whey protein từ dịch whey

1 Sau khi đề yên dịch whey trong 2 giờ, ly tâm ở tốc độ 6000 vòng trong

10 phút

Lấy tủa whey protein ra khỏi ống falcon

Loại bỏ phần dịch bằng cách đồ bỏ hoặc sử dụng pipet

Giữ lại tủa whey protein trong ống falcon

Mở nắp falcon để hơi nước bay hơi tự nhiên

Cuối cùng thu được chế phẩm bột whey

17

CHUONG 4 KET QUA THU DUOC

4.1 Xây dựng đường chuẩn hàm lwong Protein bang Albumin

Sử dụng dung dịch protein chuẩn là albumin tinh khiết có nồng độ | mg/mL Do đó cần pha loãng sao cho thu được 100 mL albumin có nồng độ

0.1 mg/mL để tạo đường chuẩn Vì vậy, tiễn hanh hut 10 mL albumin tinh khiết

sau đó định mức lên 100 mL bằng nước cất

Hinh 4.1 lo dung dich Albumin

Lấy 6 ông nghiệm đánh số thứ tự từ 0 đến 5 Bồ sung các thành phần vào ống nghiệm theo bảng sau:

18

Bang 4 1 Hoa chat cho vao dé lap duéng chuan

Albumin 0,1 mg/mL (mL)| 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Thuốc thử Bradford (mL) | 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Hàm lượng albumin (ug) | 0 10 20 30 40 50

Lắc đều các ống nghiệm, đề yên 15 phút, đo mật độ quang ở bước sóng

595 nm trên máy UV - Vis Lập đường chuẩn với trục tung là hiệu mật độ

quang AOD (A), truc hoành là lượng albumin chuẩn (ng)

Hhình4.2 Kết quả lập đường chuẩn

Từ bảng số liệu trên, ta thu được đường chuẩn như Sau:

21

4.2 Hiệu chuẩn dung dich NaOH

Hiệu chuẩn NaOH IN bang H2S04 IN (10mL)

Bảng 4.3 Kết quả 3 chuẩn độ đề hiệu chuẩn NaOH

22

2NaOH + H2SO1—> Na2SO4+ H2O

Nong độ đương lượng của NaOH thực tế thu được:

Nong độ đương lượng của NaOH thực tế thu được:

23

4.4 Kết quả thu được khi tách chiết Whey protein 4.4.1 Dịch Whey Protein

Thực hiện phương pháp Bradford 3 lần thu được kết quá như sau:

Bảng 4.4 Kết quả đo OD nông độ dịch Whey protein Ông nghiệm Lượng mẫu Lượng HO OD

Ham luong Protein trong dich whey

24

Pw = 3,1 0,2 = 0,62(g) = 620(mg) Hiệu suất thu hồi protein dịch Whey từ sữa

,

40

A1% = 100% = 64,75%

4.4.2 Bot Whey Protein

Sau khi kết tủa, làm khô, thu được lượng whey có khối lượng là 0,52g

Hòa tan lượng Whey trên với 10mL nước cất, sau đó lấy ImL dịch trên pha loãng 50 lần, tiên hành thực hiện phản ứng Bradford thu được số liệu:

Bảng4.5 Kết quả đo nông OD bột Whey profein

Dựa trên phương trình đường chuẩn: y = 0,0012x - 0.0021 (x (ug

Albumin); y (AOD)) thu dugc:

Ham lượng Protem trong bột whey: