thí nghiệm công nghệ protein và enzyme bài 2 thu nhận và tinh sạch enzyme urease từ đậu nành

4.2 Phân tích chế phẩm urease khi thực hiện tủa phân đoạn bằng ammonia sulfate 144.2.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford .... 11Hình 4.1 Xác định hàm lượng protein the

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME

BÀI 2: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH

Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ CẨM VI

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYME

BÀI 2: THU NHẬN VÀ TINH SẠCH

Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ CẨM VI Người thực hiện: S4_N3

Nguyễn Huỳnh Lan Hân : 62101112

Nguyễn Ngọc Thiện : 62101179

Lưu Thảo Linh : 62101132

Nguyễn Thành Tài : 62101173

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2024

MỤC LỤC

MỤC LỤC HÌNH ẢNH v

MỤC LỤC BẢNG vii

1 TỔNG QUAN 1

2 GIỚI THIỆU 1

2.1 Enzyme urease 1

2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 3

3 QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ TÌNH SẠCH ENZYME UREASE TỪ ĐẬU NÀNH 4

3.1 Quy trình trích ly enzyme urease thô 4

3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu 4

3.1.2 Trích ly urease 5

3.1.3 Dịch urease thô 6

3.2 Quy trình kết tủa enzym urease 7

3.2.1 Tủa (NH4)2SO4 20% bão hòa 7

3.2.2 Ly tâm thu dịch 8

3.2.3 Tủa (NH4)2SO4 55% bão hòa 8

3.2.4 Hòa tan tủa 9

3.2.5 Thẩm tích 10

4 PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM 11

4.1 Dịch enzyme urease thô 11

4.1.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 11

4.1.2 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler 13

4.2 Phân tích chế phẩm urease khi thực hiện tủa phân đoạn bằng ammonia sulfate 14

4.2.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 14

4.2.2 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler 16

4.3 Tủa enzyme urease bằng acetone 17

4.3.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 17

4.3.2 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler 19

5 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

5.1 Kết quả thu được của nhóm 21

5.2 So sánh và biện luận kết quả giữa phương pháp kết tủa phân đoạn và kết tủa bằng acetone 21

6 PHỤ LỤC 22

6.1 Bảng chuyển đổi nồng độ bão hòa của (NH4)2SO4ở nhiệt độ 20 ℃ 22 6.2 Dựng đường chuẩn Nessler 22

6.3 Dựng đường chuẩn Bradford 24

6.3.1 Nguyên tắc 24

6.3.2 Hoá chất 24

6.3.3 Cách thực hiện 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

MỤC L C HÌNH Ụ ẢNH

Hình 2.1 Phương trình urease xúc tác thủy phân urea 2

Hình 3.1 Quy trình trích ly enzyme urease thô 4

Hình 3.2 Đậu nành đã tách béo 5

Hình 3.3 Trích ly urease 6

Hình 3.4 D ch trích ly thô sau khi ly tâm 6ị Hình 3.5 Quy trình kết tủa Enzyme urease từ ịch trích ly thô d 7

Hình 3.6 Urease thô sau khi ly tâm 8

Hình 3.7 Kết tủa sau khi tủa bằng (NH4)2SO4 55% bão hòa 9

Hình 3.8 Tủa sau khi được hòa tan bởi đệm 10

Hình 3.9 Quá trình thẩm tích Urease 10

Hình 3.10 Đo lượng Urease thu được sau khi thẩm tích 11

Hình 4.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối với m u tr ngẫ ắ 11

Hình 4.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đố ới v i m u thôẫ 12

Hình 4.4 Xác định hoạt tính Urease theo phương pháp Nessler đối v i mớ ẫu tr ng 13ắ Hình 4.3 Xác định hoạt tính Urease theo phương pháp Nessler đối v i mớ ẫu thô 13

Hình 4.5 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối với m u tr ngẫ ắ 14

Hình 4.6 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đố ới v i m u sau ẫ thẩm tích 14

Hình 4.7 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler ới mẫ v u sau th m tíchẩ 16

Hình 4.8 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler với mẫu tr ng 16ắ Hình 4.9 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đố ới v i m u tẫ ủa b ng acetone 17ằ Hình 4.10 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối v i m u tr ngớ ẫ ắ 17

Hình 4.11 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đối với mẫu tr ng 19ắHình 4.12 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đối với mẫu tủa bằng acetone 19Hình 5.1 Hiệu su t t a protein c a các lo i anions và cations 22ấ ủ ủ ạHình 6.1 Các ng có nố ồng độ NH3 khác nhau 23Hình 6.2 Đường chuẩn Nessler 23Hình 6.3 Đường chuẩn Albumin thu được từ phương pháp Bradford 27

B ng 4.2 ả Xác định hoạt tính Urease theo phương pháp Nessler đối với mẫu thô 13

B ng 4.3 ả Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đố ới v i m u sau ẫthẩm tích 15

B ng 4.4 ả Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler với mẫu sau thẩm tích 16

B ng 4.5 ả Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đố ới v i m u tẫ ủa

b ng acetone 18ằ

B ng 4.6 ả Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đố ới v i m u t a b ng ẫ ủ ằacetone 19

B ng 5.1 So sánh thông s giả ố ữa hai phương pháp tủa enzyme urease 21

B ng 6.1 B ng chuyả ả ển đổi nồng độ bão hòa của (NH4)2SO4 nhiở ệt độ 20 ℃ 22

B ng 6.2 Các hóa ch t trong ng nghi m th c hiả ấ ố ệ ự ện đường chu n Nessler 23ẩ

B ng 6.3 Các giá tr ả ị thu được từ phương pháp Bradford 26

B ng 6.4 Các giá tr ả ị thu được từ phương pháp Bradford 26

1 TỔNG QUAN

Urease là enzyme xúc tác cho phản ứng tủy phân urea tạo thành khí carbonic

và amoniac Qua đó, việc thu nhận enzyme urease thô từ đậu nành trải qua các bước gồm xay nhỏ, trích ly loại lipid, trích ly urease, ly tâm để thu dịch thô Sau đó từ dịch thô để thu được urease tinh khiết có 2 phương pháp là kết tủa phân đoạn bằng ammonia sulfate hoặc bằng acetone Khi thu được urease tinh khiết tiến hành phân tích xác định hàm lượng protein theo Bradford và xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler So sánh hiệu sất thu hồi và độ tinh sạch của phương pháp tủa phân đoạn bằng muối (ammonia sulfate) cho kết quả cao hơn so với tủa bằng hợp chất hữu cơ (acetone)

2 GIỚI THI U Ệ

2.1 Enzyme urease

Urease là enzyme thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (hydrolase), phân nhóm amidase Urease có số hiệu phân loại quốc tế là EC 3.5.1.5 Tên hệ thống là Carbamate amide hydrolase

- Số hiệu phân loại quốc tế của Urease là EC 3.5.1.5

- Số 5 chỉ số thứ tự của Urease trong phân nhóm phụ.

Trong tự nhiên có hơn 200 loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme urease như H pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Bacillus pasterurii, Escherchia coli… Enzyme urease cũng có ở dịch tiêu hoá của các động vật như trâu, bò, dê, chó

Enzyme urease còn có nhiều trong các cây bậc cao, đặc biệt là các cây thuộc

họ đậu như đậu rựa (Canavalia ensiformis, jack bean), đậu nành (Glycine hispida)… Urease xúc tác cho phản ứng thuỷ phân urea, tạo thành khí carbonic và amoniac theo phương trình sau:

Bảng 2.1 Đặc tính c a ủ Enzyme urease

Hình 2.1 Phương trình rease xúc tác thủu y phân urea

Lợi dụng tính chất đặc hiệu của urease, người ta ứng dụng urease trong việc nhận biết sự có mặt của urea trong thực phẩm, nước giải khát lên men và trong sữa.2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghi m ệ

Bảng 2.2 Hóa chất và d ng c thí nghi m ụ ụ ệ

3 QUY TRÌNH THU NH N VÀ TÌNH S CH ENZYME Ậ Ạ UREASE T Ừ ĐẬ U NÀNH

3.1 Quy trình trích ly enzyme urease thô

Hình 3.1 Quy trình trích ly enzyme urease thô

Hình 3.2 Đậu nành đã tách béo3.1.2 Trích ly urease

Thực hiện cân 84 g bột đậu nành đã tách béo rồi cho vào cốc 1000 mL Sau đó thêm vào 700 mL dung dịch đệm phosphate chứa Cystein 5.10-3 M và EDTA 5.10-

3 M Khuấy đều lên sau đó đậy giấy bạc hoặc đậy kín bằng màng bọc thực phẩm, rồi đặt vào tủ hút Trong điều kiện pH 7, 12 giờ đó enzyme đạt trạng thái có hoạt tính tốt nhất và giúp bảo vệ urease khỏi bị biến tính

Vì đặc tính enzyme urease có chất kiềm hãm là các kim loại nặng (Ag+, Cu2+, Hg2+) nên khi cho dung dịch EDTA 5.10 3 M vào thì nó sẽ liên kết với các ion kim -loại nhằm ngăn sự kiềm hãm hoặc gây biến tính của chúng đối với urease

Còn dung dịch Cystein 5.10 3 M thì sẽ chuyển hydro cho cầu nối (- -S-S-) Vì sau khi trích ly, nhóm SH ở trung tâm hoạt động bị oxy hóa và hình thành nên cầu nối (-S-S-) gây mất khả năng liên kết với cơ chất của enzyme urease Sử dụng Cystein 5.10-3 M phản ứng chuyển hydro với cầu nối (-S-S-) để phục hồi nhóm SH

Hình 3.3 Trích ly urease 3.1.3 Dịch urease thô

Khoảng 12 giờ sau trích ly, lấy mẫu ra và cho vào ống falcon, điều chỉnh khối lượng cho 2 falcon bằng nhau (có thể chênh lệch ở số thập phân thứ hai 2 – 4 đơn vị)

để đem đi ly tâm mẫu 5000 vòng/phút, 10 phút để bã lắng xuống dưới tạo thuận lợi cho việc bỏ bã tách dịch chiết

Nếu sau khi ly tâm, mẫu vẫn còn nhiều cặn thì nên lọc lại bằng giấy lọc Tiếp

đó loại bỏ bã và thu dịch Lấy khoảng 1-2 mL dịch urease thô được pha loãng khoảng

50 lần để phân tích hàm lượng protein và hoạt tính urease Phần dịch urease còn lại

sẽ được đong thể tích và thực hiện kết tủa urease Các quá trình đều đều phải được thực hiện ở nhiệt độ lạnh, thấp hơn 4 ℃

Hình 3.4 D ch trích ly thô sau khi ly tâmị

3.2 Quy trình kết tủa enzym urease

Hình 3.5 Quy trình kết t a Enzyme urease t dủ ừ ịch trích ly thô3.2.1 T a (NH4)2SO4 20% bão hòa ủ

Nồng độ muối ban đầu là 0% và nồng độ muối lúc sau là 20%, dung dịch có thể tích 30 mL, thì khối lượng muối cần thêm (m1) là:

m1= 30×1141000 = 3,42 g

Cân chính xác 3,42 g muối ammonia sulfate cho vào 30 mL dịch urease thô,

để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng Đây là quá trình kết tủa âm bằng (NH)SO 20%

bão hòa, để kết tủa tạp chất Sau đó, tiến hành ly tâm thu dịch với 5000 vòng, 10 phút,

ở 4 ℃

3.2.2 Ly tâm thu dịch

Hình 3.6 Urease thô sau khi ly tâm Sau khi thu dịch urease đo lại thể tích được 31,5 mL, cân chính xác 7,08 g ammonia sulfate cho vào dịch urease, để yên 30 phút, ở nhiệt độ phòng

3.2.3 T a (NH ủ 4)2SO4 55% bão hòa

Quá trình kết tủa dương bằng (NH4)2SO4 55% bão hòa, để kết tủa enzyme Sau

đó, tiến hành ly tâm thu tủa với 5000 vòng, 10 phút, ở 4℃

Lượng (NH )4 2SO4 tính bằng g, cần bổ sung vào một lít dung dịch (NH4)2SO4

có nồng độ ban đầu đã biết để thu dung dịch có nồng độ (NH4)2SO4mong muốn ở 20℃

Nồng độ muối ban đầu là 20% và nồng độ muối lúc sau là 55%, dung dịch có thể tích 31,5 mL, thì khối lượng muối cần thêm (m2) là:

m2=31,5×225 = 7,08 g

Hình 3.7 Kết tủa sau khi t a b ng (NH4)2SO4 55% bão hòa ủ ằ3.2.4 Hòa tan tủa

Hòa tan tủa vừa thu được với đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa cystein và EDTA 5×10 M, cho vào túi cellophane -3

Hình 3.8 Tủa sau khi được hòa tan bởi đệm

3.2.5 Thẩm tích

Quá trình thẩm tích được thực hiện trong dung dịch đệm phosphate 1/15M pH

7 chứa cystein và EDTA 5×10 M-3 Thay đệm mỗi ngày 2 lần vào buổi sáng và chiều trong 2 ngày Sau quá trình thẩm tích thu được 9 mL dịch enzyme, trước khi phân tích hàm lượng protein và hoạt tính, dịch enzyme được pha loãng 50 lần bởi đệm phosphate 1/15M pH 7 chứa cystein và EDTA 5×10 M-3 Trong quá trình thẩm tích, muối khuếch tán từ trong màng cellophane đi ra dung dịch đệm một cách tự nhiên, theo cơ chế từ nơi có nồng độ muối cao đến nơi có nồng độ muối thấp, đến khi nồng

độ muối trong và ngoài bằng nhau

Hình 3.9 Quá trình th m tích ẩ Urease

Tủa sau khi được hòa tan thì cho vào túi cellophane Cho túi vào cốc và cho thêm dung dịch đệm phosphate 1/15M pH 7 có chứa EDTA và Cystein vào cốc đến khi vượt qua mức nước trong túi Để cốc vào tủ lạnh 4oC,thay đệm mỗi 24 giờ

Hình 3.10 Đo lượng Urease thu được sau khi thẩm tích

4 PHÂN TÍCH CH Ế PHẨM

4.1 Dịch enzyme urease thô

4.1.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

Hình 4.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối

với mẫu trắng

Bảng 4.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối v i mớ ẫu thô

𝑃 =16,15 × 35=565 25, (𝑚𝑔) Hình 4.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối

với mẫu thô

4.1.2 Xác định ho t tính urease ạ theo phương pháp Nessler

Hình 4.4 Xác định ho t tính Urease ạ theo phương pháp Nessler đối v i mớ ẫu trắng

Bảng 4.2 Xác định hoạt tính Urease theo phương pháp Nessler đối v i mớ ẫu thô

10,1×

1

17 10× × 50 ≈ 69 99, (𝐼𝑈/𝑚𝑙) Hoạt tính urease tổng trong dung dịch urease thô:

𝐴 = 69 99 × 35 = 2449 65, , (𝐼𝑈) Hình 4.3 Xác định ho t tính Urease ạ theo phương pháp Nessler đối v i mớ ẫu th

Hoạt tính riêng:

𝐴𝑝1= 𝐴1

𝑃1=69,9916,15≈ 4,33 (𝐼𝑈/𝑚𝑔) 4.2 Phân tích chế phẩm urease khi th c hi n tự ệ ủa phân đoạn ằb ng ammonia sulfate

4.2.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

Hình 4.5 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối

với mẫu tr ng ắ

Hình 4.6 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối

với mẫu sau th m tích ẩ

Bảng 4.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối v i mớ ẫu sau

𝑃𝑡3= 23,375 × 9 =210 375, (𝑚𝑔)

4.2.2 Xác định ho t tính urease ạ theo phương pháp Nessler

Bảng 4.4 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler ớ v i m u sau thẫ ẩm

tích Hoạt tính urease trong dung dịch urease sau thẩm tích:

𝐴3= 0,11− 0,0034

0,0089 ×

1,50,5×

10,1×

1

17 10× × 50 ≈ 105 68, (𝐼𝑈/𝑚𝑙) Hoạt tính urease tổng trong dung dịch urease sau thẩm tích:

𝐴𝑡3= 105 68 × 9 = 951 12, , (𝐼𝑈) Hoạt tính riêng:

𝐴𝑝3= 𝐴3

𝑃3=105,6823,375≈ 4,52 (𝐼𝑈/𝑚𝑔) Hiệu su t thu h i bấ ồ ằng phương pháp tủa phân đoạn b ng ammonia sulfate: ằ

4.3.1 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

Hình 4.10 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

đối với m u tr ng ẫ ắ

Hình 4.9 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối

với mẫu t a b ng acetone ủ ằ

Bảng 4.5 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford đối v i mớ ẫu t a ủ

100,02× 1 = 1983,75 (𝑚𝑔 𝑚𝑙/ ) Hàm lượng protein tổng trong dung dịch urease sau tủa acetone:

𝑃𝑡2 =1983,75 × 0,02=39 675, (𝑚𝑔)

4.3.2 Xác định ho t tính urease ạ theo phương pháp Nessler

B ng 4.6 ả Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đối v i mớ ẫu t a b ng ủ ằ

Hình 4.12 Xác định hoạt tính urease theo phương pháp Nessler đố

với mẫu t a b ng acetone ủ ằ

Hoạt tính urease trong dung dịch urease sau tủa acetone:

𝐴2= 0,204− 0,0034

0,0089 ×

1,50,5×

10,1×

1

17 10× ×

100,02× 1 ≈ 1988,76 (𝐼𝑈/𝑚𝑔) Hoạt tính urease tổng trong dung dịch urease sau tủa acetone:

𝐴𝑡2= 1988 76 × 0,02 ≈ 39 78 (𝐼𝑈) , ,Hoạt tính riêng:

𝐴𝑝2= 𝐴2

𝑃2=1988,761983,75≈ 1,003 (𝐼𝑈/𝑚𝑔) Hiệu su t thu h i bấ ồ ằng phương pháp tủa b ng acetone: ằ

5 K T QU VÀ BÀN LU N Ế Ả Ậ

5.1 K t quế ả thu được c ủa nhóm

Sau quá trình trích ly để thu được urease thô có hàm lượng protein là 16,15 (mg/mL) trong đó tổng protein trong dịch urease thô là 565,25g Hoạt tính urease được xác định theo phương pháp Nessler cho ra được hoạt tính là 69,99 (IU/mL), trong đó hoạt tính tổng của dịch là 2449,65 (IU) và hoạt tính riêng là 4,33 (IU/mg) Sau khi thu được dịch urease thô tiến hành tủa phân đoạn bằng ammonia sulfate ở nồng độ bão hòa 20% và 55% và tiến hành thẩm tích thu được hàm lượng protein là 23,375 (mg/mL), lượng protein tổng là 210,375 (mg) Khi xác định hoạt tính bằng phương pháp Nessler cho thấy hoạt tính là 105 (IU/mL), trong đó hoạt tính tổng là 951,12 (IU) và hoạt tính riêng là 4,52 (IU/mg) Từ quá trình trên cho thấy hiệu suất thu hồi là 38,83% và độ tinh sạch là 1,044

5.2 So sánh và bi n lu n kệ ậ ết quả ữa phương pháp kế ủa phân đoạ gi t t n và kết tủa b ng acetone ằ

Bảng 5.1 So sánh thông s giố ữa hai phương pháp tủa enzyme urease

Hiệu xuất thu hồi (%) Độ tinh sạch Tủa bằng acetone 1,62 0.23

Tủa phân đoạn

bằng ammonia sulfate 38,83 1,044

Theo như kết quả so sánh hiệu sất thu hồi và độ tinh sạch của phương pháp tủa phân đoạn bằng muối (ammonia sulfate) cho kết quả cao hơn so với tủa bằng hợp chất hữu cơ (acetone)

Phương pháp tủa enzyme urease bằng acetone dùng để thu các enzyme với yêu cầu thành phẩm không chứa muối

Phương pháp tủa enzyme urease bằng muối ammonia sulfate: