Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Chiết tách và phân lập Nevadensin trong cây rau om

Trong nghiên cứu này “Chiết tách và phân lập Nevadensin trong cây Rau Om” đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết Rau om bằng phương pháp LC/MS.. MỞ ĐẦU Các hợp chất tự nhiên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-oo0oo -

VÕ NGUYỄN THÙY DƯƠNG

CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP NEVADENSIN

TRONG CÂY RAU OM

(Limnophila aromatica (L.), Scrophulariaceae)

Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học Mã số: 12050146

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH 11/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – TP.HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học 1 Cán bộ hướng dẫn khoa học 2

Cán bộ chấm nhận xét 1

Cán bộ chấm nhận xét 2

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại Học Bách Khoa – ĐHQG

Tp.HCM, ngày tháng năm 201 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn gồm:

Xác nhận của chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn và trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: MSHV: Ngày, tháng, năm sinh: Nơi sinh: Chuyên ngành: Mã số :

I TÊN ĐỀ TÀI :

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 CÁN BỘ HƯỚNGDẪN 2

Tp HCM, ngày tháng năm 201

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc



Trong quá trình thực hiện luận văn, Tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của quý thầy cô trường Đại học Bách khoa Tp.HCM, đặc biệt là các anh chị em đồng nghiệp của Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp HCM, và sự động viên cũng như giúp sức cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cám ơn đến: - TS Nguyễn Thị Lan Phi đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình

nghiên cứu và thực hiện đề tài - Các thầy cô trong hội đồng nghiệm thu đề tài đã góp ý chân thành cho nội

dung Luận văn được chặt chẽ và hoàn thiện hơn - Quý thầy cô trường Đại học Bách khoa Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và

giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài - Phòng Đào tạo Sau đại học – Đại học Khoa Học Bách khoa Tp.HCM đã tạo

điều kiện tốt cho tôi trong suốt khóa học và thời gian thực hiện đề tài - Các anh chị em các bạn khoa Vật lý Đo lường – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

- Ban lãnh đạo, các anh chị khoa Đông dược - Dược liệu, khoa Kiểm nghiệm Nguyên Liệu, khoa Dược lý, khoa Kiểm nghiệm các dạng Bào chế, khoa Thiết lập Chất chuẩn, phòng Hành chính quản trị - Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM đã cộng tác và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này

- Gia đình và bạn bè đã luôn động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn

TÓM TẮT

Rau Om (Limnophila aromatica) không chỉ là loại rau gia vị mà nó còn là một loại

thảo dược có chứa nhiều tự nhiên có hoạt tính sinh học Trong nghiên cứu này “Chiết tách và phân lập Nevadensin trong cây Rau Om” đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết Rau om bằng phương pháp LC/MS Ethanol 96% là dung môi phù hợp nhất để chiết xuất Nevadensin từ cây Rau Om Phân lập được hợp chất Nevadensin từ cao chiết Rau Om với độ tinh khiết > 95% Từ đó, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Nevadensin trong cao chiết Rau Om bằng phương pháp HPLC

SUMMARY

Limnophila aromatica is one of traditional ingredient for many Vietnamese dishes, it’s

also a traditional Vietnamese natural herbal which has many substances provide a great biological activity In this research, “Extraction and isolation of Nevadensin in

Limnophila aromatica” had studied the basic chemical components in the extracted

residue using high performance liqiud chromatography (HPLC) acquired with mass spectrometry Ethanol 96% was considered as a best solvent for the extraction of Nevadensin The results from the isolation had showed more than 95 % purity of the active compound For the futher research, method validation for Nevadensin has been

established to measure the quality of Nevadensin in Limnophila aromatica using

HPLC method

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Dung môi hóa chất 21

2.3 Thiết bị 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Xác định độ ẩm 29

3.3 Khảo sát điều kiện chiết cao 36

3.4 Khảo sát thành phần hóa học của cao chiết 41

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 73

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile Cloro Cloroform d Doublet (mũi đôi) dd Doublet of doublet (mũi đôi đôi) DĐVN Dược điển Việt Nam

EthOH Ethanol EtOAc Ethyl acetate HPLC High perfomance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) IR Infrared spectroscopy

J Hằng số ghép kl Khối lượng LC/MS High perfomance liquid chromatography /Mass spectrometry /(Sắc ký lỏng ghép khối

phổ) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) M Khối lượng phân tử

MeOH Methanol MS Mass spectrometry (Khối phổ) NMR Nuclear magnetic resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) RSD Độ lệch chuẩn

s Singlet (mũi đơn) sp Sản phẩm

sx Sản xuất TLC Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng) tt Thể tích

UV Ultraviolet- visible

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Hình hoa và cây Rau om 10

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của các hợp chất 14

Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC khảo sát cột 31

Hình 3.2 Sắc ký đồ HPLC của mẫu thử khảo sát chương trình dung môi 34

Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC khảo sát bước sóng phát hiện 35

Hình 3.4 Quy trình chiết cao từ cây Rau om 40

Hình 3.5 Sắc ký đồ LC/MS ITI TOF khảo sát thành phần hóa học 42

Hình 3.6 Sắc ký bảng mỏng của cao chiết Rau om và chuẩn Nevadensin 47

Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC điều chế 50

Hình 3.8 Bột tinh thể chất phân lập 51

Hình 3.9 Sắc ký bảng mỏng kiểm tra độ tinh khiết 52

Hình 3.10 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC 53

Hình 3.11 Phổ UV-VIS của chất phân lập 55

Hình 3.12 Phổ Hồng ngoại của chất phân lập 56

Hình 3.13 Phổ khối (MS) của chất phân lập 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của cây Rau om 12

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm 29

Bảng 3.2 Kết quả các thông số sắc ký khảo sát cột 31

Bảng 3.3 Các chương trình dung môi khảo sát 32

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát các chương trình dung môi 34

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện 35

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát các dung môi chiết xuất 36

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát nồng độ ethanol 37

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát thời gian ngâm dầm 38

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát thời gian siêu âm 38

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát phương pháp chiết xuất 39

Bảng 3.11 Kết quả thành phần hóa học của cao chiết Rau om 46

Bảng 3.12 Kết quả phân lập Nevadensin từ cao F1 48

Bảng 3.13 Kết quả phân lập Neavdensin từ cao F2 49

Bảng 3.14 Kết quả Độ tinh khiết của chất phân lập được 54

Bảng 3.15 Kết quả phổ UV 55

Bảng 3.16 Kết quả phổ Hồng ngoại 56

Bảng 3.17 Kết quả dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR 60

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn 62

Bảng 3.19 Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống của thử 63

Bảng 3.20 Diện tích đỉnh và nồng độ dung dịch khảo sát tính tuyến tính 65

Bảng 3.21 Kết quả đánh giá độ lặp lại của mẫu thử 66

Bảng 3.22 Kết quả đánh giá độ đúng 67

MỞ ĐẦU

Các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học đang là mục tiêu nghiên cứu và phát triển của ngành công nghiệp dược vì nó có nhiều tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh và hầu như không có các phản ứng phụ sau sử dụng như một số thuốc tổng hợp khác

Trong “Cây thuốc Việt Nam”, Rau Om là một loại cây thuốc được dùng toàn cây và có nhiều công dụng chữa bệnh như: Trị cảm cúm, ho gà, sỏi thận, rắn độc cắn, u nhọt, viêm sưng v v [1], [2]

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong cây Rau Om có nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học như khả năng kháng ung thư, chống oxy hóa tế bào v v [3], [4],[5]

Flavonoid là dẫn xuất của phenolic có hầu hết ở người, động thực vật và vi sinhvật do đưa trực tiếp vào từ nguồn thức ăn Bản thân con người không có khả năng tự tổng hợp được phenolic. [6], [7]

Flavonoid tham gia vào tất cả các quá trình trao đổi chất, sinh tổng hợp và quá trình enzym Về mặt cấu tạo, flavonoid là các polyphenol có tính acid, có nhóm hydroxy tự do ở các vòng. [6], [7]

Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với glucid (glycosid) Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycosid thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực. [6], [7]

Hoạt tính sinh học của flavonoid: Có tác dụng với khối u và một số dạng ung thư như enpatin (3,5,3'-trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'- tetrametoxyflavon); Nâng cao tính bền của thành mạch máu như rutin; Có tác dụng estrogen như glycosid quecxetin và kaempferol- 3-3-ramnogalacto-7-ramnorid. [6], [7]

Ngoài các tác dụng trên, flavonoid còn có các tác dụng khác như: chống dị ứng, chống co giật, giãn phế quản, giãn mạch, lợi mật, giảm đau và có tác dụng diệt nấm Một số dẫn chất của flavonoid có tác dụng thông tiểu, kháng khuẩn như acvicularin Đặc biệt, flavonoid còn có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòn của thành mạch máu. [6], [7]

Các kết quả nghiên cứu khoa học đã kết luận rằng: tác dụng sinh học của flavonoid là do khả năng chống oxy hoá của chúng quy định Do khả năng ức chế quá trình oxy hoá nên chúng có hiệu ứng chống u lành tính và u ác tính Các flavonoid còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng như chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thương hàn, lị [3],[4],[7]

Nevadensin là một flavonoid có hoạt tính sinh học trong cây Rau Om Theo một số nghiên cứu, nevadensin có một số đặc tính sinh học và dược lý quan trong như khả năng hạ huyết áp, chống viêm cấp tính, tính kháng khuẩn mạnh, hoạt tính chống vi khuẩn bệnh lao phổi, ức chế và chống lại tế bào ung thư v v [8],[9]

Do đó nevadensin là một hoạt chất tiềm năng trong nghiên cứu phát triển thuốc ở ngành công nghiệp dược hiện nay

Nhằm nâng cao giá trị sử dụng của cây Rau Om và đưa công dụng của cây Rau Om vào ứng dụng trong y dược chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này

MỤC ĐÍCH

- Khảo sát thành phần hóa học trong cao chiết cây Rau Om - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây Rau Om - Chiết tách Nevadensin là flavonoid có hoạt tính sinh học trong cây Rau Om

- Phân lập và đánh giá sản phẩm để sử dụng làm chất chuẩn nghiên cứu - Xây dựng quy trình định lượng Nevadensin trong cao chiết cây Rau Om - Thẩm định quy trình định lượng Nevadensin theo quy định của ASEAN

I TỔNG QUAN 1.1 CÂY RAU OM (Limnophila aromatica) [1], [2]

Tên thực vật: Cây Rau Om Tên khác: Ngò Om, Ngổ hương

Tên khoa học: Limnophila aromatica (Lam), Scrophulariaceae

Họ (familia): Scrophulariacea (Hoa mõm sói) Chi (genus) : Limnophila

Loài (species): Aromatica

Hình 1.1 Hoa và cây Rau om Mô tả thực vật: [1], [2] Cây thân thảo, sống hằng niên, khoảng 15 đến 50 cm, mập tròn, rổng bọng, đơn giản, phân nhánh nhiều, có nhiều lông hoặc có tuyến,

Lá: mọc đối hay mọc vòng 3-5, lá đơn, không cuống, có nhiều lông, dạng hình trứng, thon

hình mũi mác, bìa lá có răng cưa thưa, gân lá hình lông chim, mặt dưới lá có những đốm tuyến dầu thơm màu xanh

Hoa: cô độc mọc ở nách lá hoặc ở ngọn thân hay nách cành Cuống hoa dài 0,5 đến 2 cm,

láng hay có tuyến Lá bắc thẳng hình mũi mác dài từ 1,5 đến 2 mm, đài hoa 4-6 mm, láng hay có tuyến, với những gân nỗi lên trong những trái Vành hoa hình môi chia 2, màu trắng, màu xanh tím nhạt hoặc màu hồng, 1 đến 1,3 cm, yếu có những tuyến mịn, bên trong có nhung trắng, Tiểu nhụy 4, chỉ ngắn, vòi nhụy phình ra ở đỉnh, nhẵn, nuốm ngắn, chẻ đôi 2 mảnh

Phân bố: [1], [2] Limnophila aromatica ( đồng nghĩa với Limnophila chinensis var Aromatica) là một cây có hoa vùng nhiệt đới thuộc họ cây mõm chó Scrophulariaceae

Rau om Limnophila aromatica có nguồn gốc ở Đông Nam Á, nơi mà rau om mọc trù phú ở nhiệt độ nóng và phát triển trong môi trường nhiều nước, đặc biệt trong ruộng ngập nước

Rau om ở Việt nam còn gọi là “ Ngò om ” hay “ Ngổ ” được trồng và sử dụng như một thực vật trang trí trong những bồn nuôi cá và là một rau mùi cho món ăn đặc sản miền nam Việt Nam

Limnophila aromatica còn được trồng chung quanh những hồ chứa và những nơi đất ẫm

ướt, trong những vùng như Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc, Nhật, Triều Tiên, Việt Nam, Lào, Philippines, Campuchia, Thái Lan, Australia v v

Ở Việt Nam, loài Limnophila aromatica được phổ biến rộng rãi, chủ yếu trồng trong

những cánh đồng ngập nước

Bộ phận dùng: Dùng toàn cây –Herba Limnophila Aromatica

Thành phần hóa học:Cây Rau Om có chứa tinh dầu ở lá như terpinolene, camphor, myrcene, limonene, caryophyllene, a-pinene, β-farnesene, Sabinene, Linalool v v Các flavonoid: Nevadensin, Isothymusin là các trimethoxyflavone và nhóm 8-oxygenated Các acid hữu cơ: oxalic, methoxybenzoic, valeric acid

b-Các phenolic phức tạp: p-Cymen-8-ol, 5-Nonenol-5-methyl, Triethyl carbinol, v.v

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của Rau Om (Limnophila aromatica) [3]

1 5,7-Dihydroxy-3,6,3',4'-tetramethoxyflavon desmetheyl

2 5,7-Dihydroxy-6,8,4'-trimethoxyflavon (Nevadensin) toàn thân 3 5-Dihydroxy-6,7,8,4'-tetramethoxyflavon (Gardenin) toàn thân 4 Nevadenin-7-O-β-D-glucopyranoside toàn thân

29 Acetic acid, tricyclo [4.4.0.0(3,8)] dec-9-en-4-yl ester tinh dầu

31 α-Humulene/ α-Caryophyllene tinh dầu

34 Trans-Shisool tinh dầu 35 3-Cyclohexene-1-carboxaldehyde tinh dầu

38 1,3-Cyclohexandiene-1-methanol, 4-(1-methylethyl) tinh dầu

42 Demethoxy-ageratochromene tinh dầu

44 12-Oxabicyclo [9.1.0] dodeca-3-7-diene, 1,5,5,8-Tetramethyl tinh dầu 45 2,6,9,9-Tetramethyl, 2,6,10-Cycloundecatriene-1-one tinh dầu

CÔNG THỨC CẤU TẠO

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của các hợp chất trong cây Rau om

Glc=Glucopyranosyl Me=Methyl

Et=Ethyl

Tác dụng dược lý

Rau Om có vị cay, thơm, hơi chát, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, chỉ khái, giải độc, tiêu thủng, trừ viêm, chống sưng, giảm đau, sát trùng đường ruột, đường tiểu, trị ỏi thận, sốt nóng, chống lảo hóa ngừa ung thư v v [1],[2],[7]

Dịch chiết và tinh dầu từ cây Rau Om thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn cao. [10],[11],[12],[13]

Dịch chiết từ cây Rau Om còn có khả năng kháng các tế bào bào ung thư.[11] Nghiên cứu chiết xuất cây Rau Om cho thấy hoạt tính bảo vệ thành mạch máu và đóng vai trò tiềm năng trong việc ngăn ngừa chống lại những rối loạn chức năng mạch máu.[9],[11],[13]

Công dụng [1],[2],[7]

- Trị ho, cảm mạo, viêm họng, viêm amiđan, viêm phổi - Lỵ cấp tính, viêm ruột và dạ dày, viêm đường tiết niệu - Dùng ngoài trị mụn nhọt, ghẻ lở, vết thương giải phẩu, bỏng, rắn độc cắn - Nâng cao cơ chế phòng vệ của cơ thể, thuốc bổ đắng giúp tiêu hóa

- Xương khớp đau nhức, dùng chữa vết thương, tẩm gạc đắp vết thương hoặc làm dịch nhỏ giọt rửa vết thương

1.2 NEVADENSIN Nguồn gốc: Nevadesin là flavonoid có trong một số loài cây như loài Baccharis, loài

Helianthus, loài Iva, loài Limnophila, loài Ocimum, loài Ononis, loài Viguiera v.v Nevadensin được phân lập lần đầu tiên ở loài Iva bởi Farkas và cộng sự [8] Công thức phân tử: C18H16O7

Tên danh pháp theo IUPAC: 5,7-dihydroxy-6,8,4’-trimethoxyflavone Công thức hóa học:

Tính chất: Bột màu vàng kim, dễ tan trong ethanol và một số dung môi hữu cơ

Hoạt tính sinh học: - Khả năng hạ huyết áp: Nghiên cứu ảnh hưởng hạ huyết áp của nevadensin trong mô

hình thử nghiệm trên chó mèo Ở chó và mèo gây mê, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp hoặc intraduodenal của thuốc với liều 2-40 mg / kg trọng lượng cơ thể giảm huyết áp (HA) 64 ± 7 mm Hg, duy trì nhịp tim và hô hấp không thay đổi và dần dần trở lại trạng thái ban đầu của nó trong 2-4 giờ tiếp theo Trong nghiên cứu này, còn cho thấy cơ chế tác dụng hạ huyết áp của Nevadensin dường như là cả trung ương và ngoại vi [3], [4]

- Hoạt tính chống viêm: Nghiên cứu tác dụng chống viêm của Nevadensin trong mô hình

chuột viêm cấp tính và mãn tính.Trong các thử nghiệm, Nevadensin cho thấy ức chế đáng

kể sự viêm sưng ( P <0,001) với liều 75 mg / kg trọng lượng cơ thể trên đường uống [3], [4] - Hoạt tính chống lao: Nevadensin và Isothymusin (6,7-dimetoxy-5, 8 , 4'-

trihydroxyflavone), được phân lập từ những phần trên mặt đất của cây L geoffrayi , tăng sự ức chế đối với Mycobacterium tuberculosis H 37Ra Tuy nhiên, hiệu quả là tương đối

thấp hơn so với các loại thuốc tiêu chuẩn (được sử dụng trong thử nghiệm) rifampicin (MIC 0,003-,0047 mg/ml), isoniazid (MIC 0,025-0,05 mg/ml) và kanamycin sulfate (MIC

1,25-2,5 mg/ml) Nevadensin có hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus bệnh lao ở nồng độ 0,2 mg/ml. [3], [4]

- Hoạt tính chống khối u và kháng ung thư: Nevadensin được đánh giá ức chế đáng kể sự

phát triển của tế bào BEL-7404 và các giá trị T/C [tỷ lệ của số lượng tế bào trong điều trị (T) để điều khiển (C)] đã được xác định là 87,6 %; 80,6% và 34,9% ở liều 1, 10 và 100 mg/ml, tương ứng [3], [4]

Nồng độ khác nhau của các loại thuốc có chứa Nevadensin đã được sử dụng để kiểm tra các hoạt tính gây độc tế bào: Cổ trướng u lympho, các tế bào ung thư biểu mô được nuôi cấy trong khoang màng bụng của chuột bạch tạng Thụy sĩ Nevadensin động ức chế vừa phải chống lại p40 với IC50 giá trị của 50 mg/ml, qua đó thể hiện tiềm năng chống ung thư của nó. [3], [4]

- Hoạt tính kháng khuẩn: Nevadensin cũng đã được tìm thấy có hoạt tính kháng khu [1]ẩn

mạnh đối với các sinh vật thử nghiệm - Escherichia coli và Staphylococcus aureus Nó cho thấy hiệu quả mạnh trên các tế bào E coli bởi lysing trong vòng 4 giờ điều trị, hợp

chất tăng cường hoạt động của fructose bis-phosphatase, một enzyme gluconeogenic ở liều gây chết, trong khi nó làm giảm hoạt động của phosphofructokinase và isocitrate dehydrogenase, các enzyme quan trọng của Embden-Meyerhof-Parnas và chu trình acid tricarboxylic, tương ứng [3], [4]

Hợp chất này cũng ức chế sự phát triển của một loại nấm gây bệnh thực vật, Alternaria solani , nhưng không có khả năng ức chế sự tăng trưởng của nấm men, Candida

albicans MIC của hợp chất cho E coli và A solani được tìm thấy là 200 và 250 mg/ml,

tương ứng [3], [4] - Các hoạt tính khác: khảo sát nevadensinvới cyclooxygenase-1 và 2 (COX-1 và COX-2)

hiệu quả ức chế của nó bằng cách sử dụng các COX xúc tác sinh tổng hợp prostaglandin trong phương pháp thử in-vitro Hợp chất này được tìm thấy có hoạt tính ức chế trung bình so với COX-1 và hoạt tính yếu so với COX-2 với sự ức chế tương ứng phần trăm 7,37 % và 0,65% cả ở liều 10 μM Ngoài ra, các thí nghiệm dược lý cho thấy nevadensin có khả năng làm tan đờm và chống ho. [3], [4]

- Tương tác Nevadensin với Lysozym Enzyme: Lysozym, một enzyme nhỏ còn được gọi

là muramidase hoặc N -acetylmuramide glycanhydrolase, bảo vệ chúng ta khỏi các mối

nguy hiểm nhiễm vi khuẩn bằng cách làm tổn hại tế bào vi khuẩn Thí nghiệm về sự tương tác giữa nevadensin và lysozyme

Sử dụng kỹ thuật quang phổ huỳnh quang, đồng bộ huỳnh quang, lưỡng sắc (CD) và sự

hấp thụ tia cực tím Từ nghiên cứu cho thấy nevadensin làm giảm hoạt động của men, hơn nữa Nevadensin liên kết với lysozyme đã không ảnh hưởng đến cấu tạo phân tử của enzyme. [3], [4] Dược động học của Nevadensin: Nghiên cứu các đặc điểm dược động học của

Nevadensin trong mô hình động vật bao gồm chuột, chó và khỉ Thuốc được đưa vào

thông qua cả hai đường tĩnh mạch ( iv) và dạ dày ( ig) cho thấy nồng độ Nevadensin trong

huyết tương của các loài động vật là tối đa và được bài tiết qua nước tiểu ước tính là triệt để Các nhà nghiên cứu quan sát được từ phân tích động học thì Nevadensin được hấp thu tương đối nhanh chóng và được loại bỏ khá nhanh chóng qua bài tiết [3], [4]

1.3 TÌNH HÌNH TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC Trong nước

Năm 2001[14]: Vũ Mỹ Linh và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần và hoạt tính kháng khuẩn từ tinh dầu cây Rau Om bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Năm 2002[15]: Vũ Mỹ Linh và các cộng sự khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cây Rau Om bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS)

Năm 2004[16]: Vũ Mỹ Linh và các cộng sự chiết tách và cô lập 3 flavonoid:

Nevadensin, Gardenin B và Nevadensin 7-O-β-glucopyranoside ở phân đoạn benzen

và dicloromethan (2 loại dung môi độc hại được khuyến cáo không sử dụng) trong cao chiết cây Rau Om bằng phương pháp sắc ký cột

Năm 2005[17]: Vũ Mỹ Linh và các cộng sự xác định thành phần hóa học và hoạt tính dược lý của cây Rau Om

Ngoài nước

Năm 1966[8]: Farkas và cộng sự lần đầu tiên phân lập được hợp chất Nevadensin từ

loài Iva bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển

Năm 2002[18]: Tucker AO và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần hợp chất dễ

bay hơi trong tinh dầu của thân và lá từ cây Limnophila aromatica bằng phương pháp sắc

ký khí ghép khối phổ (GC-MS) và là công bố đầu tiên về sự hiện diện của trans và caranone trong tinh dầu tự nhiên

cis-4-Năm 2004[10]: Sribusarakum A, Bunyapraphatsara N, Vajragupta O, Watanabe H đã khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết methanol, tinh dầu và 2 hợp chất

(Eugenol và γ-terpinen) trong cây Limnophila aromatica kết quả cho thấy hoạt tính ức

chế gốc tự do DPPH của dịch chiết methanol cao hơn tinh dầu, hợp chất Eugenol và terpinen

γ-Năm 2009[11]: Nanasombat S, Teckchuen N ở Thái Lan đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng ung thư của một số loại rau

trồng địa phương trong đó có cây Limnophila aromatica Kết quả cho thấy dịch chiết

methanol của các loài rau trồng có hoạt tính chống oxy hóa cao, kháng được nhiều

Năm 2010[19] : Bhuiyan MNI, Akter F, Chowdhury JU, Begum J Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) nhóm nghiên cứu đã xác định thành

phần hóa học trong tinh dầu từ phần trên mặt đất của cây Limnophila aromatica Kết quả cho thấy tinh dầu cây Limnophila aromatica giàu Z-ocimene (39,21%),

terpinolene (17,24%) và long não (12,89%) Năm 2011 [20] : Nhóm tác giả Chowdhury JU, Bhuiyan MNI, Begum J tiến hành

nghiên cứu thành phần dễ bay hơi từ cây Limnophila aromatica bằng phương pháp

sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Năm 2012[12]: Rattanasena và Paweena ở Pakistan đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của một số loại cây rau quả phổ biến ở Thái Lan Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của dịch

chiết ethanol 80% từ cây Limnophila aromatica có hoạt tính chống oxy hóa và hàm

lượng phenolic tổng cao, nó còn kháng được một số chủng vi khuẩn như

Staphylococcus aureus, Straphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes và Propionibacterium acnes Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng các

loại rau trồng như một loại thảo dược để chữa bệnh Năm 2014[13]: Nhóm nghiên cứu Do QD, Angkawijaya AE và các cộng sự đã khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi chiết đến tổng hàm hàm lượng phenolic, tổng hàm

lượng flavonid và hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết Limnophila aromatica

Trong nghiên cứu nhóm tác giả khảo sát tỷ lệ nước và nồng độ khác nhau (50%, 75% và 100%) của methanol, ethanol, acetone đã được sử dụng làm dung môi chiết

xuất cây L aromatica Các hoạt tính chống oxy hóa, tổng hàm lượng phenolic và tổng hàm lượng flavonoid trong cao chiết đông khô từ cây L aromatica đã được

nghiên cứu cho thấy chiết xuất thu được bằng dung môi ethanol 100% có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, tổng phenolic cao nhất và có nhiều flavonoid có hoạt tính sinh học nhất

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Toàn cây Rau Om (Limnophila aromatica) thu hoạch vào tháng 3 tại tỉnh Lâm Đồng

Rửa sạch, cắt nhỏ khoảng 1 cm, để khô nơi bóng râm khoảng 5 ngày sau đó cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 40 ºC trong 1 ngày Nguyên liệu khô được xay nhuyễn thành bột nguyên liệu

2.2 Dung môi hóa chất

- Dung môi dùng trong chiết xuất và phân lập: n-hexan, ethyl acetate, chlorofrom,

cồn tuyệt đối, nước cất, acid phosphoric, acid hydrocloric, acid formic đạt tiêu chuẩn phân tích (PA)

- Dung môi sắc ký lỏng (HPLC): methanol, acetonitrile - Silica gel 60 (40 – 60 µm; Grace)

- Bản mỏng Silica gel F254 (dày 0,25 mm, Merck) tráng sẵn - Thuốc thử: FeCl3 10%/methanol

- Chất đối chiếu: Nevadensin của công ty Shanghai TAUTO Biotechco.Ltd China; Lô; E-0498-12092823; Hàm lượng ≥ 98,0%

2.3 Thiết bị

- Đèn soi UV Camag - Bể siêu âm Hwashin - Bể cách thủy Memmert WNB10 - Tủ sấy Binder

- Cân sấy ẩm hồng ngoại Mettler LJ 16 - Cân phân tích Mettler Toledo (5 số lẻ) - Máy sắc ký lỏng điều chế Shimadzu - Máy quang phổ hồng ngoại Nicolet 760 - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu UFLC 20A, đầu dò PDA - Máy sắc ký lỏng LC/MS IT-TOF Shimadzu

- Cột sắc ký Gemini NX 5u C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

- Các dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thí nghiệm như bình định mức, bình nón, pipet, ống đong, màng lọc milipore 0,45 µm, giấy lọc

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Xác định hàm lượng nước của nguyên liệu theo công thức

X(%) = (mt - ms)/mt*100

2.4.3 Khảo sát điều kiện sắc ký HPLC

Tham khảo tài liệu và các dữ liệu trong quá trình thực nghiệm liên quan chất chuẩn để đưa ra điều kiện sắc ký cơ bản ban đầu của qui trình định lượng như:

- Cột sắc ký - Bước sóng phát hiện - Tỷ lệ pha động - Tốc độ dòng - Thể tích tiêm mẫu - Dung môi pha mẫu Từ điều kiện này sẽ tiến hành khảo sát thời gian chiết, các điều kiện sắc ký (về cột và chương trình dung môi) từ đó đưa ra qui trình định lượng Nevadensin phù hợp cho chế phẩm cao chiết được

2.4.4 Khảo sát điều kiện chiết cao

- Rau om tươi, rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ngoài không khí, sau đó sấy khô ở 40 0C trong 1 ngày, cắt nhỏ, xay nhuyễn đến mịn, tỉ lệ dược liệu – dung môi (1:100 g/ml) - Xác định hàm lượng Nevadensin trong các sản phẩm chiết xuất bằng phương pháp

HPLC, chọn dịch chiết có hàm lượng Nevadensin cao nhất Sau khi chọn được cách

tách và phân lập Nevadensin thành nguyên liệu cho các nhiên cứu về sau Khảo sát tiếp điều kiện sắc ký, đưa ra qui trình định lượng và thẩm định qui trình phân tích nevadensin trong cao chiết

2.4.4.1 Khảo sát dung môi chiết

Tách các hợp chất hữu cơ thành các nhóm khác nhau dựa vào độ hòa tan khác nhau của các hợp chất trong các dung môi hữu cơ có tính phân cực khác nhau

- Các dung môi được chọn khảo sát là dung môi có độ phân cực tăng dần; n-hexan, ethylacetat, 2-propanol, ethanol, nước

- Gửi đo tổng hàm lượng phenolic,hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết

- Lựa chọn dung môi: để cao chiêt có thể sử dụng tốt trong sản xuất, dung môi chiết

xuất đòi hỏi phải có hiệu suất chiết xuất cao, rẻ tiền, dễ tìm, không ảnh hưởng đến người sản xuất cũng như môi trường làm việc như ethanol – nước ở tỉ lệ khác nhau

2.4.4.2 Khảo sát phương pháp chiết Khảo sát mẫu ở điều kiện với 2 phương pháp

- Phương pháp 1: Chiết ngâm dầm dược liệu trong dung môi trong nhiều giờ ở nhiệt độ

phòng

- Phương pháp 2: Chiết ngâm dầm dược liệu trong dung môi ở nhiệt độ phòng, sau đó

siêu âm hỗn hợp

2.4.4.3 Khảo sát thời gian chiết

- Khảo sát thời gian ngâm dầm - Khảo sát thời gian siêu âm

2.4.5 Khảo sát thành phần hóa học cao chiết được bằng phương pháp LC-MS

Điều kiện khảo sát

- Phương pháp HPLC- MS/ IT-TOF, với điều kiện khảo sát như sau:

 Cột: C18 (250 x 4,6 mm; 5µm)

 Chế độ Negative và positive

 Tốc độ dòng khí: 10,0 L/phút, nhiệt độ: 250 ºC

2.4.6 Phân lập và tinh khiết hóa 2.4.6.1 Phân lập chất Nevadensin

- Gộp các phân đoạn có Nevadensin khi so sánh vết Rf với chất định tính Nevadensin, tiến hành sắc ký cột silica gel lần 2 với hệ dung môi n-hexan – cloroform, thu được Nevadensin và hỗn hợp có chứa Nevadensin thô

- Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế Kanuer – Merck, cột Phenomenex (250 mm x 210 mm, 5 μm) thu được hợp chất tinh khiết

b Sắc ký lớp mỏng

Điều kiện khảo sát [3]

- Bản mỏng Silica gel F254 (dày 0,25 mm, Merk) tráng sẵn - Pha động: Ethyl acetat – cloroform (5:1)

- Triển khai theo chiều đứng khoảng 10 cm - Phát hiện: UV 254 nm và 366 nm

c Sắc ký lỏng điều chế

Điều kiện khảo sát Dịch chiết thô trong phần sắc ký cột (chưa tách được hoàn toàn chất cần tìm) Chọn điều kiện sắc ký thích hợp để tách chất cần tìm một cách rõ ràng và triệt để hơn

- Cột C18: Phenomenex, Silic (250 mm x 210 mm, 5 m) - Detector: PDA, bước sóng phát hiện 284nm; 370nm và 420 nm - Nhiệt độ cột: 30 oC

- Thể tích tiêm mẫu: 1000 l - Tốc độ dòng: 10,0 ml/phút - Pha động: n-hexan – ethyl acetat, theo chương trình dung môi

d Tinh khiết hóa chất phân lập

Tiến hành sắc ký, lấy phân đoạn cần lấy, bay hơi dung môi, thu được sản phẩm Phân đoạn được cô thu hồi dung môi đến cắn, hòa tan hoàn toàn cắn trong lượng vừa đủ dung môi kết tinh, lọc qua phễu thủy tinh xốp

Dịch lọc được tiến hành bay hơi và kết tinh lạnh ở nhiệt độ 5ºC Lọc và rửa tinh thể bằng dung môi thích hợp đã được làm lạnh

2.4.7 Định danh chất nevadensin 2.4.7.1 Phương pháp phổ IR

Phổ hồng ngoại thường được ghi với biểu diển T% và giá trị giảm dần của số sóng (4000 – 400 cm-1) vì hầu hết các nhóm nguyên tử hấp thu trong vùng 4000 – 650 cm-1

Từ tần số hấp thu của các vân phổ cho phép kết luận sự có mặt của các nhóm chức trong phân tử, góp phần xác định cấu trúc phân tử của các chất nghiên cứu

Tiến hành đo phổ IR trong khoảng số sóng từ 4000 cm-1 -400 cm-1 của chất nghiên cứu: so sánh với phổ trong thư viện phổ chuẩn (nếu có) hoặc so sánh với phổ chất chuẩn đối chiếu hoặc phổ chuẩn từ tài liệu

2.4.7.2 Phương pháp quang phổ UV-VIS

Phổ tử ngoại và khả kiến liên quan chặt chẽ đến cấu tạo, nối đôi liên hợp và vòng thơm Được ứng dụng rộng rãi

Vùng sóng: tử ngoại (UV) 200 – 400 nm

Khả kiến (VIS) 400 – 800 nm Phương pháp phổ tử ngoại và khả kiến có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích định tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng

Ưu điểm của phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến trong phân tích định lượng là có độ nhạy cao, có thể phát hiện được một lượng nhỏ chất hữu cơ hoặc ion vô cơ trong dung dịch, sai số tương đối nhỏ (chỉ 1 đến 3%)

Tiến hành quét phổ UV-VIS của hợp chất nghiên cứu ghi nhận phổ UV-VIS so sánh với phổ UV-VIS của chất chất chuẩn hoặc phổ chuẩn từ tài liệu

Sự phân hoá phân tử các hợp chất hữu cơ qua sự va chạm với e thường xảy ra theo những quy luật nhất định, dựa vào những quy luật ta có thể giải thích được cấu tạo các hợp chất hữu cơ

Sử dụng thiết bị HPLC Shimadzu- MS/ IT-TOF, với điều kiện khảo sát như sau:

 Chế độ Negative và positive

 Tốc độ dòng khí: 10,0 L/phút, nhiệt độ: 250 ºC

 m/z: 50 - 750 Ghi nhận phổ MS của hợp chất nghiên cứu so sánh với phổ MS chuẩn từ tài liệu

2.4.8 Xác định độ tinh khiết

Theo định nghĩa của FDA hướng dẫn soạn tài liệu để đăng ký sản xuất chất chuẩn: "Chuẩn đối chiếu (reference standard) là một lô hay mẻ của hợp chất làm thuốc được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập hoặc bằng cách tinh chế bổ sung của nguyên liệu sản xuất và được chứng minh bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác nhận nó là nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa có thể đạt được một cách hợp lý Nó thường được dùng cho việc phân giải cấu trúc và chất làm chuẩn (benchmark) cho các chuẩn làm việc"

Chất đối chiếu chiết từ dược liệu có hàm lượng phải lớn hơn 95,0 %, thường dùng

trong xác định cấu trúc, chất đánh dấu trong sắc ký đồ vân tay Tiến hành xác định độ tinh khiết sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phương pháp HPLC bằng các điều kiện đã khảo sát ở phần trên

2.4.9 Thẩm định quy trình định lượng Nevadensin

Thẩm định phương pháp phân tích là quá trình tiến hành thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích

Các yêu cầu thẩm định phương pháp theo quy định của ASEAN [21]

Loại quy trình phân tích Định tính Định lượng

thời mẫu trắng phải không có đỉnh trùng với đỉnh chất cần định lượng - Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích của mẫu thử diện tích của chất

cần định lượng phải tăng lên so với trước khi thêm - Phổ UV của đỉnh chính trong các dung dịch thử phải giống dung dịch chuẩn

Tiến hành định lượng 6 lần mẫu thử

Từ sắc ký đồ của dung dịch chuẩn nevadensin và dung dịch cao chiết, tính hàm lượng Nevadensin có trong cao chiết

CC : nồng độ Nevadensin trong dung dịch chuẩn Ct : nồng độ Nevadensin trong dung dịch chuẩn

Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% Yêu cầu: RSD% ≤ 2%

Độ đúng

Thêm một lượng chất chuẩn với mức 80%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng vào mẫu thử đã biết trước hàm lượng chất cần định lượng Thực hiện mỗi nồng độ 3 mẫu Xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử Tính % tỷ lệ phục hồi

Yêu cầu: Tỉ lệ phục hồi trung bình của tất cả các nồng độ từ 95% – 105%

III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xác định độ ẩm

Bột nguyên liệu được xay nhuyễn cho vào đĩa nhôm, cân khối lượng mẫu trước khi sấy Sấy nguyên liệu ở 60°C, đến khối lượng không đổi

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả xác định Độ ẩm

Stt Hàm lượng nước

(%)

1 2 3

TB RSD%

3,46 3,45 3,51

3,47 0,93

Nhận xét: Độ ẩm là 3,47% < 10% đạt yêu cầu về độ ẩm

3.2 Khảo sát điều kiện HPLC

- Xác định hàm lượng nevadensin trong các sản phẩm chiết xuất bằng phương pháp HPLC khảo sát từ cetification của chuẩn đối chiếu Nevadensin:

Máy sắc ký lỏng Shimadzu LC-20AD, đầu dò chuỗi diod quang SPD-M20A Cột: Phenomenex ODS (250 x 4,6mm; 5 μm)

Tốc độ dòng: 1,0ml/phút Thể tích tiêm: 5 μl Bước sóng phát hiện: 360 nm Pha động: A: dung dịch H3PO4 0,5%; B: Actonitril Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5g bột nguyên liệu, thêm chính xác 50 ml ethanol 96%, siêu âm 15 phút

3.3.1 Khảo sát cột

Tiến hành khảo sát trên 2 loại cột khác nhau với điều kiện sắc ký theo mục 3.2.5 :

- Cột C18 (250 mm): Phenomenex ODS (250 mm x 4,6 mm - 5 m) - Cột C18 (150 mm): Phenomenex ODS (150 mm x 4,6 mm - 5 m)

Kết quả được trình bày ở Hình 3.1 và Bảng 3.2

Cột C18 (150 mm) 18,487 8,407 1,332 0,92705

Cột C18 (250 mm) 20,472 10,707 1,820 1,00000

Nhận xét: qua khảo sát nhận thấy có sự khác nhau về khả năng tách của Nevadensin trên 2

loại cột khác nhau Cột C18 (250 mm) cho kết quả tách tốt, các thông số sắc ký đạt yêu cầu phân tích định lượng (Rs>1,5 và Impurity >0,99)

Vậy chọn cột C18 Phenomenex ODS (250 mm x 4,6 mm - 5 m) để tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác

3.3.2 Khảo sát chương trình dung môi

Tiến hành theo điều kiện sắc ký ở mục 3.2.1 với cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5µm) và

chương trình dung môi thay đổi theo Bảng 3.3

Bảng 3.3 Các chương trình dung môi khảo sát

Chương trình Thời gian (phút)

Tỷ lệ dung môi Methanol Acid phosphoric 0,5%

Chương trình 1

0 20 25 30 35

25 95 95 25 25

75 5 5 75 75

Chương trình 2

0 15 20 25 30

45 95 95 45 45

55 5 5 55 55

Chương trình 3

0 10 15 20 25

45 95 95 45 45

55 5 5 55 55

Chương trình 4

0 10 15 20 25

55 95 95 55 55

45 5 5 45 45

Chương

Chương trình 1

Chương trình 2

Chương trình 3

Chương

Chương trình 4

Hình 3.2 Sắc ký đồ HPLC mẫu thử khảo sát chương trình dung môi

Bảng 3.4 Các thông số sắc ký trong quá trình khảo sát chương trình dung môi

Chương trình Độ phân giải

Chương trình 1 Chương trình 2 Chương trình 3 Chương trình 4

10,668 9,812 6,333 6,766

1,620 1,980 0,964 0,978

Nhận xét: từ kết quả khảo sát của 4 chương trình dung môi nhận thấy chương trình dung

môi 2 cho các thông số sắc ký tốt và đạt yêu cầu phân tích định lượng đối với mẫu dược liệu Vậy chương trình dung môi 2 được chọn để định lượng Nevadensin trong cao Rau Om

3.3.3 Khảo sát bước sóng phát hiện

Tiến hành khảo sát theo mục 3.2.1 với chương trình dung môi 2 đã chọn ở mục 3.2.2,

Thay đổi bước sóng phát hiện

Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC mẫu thử khảo sát bước sóng phát hiện

UV 332 nm UV 284 nm