Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Chiết xuất, phân lập Epigallocatechin gallat từ lá trà xanh (Camellia sinensis L.) làm chất đối chiếu

Thiết lập các chất cô lập được thành chất đối chiếu theo hướng dẫn ASEAN — WHO và theo ISO13528 Khảo sát nhóm hợp chất catechin trong một số sản phẩm trên thị trường có thànhphân chiết x

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ran Bese

p

- \

HÙYNH THỊ NGỌC DUNG

CHIẾT XUẤT, PHAN LẬP EPIGALLOCATECHIN GALLATE

TỪ TRÀ XANH (Camellia sinensis L.)

LAM CHAT DOI CHIEU

Chuyén nganh: CONG NGHE HOA HOCMã số: 605275

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHI MINH, tháng 08 năm 2014

Công trình được hoàn thành tại: Viện Kiếm Nghiệm Thuốc TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa hoc: TS DS Hà Diệu Ly -.- <<:Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thành Quân

Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS Nguyễn Thị Lan Cán bộ cham nhận xét 2 : TS Bạch Long Giang - - .-< :

Phi . -Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG Tp HCMngày 20 tháng 08 năm 2014

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

I.PGS TS Phạm Thành Quân

2.TS Nguyễn Thị Lan Phi

3 TS Bạch Long Giang4 TS Lê Thành Dũng

5 TS Lê Xuân TiénXác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

TS Lê Thành Dũng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMPHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc Lập — Tự Do - Hạnh Phúc

Tp.HCM,ngay tháng OS năm 2014

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: HÙYNH THỊ NGỌC DUNG

Ngày thang năm sinh: 17/11/1986

Chuyén nganh : CONG NGHE HUU CO MSHV : 120501441 TEN DE TAI

Chiết xuất, phân lập Epigallocatechin gallat từ lá trà xanh (Camellia sinensisL.) làm chất đối chiều

2 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

Lựa chọn phương pháp chiết xuất epigallocatechin gallat có độ tinh khiết cao phùhợp điều kiện phòng thí nghiệm

Phân lập EGCG và (+/-) catechin bằng sắc ký cột silica gel và Sephadex LH-20kết hợp với sắc ký lỏng điều chế

Thiết lập các chất cô lập được thành chất đối chiếu theo hướng dẫn ASEAN —

WHO và theo ISO13528

Khảo sát nhóm hợp chất catechin trong một số sản phẩm trên thị trường có thànhphân chiết xuất từ trà xanh

3 NGÀY GIAO NHIỆM VU: 06/20134 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 06/2014

5 HO VA TEN CAN BỘ HUONG DAN: TS.DS.Hà Diệu Ly, PGS.TS Phạm Thanh

Quan

Tp.HCM, ngay thang nam 2014

CAN BO HUONG DAN CHU NHIỆM BO MON ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA

Lời cảm ơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hà Diệu Ly, cô hướng dan đã cho tôi ý

tuong, động lực và giúp do tận tình trong nghiên cứu, xin cam ơn PGS.TS Phạm

Thành Quân, thay đã giúp tôi giải đáp các van dé phát sinh trong nghiên cứu, cácthay cô trong hội động bảo vệ đã có những nhận xét quý báu cho các kết quả

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị trong khoa Thiết Lập Chất Chuẩn& Chất Đối Chiếu — Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM đã tạo điều kiện, hết lòngung hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên hỗ trợ tôi hoàn thành luận văn

TÓM TATTrong luận văn nay, lá trà thuộc giống LD 97 được dùng làm nguyên liệu cho quátrình chiết xuất, phân lập acid gallic, EGCG, catechin Quá trình chiết xuất, phân lậpđược thực hiện theo phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm Kết quả đạt được như

thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường

ABSTRACTIn the thesis, the leaves of LD 97 tea collected from Lam Dong Provin wreextractd isolated EGCG, catechins, gallic acid Experiments were carried outprocedure of ultrasonic-assisted extraction method for extracting polyphenols fromfresh tea leaves The results were shown: Isolated EGCG, catechins, gallic acid fromgreen tea extraction method by supports ultrasonic Define the structure of EGCG,gallic acid, catechins by infrared, ultraviolet and nuclear magnetic resonancespectroscopic The purity of three substances were determined more than 95 % byhigh performance liquid chromatography The EGCG, catechins were evaluated theirpurity foe establishment reference standard according ISO 13528 guide Identificationand quantification EGCG, catechins from the finish product containing green teaextracts in market diertary supplements

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là côngtrình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong

luận văn là trung thực và chưa

từng được công bố trong bất kì

công trình nào khác.Huỳnh Thị Ngọc Dung

DANH SÁCH TỪ VIET TAT

EC: (-) —epicatechinEGC: (-) —epicatechin galltEGCG: (-)— epigallocatechin galltGC: (+)— gallocatechin

HPLC: High Performance Liquid Chromatography — sắc ký lỏng hiệu năng cao

ODS: Octadecylsilan — cột C18

TPCN: Thực phẩm chức nang

NMR: Nuclear Magnetic Resonance — cộng hưởng từ hạt nhân

IR: Infrared — hồng ngoại

WHO: World Health OrganizationISO/IEC: International Organization for Standardization/ InternationalElectrotechnical Commission

DĐVN: Dược Điền Việt NamSKLM: Sac ký lớp mỏng

Hình 1.1:Hình 1.2:Hình 1.3:Hình 3.1:Hình 3.2:Hình 3.3:Hình 3.4:Hình 3.5:Hình 3.6:Hình 3.7:Hình 3.8:Hình 3.9:Hình 3.10:Hình 3.11:Hình 3.12:Hình 3.13:Hình 3.14:Hình 3.15:Hình 3.16:

DANH MỤC HÌNH

Cau tạo của acid gallicCau tạo khung cơ bản của hợp chất catechinCau tạo các chất trong catechin

Phố UV của (X2.1) - EGCGCông thức cau tạo của EGCGPho UV của (X1.1) — catechinCông thức cau tạo của catechinPhố UV của (X1.2) — acid gallicCông thức cau tạo của acid gallicSắc ký đồ của (X2.1) - EGCGSac ký đỗ của (X1.2) — acid gallicSắc ký đồ của (X1.1) — catechin

Đồ thị biểu diễn sự uyén tính của EGCGĐồ thị biểu diễn sự uyễn tínhcủa catechinChiết xuất từ trà xanh và thực phẩm chức năngSac ký đỗ của hỗn hợp chuẩn

Sắc ký đồ của mẫu thử (a)Sắc ký đồ của mẫu thử (b)Sắc ký đồ của mẫu thử (c)

DANH MỤC BANGBảng 1.1: Thành phần hóa học có trong lá trà

Bảng 2.1: Các tiêu chuẩn và phương pháp đánh giá chất đối chiếu EGCG va (+/-)

catechin.Bảng 3.1: Hiệu quả trích ly của các phương pháp

Bang 3.2: Dữ liệu pho !H — NMR (500 MHz) và °C — NMR (125 MHz) của EGCGtrong aceton d-6 (trị số trong ngoặc là J tính bang Hz)

Bang 3.3: Số liệu pho !H(500 MHz) va '3C — NMR (125 MHz) của catechin trong

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của EGCGBảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng của catechinBảng 3.12: Kết quả khảo sát độ thô

Bảng 3.13: Kết quả đánh giá các chế phẩmBảng 3.14: Kết quả xác định % độ tinh khiết liên phòng

Bảng 3.16: Kết quả xác định % độ tinh khiết liên phòng của (+/-) catechinBảng 3.17: Kết quả đánh giá liên phòng thí nghiệm của (+/-) catechin theo AnovaBang 3.18: Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng EGCG

Bảng 3.19: Kết qua tính giá tri ân định hàm lượng (+/-) catechinBảng 3.20: Kết quả tính tương thích hệ thống của (+/- ) catechinBảng 3.21: Kết quả tính tương thích hệ thống của EGCG

Bảng 3.22: Kết quả tỷ lệ phục hồi của (+/-) catechin và EGCG.Bảng 3.23: Kết quả hàm lượng EGCG va (+/-) catechin có trong mẫu thử

MỤC LỤC

ĐẶT VAN DE «s42 H.HHH HH HH H.27 07.10 078077000799 07.0 070900749 8700749276021 271 090p pops 1CHƯƠNG 1: TONG QUANN < es2s 2242 E707 2780071480704 E074 B27E0744020 020174 pnpsetr 31.1 61u8in[i091 02-01172777 -:1iiS 3Pa 31.3 Thanh phan hóa học có trong lá trà — các tính chất được lý -. - + 25+ 2+s+£+zs+xzx>scsd 41.3.1 (0s h.- 4 51.3.2 Nhóm hợp chất catechin - ¿5-56 SE SxSEEE2E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEETEErkrrrrkrkrrrrees 61.3.3 Epigallocatechin øalÏaf - - c1 11310111113 3011111 nu HH kh 914 Tình hình nghiên cứu trong TƯỚC - - <5 5 <3 19900 900 Họ nh vớ 91.5 Tổng quan chung về chất chuẩn . ¿- + 26 52292 SE2E9E£EE‡E£EE£E£EEEEEEEEEEEEESEEEErkererrrree 101.5.1 6:0: 0 số 101.5.2 Phân LOAM - - - + + c EEE22026 111010101011 11180 111 1vY KH kg kế 111.5.2.1 Chất chuẩn dược điỂn + tt HH HH HH hà nh hi 111.5.2.2 Các loại chuẩn khác - St c k1 SE K1 S1 SE S HH TT TK TT HT TH TT HH 111.5.2.3 Mục đích sử dụng chất chuẩn - :-c- Sc St SE SE SE ExKEE SE S SH TS KH TH HT TT 121.53 Sơ lược về bộ tiêu chuẩn ISO Guide + tt tt tt ghe 121.5.4 Một số chất chuẩn phain lap tir duc LGU 03 ố 13

CHUONG 2: DOI TƯỢNG VA PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU -5- 2 5-2 se <se=sesee 14

2.1 Đối tượng nghiên CỨU - ¿55% SE SE2E9EEEE9EEEEEEEE 1212121211 11211121 111121111115 11 111111 re 142.2 Phương pháp nghiÊn CỨU G1 1019010 Họ TT TT tre 152.2.1 Chiết xuất cu th nh HH HH Hàn nành nhàn gà 152.2.2 Phân lập, tỉnh chế -¿- 5S SS2E2 SE 2EEEEEEEEE2EEEE1EE111211E11111.1E11T.1 1.1 162.2.3 Xác định cấu trúc -cttt che 162.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn, thẩm định phương pháp đánh giá chất đối chiếu 162.2.5 Thiết lập chất đối chiếu ¿5-5252 22x EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEETEEETkrrrrkrrrrrke 18

CHƯƠNG 3: KET QUÁ NGHIÊN CỨU 2 s°°s°° + +4e©SE24e©2224e9294402940 020410 00448P 20

Sẽ» 5ô." 203.2 Phân lẬp Q LH TH Thọ Họ Họ Thọ ke 21

3.3 — Xác định cấu trÚC - LH 1111 1111511111111 11 1111811111111 11 1111111 1111111111111 11g 213.4 Khảo sát độ tinh khiết của chế pham o.c.ccccccccsccscssesssecsssesessescsscsessscscsscsesessescsesscsesescsceseseseseeess 293.5 Thắm định phương pháp - 5- ¿6 9522 SS2E 9E 12192121215 1121111 1111210111 011.1111 111111 313.5.1 Tính tương thích hệ thong c.cccccescsssscessseseesssesessseesssssssssseeessssesssseesesssessssseessssseeeseeeseseaen 313.5.2 Tính đặc hiệu của phương pháp - 5 111 SH SH HH HH 323.5.3 Độ tuyến tính, hệ số tương quan r, phương trình hồi quy - ¿5552 5s+s+cscszxcszs2 323.5.4 Độ đúng phương pháp - - - - - << 6 - + 11+ 1* 111 SH HH KH HH HH 353.5.5 Độ thô Ă.S tHx ST HH1 1111111211111 1111111111111 11 373.6 Đánh giá chất đối chiếu - ¿6-52 SE S S2 E231 12192121111 1121111 1111210111011 1111 11111 gxe 383.7 Thiét 1p chat 808 6 -:ÖŒ1ố 393.7.1 800115801 070070ẺẼ7Ẽ78 393.7.2 Xác định giá trị ấn định - Đánh giá chất chuẩn - ¿5-55 525*S++xvEvrxzxrrrxrrrrxrrrrees 393.8 _ Ứng dụng phương pháp phân tích và chất đối chiếu để khảo sát một số sản phẩm có chứa chiếtxuất trà xanh trên thị tTƯỜIg - -¿- - ¿ SE SE St SE2E9EE 119212135 121112111 11211111 1111111111111 111111 re 43

CHƯƠNG 4: KET LUẬN VÀ DE NGHỊ e << s£ 5£ 52% 4 ESEs E2 E5 E555 6 56225595 se22E 48

ẽ.‹ nh 48

/V.\8019089:7)/8.4.7 (00707577 50

ĐẶT VAN DE

Trà là thức uống có truyền thống từ lâu đời trong nhiều nên văn hóa trên thế giới(Trung Quốc, Nhật Ban, ) Ngày nay, các nhà nghiên cứu khoa học đã chứng minhtrong trà có nhiều thành phần có lợi cho sức khỏe như các hợp chất polyphenol đặc

biệt là nhóm catechins (epicatechin, epigallocatechin, epigallogatechin gallat, ) là

những chất chống oxy hóa cao (gấp 100 lần so với acid ascorbic) Ngoài ra,epigallocatechin gallat được nhiều công trình nghiên cứu công bố về khả năng kìmhãm sự phát triển của các tế bào ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phôi

[12],[15],[16],[17],[18]Acid gallic là một acid hữu co thuộc nhóm acid trihydroxybenzoic có trong lá tra

và nhiều loai thực vật khác, nó có thé ở dạng tự do hay ở dạng một phan cua tannin.Acid gallic có tinh kháng khuẩn, kháng nam, nó cũng là chat chống oxy hóa và có khanăng kháng tế bào ung thu ma không làm tốn hại đến các tế bào lành Đặc điểm chiếtxuất thiên nhiên và an tòan vì vậy ứng dụng được quan tâm nhiều nhất của nhóm hợpchất này là khả năng chống oxy hóa nên được sử dụng nhiều trong lãnh vực thựcphẩm và mỹ phẩm [9]

Các dé tài nghiên cứu trước đây [3].|4].[5].I6] đều khảo sát các phương pháp tốiưu để trích ly epigallocatechin gallat từ trà xanh và khảo sát họat tính của cao thônhưng chưa tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết cao để phù hợp làm chuẩn đối chiếuchiết từ được liệu Hiện nay, phan lớn chất chuẩn đang sử dụng trong nước chủ yếuphải nhập từ nước ngoài (chuẩn USP, Chromadex, Wako Pure Chemicals ) với giáthành cao và thổi gian đặt hàng kéo dài vài tuần đến vài tháng Trong khi đó ở ViệtNam, bên cạnh hệ thống chất chuẩn do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương vàViện Kiểm Ngiệm Thuốc TP.HCM thiết lap, một số cơ sở khoa học cũng được phânlập được chất chuẩn từ được liệu nhưng việc sử dụng còn hạn chế trong phạm vi cơ sởvà chưa được thâm định đủ Vì vậy cần phải xây dựng hệ thống chất chuẩn với chấtlượng cao hơn để có thể áp dụng rộng rãi trong phạm vi cả nước, giúp tiết kiệm chỉ

phí, thời gian mua chuẩn từ nước ngoài nhưng vẫn đảm bảo kết quả kiểm nghiệmđáng tin cậy và hiệu quả để làm cơ sở kiểm tra chất lượng chế phẩm đông dược vàthực phẩm chức năng.

Xuất phát từ thực tế đó, trên cơ sở tham khảo tài liệu kết hợp các điều kiện thựcnghiệm, trong luận văn nay chúng tôi chiết xuất cô lập, tinh chế và thiết lập chất đốichiếu epigallocatechin gallat, catechin, gallic acid nhăm cung cấp chất đối chiếu đạtyêu cầu phục vụ cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm có trà xanh lưu hành trên thị

trường.

CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về trà [1],[6].[7]

Tên khoa học: Camellia sinensis (L.) O.Kuntze

Trà thuộc lớp Ngọc lan (hai lá mam) Magnoliopsida, bộ Tra Theales, ho TraTheaceae, chi Tra Camellia (Thea.) Cây trà sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉcó một thân chính, chia làm 3 loại: thân 26, than bui, than nho (ban gỗ) Cành trà domam sinh dưỡng phát trién thành, trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài biến đổi nhiềutừ 1 — 10cm Đốt trà càng dài là biểu hiện của giống trà có năng suất cao Lá trà mọccách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng và kích thước thay đổi tùy giống Lá tracó gần rất rõ, rìa lá có răng cưa Búp trà là giai đoạn non của một cành trà, được hìnhthành từ các mầm dinh dưỡng, gdm có tôm (phan lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2

hoặc 3 lá non

Trà là cây lâu năm, có chu kỳ sống rất lâu 60 — 100 năm, tuổi thọ kinh tế tối đa là50 — 60 năm tùy vào điều kiện môi trường và phương pháp trồng, cho năng suất caovào mùa mưa từ tháng 5 — 11, sau 10 — 15 ngày thì thu hoạch một lần Trà nguyên liệusử dụng trong cộng nghiệp chế biến chủ yếu là 1 tôm và 2 — 3 lá non

12 Phân bỗTrà được trồng nhiều tại các vành đai á nhiệt đới, khu vực có khí hậu ôn hòa, âmướt Hiện nay, trà được trồng ở hơn 30 nước, các nước sàn xuất và xuất khẩu nhiều trànhất là: Trung Quốc, An Độ, Sirlanca, Nhật Bản, Ở Việt Nam tra được trồng phốbiến ở các tỉnh miền núi phía Bac ( Lai Châu, Hoàng Liên Sơn ), các vùng trung du(Vĩnh Phúc, Yên Bái ) vùng Tây Nguyên (Lâm Đồng, Gia Lai, Kom Tum)

1.3 Thành phan hóa học có trong lá trà — các tính chất được lý [3].|6]

Bảng 1.1: Thành phần hóa học có trong lá tràThành phần % khối lượng chất khô

Catechin 25 — 30(-)-Epigallocatechin gallat $— 12(-)-Epicatechin gallat 3-6(-)-Epigallo catechin 3-6(-)-Epicatechin 1-3(+)-Catechin 1-2(+)-Gallo catechin 3-4Flavonol va flavonol glucoside 3-4Polyphenolic acid 3-4Leucoanthocyanin 2-3

Chlorophyll và các chat màu khác 05-06

Khóang 5-6

Caffein 3-4

Theobromin 02Theophyllin 05Amino acid 4—5Acid hữu cơ 05-06

Monosaccharide 4-5Polysaccharide 14-22Cellulose và hemicellulose 4— 7Pectin 5-6Lignin 5-6Protein 14-17Lipid 3-5

1.3.1 Acid gallic [6],[10],[11]Acid gallic là một acid hữu co thuộc nhóm acid trihydroxybenzoic có trong lá tra

và nhiều loai thực vật khác đặc biệt trong củ tỏi, giúp làm giảm cholesterol trong máu

Ngoai ra, acid gallic lam gia tăng phóng thích insulin tự do trong máu, tăng cường

chuyền hóa glucose trong gan, làm giảm lượng đường trong máu va trong nước tiểu.Acid gallic có khả năng ức chế 70 lọai vi khuẩn gram (-) va gram (+), khangvirus như cúm, cam lạnh Nó có họat tính kháng viêm mạnh, dùng chữa dau thầnkinh, phong thấp, đau hệ cơ và phần lưng dưới

HO OH

OH

Hình 1.1: Cau tạo của acid galic

1.3.2 Nhóm hợp chất catechin| I I |

Catechin cua trà thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3-ol, phân tử có 15 carbon bao

gdm hai vòng 6 carbon A va B được nối bởi 3 đơn vi carbon ở vị trí 2, 3, 4, hìnhthành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy Cau trúc của catechin có chứa hai

carbon bat đôi ở vi trí 2 và 3, không chứa nôi đôi ở vi trí 2,3 và nhóm 4-oxo

Hình 1.2: Cấu tạo khung cơ bản của catechinCác catechin được chia thành 2 nhóm: nhóm catechin tự do bao gom GC, EC,EGC (vi trí carbon số 3 có chứa nhóm thé hydroxyl) và nhóm đã bi ester hóa haynhóm galloyl catechin : ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở vị trí carbon số 3 được thaybang một nhóm gallat)

Các hợp chất catechin trong lá trà tác dụng với FeCla cho kết tủa xanh thẫm hoặcxanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử Các catechin đều dễ tan

trong nước nóng, rượu, aceton, ethyl acetat tao dung dịch không màu, không tan trongcác dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như benzene hoặc chloroform

Các hợp chất trong nhóm catechin:

(+)-Gallocatechin C1sH1407

(-)-Epigcatechin gallat C22Hi14010 (-)-Epigallocatechin gallat C22HisO1n

Hình 1.3: Cấu tạo các hợp chất trong (+/-) catechinHàm lượng catechin trong búp trà cao nhất khỏang 30 % khối lượng khô Trongcác hợp chất catechin được tim thấy trong trà, thành phân gallat là chiếm đa số (trên80 % tong catechin), ngòai ra các hợp chất catechin còn được tìm thấy trong cacao,nho, táo, hành, Hàm lượng các catechin trong là trà luôn thay đồi, phụ thuộc vàogiống trà, thời kỳ sinh trưởng, vị trí các lá trên búp trà và các yếu tố khác về thonhưỡng Trong quá trình phát triển của lá trà, dưới tác dụng của enzyme các catechinbị chuyên hóa dan thành các hợp chat tannin và giảm dan hàm lượng trong lá trưởng

thành.

Công thức cấu tạo catechin với nhiều nhóm hydroxyl (5 nhóm ở các catechin, 6

nhóm ở các gallocatechin, 8 nhóm ở các catechin gallat và 9 nhóm ở các gallocatechin

gallat) đảm bảo khả kháng oxy hóa rất mạnh của nhóm hợp chất catechin.Nhóm hợp chất catechin có khả năng ngăn chặn có hiệu quả các quá trình oxyhóa, đặc biệt là quá trình oxy hóa lipid, nhóm chất này còn được quan tâm sử dụngtrong mỹ phẩm và thực phẩm Do đặc điểm xuất phát từ thiên nhiên, an toàn, trà và

các chất từ trà đang được sử dụng chủ yếu như một phụ gia chống oxy hóa nhằm thaythé các phụ gia tong hợp thường dùng khác như BHT, BHA

1.3.3 Epigallocatechin gallat [6],[7],[10],[11]

EGCG là viết tat của hop chat Epigallocatechin-3 — gallat là một trong bốn loạipolyphenol được tìm thấy nhiều trong trà xanh, bao gồm epicatechin (EC),

epigallocatechin (EGC), epicatechin —3 — gallat (ECG) và epigallocatechin—3 — gallat

(EGCG) EGCG là ester của epigallocatechin và acit gallic, là hoạt chất chống ôxyhóa có nhiều trong trà xanh nhưng không có trong tra đen vì khi lên men EGCGchuyền thành thearubigin Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu, khả năng chống oxyhóa của hoạt chất EGCG trong trà xanh cao gấp 100 lần so với vitamin C, gấp 25 lần

SO VỚI Vitamin E

Với sự tiến bộ của khoa học, ngày nay các nhà nghiên cứu còn tìm thay nhữngtác dụng tích cực của EGCG đối với sức khỏe con người, như khả năng diệt trừ cácvirus, vi khuẩn, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư; ngăn ngừa các bệnh timmạch như: dau tim, đột quy, tai biến mạch máu não Ở những bệnh nhân đái tháođường, EGCG còn có tác dụng lên tuyến tụy để điều chỉnh khả năng tiết insulin — cảithiện tình trạng bệnh tiểu đường type I

Vì những tính chất dược lý trên, ngày càng có nhiều sản phẩm chứa chiết xuấttrà xanh trên thị trường dược phẩm, nhiều nhất là dang TPCN

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước|[3 |.{4|.| 5 ]

Nguyễn Hải Hà (2006): nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà, dựa vào phương

pháp Folin-ciocalteu đánh giá hàm lượng polyphenol tổng thu được Xác định cácthông số cho quá trình trích ly bằng vi sóng, thăm do, tinh chế sơ bộ dịch trích, tạosản phẩm dạng bột có hàm lượng EGCG 35%, catechin tổng 70%, polyphenol tong95% Khảo sát một số tính chat kháng oxy hóa, kháng khuẩn của sản phẩm

Dương Hoàng Long (2009): nghiên cứu chiết xuất EGCG từ trà xanh dùngphương pháp sac ký cột với hệ dung môi ethanol/nước Khảo sát các yếu tố (nông độdung môi, tốc độ dung môi, lượng dung môi, tính chất nhựa) đối với sự phân táchcatechins Xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế EGCG có hàm lượng >50% (khốilượng chất khô)|5]

Võ Ngọc Trâm (2012): sử dụng các phương pháp làm giàu EGCG từ trà xanh

như trích ly trong S-COa, dùng sắc ký cột (silicagel, nhựa trao đối ion, lingocellulose, ), kết quả cho thấy nếu cho qua sắc ký cột trao đối ion nhiều lần làm tăng

của các phòng thí nghiệm với các phương tiện phân tích hiện đại chứng tỏ chúng đáp

ứng được mục đích su dung Theo DĐVN IV, chất đối chiếu được định nghĩa nhưsau: "Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phépthử đã được quy định về hóa học, vật lý và sinh học Trong các phép thử đó các tínhchất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chat cần thử "

Theo định nghĩa của FDA hướng dẫn soạn tài liệu để đăng ký sản xuất chấtchuẩn: "Chuẩn đối chiếu (reference standard) là một 16 hay mẻ của hợp chất làmthuốc được điều chế đặc biệt bang cách tổng hợp độc lập hoặc bang cách tinh chế bồsung của nguyên liệu sản xuất và được chứng minh băng một loạt các thử nghiệmphân tích sâu rộng để xác nhận nó là nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa cóthé đạt được một cách hợp lý Nó thường được dùng cho việc phân giải cau trúc và chat

làm chuan (benchmark) cho các chuân làm việc”.

1.5.2 Phân loại

1.5.2.1 Chất chuẩn dược điểnĐặc trưng của chất chuẩn Dược điển được dé cập trong phan giới thiệu của ISOGuide 34: Chuan Dược điển được thiết lập và phân phối bởi Hội đồng Dược dién theocác nguyên tac chung của ISO này Tuy nhiên, Hội đồng Dược điển cũng có thể cungcấp các thông tin thiết yếu được ghi trong giấy chứng nhận phân tích và ngày hết hạnđến người dùng Bao g6m một số chuẩn như:

> Chuẩn Dược điển Quốc tế> Chuẩn Dược điển châu Âu> Chuẩn Dược điển Anh> Chuan Dược điển Mỹ> Chuẩn Dược điển Nhật

1.5.2.2 Các loại chuẩn khácChuẩn gốc hay chuẩn sơ cấpLà các chất được thừa nhận rộng rãi, có chất lượng phù hợp trong điều kiện quyđịnh và có giá trị được chấp nhận mà không phải so sánh với chất khác

Chuẩn làm việc hay chuẩn thứ cápBao gom các chất chuẩn sinh học và các chất đối chiếu hóa hoc được thiết lậptrên các nguyên liệu được chuẩn hóa so với các chất chuẩn gốc hay bằng phươngpháp phân tích có độ chính xác cao để cung cấp rộng rãi cho các phòng kiểm nghiệmthuốc; được dùng để định tính, định lượng, đánh giá hoạt lực, xác định độ tinh khiết củathuốc, nguyên liệu và thành phẩm

Chuẩn cơ sở hay chuẩn của nhà sản xuấtLà các chất được sản xuất, tinh khiết hóa, mô ta đầy đủ và xác định rõ cau trúc(IR, UV, MNR, MS ) thường được sử dụng trong các trường hợp chất mới (New ChemicalEntity - NCE) chưa có chuyên luận tóm tat

Chát doi chiếu chiết từ dược liệu có hàm lượng phải lớn hon 95,0 %, thườngdùng trong xác định cấu trúc, chất đánh dau trong sac ký đồ vân tay

1.5.2.3 Mục đích sứ dụng chất chuẩnCác chất đối chiếu được sử dụng theo yêu cầu của chuyên luận Dược điển hayyêu câu kiểm nghiệm Dinh tính: pho hồng ngoại, quang pho, SKLM Thử tạp chất liênquan: SKLM, HPLC, quang phô, sắc ký khí (GC) Định lượng: HPLC, quang phố, visinh, hay chuẩn độ.

1.5.3 Sơ lược về bộ tiêu chuẩn ISO GuideISO là tên viết tắt của Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa, được thành lập vào năm

1946 và chính thức hoạt động vào ngày 23/02/1947 ISO có tru sở tại Geneva (Thụy Si)

và là một tổ chức Quốc tế chuyên ngành có các thành viên là các cơ quan tiêu chuẩnQuốc gia Tùy theo từng nước, mức độ tham gia xây dựng các tiêu chuẩn ISO có khácnhau Ở một số nước, tổ chức tiêu chuẩn hóa là các cơ quan chính thức hay bán chính

thức của Chính phủ Việt Nam chính thức gia nhập từ năm 1977 và là thành viên thứ71 của ISO.

Để xây dựng quy trình thiết lập va chứng nhận chất chuẩn, chủ yếu dựa vào babộ ISO Guide 31, 34 và 35 làm cơ sở ISO Guide 31 cung cấp các chỉ dẫn cần thiếtgiúp nhà sản xuất chất chuẩn soạn thảo giấy chứng nhận phân tích một cách rõ ràng,ngăn gọn phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế ISO Guide 34 đưa ra các yêu cầu nhằmđánh giá năng lực của nhà sản xuất chất chuẩn đồng thời hướng dẫn giúp đáp ứng cácyêu cầu nay; nhìn chung, ISO này đưa ra các mô hình thử nghiệm tính đồng nhất, độ6n định và xác định hàm lượng của nguyên liệu ISO Guide 35 cung cấp các nguyênlý thống kê hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp hợp lý nhăm đánh giá độđồng nhất 16, độ ôn định, an định giá trị chất chuẩn và xác định độ không dam bảo do

ISO 13528:2005 bồ sung cho ISO Guide 43 bang cách mô tả chi tiết các phươngpháp thong kê cho các tô chức sử dụng dé phân tích các dữ liệu thu được từ chươngtrình thử nghiệm thành thạo và đưa ra các khuyến cáo thực tiễn cho đối tượng tham giatrong chương trình ISO này chỉ dẫn cách xác định giá tri ân định và độ không đảm

bảo đo chuan của giá tri này.

1.5.4 Một số chất chuẩn phân lập từ dược liệuHuỳnh Thị Mai Trang (2012): Băng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập vàtinh chế 2 hợp chất labdan diterpen lacton (hispanon và leoheteromin) có trong cao hexancủa cây ích mẫu Câu trúc hoá học được xác định bang phương pháp phô nghiệm và sosánh với tài liệu đã công bố Sản phẩm thu được có độ tinh khiết >95 %, đạt yêu cầu chochất đối chiếu chiết từ dược liệu Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn các hoạt chất vừa phân lập đểlàm chất đối chiếu nhằm hướng tới thiết lập chất đối chiếu chiết từ dược liệu phục vụ chocông tác kiểm tra chất lượng các sản phẩm có chứa ích mẫu lưu hành trên thị trường [30]

Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014): Thiết lập được 6 hợp chất có nguồn gốc từ dược liệutrinh nữ hoàng cung đạt yêu cầu chất đối chiếu hóa học thứ cấp với bộ dữ liệu chuẩn gồmđiểm chảy, pho UV, IR, MS, NMR và tiêu chuẩn cơ sở dé đánh giá chất lượng [31]

Hà Minh Hiền (2014): Thiết lập được calophylloid va 4— hydroxyxanthon làm chuẩnđối chiếu từ nhựa và vỏ quả mù u theo ISO 13528 [32]

CHƯƠNG 2: DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứuMẫu nghiên cứuLá của giống trà LD 97, thu mua tại Trung Tâm Nghiên cứu Thực Nghiệm LâmĐồng vào thời gian cây trà cho năng suất cao (tháng 9 đến tháng 11)

Thiết bị, dụng cụ, hóa chấtThiết bị và dụng cụ đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP.Máy sắc ký lỏng Shimadzu với detector PDA

Máy quang pho hồng ngoại Nicolet

May Mettle Toledo TGA/DSC ISF/1240.May đo nhiệt độ nóng chảy Buchi

Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer ( TruongKHTN TP.HCM).

Máy cô quay Heidolph, bể siêu âm Branson 3510, các dụng cụ thủy tinh canthiết

May HPLC điều chế Knauer — Merck, cột Phenomenex (250 mm x 210 mm,

5m)

Máy quang phô Shimadzu UV- Vis 1700

Bang mong Silica gel (Merck), silica gel 60 (Merck) cỡ hạt 0,040 — 0,060 mm.Hoa chat, chat chuan

Acetonitril (HPLC), methanol (HPLC), clorofrom (PA), n-hexan (HPLC), ethylacetat (PA)

Thuốc thử Folin — ciocalteu, acid acetic bang

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuat[2],[4],[5]Lá trà sau khi hái về phải xử lý, diệt men Giai doan này đóng vai trò rat quantrọng trong việc đảm bào thành phân catechin của trà Nguyên liệu sau khi được diệtmen bằng hơi nước, say khô ở 40°C, xay nhỏ, trích ly bằng một số phương pháp, tỉ lệ

được liệu -dung moi (1:6 g/ml)

Phương pháp 1: Trích ly có hỗ trợ vi sóng, thời gian vi sóng 6 phút, dung môi là

ethanol 60 °, công suất lò vi sóng 800W.Phương pháp 2: Trích ly thường bang cách đun hồi lưu có khuấy trộn, thời gianchiết 60 phút, nhiệt độ chiết 70°C, dung môi chiết ethanol 60°

Phương pháp 3: Trích ly có hỗ trợ của siêu âm, thời gian chiết 30 phút, dungmôi chiết ethanol 60 °

Phương pháp 4: Trích ly bằng cách ngâm dầm dược liệu trong dung môi ethanol

60 ° trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.

Phương pháp phân tích so màu được lựa chọn nham để định lượng ham lượngpolyphenol tổng và so sánh nhanh hiệu quả trích ly trong quá trình khảo sát phươngpháp trích ly Phương pháp Folin - ciocalteu sử dụng để đo hàm lượng polyphenoltổng

Thuốc thử Folin-ciocalteu (hỗn hợp muối phức polyphosphotungstat - molydat)rất nhạy đối với chất khử, nếu có mặt hợp chat polyphenol trong môi trường kiềm nhẹsẽ bị khử thành sản phẩm phức molydenium-tungsten có màu xanh

Hóa chất: Thuốc thử Folin-ciocalteu, dung dịch Na2COs bão hoà, nước cất.Chất chuẩn : Dung dịch (+/-) catechin

Phương pháp thực hiện: Lay 0,5 ml dung dich (chuẩn hoặc dung dịch cần đo đãpha loãng- mẫu trang dùng nước cất) cho vào bình định mức 10ml, cho tiếp 4,5mlnước cất, lắc đều, cho nhanh 0,2 ml Folin và 0,5 ml NazCOa bão hòa, lắc đều dungdịch, sau đó địch mức băng nước cất đến 10 ml, lac đều Để yên trong lgiờ, sau đótiền hành đo độ hap thu A tại bước sóng 4 = 725 nm

2.2.2 Phân lập, tinh chế [3],[4]Loc thu dịch chiết ethanol, lay phan gan cho tiếp dung môi ethanol 60° tiếp tụcsiêu âm Gộp tat ca dịch lọc, chiết với cloroform loại bỏ clorophyll — dịch lọc Dungdich gelatin 25% (ty lệ 1:60) cho vào dịch lọc nhằm loại các hợp chất tannin ngưngtu, làm lạnh 10°C, xuất hiện tủa tiến hành lọc hút chân không để loại tủa—> dịch lọc.Dịch lọc thu được chiết với ethyl acetat, cô quay thu hồi dung môi, thu được cao thô.

Sắc ký cột silica gel nhiều lần cao thô, hệ dung môi rửa giải n-hexan - ethylacetat (9 :1) Lần lượt rửa giải bằng dung môi k m phân cực và thay đổi ty lệ dung

môi dé tăng dân độ phân cực Cô dưới áp suât giảm dé loại dung môi các phân đọan.

Gộp các phân đoạn có EGCG, catechin, gallic acid khi so sánh vết Rf với cácchất định tính Sigma, tiễn hành sắc ký cột silica gel lần 2 với hệ dung môi cloroform :aceton (4,5 — 5,5) kết hợp với sắc ký lọc gel trên Sephadex LH-20 (MeOH) thu đượcba hợp chất catechin, acid gallic, EGCG thô Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc kýlỏng điều chế Kanuer — Merck, cột Phenomenex (250 mm x 210 mm, 5 um) thu đượchợp chất tinh khiết

2.2.3 Xác định cau trúcSản phẩm được xác định bang các phương pháp pho nghiệm 'H-NMR, °C -NMR, IR, phố UV, cũng như so sánh các số liệu phố có được với tài liệu tham khảo

2.24 Xây dựng tiêu chuẩn, thấm định phương pháp đánh giá chất đối chiếu

Máy sắc ký lỏng Shimadzu LC-20AD, đầu dò chuỗi diod quang SPD-M20A

Cột: Gemini ODS (250 x 4,6mm 5 um).

Tốc độ dòng: 1.0ml/phút.Thể tích tiêm: 10 ul

Bước sóng phát hiện: 280 nmPha động: A: dung dịch H:POx 0,1%; B: AcetonitrilTheo chương trình gradient:

Bảng 2.1: Các tiêu chuẩn và phương pháp đánh giá chất đối chiếu EGCG, (+/-)

-IR Dap viên KBr, phố của mẫu thử phù hop với phố đối chiếu trong bộ

dir liệu chuân.

- UV (HPLC) Có hap thu cực đại tại A = 280 nm.- !H—NMR, 8C- | Phố của mẫu thử phù hợp với phố đối chiếu trong bộ dữ liệu chuẩn

NMR

3 Điểm chảy +2 °C so với tài liệu tham khảo

4 Hàm lượng nước | Không quá 5,0 % Không quá 15,0 %(TGA)

5.Góc quay cực riêng | - 172°+ 2° (C= 1,0 mg/ml +13° đến + 18° (C = 0,7 mg/ml

trong EtOH) trong MeOH)

6 Độ tinh khiết > 95 % tính trên chế phẩm nguyên trạng

HPLC ( % diện tích)

2.2.5 Thiết lập chất đối chiếuĐánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ

Lay mẫu ngẫu nhiên theo VN + 1 trong đó N là tổng số lọ Tiến hành xác định chỉ

tiêu tinh khiết từng lọ theo phương pháp đã xây dựng Đánh giá theo kỹ thuật thốngkê phân tích ANOVA-one way so sánh 2 giá trị Fin và Fe Nếu Fin < Fre: kết quả giữacác mẫu là đồng nhất

Xác định giá trị ân định: Đánh giá chất chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệmCác phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu phải đạt tiêu chuẩn GLP hoặc

ISO 17025 Mỗi phòng thí nghiệm sẽ nhận được sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo quy

trình phân tích và các tài liệu liên quan.

Mỗi phòng thí nghiệm sẽ trả lời kết quả độc lập của phòng trên sáu lọ mẫu gởi.Tập hợp các kết quả của ba phòng thí nghiệm tham gia ( n = 18), đánh giá kết qua

theo ANOVA, so sánh 2 giá tri FEu và Fic

Trường hợp 1: Fin < Fie > kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khác nhaukhông có ý nghĩa, quy trình phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng chất phân tích

không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá.

Trường hợp 2: Fin > Fie > kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khác nhaucó nghĩa, quy trình phân tích có độ lặp lại thấp, hàm lượng chat phân tích thay đối tùy

vào mỗi phòng thí nghiệm tham gia đánh giá

CHƯƠNG 3: KET QUÁ NGHIÊN CỨU

3.1 Chiết xuất10 kg lá trà tươi sau khi được diệt men bằng hơi nước trong khỏang 3 — 5 phút,say ở 40°C trong 60 phút Xay lá trà đến kích thước < 2 — 3 mm, thu được 2,5 kgnguyên liệu, bảo quản nơi thóang mát Khảo sát bốn điều kiện chiết xuất như trên Kếtquả tong hàm lượng polyphenol được kiểm tra bang phương pháp so mau

Bảng 3.1: Hiệu quả trích ly của các phương pháp

Phương pháp trích ly Tong polyphenol (%) Hiéu suat (%)

Gop tất cả dich lọc, chiết với clorofrom để lọai bỏ clorophyll, thu dịch lọc Tiếptục loai các hợp chất tannin băng dung dich gelatin 25 % (tý lệ 1 : 60), làm lạnh 10°C,lọc bỏ tủa Dịch lọc chiết với ethyl acetat, cô quay lọai dung môi có được cao thô

ethyl acetat (35 ø)

3.2 Phân lập [2],[23]

Sắc ký cột cao ethyl acetat trên cột silica gel (8 x 50 cm) với hệ dung môi giải lyn-hexan: ethyl acetat (1-100) thu được 10 phân đọan (AI -A10) Kiểm tra các phânđoạn bang SKLM, kết quả Rf cho thấy phân đoạn A4 có chat cần phân lập

Phân đoạn A4 (5.4 g), tiếp tục sắc ký cột trên cột silica gel (5 x 50 cm) với hệ

dung môi giải ly cloroform : aceton (4,5 : 5,5) thu được 9 phân đọan (A4.1 — A4.9),

kiểm tra 9 phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi chloroform: aceton : acid formic(4:6: 0,1) dựa vào kết quả Rf chọn phân đoạn A4.2, A4.3 và A4.9

Gop hai phan đoạn A4.2 và A4.3 (15g) sắc ký cột trên cột silica gel với hệ dungmôi giải ly clorofrom: methanol (7:3) thu được X1 thô Tinh chế X1 bang sắc ký lỏngđiều chế Merck — Knauer với cột Phenomenex RP-18 (250 x 210 cm, 5 um), pha độngmethanol- acid acetic 0,2 % (70:30) thu được catechin (X1.1) tinh khiét (200 mg),acid gallic (X1.2) tinh khiét (401 mg)

Phân đọan A4.9 (0,9g) tiếp tục cho qua cột Sephadex với hệ dung môiclorofrom: methanol (4,5 ; 5,5) thu được X2 thô Tinh chế X2 băng sắc ký lỏng điềuchế Merck — Knauer với cột Phenomenex (250 x 210 em, 5 um) với hệ dung môimethanol: acid acetic 0,2% (6 ; 4) thu được EGCG (X2.1) tinh khiết ( 305 mg)

3.3 Xác định cau trúc [21],[22],[27]EGCG (X2.1): dang vô định hình mau trang ngà, kết tinh trong ethanol tuyệt đối.Phố UV cho mũi hấp thu cực đại ở 273 nm (Phụ lục 2)

cm”), C = O (1616 cm’), C-O (1292cm), vòng thom carbon (741 cm')) (Phụ lục 2 —Hình 2.1)

Phố !H -NMR cho các nữi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của một vòngbenzen thế vị trí l,2,3,5 [ồn 6,03 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6] và 6,06 (1H, d, J = 2,5 Hz,H-8], một vòng benzene thé vi trí 1, 3, 4, 5 có các proton hương phương đối xứng [ồn

6,62 (2H, d, J =2,5 Hz, 2’, 6’, 2 nhóm CH sp3 mang oxigen [ồn 5,56 (1H, m, 3), (dc 69,3, C-3)], [ồn 5,06 (1H, s, H-2), (0c 78,1, C-2)], một nhóm metylen benzil[ồn 2,93 (1H, dd, J=17,0 và 2,0 Hz, Ha-4) va 3,02 (1H, dd, J=17,0 va 4,5 Hz, Hb-4),(dc 26,7, C-4)| (Phu lục 2 — Hình 3.1, 3.2, 3.3)

H-Phố °C — NMR cho các mũi cộng hưởng với 22 carbon bao gồm một carboncarbonyl [dc 166,2, C-7”|, 18 carbon vòng thơm, hai nhóm metin gan vao carbon

mang oxygen [dc 69,3, C-3; dc 78,1, C-2], một nhóm metylen [dc 26,6, C-4], mườinhóm metylen [dc 157,1, C-5; dc 95,87, C-6; dc 157,7, C-7; dc 96,55, C-8; dc 1574,C-9; dc 99,0, C-10; dc 130,77, C-17; bc 133,1, C-4°; bc 21,9, C-1"; dc 138,8, C-4"],tam nhóm metylen [dc 106,8 (2C, dd, C-2’, C-6’); dc 146,2 (2C, dd, C-3’, C-5”); dc

110,0 ÓC, dd, C-2”, C-6”); dc 145,9 (2C, dd, C-3”, C-5”)] (Phu lục 2 — Hình 3.4)

So sánh pho !H — NMR và 8C- NMR của (X2.1) với phố của EGCG [23],[27]cho thay (X2.1) là epigallocatechin galltat Co2HigsO11 cô lập từ trà xanh trước đây

Bang 3.2: Dữ liệu phố 'H — NMR (500 MHz) và !3C — NMR (125 MHz) trongaceton d-6 (tri số trong ngoac la J tinh bang Hz).

Vi tri X2.1 EGCG

du (ppm) oC (ppm) ou (ppm) oC (ppm)

2 5,06 (1H, s) 78,1 5,05 78,1

3 5,56 (1H, m, J=2,5 Hz) 69.3 5,54 (J=2,3 Hz) 69.24 2.93 (1H, dd, J=2, 17 Hz,| 266 = | 2,89 (J=2,3; 17,3 Hz) 26.6

H-4a)

3,02 (J=4,5; 17,3 Hz)3,02 (1H, dd, J=4,5, 17 Hz,

H-4B)

5 157.1 157.16 6.03 (1H, d,J=2,5 Hz) 958 |6/01(J-24Hz) 958

7 157.7 1578

8 6.06 (1H, d, J=2,5 Hz) 96,5 |604(=24Hz) 96,59 1574 157410 99,0 99,0

V 130.7 130.7

2-6 | 662 (2H, s) 1068 | 661 106.73)—5° 146.2 146.24° 133,1 133.1

1” 121.9 121.92” — 6” | 7.03 (2H, s) 1100 |7,01 110.0

2500 -bg,221/0

= 16,5 và 4,6 Hz, H-4a); 0H 2,54 (1H, dd, J = 16,8 va 2,9 Hz, H-4b)| (Phu lục 5 —Hinh 5.1, 5.2, 5.3)

Pho °C — NMR cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 15 carbon.Trong đó gồm bốn carbon olefin mang nhóm thé [oC 156,9, C-7; dC 157,2, C-5; dC145,7, C-4’ va dC 145,6, C -3’], hai carbon có gan oxygen [dC 82,1, C-2; dC 68,4, C-

3], một nhóm metilen [dC 28,8, C-4], bay carbon olefin [6C 95,5, C-6; dC 96,2, C-8;dC 132,2, C-17; dC 115,3, C-2’, 6C 115,7, C-5’, dC 120,1, C-6’, 5C 100,6, C-10], một

proton gan oxygen [ 5C 157,7, C-9] (Phụ luc 5 — Hình 5.4)

So sánh với tài liệu tham khảo cho thay X1.1 là (+/-) catechin C¡sH¡z©s.

Hình 3.4: Công thức cầu tạo của (X1.1) - (+/-) catechinBảng 3.3: Số liệu phô !H (500 Mhz) và !3C — NMR (125MHz) trong aceton d-6Vị Chế phẩm X1.1 (+/-) Catechin

5 1572 1572

6 |588(1H,d,J=2,5 Hz) 954 | 5,87 J=2,2 Hz) 95 47 156,9 156,98_ | 6,02 (1H, d, J=2.0 Hz) 96,1 6,02 (J=2,2 Hz) 96,0

9 157/7 157/710 100.6 100.6

1 1322 132.12’ | 6,89 (1H, d, J=2,0 Hz) 115,2 6,89 (J=1,9 Hz) 115,2

4 145.7 145.65’ | 6,76 (1H, dd, J=8,5; 2,0 Hz) 115/7 6,75 (1H, J=8.I;1,9 Hz) 115,66° | 6,19 CH, d, J=8,0 Hz) 120,0 6,79 (1H, J=8,1 Hz) 120,0

Acid gallic (X1.2) [23], [25],[27]: thu được dạng bột trang nga Pho UV cho hap

thu cực đại ở 270 nm.

2000150010000

Hình 3.5: Phố UV của (X1.2) — acid gallic

Pho 'H — NMR có mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của hai proton vòngthơm [ồn 7,15 (2H, s, H-3, H-7)] (Phu lục 4- Hình 4.1)

Phố '*C-NMR có tín hiệu cộng hưởng với bảy carbon gồm một carbon carbonylcủa acid carboxylic [dc 167,6 (IC, s, C-1)] và ba carbon mong nhóm thé [dc 146,0